CN104513819A - 一种选择性提取dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种选择性提取DNA的方法属于生物技术的技术领域。步骤有，将表面修饰后的固相介质和DNA样品的溶液混合，加入中性盐并使混合溶液中盐浓度为0.4～0.5mol/L，调节混合溶液pH至4～5，震荡20～30分钟，离心分离；再将吸附上清液的pH值调至3～4加入表面修饰后的固相介质，并震荡20～30分钟，离心分离；将每次分离出来的吸附了DNA分子的固相介质分别分散在pH为8.0～11.0的水溶液中，震荡20～30分钟；离心分离，即可分别获得不同长度的DNA溶液。本发明的方法可选择性提取DNA分子，具有选择提取效率高、原料简单廉价易得、操作快速便捷等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术的技术领域，特别涉及一种基于盐屏蔽作用的利用固相介质选择性提取不同片段DNA的方法。
背景技术
DNA提取是分子生物学、生物化学、医学等领域的一项基础工作。随着DNA分子技术在临床疾病诊断、进出口检验检疫、法医学检验、血液质量控制等领域基础与应用研究的逐渐深入。对DNA分子进行选择性以及目的性提取特别是对小片段DNA的选择性提取已经成为了DNA分析技术应用推广的一个难题。
1979年，以二氧化硅为基质的固相提取DNA方法第一次被提出。目前商业上应用的提取DNA试剂盒主要是磁珠法、玻璃珠法等以二氧化硅为基质，采用向体系中加入高浓度的盐，通过盐桥建立的静电相互作用实现DNA的吸附和脱附，从而达到提取纯化DNA的目的。然而由于该种方法依靠的是间接的静电相互作用力，它的提取效率只有70％左右，并且它对DNA的吸附没有选择性，另外对小片段DNA分子的吸附效果甚微。近年来，细胞外血浆中游离小片段DNA(cfDNA)越来越多的引起人们的重视，它的成功纯化富集对非侵入性产前诊测、恶性肿瘤早期诊断、癌症治疗过程检测等临床疾病诊疗过程具有重要意义。此外，受第二代测序技术对目标DNA片段长度的限制(通常要求在一个合适的范围内如～200bp)，因此急需一种高效选择性提取小片段DNA的方法。目前，选择性提取不同长度片段DNA通常是采用凝胶电泳回收法，这种方法不仅费时费力，且存在易污染、回收效率低等诸多弊端。因此，寻求一种便捷，高效，安全无污染的选择性提取不同片段DNA分子尤其是提取小片段DNA分子具有十分重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术提取DNA分子的缺点，提供一种可高效选择性提取不同片段DNA分子的方法。
具体的技术方案如下。
一种选择性提取DNA的方法，具体步骤为：(1)将用硅烷偶联试剂进行表面修饰的固相介质和DNA样品的溶液混合，表面修饰后的固相介质的用量是全部DNA样品质量的100～200倍，加入中性盐并使混合溶液中盐浓度为0.4～0.5mol/L，调节混合溶液pH至4～5，将混合溶液震荡20～30分钟以完成长片段DNA分子与固相介质之间的静电吸附，所述的长片段DNA是指片段长度大于或等于400bp的DNA；采用离心分离的方式，分离吸附了长片段DNA的固相介质和含短片段DNA的吸附上清液；然后，将含短片段DNA的吸附上清液的pH值调至3～4再加入固相介质并震荡20～30分钟，以完成短片段DNA分子与固相介质之间的静电吸附，所述的短片段DNA是指片段长度小于或等于200bp的DNA；固相介质的用量大于或等于剩余DNA样品质量的300倍，采用离心分离方式，分离出吸附了短片段DNA的固相介质；
(2)将两次分离出来的吸附了DNA的固相介质分别分散在pH为8.0～11.0的水溶液中，震荡20～30分钟以完成DNA分子与固相介质之间的静电脱附；采用离心分离的方式，分离出固相介质，分别获得长片段DNA溶液和短片段DNA溶液。
当长片段DNA样品包含两种不同长度的长片段DNA时，还能够将两种不同长度的长片段DNA分离开，具体过程是：将步骤(2)得到的长片段DNA溶液的pH值调节至4.0～5.0，长片段DNA溶液中盐浓度调节至0.6～0.8mol/L，加入表面修饰后的固相介质，震荡20～30分钟以完成最长片段DNA分子与固相介质之间的静电吸附，表面修饰后的固相介质的用量为长片段DNA样品总质量的100～200倍，所述的最长片段DNA是指片段长度大于或等于1000bp的DNA；离心分离吸附了最长片段DNA的固相介质和含次长片段DNA的吸附上清液；然后调节含次长片段DNA的吸附上清液pH值至3～4，加入表面修饰后的固相介质，震荡20～30分钟以完成次长片段DNA分子与固相介质之间的静电吸附，表面修饰后的固相介质的用量为大于或等于次长片段DNA样品质量的300倍，所述的次长片段DNA是指片段长度大于或等于400bp且比最长片段DNA的片段长度短250bp或250bp以上的DNA；离心分离出吸附了次长片段DNA的固相介质；将分离出来的吸附了最长片段DNA的固相介质和吸附了次长片段DNA的固相介质分别分散在pH为8.0～11.0的水溶液中，震荡20～30分钟以完成DNA分子与固相介质之间的静电脱附；采用离心分离的方式，分离出固相介质，分别获得最长片段DNA溶液和次长片段DNA溶液。
本发明步骤(1)中所述的中性盐，优选NaCl或KCl。
本发明步骤(1)中所述的固相介质优选尺寸在微米区间的硅藻土、尺寸在毫米区间的玻璃珠、尺寸范围在50μm～100nm的无定形的氧化硅微粒、尺寸范围在50μm～100nm的介孔氧化硅微粒、尺寸范围在50μm～100nm的无定形氧化硅包覆磁性内核微粒或尺寸范围在50μm～100nm的介孔氧化硅包覆磁性内核微粒，所述的磁性内核为Fe，Co，Ni，Fe3O4，Fe2O3或其混合物。
本发明步骤(1)中所述的用硅烷偶联试剂进行表面修饰的固相介质，可用现有方法得到，也可按下述方法得到：
将氨基酸溶于水中，调节溶液pH值至11，将溶液置于冰水浴中，缓慢加入与氨基酸等摩尔量的3-环氧基丙基三甲氧基硅烷，将反应溶液升温至65℃，搅拌反应4小时，再加入与氨基酸等摩尔量的3-环氧基丙基三甲氧基硅烷继续搅拌反应4小时，获得末端带有氨基酸衍生基团的硅烷偶联剂；
取固相介质并分散在水中，加入末端带有氨基酸衍生基团的硅烷偶联剂，硅烷偶联剂的用量为每克固相介质使用130ml，调整溶液pH值至3.0，在60℃反应3小时，将固相介质用离心或磁吸分离出再用水和乙醇分别洗涤两次，即得到表面修饰后的固相介质。
本发明的方法有以下有益效果：
1、对DNA同时具有高的吸附效率和脱附效率，总提取效率高。
2、可以选择性分离不同片段长度尤其是两种或两种以上片段长度相差300bp以上的小片段DNA，从而对DNA进行选择性提取。
3、选择性提取效率高，尤其对短片段DNA的选择性提取效率在90％以上。
4、原料简单廉价易得，操作快速便捷。
附图说明
图1是实施例3、4、6的相关琼脂糖凝胶电泳图。
图2是实施例9的相关琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
借助以下实施例对本发明做进一步描述，应理解，以下实施例是示范性的，而不是限制性的，可根据上述发明的技术方案和实际情况，来确定具体的实施方法。
本发明中所述的DNA吸附率，是固相介质吸附的DNA质量与原溶液中该DNA总质量的比值。不同长度片段DNA选择性吸附效率是通过琼脂糖凝胶电泳图像软件定量得到。选择性提取效率是指经过吸附和脱附后最终提取出的全部DNA中，指定片段长度的DNA所占的质量百分比。
实施例1
将0.5mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在100μl含有2000bp质粒DNA和100bp线性双链DNA分子(浓度均为25ng/μl)的水溶液中，用NaCl调节体系中Na+浓度为0.4mol/L。调节溶液pH值为5.0，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分出吸附了DNA的硅藻土粒子。另取0.75mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在上述吸附上清中，溶液pH值调节为4.0。混匀后摇床震荡20分钟，用6000rpm离心分出第二次吸附了DNA的硅藻土微粒。
将两次离心分离出的吸附了DNA的硅藻土微粒分别分散在pH＝8.0的水溶液中，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分离出硅藻土微粒。测量两次脱附上清中DNA量，可得选择性提取效率达到97％。
实施例2
将1.0mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在100μl含有2000bp质粒DNA和100bp线性双链DNA分子(浓度均为25ng/μl)的水溶液中，用KCl调节体系中K+浓度为0.5mol/L。调节溶液pH值为4.0，混匀后摇床震荡30分钟。用6000rpm离心分出吸附了DNA的硅藻土粒子。另取1.0mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在上述吸附上清中，溶液pH值调节为3.0。混匀后摇床震荡20分钟，用6000rpm离心分出第二次吸附了DNA的硅藻土微粒。
将两次离心分离出的吸附了DNA的硅藻土微粒分别分散在pH＝11.0的水溶液中，混匀后摇床震荡30分钟。用6000rpm离心分离出硅藻土微粒。测量两次脱附上清中DNA量，可得选择性提取效率达到95％。
实施例3
将0.5mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在100μl含有1000bp和100bp线性双链DNA分子(浓度各为25ng/μl)的水溶液中，调节体系中盐浓度为0.4mol/L，调节溶液pH值为5.0，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分出吸附了DNA的硅藻土微粒。另取1.0mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在上述吸附上清中，溶液pH值调节为4.0。混匀后摇床震荡20分钟，用6000rpm离心分出第二次吸附了DNA的硅藻土微粒。
将两次离心分离出的吸附了DNA的硅藻土微粒分散在pH＝10.0的水溶液中，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分离出硅藻土微粒。测量两次脱附上清中DNA量，并进行琼脂糖凝胶电泳定性及定量观察选择性分离1000bp和100bp DNA情况，如图1中的2a、2d所示。从琼脂糖凝胶电泳图中可以看到硅藻土两次吸附的DNA分子分别为1000bp和100bp，采用定量软件计算得到选择性提取效率为95％，图中的S1、1a和1d是对照组，S1为空白对照、1a和1d是0M盐浓度下吸附上清和脱附上清的对照。从对照组可以看出，在不使用盐的情况下是不能将1000bp和100bp两种片段长度的DNA进行分离的。
实施例4
将0.5mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在100μl含有750bp和100bp线性双链DNA分子(浓度各为25ng/μl)的水溶液中，调节体系中盐浓度为0.4mol/L，调节溶液pH值为5.0，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分出吸附了DNA的硅藻土微粒。另取1.0mg表面赖氨酸修饰的硅藻土粒子分散在上述吸附上清中，溶液pH值调节为4.0。混匀后摇床震荡20分钟，用6000rpm离心分出第二次吸附了DNA的硅藻土微粒。
将两次离心分离出的吸附了DNA的硅藻土微粒分别分散在pH＝10.0的水溶液中，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分离出硅藻土微粒。测量两次脱附上清中DNA量，并进行琼脂糖凝胶电泳定性及定量观察选择性分离750bp和100bp DNA情况，如图1中的4a、4d所示。从琼脂糖凝胶电泳图中可以看到硅藻土两次吸附的DNA分子分别为750bp和100bp，采用定量软件计算得到选择性提取效率为93％。图中的S3、3a和3d是对照组，S3为空白对照、3a和3d是0M盐浓度下吸附上清和脱附上清的对照。从对照组可以看出，在不使用盐的情况下是不能将750bp和100bp两种片段长度的DNA进行分离的。
实施例5
将0.5mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在100μl含有500bp和100bp线性双链DNA分子(浓度各为25ng/μl)的水溶液中，调节体系中盐浓度为0.4mol/L，调节溶液pH值为5.0，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分出吸附了DNA的硅藻土微粒。另取1.0mg表面赖氨酸修饰的硅藻土粒子分散在上述吸附上清中，溶液pH值调节为4.0。混匀后摇床震荡20分钟，用6000rpm离心分出第二次吸附了DNA的硅藻土粒子。
将两次离心分离出的吸附了DNA的硅藻土微粒分别分散在pH＝10.0的水溶液中，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分离出硅藻土微粒。测量两次脱附上清中DNA量，可得提取效率为94％。
实施例6
将0.5mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在100μl含有400bp和100bp线性双链DNA分子(浓度各为25ng/μl)的水溶液中，调节体系中盐浓度为0.4mol/L，调节溶液pH值为5.0，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分出吸附了DNA的硅藻土微粒。另取1.0mg表面赖氨酸修饰的硅藻土粒子分散在上述吸附上清中，溶液pH值调节为4.0。混匀后摇床震荡20分钟，用6000rpm离心分出第二次吸附了DNA的硅藻土粒子。
将两次离心分离出的吸附了DNA的硅藻土微粒分别分散在pH＝10.0的水溶液中，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分离出硅藻土微粒。测量两次脱附上清中DNA量，并进行琼脂糖凝胶电泳定性及定量观察选择性分离400bp和100bp DNA情况，如图1中的6a和6d所示。从琼脂糖凝胶电泳图中可以看到硅藻土两次吸附的DNA分子分别为400bp和100bp，采用定量软件计算得到选择性提取效率为92％。图中的S5、5a和5d是对照组，S5为空白对照、5a和5d是0M盐浓度下吸附上清和脱附上清的对照。从对照组可以看出，在不使用盐的情况下是不能将400bp和100bp两种片段长度的DNA进行分离的。
实施例7
将0.5mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在100μl含有1000bp和200bp线性双链DNA分子(浓度各为25ng/μl)的水溶液中，调节体系中盐浓度为0.4mol/L，调节溶液pH值为5.0，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分出吸附了DNA的硅藻土微粒。另取1.0mg表面赖氨酸修饰的硅藻土粒子分散在上述吸附上清中，溶液pH值调节为4.0。混匀后摇床震荡20分钟，用6000rpm离心分出第二次吸附了DNA的硅藻土粒子。
将两次离心分离出的吸附了DNA的硅藻土微粒分别分散在pH＝10.0的水溶液中，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分离出硅藻土微粒。测量两次脱附上清中DNA量，可得选择性提取效率为90％。
实施例8
将0.8mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在100μl含有1000bp、750bp和100bp三种片段长度DNA分子(浓度各为25ng/μl)的水溶液中，调节体系中盐浓度为0.4mol/L，调节溶液pH值为5.0，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分离出第一次吸附了DNA的硅藻土微粒。再取1.0mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在吸附后上清中，溶液pH值调节为4.0。混匀后摇床震荡20分钟，用6000rpm离心分出第二次吸附了DNA的硅藻土微粒。
将第一次吸附了DNA的硅藻土微粒分散在pH＝10.0的水溶液中，混匀后摇床震荡20分钟进行静电脱附。用6000rpm离心分离出硅藻土微粒。取0.5mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在上述脱附上清中，溶液pH值调节为5.0，加入盐浓度至0.8mol/L。混匀后摇床震荡20分钟，用6000rpm离心分出第三次吸附了DNA的硅藻土微粒，再取1.0mg表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒分散在上述第三次吸附上清中，溶液pH值调节为4.0，混匀后摇床震荡20分钟，用6000rpm离心分出第四次吸附了DNA的硅藻土微粒。
将第三次、第四次、第二次离心分离出的吸附了DNA的硅藻土微粒分别分散在pH＝10.0的水溶液中，混匀后摇床震荡20分钟。用6000rpm离心分离出硅藻土微粒。测量各脱附上清中DNA量，并进行琼脂糖凝胶电泳定性及定量观察选择性分离1000bp、750bp、100bp DNA情况及效率，如图2中的2a、3a、3d所示。从琼脂糖凝胶电泳图中可以看到三次脱附得到的DNA分子依次为1000bp、750bp和100bp，采用定量软件计算得到100bp DNA选择性提取效率为95％，750bp DNA的选择性提取效率为88％，1000bp DNA的选择性提取效率为80％。图中的S、1a、1d分别为空白对照，0M盐吸附上清和0M盐脱附上清对照实验。
实施例9
将实施例6中的固相介质由表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒改为表面赖氨酸修饰的300nm无定型二氧化硅纳米粒子，其余条件不变，也能将400bp和100bp的DNA分离，选择性提取效率为93％。
实施例10
将实施例6中的固相介质由表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒改为表面赖氨酸修饰的300nm介孔二氧化硅包覆Fe3O4纳米粒子，其余条件不变，也能将400bp和100bp的DNA分离，选择性提取效率为90％。
实施例11
将实施例6中的固相介质由表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒改为表面精氨酸修饰的硅藻土微粒，其余条件不变，也能将400bp和100bp的DNA分离，选择性提取效率为90％。
实施例12
将实施例5中的固相介质由表面赖氨酸修饰的硅藻土微粒改为表面组氨酸修饰的硅藻土微粒，其余条件不变，也能将500bp和100bp的DNA分离，选择性提取效率为94％。
Claims (5)
1.一种选择性提取DNA的方法，具体步骤为：(1)将用硅烷偶联试剂进行表面修饰的固相介质和DNA样品的溶液混合，表面修饰的固相介质的用量是全部DNA样品质量的100～200倍，加入中性盐并使混合溶液中盐浓度为0.4～0.5mol/L，调节混合溶液pH至4～5，将混合溶液震荡20～30分钟以完成长片段DNA分子与固相介质之间的静电吸附，所述的长片段DNA是指片段长度大于或等于400bp的DNA；采用离心分离的方式，分离吸附了长片段DNA的固相介质和含短片段DNA的吸附上清液；然后，将含短片段DNA的吸附上清液的pH值调至3～4，再加入表面修饰后的固相介质并震荡20～30分钟，以完成短片段DNA分子与固相介质之间的静电吸附，所述的短片段DNA是指片段长度小于或等于200bp的DNA；固相介质的用量大于或等于剩余DNA样品质量的300倍，采用离心分离方式，分离出吸附了短片段DNA的固相介质；
(2)将两次分离出来的吸附了DNA的固相介质分别分散在pH为8.0～11.0的水溶液中，震荡20～30分钟以完成DNA分子与固相介质之间的静电脱附；采用离心分离的方式，分离出固相介质，分别获得长片段DNA溶液和短片段DNA溶液。
2.根据权利要求1所述的一种选择性提取DNA的方法，其特征在于，当长片段DNA样品包含两种不同长度的长片段DNA时，还能够将两种不同长度的长片段DNA分离开，具体过程是：将步骤(2)得到的长片段DNA溶液的pH值调节至4.0～5.0，长片段DNA溶液中盐浓度调节至0.6～0.8mol/L，加入表面修饰后的固相介质，震荡20～30分钟以完成最长片段DNA分子与固相介质之间的静电吸附，表面修饰后的固相介质的用量为长片段DNA样品总质量的100～200倍，所述的最长片段DNA是指片段长度大于或等于1000bp的DNA；离心分离吸附了最长片段DNA的固相介质和含次长片段DNA的吸附上清液；然后调节含次长片段DNA的吸附上清液pH值至3～4，加入表面修饰后的固相介质，震荡20～30分钟以完成次长片段DNA分子与固相介质之间的静电吸附，表面修饰后的固相介质的用量为大于或等于次长片段DNA样品质量的300倍，所述的次长片段DNA是指片段长度大于或等于400bp且比最长片段DNA的片段长度短250bp或250bp以上的DNA；离心分离出吸附了次长片段DNA的固相介质；将分离出来的吸附了最长片段DNA的固相介质和吸附了次长片段DNA的固相介质分别分散在pH为8.0～11.0的水溶液中，震荡20～30分钟以完成DNA分子与固相介质之间的静电脱附；采用离心分离的方式，分离出固相介质，分别获得最长片段DNA溶液和次长片段DNA溶液。
3.根据权利要求1或2所述的一种选择性提取DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的中性盐，是NaCl或KCl。
4.根据权利要求1或2所述的一种选择性提取DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的固相介质是尺寸在微米区间的硅藻土、尺寸在毫米区间的玻璃珠、尺寸范围在50μm～100nm的无定形的氧化硅微粒、尺寸范围在50μm～100nm的介孔氧化硅微粒、尺寸范围在50μm～100nm的无定形氧化硅包覆磁性内核微粒或尺寸范围在50μm～100nm的介孔氧化硅包覆磁性内核微粒，所述的磁性内核为Fe，Co，Ni，Fe3O4，Fe2O3或其混合物。
5.根据权利要求1或2所述的一种选择性提取DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的用硅烷偶联试剂进行表面修饰的固相介质，是按下述方法得到的：将氨基酸溶于水中，调节溶液pH值至11，将溶液置于冰水浴中，加入与氨基酸等摩尔量的3-环氧基丙基三甲氧基硅烷，将反应溶液升温至65℃，搅拌反应4小时，再加入与氨基酸等摩尔量的3-环氧基丙基三甲氧基硅烷继续搅拌反应4小时，获得末端带有氨基酸衍生基团的硅烷偶联剂；
取固相介质并分散在水中，加入末端带有氨基酸衍生基团的硅烷偶联剂，硅烷偶联剂的用量为每克固相介质使用130ml，调整溶液pH值至3.0，在60℃反应3小时，将固相介质用离心或磁吸分离出再用水和乙醇分别洗涤两次，即得到表面修饰后的固相介质。
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