CN109115745B - 淋巴细胞辐射受损sers检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供一种淋巴细胞辐射受损SERS检测方法，属于辐射生物剂量估算技术领域。该方法包括：将金壳磁珠、淋巴细胞、SERS标签通入微流控芯片内，待微流控芯片内充满溶液时停止进样并发生孵育反应，使金壳磁珠捕获淋巴细胞并进而与SERS标签发生偶联；在微流控芯片的检测区外置磁铁，待金壳磁珠在磁铁的磁场下全部富集后，将微流控芯片置于便携式拉曼光谱仪上，并进行拉曼检测。通过制备基于金壳磁珠拉曼基底的微流控芯片，相较于传统微流控芯片具有较高的SERS性能，且具有检测集成化、自动化、小型化等优点，克服了传统检测方法步骤复杂、受人为因素干扰较大、不便携、纳米粒子失效等问题。

Description

淋巴细胞辐射受损SERS检测方法

技术领域

本发明实施例涉及辐射生物剂量估算技术领域，更具体地，涉及一种淋巴细胞辐射受损SERS检测方法。

背景技术

电离辐射将导致人淋巴细胞中的组蛋白H2AX磷酸化为γ-H2AX，测定人外周血淋巴细胞中γ-H2AX表达水平可作为辐射损伤程度的表征。目前用于淋巴细胞γ-H2AX的检测主要有流式细胞技术与荧光检测技术，流式细胞技术具有检测精度高、特异性强等优点，但由于较高的成本、操作专业性较高等因素不利于该技术的大范围推广。荧光检测技术广泛应用于γ-H2AX的检测，具有技术成熟、特异性强、敏感性高，但荧光检测存在非特异性染色和漂白，并且荧光容易产生淬灭现象。

表面增强拉曼散射(SERS)技术是一种新兴的光谱检测技术，SERS技术因其高检测灵敏度，高检测通量、强大的抗干扰能力、简单的样品前处理等优点在在病原微生物检测、癌症预查、食品安全、环境污染等领域获得了广泛的应用。此外，SERS技术具有的优异分子特异性使得高分辨率SERS谱峰就可以给出丰富的特征分子结构信息，SERS技术又被称为“指纹谱”检测方法。超顺磁性纳米材料由于其高分散性、优秀的生物亲和性、磁响应特性等优点被广泛应用与生物样品提纯、分选、捕获及表面增强拉曼散射等诸多领域。磁性颗粒代替传统离心技术实现溶液中目标物的富集和捕获。此外，核壳复合结构的磁性颗粒如金壳磁珠、银壳磁珠等，由于颗粒具有纳米级贵金属粗糙表面，可以放大吸附分子的拉曼信号，所以可以采用复合磁性颗粒实现目标样品的高效捕获及检测。

微流控芯片是指在微米和纳米尺度对流体进行操作和处理的特殊技术平台。即在几平方厘米的单晶硅，石英、玻璃或者聚合物等材料上刻制出微流道，并实现对样品的预处理、反应、分离和检测。微流控芯片以其微型化、高通量、低消耗和快速检测的优点成为近年来化学分析领域的研究热点。

将SERS技术与微流控芯片技术结合起来实现对有关物质的检测已经成为研究的热点。传统的微流控SERS检测芯片将事先制备好的拉曼基底转移到微流控芯片上。这种加工成本高且耗时费力。具有拉曼增强性能的纳米粒子是另一种应用于微流控SERS检测芯片的增强基底。但是，由于纳米粒子存在沉降、团聚等问题会导致纳米粒子失效从而给检测带来不良影响。因此，有必要提供种方法用于淋巴细胞γ-H2AX的检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明实施例提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的淋巴细胞辐射受损SERS检测方法。

根据本发明实施例的一方面，提供了一种淋巴细胞辐射受损SERS检测方法，该方法包括：

将金壳磁珠、淋巴细胞、SERS标签通入微流控芯片内，待微流控芯片内充满溶液时停止进样，并发生孵育反应，使金壳磁珠捕获淋巴细胞并进而与SERS标签发生偶联；

在微流控芯片的检测区外置磁铁，待金壳磁珠在磁铁的磁场下全部富集后，将微流控芯片置于便携式拉曼光谱仪上，并进行拉曼检测。

本发明实施例提供的方法，通过制备基于金壳磁珠拉曼基底的微流控芯片，相较于传统微流控芯片具有较高的SERS性能，克服了传统基底制备成本高及纳米粒子失效问题，且具有检测集成化、自动化、小型化等优点，克服了传统检测方法步骤复杂、受人为因素干扰较大、不便携等问题。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述是示例性和解释性的，并不能限制本发明实施例。

附图说明

图1为本发明实施例的一种淋巴细胞辐射受损SERS检测方法的流程示意图；

图2为本发明实施例的一种微流控芯片制备工艺流程图；

图3为本发明实施例的一种金壳磁珠制备工艺流程图及生物修饰的过程示意图；

图4为本发明实施例的一种制得金壳磁珠透射电镜表征图；

图5为本发明实施例的一种纳米金颗粒生物修饰流程图；

图6为本发明实施例的一种制得纳米金颗粒透射电镜表征图；

图7为本发明实施例的一种微流道结构尺寸图；

图8为本发明实施例的一种微流控芯片示意图；

图9为本发明实施例的一种检测实验流程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明实施例的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明实施例，但不用来限制本发明实施例的范围。

本发明实施例提供了一种淋巴细胞辐射受损SERS检测方法。参见图1，该方法包括：101、将金壳磁珠、淋巴细胞、SERS标签通入微流控芯片内，待微流控芯片内充满溶液时停止进样，并发生孵育反应，使金壳磁珠捕获淋巴细胞并进而与SERS标签发生偶联；102、在微流控芯片的检测区外置磁铁，待金壳磁珠在磁铁的磁场下全部富集后，将微流控芯片置于便携式拉曼光谱仪上，并进行拉曼检测。

在执行上述步骤101之前，本发明实施例设计了一种被动式混合微流道。其中，微流道分为进样区、检测区、出样区。在混合处对微流道的结构做急剧修改，可以起到增加混液效果。另外，在执行步骤101之前，还可通过溶剂热法制备得到四氧化三铁核，并在制备得到四氧化三铁核后，通过四氧化三铁核制备金壳磁珠。

作为一种可选实施例，本发明实施例提供了一种通过溶剂热法制备四氧化三铁核的方法，该方法包括：在磁力搅拌下，将FeCl₃·6H2O(5mmol，1.35g)溶解到40mL乙二醇(EG)中，呈澄清透明溶液；加入NaOAc(3.6g)和PEG(1g)，进行磁力搅拌30min，溶液呈亮黄色，但PEG并未完全溶解；转移到事先加热到90℃的油浴中，加热10min，使PEG完全溶解，然后磁力搅拌10min，使其混合均匀；转移到50mL的高压反应釜中，密封后放置到干燥箱中在205℃下反应10h；反应结束后，随炉冷却至室温，采用磁分离的方法，用乙醇洗3～5次；将得到的黑色产物置入60℃的真空干燥箱中干燥24h，得到Fe3O4。其中，四氧化三铁核合成过程所用到的主要试剂可如下表1所示，后续过程中涉及到的各项化合物可如下表2所示。

表1

表2

作为一种可选实施例，本发明实施例还提供了一种通过四氧化三铁核制备金壳磁珠的方法，包括：在超声条件下，将1g的PEI溶解到200mL去离子水中，形成5mg/mL的PEI溶液，将0.1g的四氧化三铁核加入到PEI溶液中，并超声处理20min，得到PEI修饰的四氧化三铁(Fe3O4@PEI)；将PEI修饰的四氧化三铁通过磁富集用去离子水清洗5次，去除过量的未自组装在锰铁氧体表面的游离的PEI；在超声条件下，将PEI修饰的四氧化三铁的溶液(～1mg/mL)加入到15mL去离子水中，使PEI修饰的四氧化三铁分散均匀；加入250mgPVP和200μL事先配好的盐酸羟胺溶液(50mg/mL)，加入氯金酸3～5min的超声反应，通过磁富集手段，用去离子水清洗3～5次，得到黑色产物，将得到的黑色产物置入60度的真空干燥箱中干燥24h，得到金壳磁珠。

作为一种可选实施例，在制备得到金壳磁珠之后，还可对金壳磁珠进行生物修饰。本发明实施例提供了一种对金壳磁珠进行生物修饰的方法，包括：将5mg/mL的金壳磁珠的溶液用终浓度为1μM的MU和MUA混合乙醇溶液超声处理1h后过夜；将过夜后得到的溶液用乙醇清洗5次，去除过量的MU和MUA，将100μLEDC溶液和20μLNHS溶液加入到100μL，得到羧基化的金壳磁珠溶液；在羧基化的金壳磁珠溶液中加入PBST，使羧基化的金壳磁珠溶液总体积达到1mL，并在振荡条件下活化15min；将50μLCD3抗体加入到活化后的溶液中，恒温混匀1小时，通过磁富集手段，用去离子水清洗3次，去除过量的抗体，得到结合CD3抗体后的金壳磁珠。

将上述得到的抗体修饰的金壳磁珠用乙醇胺(1％，v/v)封闭1h，然后通过磁富集，用去离子水清洗3次，重悬到100μLPBS溶液中备用。

作为一种可选实施例，本发明实施例还提供了一种制备及修饰SETS标签的方法，包括：取100ml氯金酸溶液搅拌并加热至沸腾，将1.5ml浓度为1％的柠檬酸钠溶液加入到沸腾的HAuCl₄溶液中，边加热边搅拌到沸腾；其中，混合溶液的颜色由透明色逐渐加深，变为黑褐色，再由黑褐色转变为酒红色；待混合溶液颜色稳定后，停止加热，保持搅拌至混合溶液冷却到室温，取5ml纳米金颗粒加入5μLMBA磁力搅拌2h，结束后离心去除上清液，用去离子水重悬至5ml，制备得到SERS标签。

对SERS标签进行修饰的过程如下：在1ml上述过程得到的溶液中加入10μLγ-H2AX抗体(1mg/ml in PBS)加入到步骤3得到的溶液中，恒温混匀1小时。结束后，通过离心(3000rpm，5min)去除上清液，再加入PBS重悬至1mlPBS溶液中备用。

在完成上述工作后，可进行淋巴细胞辐射受损SERS检测。具体地，可将金壳磁珠、人外周全血(淋巴细胞)、SERS标签同时通入微流控芯片内，流速为1.2μL/min，待芯片内充满溶液时停止进样，同时在常温下静置10min后，在芯片捕获区下部外置磁铁，待金壳磁珠全部富集后通入过量的PBS清洗芯片内部。将芯片置于便携式拉曼光谱仪上，调整焦距使清晰成像，随后进行拉曼检测。

其中，图2为微流控芯片制备工艺流程图。图3为金壳磁珠制备工艺流程图及生物修饰的过程示意图。图4为制得金壳磁珠透射电镜表征图。图5为纳米金颗粒生物修饰流程图。图6为制得纳米金颗粒透射电镜表征图。图7为微流道结构尺寸图。图8为微流控芯片示意图。图9为检测实验流程图。

本发明实施例提供的方法，通过制备基于金壳磁珠拉曼基底的微流控芯片，相较于传统微流控芯片具有较高的SERS性能，克服了传统基底制备成本及纳米粒子失效问题。另外，由于制备的金壳磁珠，内核为超顺磁性的四氧化三铁，磁性颗粒表面包覆有连续的纳米金壳。采用该种方法制备得到的金壳磁珠具有粒径均一、金壳包覆完整、磁响应特性好、SERS性能优异，且制备工艺简便。最后，通过本发明实施例所制作的产品在作为生物传感在淋巴细胞辐射受损检测时，检测灵敏度高、实验操作简便、可靠性高，试剂消耗少。

需要说明的是，上述所有可选实施例，可以采用任意结合形成本发明的可选实施例，在此不再一一赘述。

最后，本申请的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明实施例的保护范围。凡在本发明实施例的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明实施例的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种淋巴细胞辐射受损SERS检测方法，其特征在于，包括：

(1)在磁力搅拌下，将FeCl₃·6H₂O溶解到40mL乙二醇中，直至得到澄清透明的溶液；

在所述溶液中加入NaOAc和PEG，进行磁力搅拌30min，直至溶液呈亮黄色，将所述溶液转移到事先加热到90度的油浴中，加热10min，使PEG完全溶解，然后磁力搅拌10min，使所述溶液混合均匀；

将所述溶液转移到50mL的高压反应釜中，密封后放置到干燥箱中在205度下反应10h，反应结束后，随着炉冷却至室温，采用磁分离的方法，用乙醇洗3～5次，将得到的黑色产物置入60度的真空干燥箱中干燥24h，得到四氧化三铁核；

(2)在超声条件下，将1g的PEI溶解到200mL去离子水中，形成5mg/mL的PEI溶液，将0.1g的四氧化三铁核所述加入到所述PEI溶液中，并超声处理20min，得到PEI修饰的四氧化三铁；

将PEI修饰的四氧化三铁通过磁富集用去离子水清洗5次，去除过量的未自组装在锰铁氧体表面的游离的PEI；

在超声条件下，将PEI修饰的四氧化三铁的溶液加入到15mL去离子水中，使PEI修饰的四氧化三铁分散均匀；

加入250mgPVP和200μL事先配好的盐酸羟胺溶液，加入氯金酸3～5min的超声反应，通过磁富集手段，用去离子水清洗3～5次，得到黑色产物，将得到的黑色产物置入60度的真空干燥箱中干燥24h，得到金壳磁珠；

(3)将5mg/mL的所述金壳磁珠的溶液用终浓度为1μM的MU和MUA混合乙醇溶液超声处理1h后过夜；

将过夜后得到的溶液用乙醇清洗5次，去除过量的MU和MUA，将100μLEDC溶液和20μLNHS溶液加入到100μL，得到羧基化的金壳磁珠溶液；

在羧基化的金壳磁珠溶液中加入PBST，使羧基化的金壳磁珠溶液总体积达到1mL，并在振荡条件下活化15min；

将50μLCD3抗体加入到活化后的溶液中，恒温混匀1小时，通过磁富集手段，用去离子水清洗3次，去除过量的抗体，得到结合CD3抗体后的金壳磁珠；

(4)取100ml氯金酸溶液搅拌并加热至沸腾，将1.5ml浓度为1％的柠檬酸钠溶液加入到沸腾的HAuCl4溶液中，边加热边搅拌到沸腾；其中，混合溶液的颜色由透明色逐渐加深，变为黑褐色，再由黑褐色转变为酒红色；

待混合溶液颜色稳定后，停止加热，保持搅拌至混合溶液冷却到室温，取5ml纳米金颗粒加入5μLMBA磁力搅拌2h，结束后离心去除上清液，用去离子水重悬至5ml，制备得到SERS标签；

对SERS标签进行修饰的过程如下：在1ml上述过程制备得到的含有SERS标签的溶液中加入10μL浓度为1mg/ml的γ-H2AX抗体的PBS溶液，恒温混匀1小时；结束后，在3000rpm离心5min以去除上清液，再加入PBS重悬至1mlPBS溶液中备用；

(5)将金壳磁珠、淋巴细胞、SERS标签通入微流控芯片内，待所述微流控芯片内充满溶液时停止进样，并发生孵育反应，使所述金壳磁珠捕获所述淋巴细胞并进而与所述SERS标签发生偶联；

在所述微流控芯片的检测区外置磁铁，待所述金壳磁珠在所述磁铁的磁场下全部富集后，将所述微流控芯片置于便携式拉曼光谱仪上，并进行拉曼检测。

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