DE1236239B

DE1236239B - Reagens zur Bestimmung gonadotroper Hormone

Info

Publication number: DE1236239B
Application number: DE1962N0022478
Authority: DE
Inventors: Jacobus Polderman
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1961-12-15
Filing date: 1962-12-14
Publication date: 1967-03-09
Also published as: FI44719B; GB979759A; CH445157A; NL105810C; ES283302A1; BE626138A; SE328370B; AT238884B; FI44719C

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND Int. CI.:

GOl η-33/16

DEUTSCHES

PATENTAMT

PATENTSCHRIFT

Deutsche Kl.: 421-3/54

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

Ausgabetag:

P 12 36 239.9-52 (N 22478)

14. Dezember 1962

9. März 1967

21. September 1972

Patentschrift weicht von der Auslegeschrift ab

Die Erfindung bezieht sich auf ein Reagens zur Bestimmung gonadotroper Hormone mit einem Gehalt an mit einem Gonadotropin sensibilisierten Erythrocyten und einem Antiserum gegen dieses Gonadotropin.

In der Schweiz. Z. Path. Bakt., 22, I (1959), beschreibt R. Weinbach, daß Erythrocyten, die mit Formalin und Gerbsäure behandelt wurden, geeignete Träger für Antigene sind. Diese mit Antigen beladenen Erythrocyten reagieren mit einem geeigneten Antiserum unter Bildung eines hellgelben, diffusen Niederschlags (Agglutinats).

Von diesem Prinzip ausgehend entwickelten L. Wide und C. A. Gemzell eine Schwangerschaftsreaktion, s. Acta Endocrine»!., 35, 261 (1960). Wird nämlich menschliches Choriongonadotropin als Antigen verwendet, so kann die obenerwähnte Reaktion durch Zusatz einer überschüssigen Menge an Antigen zum Reaktionsgemisch verhindert werden. Durch Verwendung von menschlichem Schwangerenurin kann die Schwangerschaft leicht festgestellt werden. 1st genügend Choriongonadotropin in dem Urin vorhanden, dann setzen sich die freien Erythrocyten als dunkelbrauner Ring am Boden des Reaktionsgefäßes ab. So zeigt also ein Ring Schwangerschaft an und ein diffuser Niederschlag das Gegenteil.

Dieses Verfahren kann auch zur Diagnose pathologischer Erscheinungen, bei denen ebenfalls Gonadotropine in dem Urin vorhanden sind, und zur Bestimmung anderer Gonadotropine, z. B. Serum-Gonadotropin im Serum schwangerer Stuten, und von Hypophysen-Gonadotropin in Hypophysen-Extrakten verwendet werden. Die letzteren beiden Bestimmungen sind wichtig für die Auswahl des Rohmaterials für die Herstellung dieser Hormone.

Es zeigte sich jedoch, daß dieses Bestimmungsverfahren in manchen Fällen zu einem fehlerhaften Schluß führt und daß in manchen Fällen das Resultat zweifelhaft ist, insbesondere, wenn kein frischer Urin untersucht wurde.

Es wurde nun gefunden, daß die Genauigkeit der Bestimmung von Gonadotropinen bedeutend erhöht werden kann, wenn man sie in Gegenwart einer oder mehrerer zur Bindung von Calciumionen in löslicher komplexer Form geeigneter, mit anderen Worten in Gegenwart von chelatbildenden Stoffen, ausführt. Vergleichsversuche ergaben nämlich, daß immer dann ein fehlerhafter Schluß gezogen wurde, wenn der Gehalt an Calciumionen in der zu untersuchenden Flüssigkeit höher als normal war. Der Gehalt dieser Ionen in frischem Urin ist ziemlich niedrig, etwa in der Größenordnung von ungefähr 0,1 mg/ml bei einer Reagens zur Bestimmung gonadotroper Hormone

Patentiert für:
N. V. Organon,Oss (Niederlande)

Dr.-Ing. F. Wuesthoff, Dipl.-Ing. G. Puls und Dr. E. v. Pechmann, Patentanwälte, 8000 München 9, Schweigerstr. 2

Als Erfinder benannt:
Jacobus Polderman, Oss (Niederlande)

Beanspruchte Priorität:

Niederlande vom 15. Dezember 1961 (272 588) - -

gesamten Calc%immenge von ungefähr 0,24 mg/ml.

Jedoch sind diese Zahlen stark unterschiedlich in verschiedenen Fällen.

Das Calcium frischen Urins ist wahrscheinlich in bedeutendem Ausmaß an Proteine gebunden, so daß die kleine Menge der restlichen freien Calciumionen den Test nicht stören kann. Läßt man aber den Urin wenige Tage stehen, dann kann der Gehalt an Calciumionen bis zu einem Wert von ungefähr 0,2 mg/ml ansteigen, was möglicherweise durch Spaltung der Calciumprotein-Komplexe verursacht wird. Der Überschuß an Calciumionen verursacht eine spontane Agglutinierung der Erythrocyten, unabhängig von der Anwesenheit von Choriongonadotropin. Das Agglutinat hat das Aussehen des bei Verwen-, dung von negativem Urin gebildeten Agglutinats. Mit anderen Worten, ein positiver Urin (der Choriongonadotropin enthält) verhält sich wie ein negativer Urin (ohne Choriongonadotropin) infolge seines hohen Gehalts an Calciumionen. Vorzugsweise muß soviel eines chelatbildenden Mittels verwendet werden, daß der Überschuß an Calciumionen gebunden wird. Ein Überschuß an chelatbildendem Mittel beeinflußt die Bestimmung nicht. Durch die vollkommene Bindung des anwesenden Calciums ist das Ergebnis unter allen Bedingungen einwandfrei.

Das erfindungsgemäße Reagens ist demzufolge gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer ausreichenden Menge eines chelatbildenden Mittels zur Bindung

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Claims

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von in der zu untersuchenden Flüssigkeit anwesen- Zunächst wurde eine 0,05gewichtsprozentige Loden Calciumionen. sung von lyophilisiertem Antiserum in dieser Puffer-

Die Erythrocyten und das Antiserum werden vor- lösung hergestellt. Dann wurden 0,4 ml dieser Antizugsweise in lyophilisierter Form, und das chelat- serumlösung einer lvolumprozentigen lyophilisierten bildende Mittel wird in wäßriger Lösung oder zu- 5 Suspension in 0,25 ml destillierten Wassers von mit sammen mit einer der Komponenten lyophilisiert, menschlichem Choriongonadotropin sensibilisierten verwendet. Erythrocyten zugegeben. Das entstandene Gemisch

Als Beispiele geeigneter chelatbildender Mittel kann als Reagens zur Schwangerschaftsbestimmung

werden erwähnt: Äthylendiamintetraessigsäure, Zitro- verwendet werden. Für diesen Zweck werden 0,1 ml

nensäure, Weinsäure, Glucuronsäure, Zuckersäure io des zu untersuchenden Urins dem Reagens zuge-

und geeignete Salze dieser Säuren, z.B. Alkalisalze, fügt.

Ammonium- und substituierte Ammoniumsalze, fer- ...

ner Polyäthylenglycole und Polyaminocarboxylate. Beispiel I

Mit Äthylendiamintetraessigsäure verwandte Verbin- 0,5 g Antiserum wurden in 100 ml eines 11,13 g

düngen, z. B. Methylaminodiessigsäure, (2-Carboxy- 15 Zitronensäure und 8,53 g Kaliumhydroxyd je Liter

phenyl)-imino-Diessigsäure, Uramil-N, N-diessig- enthaltenden Zitratpuffers gelöst. Nach gleichmäßiger

säure, Nitriloessigsäure und geeignete Salze derselben Verteilung über 100 Phiolen wurde diese Lösung

können ebenfalls für den vorliegenden Zweck ver- lyophilisiert. Vor Ausführung der Bestimmung wur-

wendet werden. Jedoch werden Äthylendiamintetra- den jeder Phiole 10 ml destillierten Wassers zuge-

essigsäure, Zitronensäure und Alkali- und Animo- 20 setzt. Dann wurden 0,4 ml dieser Lösung einer lvo-

niumsalze derselben bevorzugt. lumprozentigen lyophilisierten Suspension von sensi-^

Das chelatbildende Mittel kann einem der Be- bilisierten Erythrocyten in 0,25 ml destilliertem Was-

standteile des Testgemisches von Antiserum und ser zugesetzt. Mit diesem Reagens kann eine direkte

Erythrocyten oder der Mischung selbst vor Zugabe Bestimmung durchgeführt werden,
der zu untersuchenden Flüssigkeit zugesetzt werden. 25

Das chelatbildende Mittel wird gewöhnlich als wäß- B e i s ρ i e 1 3
rige Lösung zugesetzt. Vorzugsweise wird das chelatbildende Mittel einer Lösung des Antiserums oder 10 ml einer Suspension von mit Gonadotropin seneiner Suspension der Erythrocyten zugesetzt, bevor sibilisierten Erythrocyten von 10 Volumprozent wurman diese lyophilisiert. 30 den in 33 ml eines 0,9% Natriumchlorid und 2 Ge-

Werden 0,4 ml einer Lösung von Antiserum mit wichtsprozent Kariinchenserum enthaltenden destileinem Titer von z. B. 1000 bis 5000 in einem Phos- lierten Wassers resuspendiert, wobei man 66,7 mg des. phatpuffer verwendet, dann fügt man vorzugsweise Natriumsalzes von Äthylendiamintetraessigsäure zu-0,2 Gewichtsprozent Äthylendiamintetraessigsäure zu. setzte. Hierauf wurden 0,05 ml dieser Suspension In praktisch allen Fällen genügt diese Menge voll- 35 0,4 ml der im Beispiel 1 beschriebenen Pufferlösung kommen, um alles im Urin anwesende Calcium zu zugesetzt, die 0,05 Gewichtsprozent Antiserum entbinden. Der Phosphatpuffer kann z. B. durch Auf- hielten. Das entstandene Gemisch ist als Reagenz für lösen von 2,9 g primärem Kaliumphosphat, 9,6 g Na- die Bestimmung des entsprechenden Gonadotropins triumphosphat und 4,5 g Natriumchlorid in destillier- geeignet.

tem Wasser und Auffüllen auf ein Volumen von 40 Schlüsse über die Gegenwart oder Abwesenheit

11 hergestellt werden. von Gonadotropin, die aus Bestimmungen mit diesem

Es ist auch möglich, einen Zitratpuffer statt eines Material gezogen werden, sind in all jenen Fällen Phosphatpuffers zu verwenden, wobei jener gleich- zuverlässig, in denen die Ergebnisse bekannter Testzeitig auch als chelatbildendes Mittel dienen kann. verfahren fehlerhaft oder zweifelhaft waren. So wurde

Zahlreiche Vergleichsversuche wurden mit Urin- 45 die Sicherheit des Bestimmungsverfahrens bedeutend

proben ausgeführt, die mit Sicherheit als positiv be- erhöht und die Genauigkeit wesentlich verbessert, was

kannt waren, folglich von schwangeren Frauen insbesondere bei quantitativen Untersuchungen einen

stammten. In Abhängigkeit vom Alter des Urins und großen Vorteil bietet. Abhängig von der Menge ver-

der Temperatur, bei der er gestanden hatte, lieferte wendetem Antiserum sind Mengen von ungefähr

die oben erwähnte bekannte Methode in 5 bis 10 %> so 100 Einheiten Choriongonadotropin je Liter Urin

der untersuchten Fälle ein zweifelhaftes oder negati- und mehr leicht nachweisbar. Ferner ist es jetzt auch

ves Ergebnis. All diese Proben wurden nach dem er- möglich, genaue Bestimmungen mit Urin auszufüh-

findungsgemäßen Verfahren erneut untersucht, wobei ren, der einige Zeit gestanden hatte, was bisher nicht

sowohl die zweifelhaften, als auch die angeblich nega- gut möglich war. Ein zusätzlicher Vorteil besteht

tiven Proben ein klares und positives Resultat gaben. 55 darin, daß der Zusatz eines chelatbildenden Mittels

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Bei- zum Reaktionsgemisch auch zur Bindung allen anspiele näher erläutert. wesenden Zinks, das ebenfalls die Bestimmung stören

kann, führt.
Beispiell

Es wurde eine Pufferlösung hergestellt, die folgende Menge von Verbirfdungen je Liter enthielt: Patentansprüche:

2,88 g primäres Kaliumphosphat,

9,62 g sekundäres Natriumphosphat, g₅ 1. Reagens zur Bestimmung gonadotroper

4,5 g Natriumchlorid, welchem 2,0 g des Di- Hormone mit einem Gehalt an mit einem

natriumsalzes der Äthylendiamintetra- Gonadotropin sensibilisierten Erythrocyten und

essigsäure zugegeben wurden. einem Antiserum gegen dieses Gonadotropin, ge -

kennzeichnet durch einen Gehalt an einer ausreichenden Menge eines chelatbildenden Mittels zur Bindung von in der zu untersuchenden Flüssigkeit anwesenden Calciumionen.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erythrocyten und das Antiserum lyophylisiert sind und eines derselben das chelatbildende Mittel enthält.

3. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als chelatbildendes Mittel Äthylendiamintetraessigsäure oder Zitronensäure bzw. deren Alkali- oder Ammoniumsalz enthält.

In Betracht gezogene Druckschriften:

Acta Endocrinologica, 35, 1960, S. 261 bis 267;

Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, Vol. 76, 1951, S. 619 und 620;

American Journal of Clinical Pathology, Vol. 23, 1953, S. 613 bis 618;

The Journal of Experimental Medicine, Vol. 102, 1955, S. 631 bis 645;

American Journal of Obstetrics and Gynecology, Vol. 80, 1960, S. 596 bis 600;

Journal of Int. Arch. Allergy, Vol. 11, 1957, S. 129 bis 152.

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