CN101845435A - 一种用磁性纳米粒子提取转基因大豆dna的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用磁粒子提取转基因大豆DNA的方法，属于纳米材料和分子生物学技术领域。本发明包括磁性纳米粒子的制备，磁性纳米粒子用于转基因大豆DNA的提取。本发明提供了一种全新的提取转基因大豆DNA的方法，具有快速、操作简便、耗时短等优点，提取的DNA完全可以用于DNA杂交和PCR等分子生物学实验。
Description
技术领域
本发明涉及一种用磁性纳米粒子提取转基因大豆DNA的方法，属于纳米材料和分子生物学技术领域。
背景技术
目前转基因食品对人类的影响主要归结为外源基因在受体中的表达安全性，以及基因逃逸所造成的基因污染问题。国际上对转基因食品的检测技术可以分为两类：一种是以表达蛋白为目标的检测方法，一种是以外源DNA为目标的检测方法。以外源DNA为目标的检测方法包括DNA杂交法和聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction，PCR)。应用DNA杂交法和聚合酶链式反应法，首先要得到基因组DNA。
目前，广泛用于转基因大豆DNA的提取方法主要有CTAB法和SDS法。CTAB法和SDS法提取过程中要用到大量有毒的有机试剂，而且操作步骤繁琐，耗时间，这已经不能达到现代检测对快速、准确、方便的要求。因此有必要发明一种新的转基因大豆DNA的提取方法，国内目前尚未见有利用磁性纳米粒子提取转基因大豆DNA方面的报道，本发明弥补了这一空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、准确、操作简便、用时短的转基因大豆DNA的提取方法，为DNA杂交和聚合酶链式反应(PCR)提供方便的途径。
本发明的技术方案：一种用磁性纳米粒子提取转基因大豆DNA的方法，包括磁性纳米粒子制备，磁性纳米粒子与转基因大豆DNA提取液混合，加入聚乙二醇PEG-NaCl缓冲液，用磁铁将吸附了转基因大豆DNA的磁性纳米粒子与溶液分离，用70％乙醇清洗吸附了转基因大豆DNA的磁性纳米粒子，用TE缓冲液洗脱磁性纳米粒子上的转基因大豆的DNA。
工艺步骤为：
(1)磁性纳米粒子聚集体的制备：
①称取一定量的无水三氯化铁(0.65g)和柠檬酸三钠(0.4g)，加入乙二醇(20mL)作为溶剂，驱除氧气，磁力搅拌使之全部溶解；
②称取一定量的无水乙酸钠(1.2g)加入到反应体系中，继续搅拌，置于反应釜中油浴加热至220℃，同时磁力搅拌，反应一段时间(10h)后停止加热，继续磁力搅拌冷却至室温；
③反应后的溶液加入二倍体积的无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；
④沉淀部分继续加入步骤③相同体积的无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；
⑤沉淀部分加入去离子水(10mL)，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；
⑥沉淀分散于适量去离子水(10mL)中，室温保存备用。
(2)用磁性纳米粒子提取转基因大豆DNA
①用粉碎机将转基因大豆粉碎；
②称量一定量的转基因大豆粉末(50mg)，转入1.5mL离心管，分两次加入65℃预热的DNA提取缓冲液(0.5M Tris-HCl，0.5M NaCl，50mM EDTA，4％SDS，pH8.0)进行提取，每次加入350μL，涡旋震荡混合均匀，65℃水浴30min，期间颠倒离心管数次；第一次提取后离心分离，沉淀部分进行第二次提取，提取后离心分离，弃沉淀；两次提取液合并。
③合并后的提取液10000rpm离心10min，取上清，加入15μL磁性纳米粒子，再加入PEG-NaCl(30％PEG-6M NaCl)缓冲液，使溶液中NaCl的终浓度为2M，室温下静置10min；
④用磁铁将吸附有转基因大豆DNA的磁性纳米粒子与溶液分离，去上清；
⑤用500μL质量浓度70％乙醇清洗吸附有转基因大豆DNA的磁性纳米粒子两次，37℃烘箱烘干；
⑥加入适量(50μL)TE(50mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)缓冲液，65℃水浴孵育5min，混匀后用磁铁吸附磁性纳米粒子，取上清，即为转基因大豆DNA溶液。保存于-22℃，备用。
本发明的有益效果：本发明利用合成的磁性纳米粒子提取转基因大豆的DNA，相比传统的DNA提取方法，操作简单，耗时短，提取的转基因大豆DNA完全可以用于DNA杂交和PCR等实验，为以后的研究分析提供了便利。
附图说明
图1磁性纳米粒子的TEM(透射电镜)图。
图2磁性纳米粒子提取的转基因大豆DNA的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
(1)磁性纳米粒子聚集体的制备：
①称取0.65g无水三氯化铁和0.4g柠檬酸三钠，加入20mL乙二醇作为溶剂，驱除氧气，磁力搅拌使之全部溶解；
②称取1.2g无水乙酸钠加入到反应体系中，继续搅拌，置于反应釜中油浴加热至220℃，同时磁力搅拌，反应10h后停止加热，继续磁力搅拌冷却至室温；
③反应后的溶液加入二倍体积的无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；
④沉淀部分继续加入与步骤③相同体积的无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；
⑤沉淀部分加入10mL去离子水，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；
⑥沉淀溶于10mL去离子水中，室温保存备用。
(2)用磁性纳米粒子提取转基因大豆DNA
①用粉碎机将转基因大豆粉碎。
②称量50mg的转基因大豆粉末，转入1.5mL离心管，分两次加入65℃预热的DNA提取缓冲液(0.5M Tris-HCl，0.5M NaCl，50mM EDTA，4％SDS，pH8.0)，每次加入350μL，涡旋震荡混合均匀，65℃水浴30min，期间每10min上下颠倒离心管3次。第一次提取后离心分离，沉淀部分进行第二次提取，提取后离心分离，弃沉淀；两次提取液合并。
③合并后的提取液10000rpm离心10min，取上清，加入15μL步骤(1)中制备好的磁性纳米粒子，再加入PEG/NaCl(30％/6M)缓冲液，使溶液中NaCl的终浓度为2M，轻轻地上下颠倒数次，混合均匀，室温下静置10min。
④用磁铁将吸附有转基因大豆DNA的磁性纳米粒子与溶液分离，倒掉上清液。
⑤加入500μL 70％乙醇清洗磁性纳米粒子两次，37℃烘箱烘干。
⑥加入50μL TE(50mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)缓冲液，65℃水浴孵育5min，用磁铁吸附磁性纳米粒子，取上清，即为转基因大豆DNA溶液。保存于-22℃，备用。
Claims (1)
1.一种用磁性纳米粒子提取转基因大豆DNA的方法，其特征在于包括磁性纳米粒子制备，磁性纳米粒子与转基因大豆DNA提取液混合，加入聚乙二醇PEG-NaCl缓冲液，用磁铁将吸附了转基因大豆DNA的磁性纳米粒子与溶液分离，用70％乙醇清洗吸附了转基因大豆DNA的磁性纳米粒子，用TE缓冲液洗脱磁性纳米粒子上的转基因大豆的DNA；
(1)磁性纳米粒子聚集体的制备，步骤如下：
①称取0.65g无水三氯化铁和0.4g柠檬酸三钠，加入20mL乙二醇作为溶剂，驱除氧气，磁力搅拌使之全部溶解；
②称取1.2g无水乙酸钠加入到反应体系中，继续搅拌，置于反应釜中油浴加热至220℃，同时磁力搅拌，反应10h停止加热，继续磁力搅拌冷却至室温；
③反应后的溶液加入二倍体积的无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；
④沉淀部分继续加入与步骤③相同体积的无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；
⑤沉淀部分加入10mL去离子水，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；
⑥沉淀分散于10mL去离子水中，室温保存备用；
(2)用磁性纳米粒子提取转基因大豆DNA，步骤如下：
①用粉碎机将转基因大豆粉碎；
②称量50mg的转基因大豆粉末，转入1.5mL离心管，分两次加入65℃预热的DNA提取缓冲液进行提取，每次加入350μL，涡旋震荡混合均匀，65℃水浴30min，期间颠倒离心管数次；第一次提取后离心分离，沉淀部分进行第二次提取，提取后离心分离，弃沉淀；两次提取液合并；
所用DNA提取缓冲液组成为：含0.5M Tris-HCl、0.5M NaCl和50mM乙二胺四乙酸EDTA的质量浓度4％十二烷基磺酸钠SDS溶液，pH8.0；
③合并后的提取液10000rpm离心10min，取上清，加入15μL磁性纳米粒子，再加入PEG-NaCl缓冲液，使溶液中NaCl的终浓度为2M，轻轻地上下颠倒数次，混合均匀，室温下静置10min；
所用PEG-NaCl缓冲液组成为：质量浓度30％PEG和6M NaCl溶液；
④用磁铁将吸附有转基因大豆DNA的磁性纳米粒子与溶液分离，去上清；
⑤加入500μL质量浓度70％乙醇清洗吸附了转基因大豆DNA的磁性纳米粒子两次，37℃烘箱烘干；
⑥加入50μL TE缓冲液，65℃水浴孵育5min，混匀后用磁铁吸附磁性纳米粒子，取上清，即为转基因大豆DNA溶液；保存于-22℃，备用；
所用TE缓冲液组成为：含50mM Tris-HCl和10mM EDTA的溶液，pH8.0。
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| CN102399774A (zh) * | 2011-09-22 | 2012-04-04 | 王利兵 | 一种大肠埃希杆菌o157∶h7基因组dna作为pcr标准物质的制备方法 |
| CN110548489A (zh) * | 2019-09-12 | 2019-12-10 | 安徽工业大学 | 一种氨基磁性纳米粒子的制备方法及其在dna提取中的应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN101728040A (zh) * | 2010-01-20 | 2010-06-09 | 江南大学 | 石榴状磁性纳米粒子聚集体的制备及其在dna分离纯化中的应用 |
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2010
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Patent Citations (1)
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