CN104805010A - 一种致病菌快速富集芯片及其制备方法 - Google Patents

一种致病菌快速富集芯片及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种致病菌快速富集芯片及其制备方法，芯片包括不可逆贴合在一起的芯片流动层和芯片控制层；所述芯片流动层上设置主微流体通道和两个永磁铁；所述芯片控制层包括次微流体通道和四个驱动组件；所述微流体通道的一端为入口，另一端为富集收集池，中部设置环形的混合区；所述两个永磁铁分别对称可拆卸设置在混合区的底部；所述四个驱动组件均匀设置在次微流体通道上，位于混合区位置。本发明利用微流体芯片技术，结合现有免疫磁珠捕获和PCR扩增方法，克服了现有技术的不足，提供了一种高效、快速及自动化的食源性致病菌捕获富集芯片，采用本发明的芯片可以提高传统免疫磁珠捕获的效率，减少后续PCR模板准备的时间，并且无需专业人士操作即可自动化地完成致病菌的富集过程。

Description

一种致病菌快速富集芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种致病菌快速富集芯片及其制备方法。
背景技术
食源性致病菌主要是指以食物为载体，导致人类发生疾病的一大类细菌，包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7等。食品由于受致病菌污染，造成各种食源性疾病，甚至死亡。食品在生产、加工、储存、运输和销售等各个环节都有受到环境中致病菌影响和污染的可能，因此，有效快速的致病菌特异性检测是预防、控制和合理治疗细菌感染性疾病的必要手段。
在食品行业，相关的致病菌检测的传统方法有：培养基制备、细菌培养、菌落计数和生化指标的检测。这些方法的优点是直观且能够得到食品样品中细菌数量和特性等方面的定性及定量结果；不足之处是耗时费力，获得结果通常需要几天的时间，并且要求所要检测的细菌增殖为可见菌落，实验室工作量巨大。近年来，DNA杂交、PCR、定量PCR、实时PCR、环介导恒温扩增(LAMP)以及基因芯片法等分子生物学的检测方法，克服了传统检测方法的不足，并且便捷和快速。
为了获得高灵敏度、高特异性以及降低背景干扰的影响，目前的PCR分子生物学方法中的模板提取步骤包括样品制备、增菌培养和分离，目标DNA制备等必不可少的部分，这些过程需要24-49h，检测结果往往滞后，不能满足现代食品工业和食品安全快速检测的需要。免疫磁珠捕获加PCR法检测食源性致病菌，是特异性高，检测速度快的检测手段，但是捕获效率低、操作复杂、人为误差大，而且需要经过培训的专业人士进行操作。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种高效、快速及自动化的食源性致病菌捕获快速富集芯片。
实现本发明第一个目的的技术方案是一种致病菌快速富集芯片，包括不可逆贴合在一起的芯片流动层和芯片控制层；所述芯片流动层上设置主微流体通道和两个永磁铁；所述芯片控制层包括次微流体通道和四个驱动组件；所述微流体通道的一端为入口，另一端为富集收集池，中部设置环形的混合区；所述两个永磁铁分别对称可拆卸设置在混合区的底部；所述四个驱动组件均匀设置在次微流体通道上，位于混合区位置。
所述芯片控制层还包括两个阀门；所述两个阀门设置在微流体通道上，分别位于混合区的入口和出口处。
所述芯片流动层和芯片控制层中微通道的深度均为0.01mm～0.2mm。
所述微流体通道的宽度范围为0.1mm～5mm。
所述驱动组件和阀门均连接外源气压；所述四个驱动组件依次运动。
本发明的第二个目的是提供一种前述芯片的制备方法。
实现本发明第二个目的的技术方案是致病菌快速富集芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：通过微加工技术在微流芯片基材上加工得到芯片流动层和芯片控制层两片芯片；
步骤二：对步骤一得到的两片芯片用芯片清洗液清洗，干燥处理；
步骤三：将两片芯片贴合。
所述步骤一中的芯片基材为聚二甲基硅氧烷。
所述步骤二中的芯片清洗液清洗的方法为：采用乙醇、去离子水和乙醇依次清洗。
所述步骤三中的两片芯片的贴合方式为等离子活化后不可逆贴合。
采用了上述技术方案后，本发明具有以下的积极的效果：(1)本发明利用微流体芯片技术，结合现有免疫磁珠捕获和PCR扩增方法，克服了现有技术的不足，提供了一种高效、快速及自动化的食源性致病菌捕获富集芯片，采用本发明的芯片可以提高传统免疫磁珠捕获的效率，减少后续PCR模板准备的时间，并且无需专业人士操作即可自动化地完成致病菌的富集过程。
(2)本发明的芯片设置的阀门和驱动组件由外源气压提供动力，阀门可挤压并阻断微流体通道中的液体；驱动组件则可逆的挤压微流体通道中的液体起到蠕动效果，从而驱动微通道中液体的循环混合，由此可以加速富集。
(3)本发明相比较致病菌培养增菌，可快速制备足量的致病菌，为后续PCR等DNA扩增提供足量的模板。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为本发明芯片的结构示意图。
图2为采用本发明的芯片进行实验的数据曲线。
附图中标号为：
主微流体通道1、入口11、富集收集池12、混合区13、永磁铁2、驱动组件3、阀门4。
具体实施方式
(实施例1)
见图1，本实施例的一种致病菌快速富集芯片，包括不可逆贴合在一起的芯片流动层和芯片控制层；芯片流动层上设置主微流体通道1和两个永磁铁2；芯片控制层包括次微流体通道和四个驱动组件3和两个阀门；微流体通道1的一端为入口11，另一端为富集收集池12，中部设置环形的混合区13；微流体通道1的宽度范围为0.1mm～5mm。两个永磁铁2分别对称可拆卸设置在混合区13的底部；四个驱动组件3均匀设置在次微流体通道上，位于混合区13位于。两个阀门4设置在次微流体通道上，分别位于混合区13的入口和出口处。驱动组件3和阀门4均连接外源气压；四个驱动组件3依次运动，本实施例的驱动组件为微型蠕动泵。芯片流动层的微流体通道1和芯片控制层的次微流体通道的深度范围均为0.01mm～0.2mm
致病菌快速富集芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：通过微加工技术在微流芯片基材上加工得到芯片流动层和芯片控制层两片芯片；芯片基材为聚二甲基硅氧烷。本实施例的具体加工方法是：首先使用计算机辅助设计软件，如CAD设计和绘制芯片的各功能单元图形，然后通过微加工技术在微流芯片基材表面制备CAD设计的图形；
步骤二：对步骤一得到的两片芯片用芯片清洗液清洗，干燥处理；芯片清洗液清洗的方法为：采用乙醇、去离子水和乙醇依次清洗。
步骤三：将两片芯片等离子活化后不可逆贴合。
进行检测时，首先将修饰有致病菌特异性抗体的免疫磁珠通过微流体通道1的入口11注入，被置于混合区13底部的的永磁铁2固定，然后将待测样品泵入微流体通道1中，关闭阀门4，在驱动组件3的驱动下，实现待测样品的循环流动，使得待测样品与免疫磁珠的多次循环混合，实现了待测样品中致病菌的充分富集，最后撤离永磁铁2，打开阀门4，充分捕获了致病菌的免疫磁珠被收集在富集收集池12中用于后续分析检测。
本实例以单核细胞增生李斯特氏菌株(ATCC 43251购自上海慧耘生物科技有限公司)为模式菌来验证本发明致病菌快速富集芯片的富集效果，并与传统免疫磁珠法对比来测试二者优劣。本实例所用的免疫磁珠为羧基磁珠(直径0.5μm)购自郑州英诺生物科技有限公司，LM.多克隆抗体购自上海慧耘生物科技有限公司。按照以下步骤操作：
1)免疫磁珠活化：首先用去离子水、吗啉乙磺酸溶液(MES,pH 6.0,0.05％)、碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液按照试剂盒说明，对磁珠进行活化；
2)免疫磁珠与抗体偶联：取200μL磁珠加入到300μL抗体中，37℃下震荡1h，震荡结束后磁分离5min并去除上清，并用含有2％BSA的PBS缓冲液室温封闭1h，封闭结束用PBS洗三次，然后分散在200mL PBS中，保存于4℃备用；
3)将偶联有LM.多克隆抗体抗体的免疫磁珠通过微流体通道1的入口11注入，免疫磁珠被置于混合区13底部的永磁铁2固定在微流体通道1的混合区13中；
4)室温下，将单核细胞增生李斯特氏菌株液泵入微流体通道1并进入混合区13，关闭阀门4，在4个驱动组件3的依次驱动下，使得待测样品与免疫磁珠的多次循环混合反应，控制反应时间为5分钟；
5)然后撤离永磁铁2，打开阀门4，捕获了单核细胞增生李斯特氏菌株的免疫磁珠收集在富集收集池12中；
6)吸取富集收集池12中的悬液，磁分离5min，吸走上清后用PBS洗三次，悬浮在20μL PBS中，再涂布于显色培养基上，置于37℃恒温箱培育20h，观察并统计平板上的菌落数；
7)另取新的同批次同型号的本发明致病菌快速富集芯片，重复操作步骤3)到6)，控制反应时间为10分钟；
8)另取新的同批次同型号的本发明致病菌快速富集芯片，重复操作步骤3)到6)，控制反应时间为15分钟；
9)另取新的同批次同型号的本发明致病菌快速富集芯片，重复操作步骤3)到6)，控制反应时间为20分钟；
10)另取新的同批次同型号的本发明致病菌快速富集芯片，重复操作步骤3)到6)，控制反应时间为25分钟；
11)分析总结以上实验结果并得到拟合曲线如附图2所示。
通过以上实验验证，单核细胞增生李斯特氏菌株单次富集实验时间总耗费约3个小时，其中步骤1)和步骤2)可提前制备，实际致病菌富集时间不到1个小时，而传统培养增殖及富集时间总耗费为6到24个小时；另外，以往免疫磁珠37℃条件下富集1小时，富集效率约45％，本发明同样条件下20分钟富集效率即达到了80％，由此可见本发明的快速高效。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种致病菌快速富集芯片，其特征在于：包括不可逆贴合在一起的芯片流动层和芯片控制层；所述芯片流动层上设置主微流体通道(1)和两个永磁铁(2)；所述芯片控制层包括次微流体通道和四个驱动组件(3)；所述微流体通道(1)的一端为入口(11)，另一端为富集收集池(12)，中部设置环形的混合区(13)；所述两个永磁铁(2)分别对称可拆卸设置在混合区(13)的底部；所述四个驱动组件(3)均匀设置在次微流体通道上，位于混合区(13)位置。
2.根据权利要求1所述的一种致病菌快速富集芯片，其特征在于：所述芯片控制层还包括两个阀门(4)；所述两个阀门(4)设置在微流体通道(1)上，分别位于混合区(13)的入口和出口处。
3.根据权利要求2所述的一种致病菌快速富集芯片，其特征在于：所述芯片流动层的微流体通道(1)和芯片控制层的次微流体通道的深度范围均为0.01mm～0.2mm。
4.根据权利要求3所述的一种致病菌快速富集芯片，其特征在于：所述微流体通道(1)的宽度范围为0.1mm～5mm。
5.根据权利要求4所述的一种致病菌快速富集芯片，其特征在于：所述驱动组件(3)和阀门(4)均连接外源气压；所述四个驱动组件(3)依次运动。
6.一种如权利要求5所述的致病菌快速富集芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：通过微加工技术在微流芯片基材上加工得到芯片流动层和芯片控制层两片芯片；
步骤二：对步骤一得到的两片芯片用芯片清洗液清洗，干燥处理；
步骤三：将两片芯片贴合。
7.根据权利要求6所述的致病菌快速富集芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤一中的芯片基材为聚二甲基硅氧烷。
8.根据权利要求6所述的致病菌快速富集芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤二中的芯片清洗液清洗的方法为：采用乙醇、去离子水和乙醇依次清洗。
9.根据权利要求6所述的致病菌快速富集芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤三中的两片芯片的贴合方式为等离子活化后不可逆贴合。
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