DE3126657A1 - Mikrokapseln fuer eine immunantwort - Google Patents

Description

Mikrokapseln für eine Immunantwort

Die Erfindung betrifft ein Mikrokapsel-Reagenz, das für eine Immunantwort. geeignet ist, insbesondere ein Mikrokapsel-Reagenz, das sich für eine Antigen-Antikörper-Reaktion eignet, eine hohe Empfindlichkeit aufweist, stabil ist und nur unter Schwierigkeiten eine nicht-spezifische Agglutination verursacht.

Um eine Antigen-Antikörper-Reaktion mit hoher Empfindlichkeit in einfacher Weise zu erleichtern, wird eine immunologische Agglutinationsmethode angewandt, bei der ein Antigen oder Antikörper auf einen in Wasser unlöslichen Träger (Carrier) aufgebracht ist, der die auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion beruhende Agglutination verursacht, die mit dem bloßen Auge zu beobachten ist.

Rote Blutkörperchen von Tieren wie Hühnern, Alligatoren, Schafen etc. werden als Carrier für die Antigene oder Antikörper verwendet, und bei Verwendung dieser Carrier wird im allgemeinen die passive Hämagglutination (PHA) angewandt, da dieses Verfahren bei einfacher Arbeitsweise hohe Empfindlichkeit ergibt. Seit kurzem wird eine Methode zur sehr wirksamen halbqualitativen Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Antigerien oder Antikörpern in einfacher Weise durchgeführt, die als Mikrotiter-System bezeichnet wird. Das Mikrotiter-System weist jedoch Nachteile auf; z.B. sind infolge der Verwendung von Trägern tierischen Ursprungs die als Carrier wirkenden roten Blutkörperchen als solche antigenbildend und verursachen eine spezifische Agglutination, so daß die gewünschte Antigen-Antikörper-Reaktion nachteilig beeinflußt wird; ferner ist der Wirkungsgrad nicht einheitlich, da die Unterschiede zwischen den Objekten sich im Laufe der Zeit ändern, und die Kosten sind hoch.

Eine Latex-Agglutinationsmethode, bei der ein Polystyrollatex als Carrier verwendet wird, ist ebenfalls zum prak-

I L· U U

-A-

tischen Einsatz gekommen. Während durch diese Methode die _: bei der Verwendung von Carriern tierischen Ursprungs auftretenden Nachteile ausgeschaltet werden, weist auch diese Methode Nachteile auf; z.B. ist nicht nur die Empfindlichkeit im Vergleich zur passiven Hämagglutinationsmethode schlecht, sondern auch die Lagerfähigkeit über längere Zeiträume ist wegen einer schwachen Bindung mit einem Antigen oder Antikörper schlecht. Weiterhin pflegt auch eine natürliche Agglutination.- die nicht auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion beruht - stattzufinden, etc.

In der US-Patentanmeldung, Serial No. 110 318, vom 8.. Januar 1980 wird eine Methode zum Nachweis eines Antigens oder Antikörpers aufgrund einer Antigen-Antikörper-Agglutinatiön vorgeschlagen, bei der Mikrokapseln verwendet werden, die an ihren Wandoberflachen gebunden ein Antigen oder einen Antikörper aufweisen. Weiterhin wurden zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit solcher Mikrokapseln ' Mikrokapsel-Reagenzien vorgeschlagen, in denen spezifische Wandmaterialien wie Polyharnstoff, Polyurethane etc.

verwendet werden. Durch die Verwendung derartiger Mikrokapsel-Reagenzien ist tatsächlich eine verbesserte Nachweisempfindlichkeit erzielt worden, jedoch sind derartige Systeme im Hinblick auf eine Lagerfähigkeit über längere Zeiträume hinweg nicht zufriedenstellend.

Nunmehr wurde gefunden, daß bei Verwendung solcher Mikro- \ kapseln, in deren Wandoberfläche bei der Herstellung eine oder mehrere funktioneile Gruppen eingeführt wurden, ein Antigen oder Antikörper an die Mikrokapseln mit Hilfe eines vernetzenden Mittels gebunden werden kann, dessen eine Gruppe chemisch an das Antigen oder den Antikörper und dessen andere Gruppe an die Wandung der Mikrokapsel gebunden ist. Daraus ergibt sich, daß das Antigen oder der Antikörper durch eine chemische Reaktion fest an die Mikrokapseln gebunden wird, so daß ein Reagenz mit ausgezeichneter Lagerfähigkeit über einen langen Zeitraum er-

halten wird. Das auf diese Weise gewonnene Mikrokapsel-Reagenz ist hochgradig stabil, insbesondere auch dahingehend, daß es eine Gefriertrocknung übersteht, wie sie üblicherweise zur Anwendung gelangt, wenn die Lagerung für längere Zeit erfolgen soll.

Der Begriff "Mikrokapsel" bezieht sich auf eine Mikrokapsel, die aus einem Wandmaterial besteht,in das eine ölige Substanz als Kern eingekapselt ist. Der Begriff "funktioneile Gruppe" bezieht sich auf eine Gruppe, die eine Stel-Ie besitzt, an der ein Antigen oder Antikörper mittels eines vernetzenden Mittels gebunden werden kann.

In den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zählen zu den funktioneilen Gruppen, die in die Wandoberfläche einer Mikrokapsel eingeführt und chemisch -] 5 an diese gebunden werden, die Amino-Gruppe, Carboxyl-Gruppe, Hydroxy-Gruppe, Mercapto-Gruppe etc.

Die Einführung funktioneller Gruppen in die Wandoberfläche der Mikrokapsel gemäß der vorliegenden Erfindung kann entweder in der Weise durchgeführt werden, daß funktionel-Ie Gruppen enthaltende Verbindungen als die Wand der Mikrokapsel bildende Substanzen eingesetzt werden, oder aber in der Weise, daß nach Herstellung einer Mikrokapsel deren Oberfläche einer chemischen Behandlung unterworfen wird.

Die chemischen Behandlungsverfahren umfassen (1) ein Verfahren, zur Umwandlung einer die Wandsubstanz bildenden Vorstufe in eine Substanz, die die gewünschten funktionellen Gruppen besitzt, vermittels einer chemischen Reaktion, (2) ein Verfahren zur Reaktion einer funktioneile Gruppen besitzenden Verbindung mit der Wandoberfläche der Mikrokapsel und (3) ein Verfahren, bei dem eine funktioneile Gruppen enthaltende Verbindung unter Verwendung eines polyfunktionellen vernetzenden Mittels an die Wandoberfläche einer Mikrokapsel gebunden wird.

Als Wandsubstanzen für die Mikrokapseln gemäß der vorliegenden Erfindung können beliebige Verbindungen ohne besondere Einschränkungen.verwendet werden, sofern sie zur Knüpfung einer chemischen Bindung mit einem Antigen oder Antikörper, ohne das Antigen oder den Antikörper zu inaktivieren, sowie zur Verkapselung befähigt sind.

Der hierin verwendete Begriff "Wandsubstanz" bezieht sich auf irgendeine Wandsubstanz, die nach dem Stand der Mikrokapsel-Technologie allgemein üblich ist, wie aus den US-PSen 4 087 376, 4 089 802 und 4 100 103 und der GB-PS 53 170 zu entnehmen ist.

Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Mikrokapseln, die funktionelle Gruppen an ihrer Wandoberfläche enthalten, können durch Reaktion einer polyfunktionellen Verbindung (Wandmaterial·) wie eines polyfunktionellen Isocyanats, eines polyfunktionellen Isothiocyanate, eines polyfunktionellen Säurechlorids, einer polyfunktionellen Epoxy-Verbindung etc. mit einer Substanz hergestellt werden, die die gewünschten funktionellen Gruppen besitzt, wobei dann eine Wand gebildet wird.

Amino-Gruppen enthaltende Substanzen, die für die Herstellung von Mikrokapseln'eingesetzt werden, sind solche Verbindungen, die mindestens zwei Amino-Gruppen in einem Molekül enthalten und somit etwa 20 bis 60 Molprozent, bezogen .auf die gleiche Basis, enthalten. Zu den typischen Beispielen für solche Amino-Gruppen enthaltenden Substanzen zählen polyfunktionelle Amino-Verbindungen (z.B. Ethylendiamin, Hexamethylendiamin, cyclische Amine wie Epomat (Handelsbezeichnung, hergestellt von Ajinomoto Co., Ltd., Amin -Härter) etc., Aminosäuren (Arginin, Lysin, Cystein etc.), etc.-.

Carboxyl- bzw. Hydroxy-Gruppen enthaltende Verbindungen, die zur Herstellung von Carboxyl- bzw. Hydroxy-Gruppen enthaltenden Mikrokapseln eingesetzt werden, sind solche, die mindestens zwei Carboxy1-Gruppen, mindestens zwei Hydroxy-Gruppen oder mindestens eine Carboxyl-und eine Hydroxy-Gruppe enthalten. Das Verhältnis solcher Carboxyl- bzw.

Hydroxy-Gruppen beträgt etwa 20 bis 100 Molprozent, bezogen auf das gesamte Monomere.

Zu den typischen Beispielen für Carboxyl-Gruppen enthaltende Substanzen zählen Carboxymethylcellulose, PoIyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polystyrolcarbonsäure etc.

Ein repräsentatives Beispiel für eine Hydroxy-Gruppen enthaltende Substanz ist Polyvinylalkohol (Verseifungsgrad über 90 %).

Mercapto-Gruppen enthaltende Substanzen sind solche, die mindestens eine Mercapto-Gruppe im Molekül enthalten.

Mikrokapseln mit Mercapto-Gruppen auf ihrer Wandoberfläche können durch Reaktion einer polyfunktionellen Verbindung (Wandmaterial), wie eines polyfunktionellen Isocyanats, eines polyfunktionellen Isothiocyanats, eines polyfunktionellen Säurechlorids, einer polyfunktionellen Epoxy-Verbindung etc. mit Thioharnstoff unter Bildung von Wandungen und anschließender Reduktion der so gebildeten Mikrokapseln hergestellt werden.

Durch Umsetzung von S-Acetylmercapto-bernsteinsäureanhydrid mit Amino-Gruppen an ihrer Wandoberfläche enthaltenden Mikrokapseln lassen sich ebenfalls Mikrokapseln her-. stellen, die Mercapto-Gruppen auf ihrer Wandoberfläche ' enthalten.

Weiterhin können Mikrokapseln mit Carboxyl-Gruppen auf ihrer Wandoberfläche durch Reaktion einer polyfunktionellen Verbindung (Wandmaterial), wie eines polyfunktionellen Isocyanats, eines polyfunktionellen Isothiocyanats, eines polyfunktionellen Säurechlorids, einer polyfunktionellen Epoxy-Verbindung etc. mit einer Ester-Verbindung wie einem Polyacrylat, einem Polymethacrylat etc. unter Bildung der Wandungen und nachfolgende Hydrolyse der so gebildeten Mikrokapseln unter sauren Bedingungen hergestellt werden.

Spezifische Beispiele für polyfunktionelle Isocyanate sind

Toluoldiisocyanat, Xyloldiisocyanat, Tolylendiisocyanat, Hexamethylendiisocyanat etc.

Spezifische Beispiele für polyfunktioneile Isothiocyanate sind Phenylendixsothiocyanat, Ethylendxxsothiocyanat etc.

Spezifische Beispiele für polyfunktionelle Säurechloride sind 1-Hydroxybenzol-2,4-di(sulfonylchlorid) etc.

Spezifische Beispiele für polyfunktionelle Epoxy-Verbindungen umfassen Diepoxybenzol etc.

Die polyfunktionellen Verbindungen (Wandmaterialien). sind jedoch nicht auf die vorgenannten Verbindungen beschränkt.

Die polyfunktionellen Verbindungen werden im allgemeinen in einer Menge von 5 bis 25 Gewichts-% und die zur Einführung der funktionellen Gruppen in die Wandoberfläche verwendeten Verbindungen werden in einer Menge von 2 bis 20 Gewichts-%, bezogen auf eine ölige Kernsubstanz, eingesetzt.

Als ölige Substanzen, die den Kern der Mikrokapseln gemäß der vorliegenden Erfindung bilden, können natürliche mineralische öle, tierische öle., pflanzliche öle und synthetische öle in der vorliegenden Erfindung benutzt werden. Diese Kernsubstanzen werden innerhalb der. Kapseiwandungen vollständig eingeschlossen und beeinflussen demzufolge das Antigen oder den Antikörper nicht, unmittelbar. ·

Bevorzugte Beispiele für Mineralöle sind Erdöl, Kerosin, , Benzin, Schwerbenzin, Paraffinöl. etc. Bevorzugte Beispiele für tierische öle sind Fischtran, Schmalz etc. Bevorzugte Beispiele für pflanzliche öle sind Erdnußöl, Leinöl, Sojabohnenöl, Rizinusöl, Maisöl etc. Beispiele für synthetische öle sind Bipheny!verbindungen (z.B. Isopropyl-biphenyl, Isoamyl-biphenyl), Terpheny!verbindungen (z.B.

Verbindungen, wie sie in der DE-OS 2 153 635 beschrieben werden), Naphthalin-Verbindungen (z.B. Diisopropyl-naphthalin und Verbindungen, wie sie in der US-PS 4 003 589 beschrieben werden), alkylierte Diphenylalkane (z.B. 2,4-Dimethyl-diphenylmethan und Verbindungen, wie sie in der US-PS 3 836 383 beschrieben werden), Phthalsäure-Verbindungen (z.B. Diethylphthalat, Dibutylphthalat, Dioctylphthalat) etc.

Die für die Mikrokapseln gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbaren Kernsubstanzen sind nicht auf die vorstehend beschriebenen Verbindungen beschränkt.

Zur Erhöhung des Kontrasts bei der Agglutination können in die Kernsubstanz auch öllösliche Farbstoffe eingearbeitet werden. Wiewohl es keine strenge Begrenzung gibt, eignen sich beispielsweise als öllösliche Farbstoffe die Farbstoffe mit den Color-Index-Zahlen 12010, 12150, 12715, 12716, 13900, 26100, 26105, 26110, 26125, 27291, 45170, 605 05 etc.

Die Kernsubstänzen für die Mikrokapseln gemäß der vorliegenden Erfindung können auch Markierungsstoffe, wie ein Isotop, einen fluoreszierenden Stoff, einen magnetischen Stoff, einen UV-Stoff etc. enthalten (vgl. die japanische Patentanmeldung Nr. 156522/79, US-Serial No. 110 318 vom 8. Januar 1980, die Beispiele für solche Materialien anführt)

Die Verfahren zur Herstellung der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikrokapseln unterliegen keiner besonderen Begrenzung, das heißt, es können die üblichen Verfahren angewandt werden, wie sie beispielsweise von Äsaji Kondo, "MICROCAPSULE", Nikkan Kogyo Press, Tokyo (1970), und-von- Tamotsu Kondo und Masumi Koishi, "MICROCAPSULE", Sankyo Publishing Co., Ltd., Tokyo (1972) beschrieben wurden.

Vorzugsweise wird das spezifische Gewicht der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikrokapseln durch entsprechende Wahl der Kernsubstanz so eingestellt, daß es in einem Bereich zwischen 0,80 und 1,20 liegt.

Vorzugsweise soll die mittlere Teilchengröße der Mikrokapseln im Bereich von 0,1 bis 30 μΐη liegen, wobei der Bereich von 0,5 bis 10 μπι besonders bevorzugt wird; sie ist jedoch nicht streng auf den angegebenen Bereich beschränkt.

ο Die Konzentration der funktioneilen Gruppen an der Wandoberfläche der Mikrokapseln wird zweckmäßigerweise mit Hilfe eines Verfahrens der Fluoreszenz-Messung bestimmt.

Falls die funktionellen Gruppen Amino-Gruppen sind, wird die Intensität einer durch Reaktion der Amino-Gruppen mit Fluoreszamin gebildeten fluoreszierenden Substanz bei 475 nm gemessen, wobei eine Anregungswellenlänge von 390 nm verwendet wird; die Messung kann beispielsweise mit Hilfe eines Hitachi Fluorospectrometers Modell 650 (Handelsgerät, hergestellt von Hitachi Co., Ltd.) nach der Fluoreszamin-Methode durchgeführt werden, wie sie von Kiyoshi Sugawaha und Masami Soejima, "TAMPAKUSHITHU-NO^ TEIRYOHO" (Quantitative Analysis of Proteins), Seite 179, , veröffentlicht bei Gakkai Shuppan Center, Tokyo (1977), beschrieben wurde. Die quantitative Analyse kann leicht unter Benutzung einer Eichkurve, die an Glycin erstellt ■ wurde, durchgeführt werden.

Falls die funktionellen Gruppen Carboxyl-Gruppen sind, wird zunächst 1-Ethyl-3- (3-dimethyl'aminopropyl)carbodiimidhydrochlorid mit den Carboxyl-Gruppen zur Umsetzung ge-0 bracht und sodann das überschüssige Carbodiimid ausgewaschen. Danach.wird das erhaltene Reaktionsprodukt mit Ethylendiamin umgesetzt. Nachdem das verbleibende Ethylen- '

diamin durch Auswaschen entfernt wurde, werden die durch diese Umwandlung erhaltenen Aminogruppen nach der vorbeschriebenen Fluoreszamin-Methode quantitativ bestimmt.

Wenn die funktionellen Gruppen Hydroxy-Gruppen sind, werden die Hydroxy-Gruppen ähnlich wie im Falle der Carboxyl-Gruppen in Amino-Gruppen umgewandelt, und die quantitative Bestimmung erfolgt, wie für die Carboxyl-Gruppen angegeben.

Falls die funktionellen Gruppen Mercapto-Gruppen sind, wird die quantitative Bestimmung nach dem Silber-Potential-Titrationsverfahren durchgeführt, bei dem eine Silbersulfid-Elektrode in Silbernitrat gegen eine gesättigte Kalomel-Elektrode als Bezugselektrode benutzt wird.

Es ist vorteilhaft, daß die funktionellen Gruppen an der Wandoberfläche der Mikrokapseln der vorliegenden Erfin-

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dung in einer Menge von 10 mol oder mehr pro 1 mg Feststoff (Wand plus Kern) der Mikrokapsel, vorzugsweise

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in einer Menge von 10 bis 10 mol, bezogen auf die gleiche Basis, vorliegen.

Um ein Antigen oder einen Antikörper an die funktionelle Gruppe auf der Wandoberfläche einer Mikrokapsel gemäß der vorliegenden Erfindung zu binden, wird eine polyfunktionelle Verbindung verwendet; in diesem Falle gibt es drei bevorzugte Ausfuhrungsformen, die nachstehend beschrieben werden.

Die erste Ausführungsform besteht darin, daß zunächst eine polyfunktionelle Verbindung an die polyfunktionellen Gruppen auf der Wandoberfläche einer Mikrokapsel gebunden wird und danach ein Antigen oder Antikörper mit dem entstandenen Reaktionsprodukt zur Umsetzung gebracht wird, wobei die funktionelle Gruppe an der Oberfläche der Mikrokapsel mittels der polyfunktionel-

len Verbindung mit einem Antigen oder Antikörper verbunden wird.

Die zweite Ausführungsform besteht darin, daß zunächst ein Antigen oder Antikörper mit einer polyfunktionellen Verbindung umgesetzt und dann das dabei erhaltene Produkt an die funktionelle Gruppe auf der Wandoberfläche der Mikrokapsel gebunden wird.

Die dritte Ausführungsform besteht darin, daß ein System/ z.B. eine Mischung, aus einem Antigen oder Antikörper, einer polyfunktionellen Verbindung und einer Mikrokapsel gebildet wird, in dem dann die Bindung des Antigens oder Antikörpers mittels der polyfunktionellen, vernetzenden Verbindung an die Wandoberfläche der Mikrokapsel durch eine Simultanreaktion herbeigeführt wird.

Typische Beispiele für polyfunktionelle Verbindungen, die dazu verwendet werden können, ein Antigen oder einen Antikörper an die funktionelle Gruppe auf der Wandober-• fläche einer Mikrokapsel zu binden, umfassen folgende Verbindungen: Wenn die funktioneilen Gruppen Amino-Gruppen sind: Dialdehyde wie Glutardialdehyd; Diisocyanate wie Toluol-2,4-diisocyanat; Diisothiocyanate wie p-Phenylendiisothiocyanat; Imid-ester wie Malonsäureimid-diethylester, Disulfonylchloride wie 1-Hydroxybenzol-2,4-di-· sulfonylchlorid; Halogen-nitrobenzole wie p,p'-Difluorm,m'-dinitro-diphenylsulfonsäure etc.. Wenn die funktioneilen Gruppen Carboxyl-Gruppen sind: Wasserlösliche Carbodiimide wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- ; carbodiimid-hydrochlorid, i-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl- , 4-ethyl)-carbodiimidomethyl-p-toluolsulfonsäure; Isoxazolium-Salze wie N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonsäure; Alkylchloroformate wie Ethyl-chloroformat etc.. , Wenn die funktioneilen Gruppen Mercapto-Gruppen sind:

Ν,Ν'-o-Phenylen-dimaleinimid, m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimid-ester etc.. Jedoch sind die verwendbaren polyfunktioneilen Verbindungen nicht speziell auf die vorgenannten Verbindungen beschränkt.

Als repräsentative Beispiele für immunologisch aktive Substanzen, die an die Wandoberfläche einer Mikrokapsel gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden werden können, um eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu bewirken, seien angeführt: Peptid-Hormone wie Hypothalamus-Hormone (z.B. TRH, LH-RH, Somatostatin), Hypophysen-Hormone (z.B.

Wachstumshormon, ACTH, οί,-MSH, ß-MSH, Lipotropin, Prolactin, TSH, TSH-ß, LH, LH-ß, FSH, FSH-ß,«-Untereinheit, Arginin-Vasopressin, Lysin-Vasopressin, Oxytocin etc.), den Calcium-Stoffwechsel regulierende Hormone (z.B. Insulin, Proinsulin, C-Peptid, Glucagon etc.), Hormone des Verdauungstrakts (z.B. Gastrin, Sekretin, Pankreozymin, Cholecystokinin, GIP, Enteroglucagon etc.), auf Blutgefäße wirkende Hormone (z.B. Angiotensin I, Angiotensin II, Bradykinine etc.), Placenta-Hormone (z.B. menschliches Choriongonadotropin (HCG), HCG-ß, menschliches Chorion-Somatomammotropin und menschliches Chorion-Thyrotropin), Nichtpeptid-Hormone wie Steroide (z.B. Cortison, Corticosteron, 11-Desoxy-cortison, 11-Desoxy-corticosteron, Progesteron, 17-Hydroxy-progesteron, Pregnenolon, Aldosteron, Testosteron, Dihydro-testosteron, östradiol, östriol, östron, 2-Hydroxy-östron, Dehydro-epiandrosteron . etc.), Thyroid-Hormone (z.B. Thyroxin, 3,5,3'-Triiodthyronin, 3,3',5'-Triiod-thyronin etc.), Prostaglandine (z.B. Prostaglandin A, E, F etc.), andere Substanzen als Hormone wie Arzneimittel (z.B. Digoxin, Digitoxin, Morphin, LSD, Gentamycin, Amphetamin, Nikotin etc.), cyclische Nucleotide (z.B. cyclisches AMP, cyclisches GMP, cyclischen IMP, cyclisches UMP etc.), Enzyme (z.B. C-j-Esterase, Fructose-1 ,6-diphosphatase, alkalische Phosphatase, Dopämin-ß-hydroxylase, Pepsinogen etc.), virusspezifische Antigene (z.B. Hepatitis-B-Virus, murines Sarkomaleukämie-Virus, Wollaffen-Leukämie-Virus, Vogel-

tumor-Virus, Pflanzenvirus, Vogelvirus Typ C, Treponema pallidum, Reptospira etc.), Tumor-Antigene(z .B.oc-Fetoprotein), Blutserum-Proteine (z.B. Thyroxin-bindendes Globulin (TBG), IgG, IgM, IgE, IgA, oC -Mikroglobulin, Properdin, Anti-Rh-Antikörper, Transferrin, Aplipoprotein, Fibrinogen-Abbauprodukte, antihämolytxscher Faktor, Renin, etc.), Rheumatismus-Faktor, Folsäure, Neurophysin, Somatomedin B, Nervenwachstums-Faktor, Epidermis-Wachstumsfaktor, Staphylokokken-Enterotoxin A und B, Typ A-Toxin aus Chlostridium botulinum, Myosin, Encephalitiserzeugende basische Proteine, Substanz P, Serotonin, konjugierte Cholyl-Gallensäure, !!„„-Antigen etc..

Von diesen immunologisch aktiven Substanzen können die nachstehend genannten besonders vorteilhaft an die Wandoberfläche der Mikrokapseln gemäß dieser Erfindung ge- . bunden werden: IgG, IgM, IgE, IgA, Insulin, H -Antigen, od-Fetoprotein, menschliches Wachstumshormon, Renin, Gastrin, LH, FSH, Cortison, Angiotensin, ACTH, C-Peptid, CEA, Glucagon und Aldosteron.

Arbeitsweisen zur Bindung von Antigenen oder Antikörpern an die Mikrokapselwandungen gemäß dieser Erfindung werden im folgenden ausführlicher beschrieben.

Eine Mikrokapsel-Aufschlämmung in Kochsalzlösung wird auf einen Feststoff-Gehalt von 1 bis 3 Gewichts-% verdünnt. Ein Vernetzungsmittel, z.B. Glutardialdehyd, wird in einer Menge von 0,1 bis 50 Gewichts-%, bezogen auf den Feststoff-Gehalt der Mikrokapseln, zu der so verdünnten Mikrokapsel-Aufschlämmung hinzugefügt. Die erhaltene Mischung wird 5 bis 120 Minuten bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis '65⁰C inkubiert, damit das vernetzende Mittel mit den funktioneilen Gruppen der Mikrokapsel-Wandungen reagiert. Dann wird das restliche Vernetzungsmittel durch Auswaschen mittels Abtrennung durch Zentrifugieren entfernt.

Zu der Dispersion wird ein Antigen oder Antikörper in einer Menge von 0,1 bis 25 Gewichts-%, bezogen auf den Feststoff-Gehalt der Mikrokapseln, zugesetzt. Die Mischung wird 30 bis 120 Minuten bei 37°C inkubiert, wobei das Antigen oder der Antikörper mit den verbliebenen funktionellen Gruppen des an die Mikrokapselwandungen gebundenen Glutardialdehy.ds reagiert. Andererseits werden diejenigen •funktioneilen Gruppen am einen Ende des Glutardialdehyds, der mit den funktioneilen Gruppen an seinem anderen Ende an die Mikrokapselwandungen gebunden ist, die nicht umgesetzt wurden, mit einer Glycin-Lösung zur Reaktion gebracht, so daß dadurch sämtliche unumgesetzten funktioneilen Gruppen des Glutardialdehyds blockiert werden.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen diagnostischen Materialien zeichnen sich aus durch eine hohe Empfindlichkeit bei der Agglutination, durch die Tatsache, daß unspezifische Agglutination nur unter Schwierigkeiten stattfindet, durch die Tatsache, daß die Mittel über lange Zeiträume stabil gelagert und leicht mit gleichbleiben- äer Qualität im industriellen Maßstab hergestellt werden . können, und durch die.Tatsache, daß die damit verwendbaren Antigene oder Antikörper innerhalb eines äußerst weiten Bereichs ausgewählt werden können, durch die Tatsache, daß als Kern der Mikrokapsel eine ölige Substanz eingesetzt wird, die im Vergleich zur Verwendung einer wasserlöslichen Substanz als Kern die Verkapselung erleichtert, durch die Tatsache, daß die Oberfläche der Mikrokapsel ungleichmäßig ist, wodurch sich im Vergleich zu einphasigen Teilchen, die eine glatte Oberfläche besitzen, eine vergrößerte Oberfläche ergibt, etc., d.h. diese Mittel sind unter diagnostischen und präparativen Gesichtspunkten außerordentlich wertvoll.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, die bevorzugte Ausführungsformen beschreiben, im einzelnen erläutert.

Sofern nicht anders angegeben bezeichnen alle Prozentangaben Gewichts-%, und sämtliche Reaktionen wurden bei Raumtemperatur und dem atmosphärischen Druck der Umgebung durchgeführt.

Beispiel T

Herstellung von Mikrokapseln Ä, die Amino-Gruppen an ihrer Oberfläche besitzen:

• In einem Öl-Gemisch (spezifisches Gewicht ca. 1,10) aus 11,8 g Diisopropylnaphthalin und 13,2 g eines chlorierten Paraffins (Chlorierungsgrad 50 %) wurden 0,1 g eines öllöslichen roten Farbstoffs, "Eisen Spiron Red" (hergestellt von der Hodogaya Chemical Co., Ltd.) aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde in Eis vorgekühlt. In dieser gekühlten Lösung wurden 4 g einer 50-proz. Lösung eines Tolylen-diisocyanat-Trimethylol-propan-Addukts (Handelsbezeichnung Desmodur-L, Hersteller: Bayer Co., Ltd.) in Methyl-ethylketon aufgelöst. Die erhaltene öllösung wurde • zu einer Lösung von 2,5 g Hexamethylendiamin in 65 g einer 5-proz. wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol (Ver- ; seifungsgrad 88 %, Polymerisationsgrad 500) hinzugefügt. Die· Lösung wurde gerührt und emulgiert, und dabei wurde sie auf eine mittlere öltröpfchengröße von etwa 6 μΐη eingestellt. Dann wurde die Emulsion mit 100 g Wasser verdünnt. Die verdünnte Emulsion wurde, um die Mikroverkap- ; seiung zu bewirken, 1 h bei 75⁰C zur Reaktion gebracht.

Nach Bildung der Mikrokapseln wurde die Mikrokapsel-Aufschlämmung zentrifugiert und zur Entfernung der verbliebenen Reaktionsflüssigkeit mit physiologischer Kochsalz- j lösung gewaschen. Danach wurden die Mikrokapseln in physiologischer Kochsalzlösung zu einer Dispersion mit einem · Feststoff-Gehalt von 10 % dispergiert.

- 17 Herstellung von Mikrokapseln B zum Vergleich;

Die Mikrokapseln B wurden in ähnlicher Weise wie vorste-, hend beschrieben jedoch mit der Abweichung hergestellt, daß 0,1 g eines Ethylendiamin-Propylenoxid-Addukts statt des Hexamethylendiamins verwendet und in einem öl-Gemisch vom spezifischen Gewicht 1,10 aufgelöst wurden.

Quantitative Bestimmung der Konzentration der Amino-Gruppen an der Wandoberfläche der Mikrokapseln;

Die wie oben beschrieben hergestellten Mikrokapseln wurden auf einen Feststoff-Gehalt von 1 % verdünnt. 100 μΐ der so verdünnten Mikrokapseln wurden in ein Prüfröhrchen gegeben,und 1,5 ml eines Veronal-Puffers (pH 8,6) wurden zugesetzt. Unter kräftigem Rühren wurden dann 0,5 ml einer Lösung von 30 mg Fluoreszamin in 100 ml Dioxan tropfenweise zu der Mischung hinzugefügt. Mit Hilfe eines Fluoro-Spektrometers, hergestellt von der Firma Hitachi, Ltd., wie vorher beschrieben, wurde dann unter Anregung bei Ex = 390 nm die emittierte Fluoreszenz-Intensität bei Em = 475 nm gemessen. Unter Verwendung einer mit HiI-fe einer Glycin-Lösung erstellten Eichkurve wurde die Konzentration der Amino-Gruppen quantitativ ermittelt.

Die Mikrokapseln A gemäß der Erfindung enthielten

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5,6 χ 10 mol Amino-Gruppen pro 1 mg des Feststoff-Anteils. Auf der Oberfläche eines Mikrokapsel-Teilchens der mittleren Größe von 6 μπι lagen die Amino-Gruppen in einer Konzentration von 3,7 χ 10 '^/cm² vor.

Auf der anderen Seite waren in den Mikrokapseln B zum Vergleich die Amino-Gruppen in einer Menge von weniger

-10
als 10 mol pro 1 mg des Feststoff-Anteils vorhanden.

Sensibilisierung der Amino-Gruppen aufweisenden Mikrokapseln A mit modifJ2iertem menschlichen IgG: ι

Eine Probe von 1,5 g der jeweiligen gemäß Beispiel 1 hergestellten Mikrokapseln wurde entnommen und in je 10 ml . physiologischer Kochsalzlösung dispergiert. Der Dispersion wurden 100 μπι Glutardialdehyd zugemischt und das ' erhaltene Gemisch anschließend 30 min bei 37°C umgesetzt, j

Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung un- · ter Benutzung einer Zentrifuge ausgewaschen und der erhaltene Niederschlag in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung dispergiert. i

Die Dispersion wurde dann mit einer 1-proz. physiologischen Kochsalzlösung von menschlichem IgG auf das 20-fache ihres ursprünglichen Volumens verdünnt. Eine Probe von 2 ml des Verdünnungsprodukts wurde zu 2 ml der vorerwähnten, mit Glutardialdehyd behandelten Mikrokapsel-Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde 1 h bei 37⁰C inkubiert und dann 15 h bei 4°C stehen gelassen. Danach wurde die Mischung zweimal einer Trennung durch Zentrifugieren mit einer 0,2 % Glycin enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung unterworfen. Das auf diese Weise gewaschene ^: Produkt wurde in 2 ml einer 0,15M-Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS, pH = 7,2) dispergiert, die 3 % Rinder-Serumalbumin und 1 % Saccharose enthielt, um damit ein Reagens A 1 zum Nachweis eines Rheumatismus-Faktors zu j erhalten.

Vergleichsbeispiel 1

Das Reagens A 2 zu Vergleichszwecken wurde mittels einer Verfahrensweise der Sensibilisierung wie oben jedoch mit der Abweichung hergestellt, daß die Sensibilisierung mit modifiziertem menschlichen IgG ohne Glutardialdehyd-Behandlung vorgenommen wurde.

Vergleichsbeispiel 2

Unter Verwendung der wie oben beschrieben erhaltenen Mikrokapseln B zum Vergleich wurde die bei der Gewinnung des Reagens A 1 angewandte Verfahrensweise der Sensibilisierung mit modifiziertem menschlichen Ig G wiederholt.

Auf diese Weise wurde das Reagens B 1 zu Vergleichszwecken hergestellt.

Mikroplattenprüfung

In bezug auf die mit modifiziertem menschlichen IgG sensibilisierten Reagenzien wurde eine Zelle, in der die Agglutination- klar erkennbar war, als positiv bewertet, und die maximale Verdünnung der Seren, die noch eine positive Reaktion ergab, wurde bestimmt und als Antikörper-Titer angegeben.

Eine Verdünnungsreihe von aufeinanderfolgenden Verdünnungen auf das jeweils 2-fache der entsprechenden Zellen auf Mikroplatten wurde hergestellt, indem eine Probe von 25 μΐ eines Serums zum Nachweis des Rheumatismus-Faktors (positive Kontrolle) mit einer 0,15M-Phosphat-' puffer-Kochsalzlösung (PBS, pH = 7,2) verdünnt wurde; eine entsprechende Reihe wurde als negative Kontrolle .(normales Kaninchen-Serum) hergestellt.

Danach wurden 25 μΐ der mit modifiziertem menschlichen IgG sensibilisierten Mikrokapsel-Reagenzien mit einem Tropfer entnommen und tropfenweise zu den betreffenden Zellen der einzelnen Verdünnungen der Reihen auf den Mikroplatten hinzugefügt. Die Mikroplatten wurden 5 min geschüttelt, um eine Antigen-Antikörper-Reaktion herbeizuführen. Danach wurden die Mikroplatten über Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Am nächsten Morgen wurden die am Boden der Zellen gebildeten Agglutinations-Muster beobachtet, wobei die in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführten Titerwerte erhalten wurden.

Tabelle 1

Reagens	Antikörper-Titer	Negatives Serum
Reagens A 1 Reagens A 2 zum Vergleich Reagens B 1 zum Vergleich	Positives Serum	^ 20 ^ 20 ^ 20
2 560 320 40

Aus den oben dargestellten Ergebnissen ist zu entnehmen, daß das durch Sensibilisierung der Amino-Gruppen an der Oberfläche aufweisenden Mikrokapsel mit modifiziertem menschlichen IgG gewonnene Reagens eine Empfindlichkeit zum Nachweis eines Rheumatismus-Faktors besitzt, die das • 2 -fache derjenigen des Reagens B 1 zum Vergleich beträgt. Es ist ebenfalls leicht zu erkennen, daß die festere Bindung des modifizierten menschlichen IgG an die Oberfläche der Mikrokapseln eine höhere Nachweisempfindlichkeit bewirkt, da das System gemäß der vorliegenden Erfindung die 2 -fache Nachweisempfindlichkeit derjenigen des Reagens A 2 zum Vergleich aufweist.

Eignung für die Gefriertrocknung

Die mit modifiziertem menschlichen IgG sensibilisierten, wie oben beschrieben hergestellten Reagenzien wurden unter Benutzung einer Gefriertrocknungsanlage, Modell FD-1 (Handelsbezeichnung, hergestellt von der Firma Tokyo Rika Co., Ltd.) gefriergetrocknet. Nachdem die auf diese Weise gefriergetrockneten Reagenzien 1 Woche bei 4°C in einem Kühlschrank aufbewahrt worden waren, wurde eine der bei der Gefriertrocknung entfernten entsprechende Menge Feuchtigkeit neu hinzugefügt, um die Reagenzien in ihrem ursprünglichen Zustand wiederherzustellen. Der Mikroplat-

3Ί26657

ten-Test wurde wie oben beschrieben durchgeführt, wobei die in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführten Antikörper-Titerwerte erhalten wurden.

Tabelle 2

Reagens	Antikörper-Titer	Negatives Serum
Reagens A 1 gem.d.Erfindung, gefriergetrockn. Reagens A 2 zum Vergleich, gefriergetrockn. Reagens B 1 zum Vergleich, gefriergetrockn.	Positives Serum	O O O CN · CN CN VlI VlI VlI
1 280 40 * 20

Wie aus den oben dargestellten Ergebnissen zu ersehen ist, bleibt in dem Reagens, das erhalten wurde, indem das modifizierte menschliche IgG chemisch an die Amino-Gruppen an der Oberfläche aufweisenden Mikrokapseln gebunden wurde, der Antikörper-Titer· auch nach der Gefriertrocknung fast in gleicher Höhe erhalten, während bei den Reagenzien zum Vergleich, in denen das modifizierte menschliche IgG nicht chemisch an die Mikrokapselwandung gebunden war, der Antikörper-Titer erheblich reduziert wurde, so daß die Vergleichsreagenzien den Anforderungen des praktischen Gebrauchs nicht standhalten konnten.

Beispiel 2

Herstellung von Mikrokapseln, die Carboxyl-Gruppen an ihrer Oberfläche besitzen:

Mikrokapseln wurden unter den in Beispiel 1 beschriebenen

Bedingungen jedoch mit der Abweichung hergestellt, daß 3 g Carboxymethylcellulose statt des Hexamethylendiamxns in der wäßrigen Polyvinylalkohol-Lösung aufgelöst wurden.

Quantitative Bestimmung der Konzentration der Carboxyl-Gruppen an der Wandoberfläche der Mikrokapseln;

Eine der beiden funktionellen Gruppen von Carbodiimid wurde mit der Carboxylgruppe an der Wandoberfläche der ; Mikrokapseln umgesetzt. Danach wurde Ethylendiamin mit der anderen, unumgesetzten funktioneilen Gruppe des Carbodiimids zur Reaktion gebracht. Auf diese Weise wurden die Carboxyl-Gruppen in Amino-Gruppen überführt. Darauf- ; hin wurde die Konzentration der Amino-Gruppen quantitativ nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt. Das heißt, eine Probe von 1,5 g der derart hergestellten Mikrokapseln wurde entnommen und mit 10 ml eines 0,15M-Phosphat-Puffers, der einen pH von 4,5 besaß, verdünnt. 5 ml einer 1-proz. wäßrigen Lösung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid wurden zu der erhaltenen Verdünnung hinzugefügt. Die Mischung wurde sodann 1 h bei 37°C inkubiert. Nachdem ^; die verbleibende Reaktionslösung durch Trennung mittels Zentrifugieren entfernt worden war, wurde der Niederschlag in 1.0 ml einer 0,1-proz. Ethylendiamin-Lösung dispergiert. ; Die Dispersion wurde 1 h bei 37°C inkubiert. ,

Nach Beendigung der Reaktion wurde die verbleibende Lösung durch Zentrifugieren entfernt, und der Niederschlag wurde in 15 ml physiologischer Kochsalzlösung dispergiert. Aus dieser Dispersion wurde eine Probe von 100 μΐ in ein ' Prüfröhrchen entnommen, und die Konzentration der Amino- , Gruppen wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise bestimmt.

In dem Fall, in dem Mikrokapseln wie vorstehend beschrieben mit Ethylendiamin behandelt worden'waren, waren Amino-

_o

Gruppen in einer Menge von 2,7 χ 10. mol pro 1 mg des Feststoff-Anteils der Mikrokapseln anwesend, d.h. in den Mikrokapseln lagen Carboxyl-Gruppen in einer Menge von

—8

mindestens 2,7 χ 10 mol pro 1 mg Feststoff vor. Dementsprechend waren Carboxyl-Gruppen in einer Konzentration von 1,9 χ 10 /cm² auf der Oberfläche eines Mikrokapsel-Teilchens mit einer mittleren Größe von 6 μΐη vorhanden.

Sensibilisierung der Carboxyl-Gruppen aufweisenden Mikrokapseln mit modifiziertem menschlichen IgG;

Von den in diesem Beispiel 2 hergestellten Mikrokapseln wurden mit einem Tropfer jeweils Proben zu 1,5 g entnommen und jeweils in 10 ml eines 0,15M-Phosphatpuffers, der einen pH von 4,5 besaß, dispergiert. Zu jeder der erhaltenen Dispersionen wurde 2 ml einer 1-proz. wäßrigen Lösung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid zugesetzt und die Mischung 60 min bei 37⁰C zur Reaktion gebracht. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit physiologischer Kochsalzlösung unter Abtrennung durch Zentrifugieren ausgewaschen, Daraufhin wurde mit modifiziertem menschlichen IgG auf die in Beispiel T beschriebene Weise sensibilisiert, um damit ein Reagens zum Nachweis eines Rheumatismus-Faktors herzustellen.

Unter Verwendung des auf diese Weise erhaltenen Reagens wurde ein Mikroplatten-Test wie in Beispiel 1 durchge- . führt, wobei in der nachstehenden Tabelle 3 aufgeführte Antikörper-Titerwerte erhalten wurden.

Tabelle 3

Reagens	Antikörper-Titer	Negatives Serum
Reagens gem.d.Erfindung nach Beispiel 2	Positives Serum	20
2 560

ο ι δ. υ υ

- 24 Beispiel 3

Herstellung von Mikrokapseln, die Hydroxy-Gruppen an ihrer Oberfläche besitzen:

Mikrokapseln, die Hydroxy-Gruppen an ihrer Wandoberfläche aufweisen, wurden wie in Beispiel 1 .jedoch mit der Abweichung hergestellt, daß 3 g Polyvinyalkohol (Poval, hergestellt von Kuraray Co., Ltd.; Verseifungsgrad 90 %; Polymerisationsgrad 500) statt des Hexamethylendiamins in einer wäßrigen Lösung von Polyvinylakohol aufgelöst wurden. Alle übrigen Bedingungen waren mit den Herstellungsbedingungen der Mikrokapseln in Beispiel 1 identisch.

Quantitative Bestimmung der Konzentration der auf der Wandoberfläche der Mikrokapseln vorhandenen Hydroxy-Gruppen:

Cyanurchlorid wurde mit den Hydroxy-Gruppen auf der Wand-Oberfläche der Mikrokapseln zur Reaktion gebracht. Dann wurde Ethylendiamin mit den verbleibenden, unumgesetzten funktionellen Gruppen des Cyanurchlorids zur Reaktion gebracht. Auf diese Weise wurden die Hydroxy-Gruppen in Amino-Gruppen überführt, und die Konzentration der Amino-Gruppen wurde anschließend gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren quantitativ bestimmt. Das heißt, Proben von 1,5 g der gemäß diesem Beispiel hergestellten Mikrokapseln wurden entnommen und jeweils mit 10 ml einer ■ 0,15M-Phosphatpuffer-Lösung, die den pH 8,0 besaß, verdünnt. Zu den verdünnten Proben wurden jeweils 5 ml einer 1-proz. wäßrigen Lösung von Cyanuchlorid hinzugefügt. Die.erhaltene Mischung wurde dann 2 h bei 37⁰C inkubiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde die verbleibende Flüssigkeit durch Zentrifugieren entfernt und der Niederschlag in 15 ml physiologischer Kochsalzlösung dispergiert. Von der Dispersion wurde eine Probe von 100 μΐ in ein Prüfröhrchen entnommen. Die Konzentration der Amino-Gruppen wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Metho- : d-3 bestimmt.

Die Mikrokapseln enthielten 1,1 χ 10 raol Amino-Gruppen pro 1 mg des Feststoff-Anteils der Mikrokapseln, d.h. mindestens 1,1 χ 10 mol Hydroxy-Gruppen pro 1 mg des Feststoff-Gehalts. Auf der Oberfläche der Mikrokapsel-Teilchen mit einer mittleren Teilchengröße von 6 μπ\ lagen die Hydroxy-Gruppen in einer Konzentration von 7,3 χ 10^l4/cm² vor.

Sensifailisierung der Hydroxy-Gruppen an ihrer Oberfläche aufweisenden Mikrokapseln mit modifiziertem menschlichen IqG:

Von den gemäß diesem Beispiel 3 hergestellten Mikrokapseln wurden Proben von je 1,5 g entnommen und in jeweils 10 ml eines Phosphatpuffers dispergiert, der den pH 8,0 besaß. Zu der Dispersion wurden jeweils 2 ml einer 1-proz. wäßrigen Lösung von Cyanurchlorid hinzugefügt. Die Mischung wurde 2 Stunden bei 37⁰C reagieren gelassen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung unter Abtrennung durch Zentrifugieren gewaschen. Daraufhin wurde die Sensibilisierung mit modifiziertem menschlichen IgG wie in Beispiel 1 durchgeführt, um damit ein Reagens zum Nachweis des Rheumatismus-Faktors herzustellen.

Unter Verwendung des auf diese Weise erhaltenen Reagens wurde ein Mikroplatten-Test wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei die in der nachstehenden Tabelle 4 aufgeführten Antikörper-Titerwerte erhalten wurden.

Tabelle 4

Reagens	Antikörper-Titer	Negatives Serum
Reagens gem.d.Erfindung nach Beispiel 3	Positives Serum	< = 20
1 280

Beispiel 4

Herstellung von Mikrokapseln, die Mercapto-Gruppen an ihrer Oberfläche besitzen;

Von den gemäß Beispiel 1 hergestellten Mikrokapseln wurden 5 g entnommen und in 20 ml eines 0,15M-Phosphatpuffers dispergiert, der den pH 6,0 besaß. Zu der Dispersion wurden 5 ml einer 1-proz. wäßrigen Lösung von S-Acetylmercapto-bernsteinsäureanhydrid hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde 1 h bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach Beendigung der Reaktion wurde die verbleibende Flüssigkeit durch Abtrennung mittels Zentrifugieren entfernt. Das resultierende Produkt wurde anschließend in 25 ml physiologischer Kochsalzlösung dispergiert.

Quantitative Bestimmung der an der Oberfläche der Mikrokapseln vorhandenen Mercapto-Gruppen:

Die Probenahme erfolgte unter Einsatz von 10 ml derjenigen Mikrokapseln (Feststoff-Gehalt 2 %), mit denen das , S-Acetylmercapto-bernsteinsäureanhydrid zur Reaktion gebracht worden war.

Mit Hilfe einer Silbersulfid-Elektrode gegen eine gesättigte Kalomel-Elektrode als Standard·wurde mittels eines pH-Meters (hergestellt von Hitachi-Horiba Co., Ltd.) die Potentialänderung auf tropfenweisen Zusatz von 0,002N-Silbernitrat abgelesen. Nach Zugabe von 0,41 ml Silbernitrat änderte sich das Potential sprunghaft; das bedeu-

tet, daß Mercapto-Gruppen in einer Menge von 4,1 χ 10 mol pro 1 mg des Feststoff-Anteils der Mikrokapseln anwesend waren und Mercapto-Gruppen in einer"Zahl von 2,7 χ 10 /cm² auf der Oberfläche der Mikrokapseln mit einer mittleren
Teilchengröße von 6 μπι vorlagen.

- 27 Sensibilisierung mit modifiziertem menschlichen IgG:

Wie in Beispiel 1 wurden 0,5 ml eines 0,15M Phosphatpuffers, der den pH 6,5 besaß, zu 1 ml einer 1-proz. wäßrigen Lösung des modifizierten menschlichen IgG hinzugefügt. Unter Rühren mit einem Rührer wurden 2 mg S-Acetylmercapto-bernsteinsäureanhydrid dem Gemisch zugesetzt. Die Mischung wurde dann 40 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zur Abtrennung der Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht durch eine Säule mit Sephadex G-25 hindurchgeschickt. Das Gesamtvolumen wurde auf 20 ml eingestellt, wovon 2 ml abgenommen und zu 2 ml der gemäß Beispiel 4 hergestellten Mikrokapseln hinzugefügt wurden. Zu der Mischung wurden 2 ml einer gesättigten Lösung von o-Phenylen-dimaleinimid in einem 0,15M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gegeben. Die Mischung wurde dann 1 h bei 3 7°C zur Reaktion gebracht. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt 15 h bei 4⁰C absitzen lassen. Danach wurde das Reaktionsprodukt durch Zentrifugieren abgetrennt, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann in 2 ml einer 0,15M-Phosphatpuffer-Kochsalzlösung dispergiert, die 3 % Rinder-Serumalbumin enthielt, um damit ein Reagens zum Nachweis des Rheumatismus-Faktors herzustellen.

Unter Verwendung des auf diese Weise erhaltenen Reagens wurde ein Mikroplatten-Test wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei die in der nachstehenden Tabelle 5 aufgeführten Antikörper-Titerwerte erhalten wurden.

Tabelle 5

Reagens	AntikÖrper-Titer	Negatives Serum
Reagens gem.d.Erfindung nach Beispiel 4	Positives Serum	= 20
2 560

Claims (10)

1. VON KREISLER SCHÖTWALD - EiSHOLD .:. FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER

   PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler 11973

   Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Fuji Photo Film Co. Ltd. Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden

   Dr. J. F. Fues, Köln

   No . 210, Nakanuma Dipl.-Chem. Alek γοη Kreisler, Köln

   ... , . , .. Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln

   Minamiashigarashi Dipl.-Ing. G. SelHng, Köln

   Kanagawa, Japan Dr. H.-K. Werner, Köln

   DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

   D-5000 KÖLN 1

   W/GF 6. Juli 1981

   Patentansprüche

   Mikrokapsel zur Bewirkung einer Immunantwort, dadurch ·,

   gekennzeichnet, daß" ein Antigen oder Antikörper mit #·

   Hilfe eines vernetzenden Mittels an eine funktioneile Gruppe der Wandoberfläche der Mikrokapsel gebunden ist.
2. 2. Mikrokapsel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als funktionelle Gruppe eine Amino-Gruppe, Carboxyl-Gruppe, Hydroxy-Gruppe oder Mercapto-Gruppe vorliegt. ·
3. 3. Mikrokapsel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das vernetzende Mittel ein polyfunktionelles Isocyanat, ein polyfunktionelles Isothiocyanat, ein polyfunktionelles Säurechlorid oder eine polyfunktionelle Epoxy-Verbindung ist.
4. 4. Mikrokapsel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, ft daß das polyfunktionelle Isocyanat Toluol-diisocyanat, *--, Xylol-diisocyanat, Tolylen-diisocyanat oder Hexamethylendiisocyanat ist.

   Telefon: (0221) 131041 · Telex: 8882307 dopa d · Tetegramm: Dompatent Köln

   ο ι £ υ υ
5. 5. Mikrokapsel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das polyfunktionelle Isothiocyanat Phenylen-diisothiocyanat oder Ethylen-diisothiocyanat ist.
6. 6. Mikrokapsel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das polyfunktionelle S
   2,4-disulfonylchlorid ist.

   daß das polyfunktionelle Säurechlorid 1-Hydroxy-benzol- :
7. 7. Mikrokapsel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die polyfunktionelle Epoxy-Verbindung Diepoxybenzol ist.
8. 8. Mikrokapsel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das vernetzende Mittel in einer Menge von 5 bis 25 Gewichts-% und die die funktionelle Gruppe in die Mikrokapsel einführende Verbindung in einer Menge von 2 bis 20 Gewichts-%, jeweils bezogen auf die Mikrokapsel zur Anwendung gebracht wird.
9. 9. Mikrokapsel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

   daß die funktionelle Gruppe in einer Konzentration

   — 9
   von mindestens 10 mol p:

   der Mikrokapsel vorliegt.

   —9
   von mindestens 10 mol pro 1 mg des Feststoff-Gehalts
10. 10. Mikrokapsel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionelle Gruppe in einer Konzentration

    9 —5
    von 10 bis 10 mol pro

    der Mikrokapsel vorliegt.

    9 —5
    von 10 bis 10 mol pro 1 mg des Peststoff-Gehalts