DE2031759A1 - Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von L-Asparaginase - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von L-Asparaginase durch Kultur L-Asparaginase erzeugender Mikroorganismen in einem geeigneten Kulturmedium.

Das Enzym L-Asparaginase (3,5*11-L-Asparagin-amidohydrolase nach der Nomenklatur der International Enzyme Commission) zeigt bei Abtrennung aus Meerschweinchenserum oder Bakterienkulturen von Escheriohia coli oder Serratia maroesoens oder auch - wie es in der gleichfalls anhängigen UK-Patentanmeldung 403^3/68 geschrieben ist - von Bakterien der Gattung Erwinia» insbesondere Erwinia carotovora, eine Antitumoraktivität.

L-Asparaginase dieser bakteriellen Herkunft wird zur Zeit für klinische Versuche zur Behandlung gewisser Typen von Leukämie und disseminiertem Karzinom verwendet. Die Nachfrage nach dem Enzym übersteigt jedoch bei weitem die derzeitige Verfügbarkelt, da der gewerbsmäßigen Herstellung dieses Enzyms ausgehend von E. CpIi und S. Haroescens seine niedrige Aktivität in den Kulturen dieser Bakterien und die

29> (JX 3256/OI1)-NÖE(7)

00Ö882/200S

mit seiner Isolierung verbundenen Schwierigkeiten entgegenstehen.

Es wurde nun gefunden, daß die L-Asparaginaseausbeute durch Zumischen von zumindest einer der Aminosäuren Asparaginsäure, Threonin, Serin oder Glutaminsäure zu einer Kultur, eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus¹ in einem geeigneten Kulturmedium stark erhöht werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase durch Kultivierung eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus¹ in einem geeigneten Nährmedium ist mithin dadurch gekennzeichnet, daß zu diesem Medium eine wirksame Menge von zumindest einer der Aminosäuren Glutaminsäure, Serin, Threonin oder Asparaginsäure zugegeben wird.

Die L-Asparaginase wird dann durch irgendein geeignetes zeilzerstörendes Verfahren und vorzugsweise nach der im einzelnen in der UK-Patentanmeldung 4OJ544/68 beschriebenen Methode "extrahiert" bzw. isoliert.

Unter der Bezeichnung "wirksame Menge" wird ein Gehalt des Nährmediums an spezieller Aminosäure verstanden, der ausreicht, eine merkliche Verbesserung der L-Asparaginaseausbeute der Kultur eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus¹ verglichen mit der Ausbeute bei Abwesenheit dieser wirksamen Menge herbeizuführen. Die minimale wirksame Menge hängt natürlich jeweils vom gewählten Kulturmedium, den kultivierten Mikroorganismen und den Wachstumsbedingungen, wie der Kultivierung in kontinuierlichem Verfahren oder diskontinuierlich bzw. chargenweise, in tiefen oder flachen Kulturen usw. ab.

Ö098 82/200S _ÖA

Pur chargenweise Kulturen wurde gefunden, daß typisch verbesserte Enzymausbeuten mit einem L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus erhalten werden, wenn das Kulturmedium während der chargenweisen Kultur durch :eine zumindest 3 mg Aminosäure pro ml Kultur und vorzugsweise 12 bis 30 mg/ml äquivalente Menge ergänzt wird. Diese Ergänzung des Kulturmediums kann in unterschiedlicher Weise erreicht werden. Beispielsweise kann die gesamte ergänzende Aminosäure vor der Kultivierung des L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus¹ oder während einer anfänglichen Kultivierungsstufe zum Nährsubstrat hinzugefügt werdeni Alternativ kann eine relativ geringe aber wirksame Menge Aminosäure kontinuierlich oder in Abständen während einer gewünschten Kultivierungsperiode zugegeben werden, wobei die Zufuhrgeschwindigkeit (der Aminosäure) so eingerichtet wird, daß sie etwa der Geschwindigkeit des Verbrauchs durch den Mikroorganismus entspricht. Es wurde gefunden, daß letztere Verfahrensweise normalerweise höhere L-Asparaginaseausbeuten liefert und sie wird daher bevorzugt, obgleich die Durchführung nicht ganz so bequem ist. Eine dazwischenliegende Verfahrensweise, bei der die Kultur zu Anfang mit Aminosäure versetzt und später mit weiterer Aminosäure ergänzt wird, wenn die Geschwindigkeit der Zunahme der L-Asparaginase abnimmt, kann in der Praxis auch von Vorteil sein.

Wenn die genannte^ Aminosäure^ beim erfindungsgemäßen Verfahren kontinuierlich oder fortlaufend zu der chargenweisen Kultur zugesetzt wird bzw. werden, sollte die Zuführgeschwindigkeit und die Gesamtzufuhr derart eingerichtet werden, daß sie insgesamt zumindest 3 mg Aminosäure pro ml Kultur und vorzugsweise etwa 12 bis 30 mg/ml entspricht.

Ö 09 88 2/20 0 5 _BAD OWQiNAL.

Obgleich Mengen bzw. Gehalte über etwa JO mg/ml angewandt werden können, wird im allgemeinen dadurch kein Vorteil erzielt und es wurde sogar gefunden, daß das Wachstum eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus¹ durch überschüssige Aminosäuregehalte ernstlich gehemmt werden kann.

Bei einem kontinuierlichen Kulturverfahren, bei dem Kulturmedium fortlaufend in ein L-Asparaginase erzeugende Mikroorganismen enthaltendes Kulturgefäß eingeführt und L-Asparaginase von der kontinuierlich "geernteten" bzw. abgezogenen Kultur abgetrennt wird, können verbesserte Ausbeuten erreicht werden, wenn ein Kulturmedium kontinuier» lieh zugeführt wird, das mit zumindest 5 mg Aminosäure pro ml Kulturmedium ergänzt wurde und vorzugsv/eise mit etwa 7 bis 20 mg/ml. Bei einer solchen kontinuierlichen Kultur wird die Aminosäure in dem damit versetzten zugeführten Kulturmedium natürlich kontinuierlich verbraucht und wieder ersetzt und die "aktuelle" Konzentration der Aminosäure in unmittelbarer Umgebung der wachsenden Mikroorganismen kann daher ohne schädliche Wirkung zu irgendeinem Stadium des Verfahrens beträchtlich unter die minimal erforderliche Konzentration im zugeführten Kulturmedium sinken»

Einige Kulturmedien, insbesondere komplexe Medien. natürlichen Ursprungs, wie von Hefeextrakt* können geringe Mengen von einer oder mehreren der angegebenen Aminosäuren enthalten. Von derart zufälligen mehr oder minder vernachlässigbaren Gehalten herkömmlicher Kulturmedien unterscheidet sich jedoch die Erfindung durch die wohlerwogene , (gegebenenfalls ergänzende) Zugabe dieser Aminosäuren in wirksamen, d.h. die L-Asparaginaseausbeute beachtlich stei-

009882/200S

gernden, Mengen, die bedeutend höher liegen als die bisher in solchen Medien zwangsläufig vorhandenen Mengen.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die L-Asparaginaseausbeute - ausgedrückt in Internationalen Einheiten pro ml Kultur - zwischen etwa 40# und 6OO# höher liegen als bei Verfahren, bei denen ein nicht erfindungsgemäß ergänztes Medium unter sonst identischen Bedingungen verwendet wird. Die Steigerung der Ausbeute rührt nicht allein von der Erhöhung der Zahl der Zellen der im ergänzten Kulturmedium gezüchteten Mikroorganismen her, sondern von einer Zunahme der pro Zelle erzeugten L-Asparaginasemenge, d.h. die Enzymaktivität pro Zelle des Mikroorganismus¹ ist erhöht und damit die vom Bakterium erzielbare Enzymaktivität pro mg Protein (spezifische Aktivität).

Die angegebenen Aminosäuren können dem Kulturmedium in irgendeiner zweckmäßigen Form zugesetzt werden. Wenn die Löslichkeit der Aminosäure in Wasser gering ist, wird diese häufig mit Vorteil in Form eines Salzes oder Esterhydrochlorids zugegeben, das innerhalb des Substrats die freie Aminosäure in Freiheit setzen kann. Unter diesen Bedingungen können beträchtliche Mengen an Puffersubstanz zur Unterdrückung freigesetzter Ionen, sowie auch zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes im Kulturmedium auf einen für die Kultivierung des L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus¹ geeigneten Wert erforderlich sein. Wenn beispielsweise Natrium- oder Kaliumsalze einer der genannten Aminosäuren verwendet werden, kann Phosphorsäure als Puffer hinzugefügt werden. Die maximale Grenze, bis zu der Aminosäurederivate erhöhte Enzymausbeuten ergeben, wird erreicht, wenn der L-Asparaginase erzeugende Mikroorganismus infolge der erhöhten Pufferkonzentration nicht

009882/20ÖS

mehr wachsen kann. So können in Anwesenheit von einigen Puffersubstanzen maximale Ausbeuten bei Zugabe von bedeutend weniger als 3 Gew./Vol.-# (an zum Kulturmedium hinzugefügter) Aminosäure erreicht werden.

Zu den L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismen gehören die Bakterien Esoherichia coli und Serratla maroesoens und bei bevorzugten Verfahren gemäß der Erfindung Pflanzenpathogene der Gattung Erwinia, wie Erwinia carotovora, Erwinia aroideae, Erwinia atroseptica und Erwinia chrysanthemi *

Geeignete Kulturmedien enthalten normalerweise eine organische Stickstoffquelle, obgleich chemisch einfach definierte Medien, die Stickstoff in anorganischer Form und Quellen für Kohlenstoff, wie Glucose, Glycerin oder dergleichen enthalten, verwendet werden können. Die Kultivierung der zur Gattung Erwinia gehörenden Bakterien wird üblicherweise in Mischung mit komplexen stickstoffhaltigen Medien initiiert, die Peptone, Eiweißhydrolysate, Hefeautolysate oder dergleichen enthalten; wenn jedoch das Wachstum in Gang gekommen ist, kann das Kulturmedium durch allmähliche Verdünnung mit einem einfachen Medium und Abzug des komplexen Mediums ausgetauscht werden, bis die Bakterien praktisch im einfachen Medium wachsen. Zu den verfügbaren Medien (bzw. Ausgangsmaterialien), die beim (bzw. für das) erfindungsgemäße(n) Verfahren verwendet werden können, gehören Hefeexträkt, Getreideeinweiehliquor, Trypton, Erbseneinweichliquor, Fischmehl, Fleischmehl, Casein, Bouillonpulver, Malzextrakt, Sojabohnenmehl und Getreidemehl .

Es wird angenommen, daß gewisse handelsüblich erhältliche Nährmedien, wie beispielsweise einige Hefeextrakte,

009882/2005

Spuren von einer oder mehreren der gewünschten Aminosäuren enthalten können, die aber durch die üblichen Sterilisationsverfahren für Nährmedien zerstört oder vermindert werden. Es kann jedoch sein, daß die Menge an zuzufügender Aminosäure bei Verwendung solcher Medien herabgesetzt werden kann und gemäß der Erfindung besteht ein weiteres Merkmal des Verfahrens darin, daß zumindest ein Teil der wirksamen Menge an Aminosäure durch ein Nährmedium geliefert wird, das merkliche Mengen davon, d.h. zumindest 0,1 Gew.-$ der · gewünschten Aminosäure enthält.

Es wurde gefunden, daß die beachtlichsten Steigerungen der L-Asparaginaseausbeute beim erfindungsgemäßen Verfahren mit den L-Isomeren der genannten Aminosäuren erhalten werden. Die D- oder DL-Isomeren können Jedoch beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, obgleich im allgemeinen die L-Isomeren sowohl billiger als auch bequemer erhältlich sind.

Bei bevorzugten Verfahrensweisen gemäß der Erfindung ist die bevorzugte Aminosäure normalerweise L-Glutaminsäure, die im allgemeinen (wegen ihrer geringen Wasserlöslichkeit) in Form des Natrium- oder Kaliumsalzes in Verbindung mit einem geeigneten Puffermittel, wie Phosphorsäure, zur Unterdrückung der freigesetzten Natrium- oder Kaliumionen verwendet wird. Wenn beispielsweise das Kulturmedium für ein chargenweises Verfahren ein komplexes Medium ist, liegt der auf das Substrat bezogene optimale Zusatz an Natrium-L-glutamat, wie gefunden wurde, bei etwa 2 Gew.-#/Vol.-j6. Obgleich die prozentuale Konzentration an L-Glutaminsäure (Natriumsalz) über etwa 2# erhöht werden könnte, kann dann die ebenfalls notwendige Erhöhung der Phosphorsäurekonzentration anfangen, das bakterielle Wachstum nachteilig zu

009882/2 005 ' ■

beeinflussen. Typischerweise kann bei einem chargenweisen Verfahren, bei dem Erwinia carotovora in Zumischung mit einem "Yeatex"-Substrat (Hefeextrakt) gezüchtet wird, eine anfängliche Zugabe von etwa 2% Natrium-L-glutamat zu einer etwa 5-£^>ach erhöhten L-Asparaginaseausbeute führen. Der Zusatz von 7 bis 8 kg Natrium-L-glutamat zu 400 1 "Yeatex"-Kultur erhöht, wie gefunden wurde, die L-Asparagi-P naseausbeute unter normalen Arbeitsbedingungen von 7 Enzymeinheiten/ml auf 40 Enzymeinheiten/ml Kultur,

Für kontinuierliche Kulturen wurde gefunden, daß typischerweise ein mit etwa 1,5% Natrium-L-glutamat versetztes Nährmedium optimale L-Asparaginaseausbeuten liefert. Wenn beispielsweise ein Medium für kontinuierliche Kultur mit etwa 5$ "Yeatex" und versetzt mit etwa 1,5$ Natrium-L-glutamat verwendet wird, kann die Ausbeute an L-Asparaginase 80 I.E./ml (Internationale Einheiten/ml) betragen.

Es folgen typische Beispiele für die Gewinnung von L-Asparaglnase gemäß der Erfindung; diese erfindungsge-" mäße Erzeugung wird mit ähnlichen Verfahren ohne Anwendung wirksamer Mengen der genannten Aminosäuren verglichen.

Beispiel 1 Kulturgefäß

Die nachfolgend beschriebenen Arbeiten wurden in einem sterilisierbaren Kulturgefäß aus rostfreiem Stahl mit einem Heizmantel und Einrichtungen zur Überwachung der Temperatur und des Inhalts durchgeführt.

0 0 9 8 8 2/2005 ' ^{BAD 0R1GiNAL}

Am oberen Ende und am Boden dieses Gefäßes waren Einlaßöffnungen für den Zutritt steriler Luft vorgesehen. Der Deckel für den hermetischen Verschluß des Gefäßes hatte Einfüllöffnungen, durch welche Antischaummittel, Puffer, Keime und Ergänzungszusätze zugeführt werden konnten. Ein Rührer aus rostfreiem Stahl sorgte für die Umwälzung des Behälterinhalts. Im übrigen war ein pH-Meßgerät vorgesehen. Die pH-Überwachung konnte auf den erforderlichen pH-Wert eingestellt und bei einem Anstieg des pH-Wertes während der Kultivierung 3*2 m Phosphorsäure-Puffer mit Hilfe einer Peristaltikpumpe bei Bedarf eingeschleust werden.

Herstellung der Keim- bzw. Impfkultur

150 ml gekochter Fleischbouillon nach Robertson wurden mit einer gefriergetrockneten Kultur von Erwinia carotovora (N.C.P.P.B 1066) geimpft und über Nacht (1? Stunden lang) bei 37⁰C inkubiert und bei 4⁰C gelagert. Roux-Flasehenagarplatten (Kulturoberfläche 10 cm χ 20 cm; mit 2,4$ "Oxoid-Agar No. 3" verfestigte bzw. eingedickte Nährbouillon von ~*ff> "Oxoid CM 129"-Körnern) wurden mit 5 ml Nährkultur geimpft und 12 Stunden lang bei 27°C inkubiert und wiederum für bis zu 4 Wochen bei 4⁰C gelagert. Unmittelbar vor Gebrauch wurden 4 Roux-Flaschen mit 50 ml destilliertem Wasser in eine Keimflasche ausgespült und (der Inhalt) mit destilliertem Wasser auf 550 ml aufgefüllt. Der Inhalt der Keimflasche wurde zur Beimpfung von I5 1 eines sterilen Mediums (525 g "Yeatex" leichter Qualität; 3,5#) verwendet, das vor der Sterilisierung auf pH 6,8 bis 7*0 gebracht und vor der Verwendung auf 37°C vorgewärmt worden war. Die Inkubation erfolgte bei 37°C über 12 Stunden in einem Wasserbad mit einer Belüftung von -12 l/min duroh ein Einleitungsrohr von 0,64 mm lichter Weite und führte zu einem Keirapräparat in

0 0 9 8 8 2/2005

- ίο -

einer für die Zugabe zu sterilen Kulturmedien in Kulturgefäßen geeigneten Form.

Herstellung des Kulturmediums

Das Kulturmedium wurde in folgender Weise hergestellt: 16,3 kg "Yeatex" (der English Grains Co. Ltd.) wurden in 50 1 heißem Leitungswasser gelöst, gerührt und in in einem sterilen Kulturgefäß enthaltenes Leitungswasser überführt unter Auffüllung des Volumens bis auf 369 1. Dazu wurde Sodalösung (0,5 1; 10 η) zur Einstellung des pH-Wertes auf 6,8 bis 7 gegeben. Das Medium wurde unmittelbar durch ^O Minuten langes Rühren bei 121⁰C sterilisiert, wobei die Temperatur mit Hilfe eines Dampfmantels oder durch Einblasen oder Durchblasen von Dampf kontrolliert wurde. Das Medium wurde dann abgekühlt, wobei der Druck im Gefäß durch Einlaß von steriler Luft über Atmosphärendruck gehalten wurde. Die Temperatur und der pH-Wert wurden dann auf 37°C bzw. 6,8 bis 7*0 eingestellt und eine Antischaummittelzufuhr angeschlossen. Dieses Antischaummittel wurde durch eine 25 Vol.-#ige wässrige Silicon MS-Emulsion RD (der Hopkin and Williams Ltd.) gebildet, die unter Druck gesetzt und aseptisch über den Deckel des Kulturgefäßes zugeführt wurde. Der Druck im Kulturgefäß wurde dann abgelassen und durch das Einlaßrohr am Boden des Kulturgefäßes wurden dem Medium 10 l/min sterile Luft zugeführt. Das Medium wurde mit einem Flügelrührer mit einer Geschwindigkeit von >85 U/min umgewälzt.

Erzeugung von L-Asparaginase

15 1 Keimflüssigkeit wurden dann durch einen Einlaß

009882/200 5

im Gefäßdeckel in das Kulturgefäß überführt. Die pH-Uberwachung wurde auf einen pH-Wert von 6,8 bis 7 und die Temperaturregelung auf J57°C eingestellt. Der Ablauf des Verfahrens wurde durch Messung der Geschwindigkeit der Kohlendioxydentwicklung und mit Hilfe von Enzymprüfungen verfolgt.

Die Ergebnisse der Prüfungen des Enzymgehaltes zeigen, daß die Enzyrnausbeute (gemessen in I.E./ml Kultur) nach etwa 8 Stunden in diesem nicht ergänzten Medium konstant bleibt. Bei Erreichen dieses Stadiums wurden pH- und Temperaturregelung abgeschaltet und die Luftzufuhr für eine sterile Abschirmung an das obere Ende, des Kulturgefäßes verlegt. Es wurde weiter gerührt und die Kultur in etwa einer Stunde durch Umlauf von kaltem V/asser durch den Doppelmantel auf 20°C abgekühlt. Die Kultur wurde dann zentrifugiert und der zeilhaltige Bodensatz in einen Mixer überführt. Ein Puffer aus 10 niM ''Tris''-HCl, 3omM Natriumchlorid und 1 raM Äthylendiamintetraessigsäure von pH 7>0 und 2⁰C wurde mit dem Zellschlamm in einer Menge von 11 Puffer je ! kg Zellschlamm cremig geschlagen bzw. vermischt Aus der resultierenden gepufferten Mischung wurde die L-Asparaginase dann nach einem Verfahren "extrahiert¹' bzw. isoliert, das mehr im einzelnen in der UK-Patentanmeldung 40544/68 beschrieben ist. Grob gesprochen umfaßt dieses Verfahren eine Zell-Lysis mit starkem Alkali, ein Zentrifugieren und eine Salzfällung in der überstehenden Flüssigkeit zur Isolierung des Enzyms. *

Die Ergebnisse für 7 Kulturen sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefaßt. '

00 9882/200 5

"Ernte" Zeil- Zeil- L-Asparagina- Trok-(1) schlamm creme seaktivität ken-(kg) (1) (Mega-Einhei- gew.

ten) (g/l)

Kultur Creme

3,91

3,52

4,45

4,34

3,09

4,14

4,00

4,22

4,11
4,20

Tabelle

Gesamt- H^POh Anti- CO₂* (g/l) N in: TG /η \ schaum- max

^^XJ mittel (Ji) Medium übersteh. (1) Fl.

6,81

6,18

7,76

7,56

5,55

7,21

7,21

7,43

7,13

7,40

3,42
2,80
4,08
2,70
1,54
3,10
3,05
3,00
3,19
3,75

3,50
3,05
3,92
3,46

1,79
3,32
3,85
3,98
3,52
4,29

2,80

2.72

2,90

2,95

2,1G

3,0

2,9

3,14

2,96

2,37

1,05 2,4 0,97 1.65 1,09 2,4

0,80 1,17 1,10

1,14 1,07 C,89

1,08 2,34 2,50 2,40 2,4C

2,45

0.2 1,6

0,93 1,5

0,50 1,6

0,55 1,6

1,25 1,5

C,15 2,0

0,15 2,25

0,36 2,3
0,80 ' 1,7

2,30

2,01

2,21

2,09

2,21 . 2,13

2,21

2,55

2,46

0,2OC 2,3 2,42

1.90 1,74 1,96 1,89 1,93 1,85 1,93

2,02 2,07

ro ι

mittlere Enzym-Aktivitäten In der Kultur

bezogen auf Trockengewicht (TG) bezogen auf Protein unter der Annahme, daß das Protein

705έ des TGs ausmacht

* Peak-Ablesung am C0₂__{Analysafcor im abgehenden} Luftstrom 8,2 I.E./ml 2,9 I.E./^mS trockene Zellen

4,1 I.E./mg Protein

IV) CD CaJ

Wie man sieht* wird eine mittlere L-Asparaginase-Aktivität von 8,2 I.E. pro ml Kultur oder von 2,9 I»E./mg der trockenen Zellen erhalten. Nimmt man an, daß 70$ des Ge wichts der trockenen Zellen durch Protein gebildet wird, so liegt die mittlere L-Asparaginase-Aktivitat bei 4,1 I.E./mg Protein»

Beispiel 2

7 Kulturchargen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, jedoch unter Zugabe von 6,5 bis 8 kg Natrium-L-glutamat-monohydrat, das als Lösung in 4ö 1 Wasser zum Kulturmedium hinzugegeben wurde, bevor letzteres auf 369 1 aufgefüllt wurde.

In dem so ergänzten Medium wurden zwei Hauptwachstumsphasen beobachtet, von denen die erste, einem Wachstum in 4,5# "Yeatex" entsprechende nach 5 bis 6 Stunden und die zweite nach etwa 18 bis 22 Stunden einen Peak bei der Kohlendioxydentwioklungsgeschwindigkeit gab. Nach Abfall der Kohlendioxydentwicklung hinter dem zweiten Peak nach 20 bis 25 Stunden Wachstum wurde die Kultur in der gleichen Weise aufbereitet wie bereits für das nicht ergänzte Medium beschrieben wurde.

Die Ergebnisse für diese 7 Kulturen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

0 0 9 8 8 2/2005

Tabelle 2

"Ernte" Zeil- Zeil- L-Asparaginase-Aktivität TG Gesamt-HUPOh Anti- Alter (g/l) Stick- gebrauch- End-Glu-(1) schlamm creme Mega-Einheiten Einheiten (g/l) TG ^? schaum-r bei stoff in tes Na-L- tamin-(kg) (1) Kultur Kultur pro mg (kg) (1) mittel^MErnte" Medium über- gluta- säure-Creme pro ml trock. (1) (Std.) steh.· mat-mono- gehalt

Zellen Pl. hydrat

	400	10,21	18.9 .	16,6	13.9	41,4	4.6	9.04	3	,62	17,35	0,25	25	4.42	4.39	8,00	40 ns/i
O	385	10,26	18,3	15,4	13.4	40,0	4,7	8,61	3	,31	14,00	0,38	21	3,79	2.78	6,50	4O O£/1
O ay oo	420	11,08	21,7	16,8	11.7	40,0	4,7	8,46	3	.55	13,15	o,35	24	3,81	3,82	7,oo	20 nc/l
·■>«. ho	400	11? 58	19T6	16,4	13,7	41,1	5,0	8,34	3	,34	11,75	0,38	23	3,β9	3.93	7,00	40 nc/l
o· crt	406	11,91	21,4	20,5	18,4	50,6	6,4	7,95	3	,23	14,60	0,70	20	3,75	,3,67	7,25
	400	12,06	20,1	18,7	16,1	46,8	5f5	8,49	3	,40	14,25	o,55	22,5	4,00	3.92	7,25

11,40 19,6 20,8 I5_f8 51·9 6,4 8,12 3*25. 14fl5 1.68 21 3.90 3.68

. mittlere Enzym-Aktivitäten

In der Kultur

bezogen auf Trockengewicht (TG)

bezogen auf Protein unter der Annahme, daß das Protein des TGs ausmacht

7,25

44,5 IE/ml
5,3 ΙΕ/mg trockene
Zellen

7,6 ΙΕ/mg Protein

203175f^;

Wie man sieht, liegt die mittlere L-Asparaginase-Aktivität bei H-, 5 I.E./ml Kultur oder 5*3 I.E.. pro mg trockene Zellen. Wenn man wiederum annimmt, daß der Proteingehalt 70Ji des Trockengewichtes ausmacht, so liegt die mittlere L-Asparaginase-Aktivität bei 7#6 I·E./mg Protein.

Die Ausbeute pro ml Kultur wird also durch die Erfindung um einen Paktor von mehr als 5 verbessert.

Beispiel 3

Eine Kultur von Erwinla carotovora (N.C.P.P.B 1066) wurde in 4,5# "Yeatex" mit Zusatz von 6,5 kg Natrium-L-glutamat-monohydrat wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet. En zymprlif ungen während, des Wachstums ergaben die in der nachfolgenden Tabelle 3 zusammengefaßten Ergebnisse.

CC 9-8 8 2/ 2GC 5

BAD-ORIGINAL

Tabelle 3

Alter .der bakteriel- L-Asparaglnase L-Asparaglnase Zusatz % CO Kultur les TG (I.E./ml) (l.E./^mS trock. von (Std.) (rag/ml) Zellen) 3,2 m

(1)

O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ίο 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

2.70

7,3

3,84

12,9

7,47

8,61

34,0

40_;0

2,7

3,4

4,6

4,6

Null	0,10
Midi	0,10
KkIl	0,18
KmII	0,55
0.45	' 1,30
1,40	1,35
2,10	0,80
2,20	0,60
2f20	0,55
2,75	0,60
3,50	0,65
3,88	0,60
4,25	0,60
4,80	0,70
5,15	0,85
5,90	1,05
7,40	S35
8,90	1,85
10,40	2,05
12,15	1,95
13,45	1,50
14,00	0,50

.0 09882/2 005

BAD ORIGINAL

Die ausgeprägte Abnahme der Kohlendioxydentwicklung nach 21 Stunden zeigt, daß sich die Bakterienkultur in der Nähe des Endes einer Wachstumsperiode befindet und obgleich nach diesem Stadium noch ein leichtes Weiterwachsen beobachtet wird, findet praktisch keine weitere Steigerung der L-Asparaginasesynthese statt.

Beispiel 4

Die L-Asparaginaseausbeuten von 20 1 Kulturen von Erwinla carotovora (N.C.P.P.B 1O66) - gezüchtet in "Yeatex" mit und ohne Ergänzungszusatz und nach 20 Stunden aufbereitet - wurden bestimmt. Sie sind in der nachfolgenden Tabelle 4 wiedergegeben. Da vom "Yeatex" angegeben wird, daß er bis zu 6,5$ L-Glutaminsäure enthält, ist der tatsächliche Glutaminsäuregehalt der Nährlösung höher als bei gleicher Zugabe aber aminosäurefreiem Nährmedium. In der nachfolgenden Tabelle 4 wird daher eine geschätzte Glutaminsäure-Gesamtkonzentration angegeben.

Tabelle^ _(I#B#>

■ jtf "Yeatex" % zugesetz- korrigier- L-Asparagi- mg trock. L-Asparates Natrium- ter Gluta- nase pronL Zellen ginase glutamat minsäure- Kultur pro ml (I.E.) gehalt pro mg

trock. '- , Zellen

0,45 11,1 3,2 3,5 0,55 16,7 4,0 4,2 0,29 8,2 2,8 2,9

3,5	0,28
4,3	0,34
4,5	kein
	Zusatz

009882/20 0 5

- i8 -

Der L-Asparaginasegehalt und Glutaminsäuregehalt der in 2,5$ "Yeatex" unter Zusatz von O,28$ Natrium-L-glutamatmonohydrat gezüchteten Kultur wurde während des Wachstums zu verschiedenen Zeiten bestimmt. Die erhaltenen Werte sind in der nachfolgenden Tabelle 5 wiedergegeben.

4 Std.

Tabelle	Std.	5	Std.	16	Std.	20 Std.	E.	/ml
8	,8	12	,8	9	,9	11,1 I.	0,	005
5,	, 14#	6	,09$	0	,02*	Spuren
O1	O

L-Asparaginase Glutaminsäure 0,

Wie man diesen Ergebnissen entnimmt, wird die L-Asparaginasebildung durch den Zusatz von L-Glutamat verstärkt, und sie hält weiter an bis das Glutamat verbraucht ist. Es wird ebenfalls deutlich, daß eine beträchtliche, vor dem Wachstum vorhandene, Menge Glutaminsäure während der ersten 4 Stunden verlorengeht, was wahrscheinlich auf eine Zersetzung während der Sterilisation des Kulturmediums zurückzuführen ist.

Beispiel 5 ·

Eine Kultur von Erwinia carotovora (N.C.P.P.B 1066) wurde in kontinuierlicher Kultur in einem Gerät für kontinuierliche Kulturen vom "Portionstyp" gezüchtet, wie es von Herbert, Phipps und Tempest (Laboratory practice I965, 14, II5O-II6I) beschrieben wird. Die mit Rührer versehene Vorrichtung (stirred fermenter) war mit einer automatischen Einrichtung zur Kontrolle von Temperatur und pH-Wert ausgerüstet, die bei 37°C bzw. pH 7*0 gehalten wurden. Als Kultur·

009882/20Q5

medium wurde 5% "Yeatex" allein oder mit Zusatz verschiedener Mengen L-Glutaminsäure verwendet. Die Herstellung des Kulturmediums und der Keimkulturen erfolgte in gleicher Weise wie bei den vorangehenden Beispielen.

Nach Beimpfen des im Gerät enthaltenen Kulturmediums und (anfänglich) chargenweiser Züchtung der Kultur wurde der Zulauf von frischem, sterilem Medium in Gang gesetzt. Die Verdünnungsrate D, d.h. f/v, wobei f die Strömungsgeschwindigkeit (1/Std.) und ν das Kulturvolumen (Liter)

-1

ist, wurde einige Tage lang bei D = 0,3 S.td.. konstantgehalten, bis üieicngewichtsbedingungen erreicht waren, wie durch die Konätanz des Bakterientrockengewichts und des- Gehalts an L-Aisparaginase bei wiederholten Proben festgestellt wurde. Das Kulturmedium wurde dann mit 0,5$ L-Giutaminsäure ergänzt und ein neues Gleichgewicht eingestellt. Weitere Zusätze für Gehalte von \% und 1,5% L-Glutaminsäure wurden vorgenommen und für entsprechende Gleichgewichtseinstellungen gesorgt. Die Ergebnisse (bestimmt wurden das BakterientroGkeiigewicht und der L-Asparaginasegehalt) für die jeweiligen Gleichgewichtszustände sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt.

	Kulturmedium	5*	L-GIu-	Tabelle	6.	6	L-Asparaginase (ΐ.Έ,/ml)-. I.	BAD	E	./mg
Zufließendes			L-GIu-	Bakterien-TG (mgy-'m!)	3	24		9	,2
'5% "Yeatex"	+ O,	5Jf	L-GIu-		,0	48	8	,7
5# "Yeatex" tarainsäure	+ 1,		00 9 8	5,	,7	62	7	,8
% "Yeatex" taminsäure	+ ■■ 1,			8,	5	80	8
556 "Yeatex" taminsäure			- 9,
		8 2 / 2 0 C			QRlQJNAi-

Beispiel 6

Chargenweise Kulturen von Erwinla oarotovora (N.C.P.P.B 1066) wurden In einem "Yeatex"-Medium mit bzw* ohne Zugabe von ergänzender Aminosäure gezüchtet. Die resultierenden Asparaginaseausbeuten sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.

Tabelle 7 Kulturmedium Asparaglnaseausbeute (I.E./mi)

"Yeatex" 6,7

"Yeatex" + \% Serin 10,7

"Yeatex" + 1% Asparaginsäure 16,1

"Yeatex" + 1# Glutaminsäure 20,2

In den vorangehenden Beispielen wurde ein beim National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, England unter der Nummer N.C.P.P.B 1066 hinterlegten Stamm von Brwinla carotovora verwendet, da diese Spezies eine besonders hohe spezifische Wirksamkeit (d.h. ein besonders hohes Verhältnis von enzymatischer Aktivität bezogen auf mg erzeugtes Protein) liefert* " " *

Andere Bakterien der Gattung Erwlnia, die beim erfindungsgemäßen Verfahren angewandt wurden, sind:

009882/20 05

- 21 -

Erwinia aroideae
Erwinia aroideae
Erwinia atroseptica
Erwinia carotovora
Erwinia carotovora
Erwinia carotovora
Erwinia carotovora
Erwinia carotovora
Erwinia carotovora
Erwinia carotovora
Erwinia carotovora

N.C.P.P.B. N.C.P.P.B. I38O N.C.P.P.B. N.C.P.P.B. 31 N.C.P.P.B.-312 N.C.P.P.B. 392 N.C.P.P.B. ^38 N.C.P.P.B. 468 N.C.P.P.B. N.C.P.P.B. N.C.P.P.B. 70S

Erwinia carotovora N.C.P.P.B.

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. IO65

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 1120

Erwinia carotovora N.C.P.P.B, 128Q

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 1281

Erwinia chrysarathenii N.C.P.P.B. 516

Bakterien anderer Gattungen, die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind:

009882/2005

.J&chcrichiu coli A.T.G.G. 11302

£scherichia coli M.-K.il. 103

L'scherichia coli Moli.3. iSk

^scherichia coli H.CtT.C. 816^

Eschei-ichia coli N.C.T.C. 8196

Eijcherichia coli II.C.C?.C.. 9C01

Serratia marcescer.s II.C.I.B. 1377

Serratia narcescens I«.G.I.3. 4o12

Serratia narcescens NoCI₀B, 8265

Serratia aarcoscens N.C.I.3. 8S89

Serratia marcescens N.C.I.B. 9155

Serratia marceccens M.R„3. UK/8

A.T.G.G.« Acerican Type Culture Collection, "ϋ_β3.Α_β

M.H.2. ^Ä Micrabiological Hesearch Establishment₈ Sallshmrj, Sogland

N.C.I.B.» National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen,

Scotland N.C.P.P.B.⁵= National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, England

N.C.T.C.* National Collection of Type Cultures, U.S.A.

Das erfindungsgemSSe Verfahren wird normalerweise bei Temperaturen zwischen 10 und 4o°C« vorzugsweise bei 25 bis 35°C, und einem pH-Wert awisehen etwa 6 und 8 durchgeführt. Die Bakterien werden Üblicherwelse unter aeroben . Bedingungen gezüchtet, sie können jedoch auch unter geeigneten Umständen unter anaeroben Bedingung©©, gefeildet werden·

009882/2005

BAD ORIGINAL

Die gemäß der Erfindung von Bakterien der Gattung Erwinia erzeugte und wie In der britischen Patentanmeldung No. 40^44/68 beschrieben "extrahierte" und gereinigte L-Asparaginase bildet ein Produkt» das nach der Nomenklatur der International Enzyme Commission als 3,5»1>1-L-Asparagin-amidohydrolase bezeichnet wird, aber in seinen Eigenschaften bedeutend von bislang bekannten L-Asparaglnasen abzuweichen scheint, die sich beispielsweise vom Escheriehia ™ coil ableiten. Die Aminosäurebestimmung bei Proben von L-Asparaginase vom E. Coil (hergestellt durch die Farbenfabriken Bayer AQ.) ergab« verglichen mit Proben» die ausgehend von Erwinia carotovora erhalten wurden, folgende Ergebnisse:

Γ -eh. c. Ii

Την	120
5er	60
.aiu	8k
I ro	hd
GIy	105
Ala	120
VaI	120
GyS	6

i*. c r '

ν. c . r

80 123

93 2

009882/2005 _BAD

Met	Zk
lie	48
Leu	84
Tyr	54
Phe	36
Ly s	8'f
Hie	12
Arg	36
Trp	12

104

27 ·

6?

Ebenso gab die Vergleichsbestimniung der isoelektrischen Punkte (durch isoelektrische Fokussierung) unterschiedliche Werte, und zwar wurde ein Wert von etwa pH 5,2 (für Präparate aus S. Coil) und von etwa pH 8,5 (für Präparate ausgehend von Sr. carotovora) gefunden« Weiter lagen di© Giutaminase-Aktivitäten bei 2 bis 3Jf der Asparaginase-Aktivität (für B. CoIi) und bei 5 bis 7% (für Er. carotovora)« Darüber hinaus sind die beiden Asparaginase!! serologisch deutlieh voneinander verschieden« Mit den jeweiligen Präparaten erhaltene Antisera sprechen nicht, auf die andere Asparaginase an. Der klinische Nutzen« der daraus gezogen werden kann, besteht darin, daß in Fällen, in denen die Behandlung mit einer Asparaginase zur Ausbildung einer Ufoeresnpfindliehkeit (einer allergischen Reaktion) führt, die Behandlung mit der zweiten Asparaginase fortgeführt werden kann. Molekulargewichte der von Brwinla abgeleiteten Asparaginase liegen normalerweise zwischen etwa 130*000 und 150«000»

Die Behandlung von Leukämie und dissemlnierten Karzinom

009882/2005

erfolgt üblicherweise durch Injektion von L-Asparaginase in Form einer physiologischen Lösung, wie physiologischer
Salzlösung, obwohl unter gewissen Umständen orale Verabreichungen möglich sein können. Eine typische Lösung für intravenöse Injektionen enthält 15 mg L-Asparaginase pro ml physiologische Salzlösung. Typische Dosierungen liegen zwischen etwa 0,05 und 5,0 mg pro kg Körpergewicht der Be- | handlungsperson.

009882/2005

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren sur Gewinnimg von L-Asparaginase durch Kultur L-Asparaginase erzeugender Mikroorganismen in eine® geeigneten Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß diesem Medium susätslich eine wirksame Menge von zumindest einer der Aminosäuren Glutaminsäure, Serin, Threonin oder Asparaginsäure zugesetzt wird*

   2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet* daß der kultivierte Mikroorganismus durch Escherichia coli oder Serratia marcescens gebildet wird oder zur Gattung Brwinia gehört.

   5. Verfahren nacfe Anspruch 2* dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus der Gattung Erwinia durch Erwinla carotovora, Brwinia aroideae oder durch Irwinia ahrysantlaeiai' oder atroseptica gebildet wird«

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

   in chargenweiser Kultur gearbeitet und Bakterien der Gattung Brwinia unter Zusatz von zumindest einer der genannten Aminosäuren gezüchtet werden, daß zumindest ein Teil der resultierenden Bakterienzellen zur Freisetzung der ^-Asparaginase zerstört werden, welch letztere isoliert wird.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die gezüchteten Bakterien zu irgendeiner Spezies nach Anepruoh 3 gehören,

   6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5.» dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur insgesamt Bit zumindest Jj mg der genannten AminoBäure pro ml Kultur versetzt wird«

   003882/200S

   7. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur mit 12 bis 20 mg der genannten Aminosäure pro ml Kultur versetzt wird.

   8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7» dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte ergänzende Aminosäure zum Kulturmedium vor Beginn der Kultivierung oder in einem frühen Stadium derselben oder auch kontinuierlich oder in gewissen Abständen über den Kulturablauf verteilt zugegeben wird.

   9. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine kontinuierliche Kultivierung von Bakterien der Gattung Erwinia unter kontinuierlicher Zufuhr eines Kulturmediums, das mit einer wirksamen Menge von zumindest einer der genannten Aminosäuren versetzt 1st und kontinuierliche Abtrennung eines Anteils der Kultur, in dem zumindest ein Teil der Bakterienzellen zur Freigabe der L-Asparaginase zerstört wird, welch letztere isoliert wird.

   10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die gezüchteten Bakterien zu einer der Spezies nach Anspruch gehören.

   11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das kontinuierlich zugelieferte Kulturmedium mit zumindest 3 (Qg der genannten Aminosäure pro ml Medium und insbesondere Ddt 7 bis 20 mg Aminosäure pro ml Medium versetzt wird·

   12. Verfahren nach einem der Ansprüche k bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium Quellen für Stickstoff und Kohlenstoff enthält, wobei der Stickstoff insbesondere in anorganischer Fons zugegeben wird und als Kohlenstoff-

   009882/2005

   quelle Glucose oder Glycerin verwendet wird, vorzugsweise aber als Quellen für Stickstoff und Kohlenstoff, Peptone, Eiweißhydrolysate oder Hefehydrolysate dienen»

   1J5· Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure in Form eines Salzes oder Ester-hydrochlorids zugegeben wird, das innerhalb des Kulturmediums freie Aminosäure freigeben kann und insbesondere als Natrium- oder Kaliumsalz.

   14. Verfahren nach Anspruch 13* dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung eines Aminosäuresalzes, wie des Natriumoder Kaliumsalzes, Phosphorsäure als Puffer zugegeben wird-

   15· Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Isomeren der Aminosäuren verwendet werden.

   16. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 15* dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur zwischen 10 und 40°C und insbesondere zwischen 25 und 35 C gehalten wird.

   17· Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert zwischen etwa 6 und δ gehalten wird.

   18. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 16, gekennzeichnet durch aerobe Bedingungen.

   19· Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis l8 erzeugten L-Asparaginase für pharmazeutische Mittel mit insbesondere antileukämischer Wirkung oder einer Wirksamkeit gegen disseminiertes Karzinom insbesondere in Form einer physiologischen Salzlösung mit einer Konzentration von 10 bis 20 mg Protein pro ml Lösung. 'Q0 9882/200 5