CN109929831B - 金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤DNA的方法，属生物技术领域。本发明采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：1)先采用上样液平衡DNA富集材料，将该DNA富集材料与生物样品以质量比为100‑1000:1混合，孵化0.5分钟‑12小时，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；2)采用pH1‑6洗涤液，过滤或者离心分离，收集上层清液，得DNA，上述整个过程在10‑60℃进行，所述DNA富集材料为金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料。本发明的方法在提取循环肿瘤DNA方面表现出了高选择性和高通量等特点，可以实现循环肿瘤DNA的有效分离和富集。

Description

金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤DNA的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤DNA的方法。
背景技术
循环肿瘤DNA，即ctDNA(circulating tumor DNA)，是指肿瘤细胞经过细胞凋亡或者坏死产生的DNA片段释放进入循环系统。ctDNA存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中。由于ctDNA半衰期为1小时左右，能准确反映肿瘤当前情况，所以ctDNA可以作为组织活检的非侵入性替代方案。另外，ctDNA在癌症早期诊断、预后和测定药物治疗反应中发挥作用。
目前主流的ctDNA突变检测技术包括基于PCR扩增技术和基于DNA序列检测技术两类。但是不管哪种测序技术，都需要都对DNA进行富集和提取，以降低对扩增或者后续测序的干扰。
ctDNA的主要提取方法主要是基于硅球、磁性小球的固相萃取方法和基于苯酚-氯仿的液液提取方法。主要问题是提取效率和重新性。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤DNA的方法。
一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤DNA的方法，采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：
1)先采用上样液平衡DNA富集材料，将该DNA富集材料与生物样品以质量比为100-1000:1混合，孵化0.5分钟-12小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；
2)采用pH 1-6清洗液与沉淀混合，孵化0.5分钟-60分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；
3)采用pH 8-13洗脱液与沉淀混合，孵化0.5分钟-60分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctDNA，上述整个过程在10-60℃进行，
所述DNA富集材料为种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料。
所述金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料，其内核为金属纳米颗粒，其外壳的结构式为如下所示：
Figure BDA0001513121570000021
所述金属为Ag,Ti,Fe,Ga,Ni,Au,Pd或Pt。
所述生物样品为血液、滑膜液、脑脊液或尿液。
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，pH＝1-6。
所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，pH＝1-6。所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为氨水或三乙胺，有机溶剂体积浓度为10-50％，pH＝8-13。
本发明的有益效果为：本发明方法提取循环肿瘤DNA表现出了高选择性和高通量等特点，可以实现循环肿瘤DNA的有效分离和富集。
附图说明
图1为本发明一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料的制备示意图。
具体实施方式
本发明所述的一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料采用《ColloidalCarbon Spheres and Their Core/ShellStructures with Noble-Metal Nanoparticles》Angew.Chem.2004,116,607–611中的制备方法制备而得，其制备的过程如图1所示。制备出内核为Ag,Ti,Fe,Ga,Ni,Au,Pd或Pt纳米颗粒的一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料；其外壳的结构式为如下所示。
Figure BDA0001513121570000031
实施例1
一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤DNA的方法，所述的金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒采用上述方法制备而得，其中的内核为金纳米颗粒；采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：
1)先采用上样液平衡DNA富集材料，将该DNA富集材料与血液以质量比为100:1混合，孵化12小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；
2)采用pH 1-6清洗液与沉淀混合，孵化60分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；
3)采用pH 8-13洗脱液与沉淀混合，孵化60分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctDNA，上述整个过程在30℃进行。
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈，有机酸为甲酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，pH＝1-6。
所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈，有机酸为甲酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，pH＝1-6。
所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为乙腈，有机酸为氨水，有机溶剂体积浓度为10-50％，pH＝8-13。
经过标准品评价，经过DNA富集材料提取后，DNA的提取回收率是82％，覆盖度是84％。
实施例2
一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤DNA的方法，所述的金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒采用上述方法制备而得，其中内核为银纳米颗粒；采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：
1)先采用上样液平衡DNA富集材料，将该DNA富集材料与滑膜液以质量比为1000:1混合，孵化0.5分钟小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；
2)采用pH 1-6清洗液与沉淀混合，孵化0.5分钟分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；
3)采用pH 8-13洗脱液与沉淀混合，孵化0.5分钟分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctDNA，上述整个过程在60℃进行，
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为甲醇，有机酸为乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，pH＝1-6。
所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为甲醇，有机酸为乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，pH＝1-6。
所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为甲醇，有机酸为三乙胺，有机溶剂体积浓度为10-50％，pH＝8-13。
经过标准品评价，经过DNA富集材料提取后，DNA的提取回收率是81％，覆盖度是84％。
实施例3
一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤DNA的方法，所述的金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒采用上述方法制备而得，其中内核为Pt纳米颗粒；采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：
1)先采用上样液平衡DNA富集材料，将该DNA富集材料与脑脊液以质量比为500:1混合，孵化6小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；
2)采用pH 1-6清洗液与沉淀混合，孵化30分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；
3)采用pH 8-13洗脱液与沉淀混合，孵化30分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctDNA，上述整个过程在10℃进行。
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙醇，有机酸为三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，pH＝1-6。
所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙醇，有机酸为三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，pH＝1-6。
所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为乙醇，有机酸为三乙胺，有机溶剂体积浓度为10-50％，pH＝8-13。
经过标准品评价，经过DNA富集材料提取后，DNA的提取回收率是83％，覆盖度是85％。

Claims (3)

1.一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：
1)先采用上样液平衡DNA富集材料，将该DNA富集材料与生物样品以质量比为100-1000:1混合，孵化0.5分钟-12小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；
2)采用pH 1-6清洗液与沉淀混合，孵化0.5分钟-60分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；
3)采用pH 8-13洗脱液与沉淀混合，孵化0.5分钟-60分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctDNA；
上述整个过程在10-60℃进行，
所述DNA富集材料为金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料；
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，pH＝1-6；
所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，pH＝1-6；
所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机碱为氨水或三乙胺，有机溶剂体积浓度为10-50％，pH＝8-13；所述金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料，其内核为金属纳米颗粒，其外壳的结构式为如下所示：
Figure FDA0003866291200000011
2.根据权利要求1所述的一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述金属为Ag,Ti,Fe,Ga,Ni,Au,Pd或Pt。
3.根据权利要求1所述的一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环提取肿瘤DNA的方法，其特征在于所述生物样品为血液、滑膜液、脑脊液或尿液。
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