DE2031759B2 - Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von L-Asparaginase und deren Verwendung - Google Patents

Description

Wl

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von L-Asparaginase durch Kultivierung L-Asparaginase erzeugender Mikroorganismen in einem geeigneten Kulturmedium sowie die Verwendung der erhaltenen L-Asparaginase für pharmazeutische Mittel.

Das Enzym L-Asparaginase (3.5.1.1 -L-Asparaginamidohydrolase nach de;· Nomenklatur der International Enzyme Commission) wurde bereits aus zahlreichen tierischen und bakteriellen Kulturen gewonnen (vgl. etwa R. E. Perterson, A. Ciegler, Applied Microbiology, 17 [1969], 929/930). Seine Antitumorwirkung wurde an dem aus Meerschweinchenserum oder Bakterienkulturen von Escherichia coli oder Serratia marcescens oder (vgL die Patentanmeldung P 19 42 833.2) aus Bakterienkulturen der Gattung Erwinia, insbesondere Erwinia carotovora, gewonnenen Enzym nachgewiesen, die normalerweise in komplexen Kulturmedien auftreten, die Nährstoffquellen wie etwa Hefeextrakt oder Peptine enthalten.

L-Asparaginase dieser bakteriellen Herkunft wird zur Zeit für klinische Versuche zur Behandlung gewisser Typen von Leukämie und disseminiertem Karzinom verwendet. Die Nachfrage nach dem Enzym übersteigt jedoch bei weitem die derzeitige Verfügbarkeit, da der Erzeugung dieses Enzyms im technischen Maßstab ausgehend von E. coli und S. marcescens seine niedrige Aktivität in den Kulturen dieser Bakterien und die mit seiner Isolierung verbundenen Schwierigkeiten entgegenstehen.

Auf die Ermittlung der Bedingungen für eine Optimierung der Ausbeute an L-Asparaginase aus verschiedenen Bakterien wurden große Anstrengungen verwandt. So wurde beispielsweise angegeben, daß die Ausbeute an L-Asparaginase aus Escherichia coli dadurch gesteigert werden kann, daß die Bakterien auf einem Kulturmedium wie etwa Getreideeinweichliquor mit hohem Aminosäuregehalt einschließlich einem Gehalt von mindestens freier L-Glutaminsäure, freiem L-Methionin und freier Milchsäure in einer Menge von typischerweise 6,5 mg/ml kultiviert werden (vgl. Roberts et al., J. Bact, 95 [ 1968], 2117-2123). Bakterien der Gattung Erwinia liefern allgemein höhere Ausbeuten an L-Asparaginase als Escherichia coli (vgl. die DE-Patentanmeldung P 19 42 833.2). Es wurde nun festgestellt, daß diese Ausbeute etwa auf das Vierfache (auf 80 IU/ml gegenüber 24 IU/ml nach der Patentanmeldung P 19 42 833.2) gesteigert werden kann, wenn die Bakterien in einem Medium kultiviert werden, das ergänzend mit hohen Konzentrationen von bis zu 30 mg/ml an Glutaminsäure, Threonin, Serin oder Asparaginsäure versetzt ist, ohne daß die Konzentrationen der übrigen Aminosäuren und anderen Nährbestandteile entsprechend gesteigert werden.

Der Erfindung liegt die Feststellung zugrunde, daß die Ausbeute an L-Asparaginase durch Zumischen von zumindest einer der Aminosäuren Asparaginsäure, Threonin, Serin oder Glutaminsäure zu einer Kultur eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium stark erhöht werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase durch Kultivierung eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium ist mithin dadurch gekennzeichnet, daß zu diesem Medium zusätzlich eine wirksame Menge von zumindest 3 mg/ml zumindest einer der Aminosäuren Glutaminsäure, Serin, Threonin oder Asparaginsäure zugegeben wird.

Die L-Asparaginase wird dann durch irgendein geeignetes zeilzerstörendes Verfahren und vorzugsweise nach der im einzelnen in der Patentanmeldung P 19 42 900.6 beschriebenen Methode gewonnen.

Unter der Bezeichnung »wirksame Menge« wird ein

Gehalt des Nährmediums an spezieller Aminosäure verstanden, der ausreicht, eine merkliche Verbesserung der L-Asparaginaseausbeute der Kultur eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus verglichen mit der Ausbeute bei Abwesenheit dieser wirksamen Menge herbeizuführen. Die minimale wirksame Menge hängt jeweils vom gewählten Kulturmedium, den kultivierten Mikroorganismen und den Wachstumsbedingungen sowie davon ab, ob die Kultivierung kontinuierlich oder diskontinuierlich bzw. absatzweise, in tiefen oder ι ο flachen Kulturen usw. durchgeführt wird.

Für absatzweise Kultivierung wurde gefunden, daß typisch verbesserte Enzymausbeuten mit einem L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus erhalten werden, wenn das Kulturmedium während der diskontinuierlichen Kultivierung durch zumindest 3 mg Aminosäure pro ml Kultur und vorzugsweise 12 bis 30 mg/ml ergänzt wird. Diese Ergänzung des Kulturmediums kann in unterschiedlicher Weise erreicht werden. Beispielsweise kann die gesamte ergänzende Aminosäure vor der Kultivierung des L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus oder während einer anfänglichen Kultivierungsstufe zum Nährsubstrat hinzugefügt werden. Alternativ kann eine relativ geringe, aber wirksame Menge Aminosäure kontinuierlich oder in Abständen während einer gewünschten Kultivierungsperiode zugegeben werden, wobei die Zugabegeschwindigkeit so eingerichtet wird, daß sie etwa der Geschwindigkeit des Verbrauchs durch den Mikroorganismus entspricht. Es wurde gefunden, daß letztere Verfahrensweise nor- jo malerweise höhere L-Asparaginaseausbeuten liefert; sie wird daher bevorzugt, obgleich die Durchführung nicht ganz so bequem ist Eine dazwischenliegende Verfahrensweise, bei der die Kultur zu Anfang mit Aminosäure versetzt und später mit weiterer Aminosäure ergänzt r> wird, wenn die Geschwindigkeit der Zunahme der L-Asparaginase abnimmt kann in der Praxis auch von Vorteil sein.

Bei kontinuierlicher oder fortlaufender Aminosäurezugabe zu der absatzweise kultivierten Kultur sollten Zufuhrgeschwindigkeit und Gesamtzufuhr erfindungsgemäß derart eingerichtet werden, daß insgesamt mindestens 3 mg Aminosäure pro ml Kultur und vorzugsweise etwa 12 bis 30 mg/ml zugegeben werden.

Obgleich Gehalte über etwa 30 mg/ml angewandt ·τ> werden können, wird im allgemeinen dadurch kein Vorteil erzielt; es wurde sogar gefunden, daß das Wachstum eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus durch überschüssige Aminosäuregehalte ernstlich gehemmt werden kann. w

Bei kontinuierlicher Kultivierung, bei der Kulturmedium fortlaufend in ein L-Asparaginase erzeugende Mikroorganismen enthaltendes Kulturgefäß eingeführt und L-Asparaginase von der kontinuierlich »geernteten« bzw. abgezogenen Kultur abgetrennt wird, können γ, verbesserte Ausbeuten erreicht werden, wenn ein Kulturmedium kontinuierlich zugeführt wird, das mit zumindest 3 mg Aminosäure pro ml Kulturmedium und vorzugsweise mit etwa 7 bis 20 mg/ml ergänzt wurde. Bei einer solchen kontinuierlichen Kultivierung wird die _w> Aminosäure in dem damit versetzten zugeführten Kulturmedium entsprechend kontinuierlich verbraucht und wieder ersetzt; die jeweilige Konzentration der Aminosäure in unmittelbarer Umgebung der wachsenden Mikroorganismen kann daher ohne schädliche Wirkung zu irgendeinem Stadium des Verfahrens beträchtlich unter die minimal erforderliche Konzentration im zugeführten Kulturmedium sinken.

Einige Kulturmedien, insbesondere komplexe Medien natürlichen Ursprungs wie von Hefeextrakt, können geringe Mengen von einer oder mehreren der angegebenen Aminosäuren enthalten. Von derart zufälligen, mehr oder minder vernachlässigbaren Gehalten herkömmlicher Kulturmedien unterscheidet sich jedoch die Erfindung durch die gezielte, gegebenenfalls ergänzende Zugabe dieser Aminosäuren in wirksamen, d. h. die L-Asparaginaseausbeute beachtlich steigernden. Mengen, die bedeutend höher liegen als die bisher in solchen Medien natürlicherweise vorhandenen Mengen.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die L-Asparaginaseausbeute — ausgedrückt in Internationalen Einheiten pro ml Kultur — zwischen etwa 40 und 600% höher liegen als bei Verfahren, bei denen ein nicht erfindungsgemäß ergänztes Medium unter sonst identischen Bedingungen verwendet wird. Die Steigerung der Ausbeute rührt nicht allein von der Erhöhung der Zahl der Zellen der im ergänzten Kulturmedium gezüchteten Mikroorganismen her, sondern auch von einer Zunahme der pro Zelle erzeugten L-Asparaginasemenge, was bedeutet, daß die Enzymaktivität pro Zelle des Mikroorganismus und damit die vom Bakterium erzielbare Enzymaktivität pro mg Protein (spezifische Aktivität) erhöht ist.

Die angegebenen Aminosäuren können dem Kulturmedium in irgendeiner zweckmäßigen Form zugesetzt werden. Wenn die Löslichkeit der Aminosäure in Wasser gering ist, wird diese häufig mit Vorteil in Form eines Salzes oder Esterhydrochlorids zugegeben, das innerhalb des Substrats die freie Aminosäure in Freiheit setzen kann. Unter diesen Bedingungen können beträchtliche Mengen an Puffersubstanz zur Unterdrükkung freigesetzter Ionen sowie auch zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes im Kulturmedium auf einen für die Kultivierung des L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus geeigneten Wert erforderlich sein. Wenn beispielsweise Natrium- oder Kaliumsalze einer der genannten Aminosäuren verwendet werden, kann Phosphorsäure als Puffer hinzugefügt werden. Die maximale Grenze, bis zu der Aminosäurederivate erhöhte Enzymausbeuten ergeben, wird erreicht, wenn der L-Asparaginase erzeugende Mikroorganismus infolge der erhöhten Pufferkonzentration nicht mehr wachsen kann. So können in Anwesenheit von einigen Puffersubstanzen maximale Ausbeuten bei Zugabe von bedeutend weniger als 3% (G/V) an zum Kulturmedium hinzugefügter Aminosäure erreicht werden.

Zu den L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismen gehören die Bakterien Escherichia coli und Serratia macescens und bei bevorzugten Verfahren gemäß der Erfindung Pflanzenpathogene der Galtung Erwinia wie Erwinia carotovora, Erwinia aroideae, Erwinia atrosepticaund Erwinia chrysanthemi.

Geeignete Kulturmedien enthalten normalerweise eine organische Stickstoffquelle, obgleich chemisch einfach definierte Medien, die Stickstoff in anorganischer Form und Kohlenstoffquellen wie Glucose, Glycerin oder dergleichen enthalten, verwendet werden können. Die Kultivierung der zur Gattung Erwinia gehörenden Bakterien wird üblicherweise in Mischung mit komplexen stickstoffhaltigen Medien initiiert, die Peptone, Eiweißhydrolysate, Hefeautolysate oder dergleichen enthalten; wenn jedoch das Wachstum in Gang gekommen ist, kann das Kulturmedium durch allmähliche Verdünnung mit einem einfachen Medium und Abzug des komplexen Mediums ausgetauscht werden.

bis die Bakterien praktisch im einfachen Medium wachsen. Zu den verfügbaren Medien, die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, gehören Hefeextrakt, Getreideeinweichliquor, Trypton, Erbseneinweichliquor, Fischmehl, Fleischmehl, ■; Casein, Bouillonpulver, Malzextrakt, Sojabohnenmehl und GetreidemehL

Es wird angenommen, daß bestimmte handelsübliche Nährmedien wie beispielsweise einige Hefeextrakte Spuren von einer oder mehreren der gewünschten ι ο Aminosäuren enthalten können, die aber durch die üblichen Sterilisationsverfahren für Nährmedien zerstört oder in der Menge verringert werden. Es kann jedoch sein, daß die Menge an zuzufügender Aminosäure bei Verwendung solcher Medien herabgesetzt werden kann; gemäß der Erfindung besteht ein weiteres Merkmal des Verfahrens darin, daß zumindest ein Teil der wirksamen Menge an Aminosäure durch ein Nährmedium geliefert wird, das merkliche Mengen, d. h. mindestens 0,1 Gew.-%, der gewünschten Aminosäure enthält

Es wurde gefunden, daß die beachtlichen Steigerungen der L-Asparaginaseausbeute beim erfindungsgemäßen Verfahren mit den L-Isomeren der genannten Aminosäuren erhalten werden. Die D- oder DL-Isomeren können jedoch beim erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls verwendet werden, obgleich im allgemeinen die L-Isomeren sowohl billiger als auch bequemer erhältlich sind.

Bei bevorzugten Verfahrensweisen gemäß der Erfindung ist die bevorzugte Aminosäure normalerweise L-Glutaminsäure, die im allgemeinen (wegen ihrer geringen Wasserlöslichkeit) in Form des Natrium- oder Kaliumsalzes in Verbindung mit einem geeigneten Puffermittel wie Phosphorsäure zur Unterdrückung der freigesetzten Natrium- oder Kaliumionen verwendet wird. Wenn beispielsweise das Kulturmedium beim diskontinuierlichen Verfahren ein komplexes Medium ist, liegt der auf das Substrat bezogene optimale Zusatz an Natrium-L-glutamat, wie gefunden wurde, bei etwa 2% (G/V). Obgleich die prozentuale Konzentration an L-Glutaminsäure (Natriumsalz) über etwa 2% erhöht werden könnte, kann dann die ebenfalls notwendige Erhöhung der Phosphorsäurekonzentration anfangen, das bakterielle Wachstum nachteilig zu beeinflussen. Typischerweise kann bei einem absatzweisen Verfahren, bei dem Erwinia carotovora unter Zumischung von Bierhefe-Autolysat gezüchtet wird, eine anfängliche Zugabe von etwa 2% Natrium-L-glutamat zu einer etwa 5fach erhöhten L-Asparaginaseausbeute führen. Der Zusatz von 7 bis 8 kg Natrium-L-glutamat zu 400 I mit Bierhefe-Autolysat versetzten Kulturmedium erhöht, wie gefunden wurde, die L-Asparaginaseausbeute unter normalen Arbeitsbedingungen von 7 Enzymeinheiten/ml auf 40 Erizymeinheiten/ml Kultur.

Bei kontinuierlicher Kultivierung wurde gefunden, daß typischerweise ein mit etwa 1,5% Natrium-L-glutamat versetztes Nährmedium optimale L-Asparaginaseausbeuten liefert. Wenn beispielsweise ein Medium für kontinuierliche Kultur mit etwa 5% Bierhefe-Autolysat bo unter Zusatz von etwa 1,5% Natrium-L-glutamat verwendet wird, kann die Ausbeute an L-Asparaginase 80 ΙΕ/ml (Internationale Einheiten/ml) betragen.

Es folgen typische Beispiele für die Gewinnung von L-Asparaginase gemäß der Erfindung; diese erfindungs- b5 gemäße Erzeugung wird mit gleichen Verfahren ohne Zusatz wirksamer Mengen der genannten Aminosäuren verglichen.

Beispiel 1
Kulturgefäß

Die nachfolgend beschriebenen Versuche wurden in einem sterilisierbaren Kulturgefäß aus rostfreiem Stahl mit einem Heizmantel und Einrichtungen zur Überwachung der Temperatur des Inhalts durchgeführt

Am oberen Ende und am Boden dieses Gefäßes waren Einlaßöffnungen für den Zutritt steriler Luft vorgesehen. Der dicht verschließbare Deckel des Gefäßes hatte Einfüllöffnungen, durch die Antischaummittel, Puffer, Impfmaterial und die Ergänzungszusätze zugeführt werden konnten. Der Behälterinhalt wurde mit einem Rührer aus rostfreiem Stahl umgewälzt, ferner war ein pH-Kontrollgerät vorgesehen. Die pH-Kontrolle konnte auf den erforderlichen pH-Wert eingestellt werden; bei einem Anstieg des pH-Wertes während der Kultivierung konnte 3,2 m Phosphorsäure-Puffer mit Hilfe einer Peristaltikpumpe bei Bedarf eingepumpt werden.

Herstellung der Impfkultur

150 ml gekochte Fleischbouillon nach Robertson wurden mit einer gefriergetrockneten Kultur von Erwinia carotovora (N.CP.P.B 1066) geimpft und über Nacht (17 Stunden lang) bei 37°C inkubiert und bei 4° C gelagert. Roux-Flaschenagarplatten (Kultiiroberfläche 10 cm χ 20 cm; mit 2,4"Vb »Oxoid-Agar Nr. 3« (getrocknetes hydrophiles, kolloidales Polysaccharid aus Algen) verfestigte bzw. eingedickte Nährbouillon von 3% Trypton-Soyaagar-Körnern wurden mit 5 ml Nährkultur geimpft und 12 Stunden lang bei 37°C inkubiert und wiederum für bis zu 4 Wochen bei 4° C gelagert. Unmittelbar vor Gebrauch wurden 4 Roux-Flaschen mit 50 ml destilliertem Wasser in eine Keimflasche ausgespült und der Inhalt mit destilliertem Wasser auf 550 ml aufgefüllt. Der inhalt der Keimflasche wurde zur Beimpfung von 151 eines sterilen Mediums (525 g helles Bierhefe-Autolysat, 3,5%) verwendet, das vor der Sterilisierung auf pH 6,8 bis 7,0 gebracht und vor der Verwendung auf 37° C vorgewärmt worden war. Die Inkubation erfolgte bei 37°C über 12 Stunden in einem Wasserbad unter Belüftung mit 12 l/min durch ein Einleitungsrohr von 0,64 mm lichter Weite und führte zu einer Impfkultur in einer für die Zugabe zu sterilen Kulturmedien in Kulturgefäßen geeigneten Form.

Herstellung des Kulturmediums

Das Kulturmedium wurde in folgender Weise hergestellt: 16,3 kg Bierhefe-Autolysat wurden in 50 1 heißem Leitungswasser gelöst, gerührt und in in einem sterilen Kulturgefäß enthaltenes Leitungswasser überführt, wobei auf 369 1 aufgefüllt wurde. Zur Einstellung des pH-Wertes auf 6,8 bis 7 wurde Sodalösung (0,5 1; 10 n) gegeben. Das Medium wurde unmittelbar darauf durch 30 Minuten langes Rühren bei i21°C sterilisiert, wobei die Temperatur mit Hilfe eines Dampfmantels oder durch Einblasen von Dampf kontrolliert wurde. Das Medium wurde dann abgekühlt wobei der Druck im Gefäß durch Einlaß von steriler Luft über Atmosphärendruck gehalten wurde. Nach Einstellung der Temperatur auf 37°C und des pH-Werts auf 6,8 bis 7,0 wurde eine Antischaummittelzufuhr angeschlossen. Das Antischaummittel bestand aus einer 25vol.-%igen wäßrigen Silikonemulsion, die unter Druck gesetzt und aseptisch über den Deckel des KnlfnropfäRpc viitTpfnhrt

wurde. Der Druck im Kulturgefäß wurde dann abgelassen, worauf dem Medium durch das Einlaßrohr am Boden des Kuliurgefäßes 10 l/min sterile Luft zugeführt wurden. Das Medium wurde mit einem Flügelrührer mit einer Geschwindigkeit von 385 U/iiiin ^r> umgewälzt.

Erzeugung von L-Asparaginase

15 I Impfflüssigkeit wurden dann durch den Einlaß im Gefäßdeckel in das Kulturgefäß eingebracht. Die pH-Kontrolle wurde auf einen pH-Wert von 6,8 bis 7 und die Temperaturregelung auf 37°C eingestellt. Der Ablauf des Verfahrens wurde durch Messung der Geschwindigkeit der Kohlendioxidentwicklung und mit Hilfe von Enzymtests verfolgt.

Die Ergebnisse der Tests des Enzymgehaltes zeigen, daß die Enzymausbeute (gemessen in ΙΕ/ml Kultur) nach etwa 8 Stunden in diesem nicht ergänzten Medium konstant bleibt. Bei Erreichen dieses Stadiums wurden pH- und Temperaturregelung abgeschaltet und die Luftzufuhr zum sterilen Abschluß an das obere Ende des Kulturgefäßes verlegt. Es wurde weiter gerührt und die Kultur in etwa einer Stunde durch Umlauf von kaltem Wasser durch den Doppelmantel auf 20°C abgekühlt. Die Kultur wurde dann zentrifugiert und der zellhaltige Bodensatz in einen Mixer überführt. Ein Puffer aus 1OmM Tris-HCI, 3OmM Natriumchlorid und ImM Äthylendiamintetraessigsäure von pH 7,0 und 2⁰C wurde mit dem Zellschlamm in einer M^nge von 1 I Puffer je 1 kg Zellschlamm vermischt. Aus der resultierenden gepufferten Mischung wurde die L-Asparaginase dann nach dem in der Patentanmeldung P 19 42 900.6 angegebenen Verfahren isoliert. Im Prinzip umfaßt dieses Verfahren die Lyse der Zellen mit starkem Alkali, Zentrifugieren und eine Salzfällung in der überstehenden Flüssigkeit zur Isolierung des Enzyms.

Die Ergebnisse für 7 Kulturen sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Gewonnene Menge	Zellschlamm	H3PO4	Zellcreme	L-Asparaginaseaktivitiit	Creme	Trockengew.	Gesamt-
		(D		(Mega-Einheiten)	3,50		Trockengewicht
(1)	(kg)	(D	Kultur	3,05	(g/l)	(kg)
375	3,91	6,81	3,42	3,92	2,80	1,05
355	3,52	6,18	2,80	3,46	2,72	0,97
375	4,45	7,76	4,08	1,79	2,90	1,09
390	4,34	7,56	2,70	3,32	2,95	1,15
380	3,09	5,55	1,54	3,85	2,10	0,80
390	4,14	7,21	3,10	3,98	3,0	1,17
380	4,08	7,21	3,05	3,52	2,9	1,10
355	4,22	7,43	3,00	4,29	3,14	1,14
360	4,11	7,13	3,19		2,96	1,07
375	4,20	7,40	3,75	CO2*) max.	2,37	0,89
Tabelle 1 (Fortsetzung)			(%>
Gewonnene Menge	Antischaummittel	(g/I) Stickstoffgehalt
(1)	(D	in Medium	in der übersteh. R.

375	2,4	auf das Trockengewicht (TG)	TGs ausmacht	0,2	1,6	2,30	1,90
355	1,65	bezogen auf Protein unter der Annahme,	0,93	1,5	2,01	1,74
375	2,4	70% des	0,50	1,6	2,21	1,96
390	2,4	0,55	1,6	2,09	1,89
380	1,08	1,25	1,5	2,21	1,93
390	2,34	0,15	2,0	2,13	1,85
380	2,50	0,15	2,25	2,21	1,93
355	2,40	0,36	2,3	2,55	2,04
360	2,40	0,80	1,7	2,46	2,02
375	2,45	0,200	2,3	2,42	2,07
Mittlere	Enzym-Aktivitäten
In der Kultur		- 8,2 IE/ml
bezogen		- 2,9 IE/mg	trockene Zellen
daß das Protein
	- 4,1 IE/mg	Protein

*) Peak-Ablesung am COi-Analysator im abgehenden Luftstrom. 030120/29

Wie man sieht, wird eine mittlere L-Asparaginase-Aktivität von 8,2 IE pro ml Kultur oder von 2,9 I E/mg der trockenen Zellen erhalten. Nimmt man an, daß 70% des Gewichts der trockenen Zellen durch Protein gebildet werden, so liegt die mittlere L-Asparaginase-Aktivität bei 4.1 ΙΕ/mg Protein.

Beispiel 2

7 Kulturchargen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet, jedoch unter Zugabe von 6,5 bis 8 kg Natrium-L-glutamat-monohydrat, das als Lösung in 40 I Wasser zum Kulturmedium vor dem Auffüllen auf 369 I

10

hinzugegeben wurde.

In dem so ergänzten Medium wurden zwei Hauptwachstumsphasen beobachtet, von denen die erste, einem Wachstum in 4,5% Bierhefe-Autolysat entsprechende nach 5 bis 6 Stunden und die zweite nach etwa 18 bis 22 Stunden einen Peak bei der Kohlendioxidentwicklungsgeschwindigkeit ergab. Nach Abfall der Kohlendioxidentwicklung hinter dem zweiten Peak nach 20 bis 25 Stunden Wachstum wurde die Kultur in der gleichen Weise aufbereitet, wie bereits für das nicht ergänzte Medium beschrieben wurde.

Die Ergebnisse für diese 7 Kulturen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Gewonnene
Menge

Zellschlamm Zellcreme

(kg)

(I)

L-Asparaginase-Aktivität Einheiten (Mega-Einheiten)

Kultur pro mg

Kultur Creme pro ml trock.

Zellen

Trocken	Gesamt-
gewicht	Trocken
	gewicht
(g/l)	(kg)
9,04	3,62
8,61	3,31
8,46	3,55
8,34	3,34
7,95	3,23
8,49	3,40
8,12	3,25

400
385
420
400
406
400
400

10,21	18,9	16,6	13,9	41,4	4,6
10,26	18,3	15,4	13,4	40,0	4,7
11,08	21,7	16,8	11,7	40,0	4,7
11,58	19,6	16,4	13,7	41,1	5,0
11,91	21,4	20,5	18,4	50,6	6,4
12,06	20,1	18,7	16,1	46,8	5,5
11,40	19,6	20,8	15,8	51,9	6,4

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Gewonnene
Menge

H₁PO₄

(D

Antischaummittel

(I)

Alter bei der Stickstoffgehalt (g/l)

Gewinnung

(h)

im Medium in der übersteh.
Flüssigkeit

Gebrauchtes	End-Glutamin
Na-L-glut-	Säuregehalt
amat-mono-
hydrat
(kg)	(mg/1)
8,00	40
6,50	40
7,00	20
7.00	40

400 17,35 0,25 25 4,42 4,39

385 14,00 0,38 21 3,79 2,78

420 13,15 0,35 24 3,81 3,82

400 11,75 0,38 23 3,89 3,93

406 14,60 0,70 20 3,75 3,67

400 14,25 0,55 22,5 4,00 3,92

400 14,15 1,68 ' 21 3,90 3,68

Mittlere Enzym-Aktivitäten

In der Kultur - 44,5 IE/ml

bezogen auf Trockengewicht (TG) - 5,3 ΙΕ/mg trockene Zellen

bezogen auf Protein unter der Annahme, daß das Protein

70% des TGs ausmacht - 7,6 ΙΕ/mg Protein

7,25
7,25
7,25

Wie man sieht, liegt die mittlere L-Asparaginase-Aktivität bei 44,5 ΙΕ/ml Kultur oder 53 IE pro mg trockene Zellen. Wenn man wiederum annimmt, daß der Proteingehalt 70% des Trockengewichtes ausmacht, so liegt die mittlere L-Asparaginase-Aktivität bei 7,6 I E/mg Protein.

Die Ausbeute pro ml Kultur wird also durch die Erfindung um einen Faktor von mehr als 5 verbessert.

Beispiel 3

Eine Kultur von Erwinia carotovora (N.GP.P.B. 1066) wurde in 4,5% Bierhefe-Autolysat mit Zusatz von 6,5 kg Natrium-L-glutamat-monohydrat wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet Enzymtests während des Wzchstums ergaben die in der nachfolgenden Tabelle 3 zusammengefaßten Ergebnisse.

	11	2031	759	Zusatz von 3,2 m	12	% CO2 im
				H1PO4		Kulturabgas
Tabelle 3	Bakterien-
Aller der	Trocken	L-Asparaginase	L-As
Kultur	gewicht		paragi
			nase	(I)
			(IE/mg	Null	0,10
	(mg/ml)		trock.	Null	0,10
<h)		(IE/ml)	Zellen)	Null	0,18
O				Null	0,55
1				0,45	1,30
2				1,40	1,35
3				2,10	0,80
4				2,20	0,60
5	2,70			2,20	0,55
6		7,3	2,7	2,75	0,60
7				3,50	0,65
8				3,88	0,60
9				4,25	0,60
10				4,80	0,70
11	3,84			5,15	0,85
12		12,9	3,4	5,90	1,05
13				7,40	1,35
14				8,90	1,85
15				10,40	2,05
16				12,15	1,95
17	7,47			13,45	1,50
18		34,0	4,6	14,00	0,50
19
20	8,61
21	40,0	4,6

Die ausgeprägte Abnahme der Kohlendioxidentwicklung nach 21 Stunden zeigt, daß sich die Bakterienkultur in der Nähe des Endes einer Wachstumsperiode befindet: obgleich nach diesem Stadium noch ein

leichtes Weiterwachsen beobachtet wird, findet praktisch keine weitere Steigerung der L-Asparaginasesynthese statt.

Beispiel 4

Die L-Asparaginaseausbeuten von 201 Kulturen von Erwinia carotovora (N.CP.P.B. 1066) — gezüchtet in Bierhefe-Autolysat mit und ohne Ergänzungszusatz und nach 20 Stunden aufbereitet — wurden bestimmt Sie sind in der nachfolgenden Tabelle 4 wiedergegeben. Da das eingesetzte Bierhefe-Autolysat nach Angabe bis zu

6,5% L-Glutaminsäure enthält, ist der tatsächliche Glutaminsäuregehalt der Nährlösung höher als bei einem aminosäurefreien Nährmedium. In der nachfolgenden Tabelle 4 wird daher eine geschätzte Glutaminsäure-Gesamtkonzentration angegeben.

Tabelle 4	Zugesetztes Natriumglutamat (%)	Korrigierter Glutaminsäure gehalt	L-Asparaginase pro ml Kultur (IE)	mg track. Zellen pro ml (IE)	L-Asparaginase (IE) pro mg trock. Zeller
Zugesetztes Bier hefe-Autolysat (%)	0,28 0,34 kein Zusatz	0,45 0,55 0,29	11,1 16,7 8,2	3,2 4,0 2,8	3,5 4,2 2.9
3,5 4,3 4,5

Der L-Asparaginasegehalt und Glutaminsäuregehalt der in 3,5% Bierhefe-Autolysat unter Zusatz von 0.28% Natrium-L-glutamat-monohydrai gezüchteten Kultur

wurde während des Wachstums zu verschiedenen Zeiten bestimmt. Die erhaltenen Werte sind in der nachfolgenden Tabelle 5 wiedergegeben.

Tabelle 5

4h

8h 12h

16h

20 h

L-Asparaginase (IE/ml)
Glutaminsäure (%)

0,15

5,8	6,8	9,9	11,1
0,14	0,09	0,02	Spuren
			»0,005

.Wie man diesen Ergebnissen entnimmt, wird die L-Asparaginasebildung durch den Zusatz von L-Glutamat verstärkt und hält weiter an, bis das Glutamat verbraucht ist. Es wird ebenfalls deutlich, daß eine beträchtliche, vor dem Wachstum vorhandene Menge Glutaminsäure während der ersten 4 Stunden verlorengeht, was wahrscheinlich auf eine Zersetzung während der Sterilisation des Kulturmediums zurückzuführen ist.

Beispiel

Eine Kultur von Erwinia carotovora (N.C.P.P.B. 1066) wurde in kontinuierlicher Kultur in einem Gerät für kontinuierliche Kulturen vom »Portionstyp« gezüchtet, wie es von Herbert, Phipps und Tempest (Laboratory practice, 1965, 14, 1150—1161) beschrieben wurde. Die mit Rührer versehene Vorrichtung (Rührfermenter) war mit einer automatischen Einrichtung zur Kontrolle von Temperatur und pH-Wert ausgerüstet, die bei 37°C bzw. pH 7,0 gehalten wurden. Als Kulturmedium wurde 5% Bierhefe-Autolysat allein oder mit Zusatz verschiedener Mengen L-Glutaminsäure verwendet. Die Herstellung des Kulturmediums und der Impfkulturen erfolgte in gleicher Weise wie bei den vorangehenden Beispielen.

Nach Beimpfen des im Gerät enthaltenen Kulturmediums und anfänglich absatzweiser Züchtung der Kultur wurde der Zulauf von frischem, sterilem Medium in Gang gesetzt. Die Verdünnungsrate D, d. h. f/v, wobei f die Strömungsgeschwindigkeit (l/h) und ν das Kulturvolumen (1) ist, wurde einige Tage lang bei D= 0,3 h-' konstantgehalten, bis Gleichgewichtsbedingungen erreicht waren, wie durch die Konstanz des Bakterientrokkengewichts und des Gehalts an L-Asparaginase bei wiederholten Proben festgestellt wurde. Das Kulturmedium wurde dann mit 0,5% L-GIutaminsäure ergänzt und ein neues Gleichgewicht eingestellt. Weitere Zusätze für Gehalte von 1% und 1,5% L-Glutaminsäure wurden vorgenommen und für entsprechende Gleichgewichtseinstellungen gesorgt Die Ergebnisse (bestimmt wurden das Bakterientrockengewicht und der L-Asparaginasegehalt) für die jeweiligen Gleichgewichtszustände sind in der nachfolgenden Tabelle 6 zusammengefaßt.

Tabelle 6

Zufließendes Kulturmedium	Bakterien-	L-Asparaginase	IE/mg
	Trockengewicht
	(mg/ml)	(IE/ml)
5% Bierhefe-Autolysat	2,6	24	9,2
5% Bierhefe-Autolysat	5,5	48	8,7
+ 0,5% L-Glutaminsäure
5% Bierhefe-Autolysat	8,0	62	7,8
+1,0% L-Glutaminsäure
5% Bierhefe-Autolysat	9,7	80	8,3
+1,5% L-Glutaminsäure

Beispiel 6

Absatzweise Kulturen von Erwinia carotovora (N.GP.P.B. 1066) wurden in einem Bierhefe-Autolysat enthaltenden Medium mit bzw. ohne Zugabe von ergänzender Aminosäure kultiviert. Die resultierenden Asparaginaseausbeuten sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.

Tabelle 7	Asparaginaseausbeute (IE/ml)
Kulturmedium	6,7
5% Bierhefe-Autolysat	10,7
5% Bierhefe-Autolysat
+ 1% Serin	16,1
5% Bierhefe
+ 1% Asparaginsäure	20,2
5% Bierhefe-Autolysat
+ 1% Glutaminsäure

In den vorangehenden Beispielen wurde ein bei der π National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, England, unter der Nummer N.C.P.P.B. 1066 hinterlegter Stamm von Erwinia carotovora verwendet, da diese Spezies eine besonders hohe spezifische Wirksamkeit (d. h. ein besonders hohes Verhältnis von enzymatischer >n Aktivität bezogen auf mg erzeugtes Protein) liefert.

Andere Bakterien der Gattung Erwinia, die beim erfindungsgemäßen Verfahren angewandt wurden, sind:

Erwinia aroidea N.C.P.P.B. 1274

Erwinia aroidea N.C.P.P.B. 1380 -'

Erv.iniaatroseptica N.C.P.P.B. 549

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 31

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 312

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 392

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 438 "'

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 468

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 491

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 569

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 708

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 898 '"'

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 1065

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 1120

Erwinia carotovora N.C.P.P.B. 1280

Erwinia carolovora N.C.P.P.B. 1281

Erwinia chrysanthcmi N.C.P.P.B. 516 ■ "'

Bakterien anderer Gattungen, die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind:

Escherichia coli A.T.C.C. 11303

Escherichia coli M.R.E. 163 ''

Escherichia coli M.R.E. 164

Escherichia coli N.C.T.C. 8164

Escherichia coli N.C.T.C. 8196

Escherichia coli N.C.T.C. 9001

Serratia marcesccns N.C.I.B. 1377 '"

Serratia marcesccns N.C.I.B. 4612

Serratia marcescens N.C.I.B. 8266

Serratia marcescens N.C.l.B. 8889

Serratia marcescens N.C.l.B. 9155

Serratia marcescens M.R.E. UK/8 "'"'

A.T.C.C. ■■= American Type Culture Colleclion. USA. M.R.K. = Microbiological Research Establishment.

Salisbury. England,
N.C.l.B. = National Collection of Industrial Bacteria. _hl,

Aberdeen, Scot la,id. N.C.IMUl. = National Collection of Plant Paiho^nii

Bacteria, üngiand.
N.C.T.C . = National Collection of Tvpe Cultiirw

USA.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird normalerweise bei Temperaturen zwischen 10 und 40 C, vorzugsweise bei 25 bis 35" C, und einem pH-Wert zwischen etwa 6 und 8 durchgeführt Die Bakterien werdei üblicherweise unter aeroben Bedingungen gezüchtet, sii können jedoch auch unter geeigneten Umständen urne anaeroben Bedingungen gebildet werden.

Die gemäß der Erfindung von Bakterien der Gattunj Erwinia erzeugte und wie in der Patentanmeldung P 19 42 900.1 beschrieben gewonnene und gereinigtf L-Asparaginase bildet ein Produkt, das nach dei Nomenklatur der Internationa] Enzyme Commission al; 3.5.1.1-L-Asparagin-amidohydrolase bezeichnet wird aber in seinen Eigenschaften bedeutend von bislang bekannten L-Asparaginasen abzuweichen scheint, die sich beispielsweise von Escherichia coli ableiten. Di« Aminosäurebestimmung bei Proben von L-Asparagina se von E. coli ergab im Vergleich mit Proben, dit ausgehend von Erwinia carotovora erhalten wurden folgende Ergebnisse:

Aminosäure	Escherichia coli	Erwinia carolovora
Asp	180	131
Thr	!20	89
Ser	60	64
GIu	84	80
Pro	48	49
GIy	108	123
AIa	120	105
VaI	120	98
Cys	6	2
Met	24	33
lic	48	61
Leu	84	104
Tyr	54	48
Phe	36	27
Lys	84	67
Nis	12	25
Arg	36	68
Trp	12	0

Ebenso gab die vergleichende Bestimmung der isoelektrischen Punkte durch isoelektrische Fokussierung unterschiedliche Werte, und zwar wurde ein Wen von etwa pH 5.2 für Präparate aus E. coli und von etwa pH 8,5 für Präparate ausgehend von Er. carotovora gefunden. Weiter lagen die Glutaminase-Aktivitäten bei 2 bis 3% der Asparaginase-Aktivität für E. coli und bei 5 bis 7% für Er. carotovora. Darüber hinaus sind die beiden Asparaginasen serologisch deutlich vOneinandcr verschieden. Mit den jeweiligen Präparaten erhaltene Antisera sprechen nicht auf die andere Asparaginase an. Der klinische Nutzen, der daraus gezogen werden kann, besteht darin, daß in Fällen, in denen die Behandlung mit einer Asparaginase zur Ausbildung einer Überempfindlichkeit (allergische Reaktion) führt, die Behandlung mit der zweiten Asparaginase fortgeführt werden kann. Die Molekulargewichte der von Erwinia abgeleiteten Asparaginase liegen normalerweise zwischen etwa 130 000 und 150 000.

Die Behandlung von Leukämie und disseminierten Karzinomen erfolgt üblicherweise durch Injektion von !.-Asparaginase in Form einer physiologischen Lösung wie physiologischer Salzlösung, obwohl unter gewissen Umständen orale Verabreichungen möglich sein können. Eine typische Lösung für intravenöse Injektionen enthält 15 mg L-Asparaginase pro ml physiologischer Salzlösung. Typische Dosierungen liegen zwischen et« a 0,05 und 5.0 mg pro kg Körpergewicht der behandelten Person.

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Claims (9)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase durch Kultivierung L-Asparaginase erzeugender Mikroorganismen der Gattung Erwinia in einem geeigneten Nährmedium und Zerstörung zumindest eines Teils der resultierenden Bakterienzellen zur Freisetzung der L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß diesem Medium zusätzlich ι ο eine wirksame Menge von zumindest 3 mg/ml zumindest einer der Aminosäuren Glutaminsäure, Serin, Threonin oder Asparaginsäure zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus der Gattung Erwinia Erwinia carotovora oder Erwinia aroidea ist

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung diskontinuierlich durchgeführt und das Kulturmedium mit 12 bis M 30 mg Aminosäure pro ml Kulturmedium versetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte Aminosäuremenge dem Kulturmedium vor Beginn der 2> Kultivierung oder in einem frühen Kultivierungsstadium oder auch kontinuierlich oder in gewissen Abständen während der Kultivierung zugegeben wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, jo dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung kontinuierlich durchgeführt und das Kulturmedium mit 7 bis 20 mg Aminosäure pro ml Kulturmedium versetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, i> dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure in Form eines Salzes oder Ester-hydrochlorids zugegeben wird, das innerhalb des Kulturmediums freie Aminosäure freisetzen kann, insbesondere als Natrium-oder Kaliumsalz. 4<>

7. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung eines Aminosäuresalzes wie des Natrium- oder Kaliumsalzes Phosphorsäure als Puffer zugegeben wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, v> dadurch gekennzeichnet, daß die L-Isomeren der Aminosäuren verwendet werden.

9. Verwendung der nach einem der vorhergehenden Ansprüche erzeugten L-Asparaginase für pharmazeutische Mittel mit insbesondere antileukä- ^r>o mischer Wirkung oder einer Wirksamkeit gegen disseminierte Karzinome, insbesondere in Form einer physiologischen Salzlösung mit einer Konzentration von 10 bis 20 mg Protein pro ml Lösung.

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