JP2005505269A - 核酸のアーカイブ - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は固相に核酸を強固に結合するステップ及びその利用に対応するステップ。
【解決手段】拡散を、サンプル由来の核酸を強固に結合するのに十分な親水性と電気陽性を有する固相マトリックスに結合する。これらステップは大容積および／又は低濃度検体からの核酸（二本鎖又は一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ）の捕捉、緩衝液の効果、洗浄及び容積の現象を包含し、固相に結合した核酸を酵素、ハイブリダイゼーション又は増幅処理と結びつけることができる。強固に結合した核酸は、例えば反復分析に使用して研究及び商業応用での結果の確認又は追加遺伝子の試験に使用できる。さらに大容積血漿検体からのウイルスの抽出、精製及び固相増幅の方法も開示する。
【解決手段】拡散を、サンプル由来の核酸を強固に結合するのに十分な親水性と電気陽性を有する固相マトリックスに結合する。これらステップは大容積および／又は低濃度検体からの核酸（二本鎖又は一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ）の捕捉、緩衝液の効果、洗浄及び容積の現象を包含し、固相に結合した核酸を酵素、ハイブリダイゼーション又は増幅処理と結びつけることができる。強固に結合した核酸は、例えば反復分析に使用して研究及び商業応用での結果の確認又は追加遺伝子の試験に使用できる。さらに大容積血漿検体からのウイルスの抽出、精製及び固相増幅の方法も開示する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学、生化学、遺伝学及び生物学的研究の一般分野に関する。より詳細には、本発明はいかなる生物試料に由来した核酸をも固相マトリックス上に捕捉し、強固に結合する方法に関する。固相に結合した核酸は固相核酸酵素反応、オリゴヌクレオチド又はプローブハイブリダイゼーション、及び／又は信号増幅反応又は標的増幅反応を含む様々な操作に利用できる基質として、直接複数回利用することができる。本発明は、更に、核酸ハイブリダイゼーション及び／又は増幅と核酸捕捉とを結合させる商業上の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の分子構造は、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマと特定の標的器官又は組織に固有の配列との相補的塩基対合手段により、特異的な検出を提供する。全ての生物体又は種は、特異的且つ特徴的な核酸配列を含んでいることから、核酸検出全般に共通なストラテジは、様々な研究・開発分野及び商工業に極めて広範囲な用途を有している。核酸検出の実用化の可能性は、低濃度で存在する核酸配列を高い信頼度で、正確且つより高いコピー数まで増幅又はコピーする方法が開発されたことで更に高められ、その結果核酸配列は検出法でより簡単に検出されるようになった。
【０００３】
最初の核酸増幅法はＭｕｌｌｉｓらが記載したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である（米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第４，９６５，１８８号であり、これらの特許全ては、本願に参照によって具体的に組み込まれる）。ＰＣＲが紹介されてより、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）（Ｍａｌｅｋに付与された米国特許第５，１３０，２３８号）、等温法（Ａｕｅｒｂａｃｈに付与された米国特許第５，３５４，６６８号）、リガーゼチェインリアクション法（Ｂｕｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒに付与された米国特許第５，４２７，９３０号）及び鎖置換増幅法（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒに付与された米国特許第５，４５５，１６６号）といった増幅に関する様々なストラテジが報告されており、それらは全て参照によりここに組み込まれている。ＳＤＡ又はＮＡＳＢＡといった一部の増幅方法は、一本鎖標的核酸を必要とする。通常この標的は増幅前に高温を利用した溶融操作により一本鎖にされる。
【０００４】
核酸の増幅及び検出前に、標的核酸を生物試料より抽出してから精製し、増幅反応酵素の阻害因子を取り除く。更に標的核酸を解離し、アニールするプライマを常に利用可能なように準備しなければならない。核酸の精製については様々な方式が知られている。
その中には、例えばフェノール−クロロホルム及び／又はエタノール沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、コールド・スプリング・ハーバー研究所、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９年））、高塩析沈殿（Ｄｙｋｅｓ、電気泳動９：３５９〜３６８項（１９８８年）、プロテイネースＫ消化法（Ｇｒｉｍｂｅｒｇら、核酸研究、２２：８３９０項（１９８９年）、キレックス（ｃｈｅｌｅｘ）及びその他煮沸法（Ｗａｌｓｈら、バイオ／テクニーク１０：５０６〜５１３項（１９９１年））並びに固相結合及び溶出法（ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎとＧｉｌｌｅｓｐｉｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：６１５〜６１９項（１９７９年））が挙げられ、これらの特許全ては、本願に参照によって具体的に組み込まれる。
【０００５】
従って標的核酸の分析は３ステップから構成される：即ち生物試料からの核酸の抽出／精製、特異標的配列の直接プローブハイブリダイゼーション及び／又は増幅、並びにその特異的検出である。これら３ステップの従来のプロトコルは別々に実施されるので、その結果核酸の分析は手間のかかるものになっている。さらに各ステップを実施するには、様々な操作、装置及び試薬が必要である。現状の方策に対するその他の懸念は、試料の２次汚染の可能性である。例えば同時に取り扱っている試料間或いは、前もって増幅されたサンプルからの２次汚染である。
【０００６】
分析を目的とする場合、追加の確認用検体を入手することが、たとえ不可能ではないものの困難であるため、極少量の検体から核酸を抽出しなければならないということがたびたびある。例としては、犯罪現場証拠の分析や臨床試験向けの細針生検などがある。従ってこの様な例では、核酸検体のサイズによって遺伝子鑑定やレプリカ試験による確認の程度が限定されている。この様な少量検体に従来の抽出プロトコルを用いると、核酸を失ってしまったり、１回或いは数回だけの増幅分析が可能であるような収量しかないということが起り得る。
【０００７】
固相へＤＮＡを結合させ、続いてそこからＤＮＡを溶出する条件はＢｏｏｍ（米国特許第５，２３４，８０９号、これは参照によりここに組み込まれている）やＷｏｏｄａｒｄ（米国特許第５，４０５，９５１号、米国特許第５，４３８，１２９号、米国特許第５，４３８，１２７号、これらは全て参照によりここに組み込まれている）によって記載されている。具体的には、ＤＮＡは電気陽性又は親水性である固相に結合する。電気陽性元素はヒドロキシル（−ＯＨ）或いはその他の基により十分に親水性にすることができ、その結果ＤＮＡと強固に結合する固相マトリックスができるが、この固相マトリックスにはタンパク質或いは阻害物質とは結合しない。通常の精製方法は結合した核酸の溶出を必要とするため、核酸は結合するものの実質的に完全な溶出が不可能な固相マトリックスはＤＮＡ精製には不向きであると報告されている。実際、十分な親水性を有し、適度に核酸を結合しながら、それより核酸を溶出することができる固相マトリックスを得ようと多くの努力が払われてきた（例えばいずれもＷｏｏｄａｒｄに付与され、この参照によりここに組み込まれている米国特許第５，５２３，３９２号、第５，５２５，３１９号及び第５，５０３，８１６号を参照）。
【０００８】
上記のブームは、高カオトロピック塩を使用し、可逆的にシリカにＤＮＡを結合する固相ＤＮＡ増幅を記載している。しかし、核酸は実際にはシリカ結合ＤＮＡを増幅反応緩衝液中に加える時にシリカより溶出する。従ってこのブームの方法による増幅は溶液内で起こっており、固相上で起こるものではない。更に核酸は増幅前に固相から溶出されるため、増幅は１回しか行われない。
【０００９】
Ｄｅｌ ＲＩｏら、バイオ／テクニーク２０：９７０〜９７４項（１９９６年）は、反復増幅を可能にする、核酸の取り込みフィルタについて記述している。
しかし彼らは不可逆的な結合の仕組みを記載しておらず、そのため高濃度の核酸分析にのみ推奨されるものであり、そして限られた分析回数にのみ推奨されるものである。
【００１０】
核酸の精製及び／又は抽出とその他の核酸分析工程及び／又は操作とを直接統合し、分析手順及び方策を簡素化すること、並びに相互汚染のリスクを減らし、そして／又は取り除くことは有益だろう。更に、プローブハイブリダイゼーション又は増幅プライマをアニールするために、一本鎖核酸を生成するのに必要な融解ステップを除去することも有益であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この様な背景より、本発明は核酸精製及び／又は抽出と、その他の核酸分析及び／又は操作に関する方策を相互作用させる方法を提供する。
【００１２】
本発明は更に直接固相核酸操作法及び／又は分析法も提供するが、この方法では操作及び／又は分析は核酸を固相から溶出することなしに行われる。本発明は核酸が高親和性を有する固相材料を得るために、親水性が付与された１又はそれ以上の高電気陽性元素よりなる固相材料の仕様を包含する。
【００１３】
本発明は更に試料から核酸を抽出して強固に結合させ、核酸を取り外せないようにアーカイブする方法も提供する。
【００１４】
本発明の方法では、マトリックスに結合した核酸を繰り返し分析し、そして／又は操作することができ、この時結合した核酸が分析中に変化することも消耗することもない。
【００１５】
本発明はまた生物試料中から低濃度で高流量の核酸を捕捉して強固に結合する方法も提供する。
【００１６】
本発明は、いかなる溶融ステップを行うことなく、二本鎖核酸を１本鎖核酸に変換する新規な機構を提供する。
【００１７】
従って、本発明の実施態様の１つは、酵素認識、ハイブリダイゼーション及びプライマの依存増幅を含むが、これらに限定されない直接固相操作及び分析をする核酸に、強固に結合する固相マトリックスを使用する方法であって、操作及び分析を繰り返す間、核酸を固相マトリックスから洗い流さない方法を提供する。
【００１８】
本発明は更に各種基材の表面を本発明の固相マトリックスでコーティングする方法、及びその利用を提供する。
【００１９】
本発明はまた、その表面を固相マトリックスで覆う基材からなる、少なくとも１種類の容器を含む、核酸分析又は操作用のキットを提供する。
【００２０】
本発明のその他の特徴及び利点は、添付の図面と結びつけることで、本発明の原理を例示の形で説明している以下の詳細な説明より明らかになるであろう。
前記の概要説明及び以下の詳細な説明は典型的な例示と説明を目的とするにすぎず、請求する発明を制限するものではないと理解すべきである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明はＲＮＡ、ＤＮＡ又はその他の核酸を固相マトリックスに強固に結合させる新規方法及びマトリックスに結合した核酸の使用に基づくものである。本明細書記載の方法により、固相マトリックスに直接結合した核酸をマトリックスから核酸を溶出せずに、核酸を長期間保存し、及び／又は繰り返し分析し、及び／又は拡大分析を行い、及び／又は複数操作を行うことができる。本明細書に開示された各方策は従来技術の持つ欠点を克服している。
【００２２】
本発明のある実施態様は、固相材料に強固に結合した核酸の具体的な応用を示す。これら既知材料は、核酸がこの固相材料より溶出できないことから、従来当業者からは核酸分析及び／又は操作には不向きであると考えられていた。更に、従来の方法に比べ、本発明のある実施態様での核酸の操作は、核酸が固相マトリックスにまだ結合した状態で行われる。
【００２３】
より具体的には、本発明は水酸（ＯＨ）基又はそれ以外の基によって親水性を付与された１又はそれ以上の強い電気陽性元素を構成元素として含む固相マトリックスを使用し、結果として核酸に対し強い親和性を有する固相マトリックスを生成することを含んで成る。
本明細書で用いる場合、用語「電気陽性」とは、電子を引きつける元素又は材料を意味する。本発明の目的に適した電気陽性材料の例としては、アルミニウム、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、スカンジウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、タンタル、クロム、モリブデン、タングステン、ホウ素、ガリウム、インジウム、ゲルマニウム、錫及び鉛から成るグループより選択された１又はそれ以上の元素を一般的に含む材料を挙げることができるが、もとよりこれに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の目的に好適な固相マトリックスとしては、上記電気陽性材料の酸化物を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
例としては、アルファ酸化アルミニウム（ａ−Ａｌ２Ｏ３）、ガンマ酸化アルミニウム（ｙ−Ａｌ２Ｏ３）及び酸化アルミニウムの混合組成物（ＡｌｘＯｙ）の薄膜を含む酸化アルミニウムを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本明細書で用いる用語「混合組成物」とは、式ＭｘＯｙで表すことができ、式中の「ｘ」及び「ｙ」が化合物の元素組成を表し、「ｘ」及び「ｙ」は整数でも分数でもよい金属酸化物の各種組成物を構成要素として含む組成物を表す。例えば酸化アルミニウムの混合組成物は式ＡｌｘＯｙで表される酸化アルミニウムの混合物を含んで成る。好ましいマトリックスの更なる例としては、酸化チタン（Ｔｉ２Ｏ３）及び変性酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）が挙げられる。本明細書では用語「変性酸化ジルコニウム」は、塩酸や硝酸といった酸又は水酸化カリウムといった塩基にさらされ、加水分解表面組成を生成する酸化ジルコニウムを指す。
【００２５】
本発明の固相マトリックスは核酸に対し高い親和性を有している。そのため適当な条件の下に本発明の固相マトリックスと接触した核酸は、このマトリックスと強固に結合するようになる。本明細書では用語「強固に結合」は、核酸が固相マトリックスに十分に結合し、結合した核酸の大部分が、結合した核酸の操作及び／又は分析中にもマトリックスに結合したままの状態を保つことを意味する。即ち、マトリックスに結合した核酸の極少量だけが、操作及び／分析中に、特定緩衝液条件下に固相マトリックスから遊離する。
【００２６】
本発明は特定の応用を目的として、これら固相マトリックスへの核酸の不可逆的結合を活用する。強固に結合した核酸は、以下に詳しく説明し、実施例を示す様に、核酸操作及び／又は分析のために用意された反応混合物と直接接触させることができる。
【００２７】
実施態様の１つでは、本発明は核酸を固相マトリックスに捕捉してから、結合核酸を繰り返し、及び／又は詳しく分析する方法を提供する（核酸アーカイブ）。本明細書に記載する強固に結合した核酸は室温に於いて、おそらくは無期限に安定している。従って本発明は、核酸保存の有益な方法を提供する。こうして保存した核酸は、その後必要に応じて分析し、又は操作することができる。このことは生物試料の量が限られている場合及び／又は代替が効かない場合、そして直後或いは元の試料の保管後のいずれにおいても再分析が有益な場合に役立つ。この様な事態が発生する分野としては、例えば科学捜査、医学及び生物学的研究、家畜又はヒトの臨床診断、歯科学、環境、食品又は水中微生物学、並びに農業又はその他産業応用が挙げられる。
【００２８】
別の実施態様では、本発明はＤＮＡとＲＮＡの両方を含むサンプルから、固相マトリックスにＤＮＡ又はＲＮＡのみを結合する方法を提供する。例えば、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含むサンプルを、マトリックスがＤＮＡのみ結合する条件下に固相マトリックスと接触させることを含んで成る、核酸をアーカイブする方法である。この実施態様では、上記の条件は、前記サンプルを固相マトリックスに接触させる前に、サンプル又はマトリックスに、グアニジンチオシアネートをベースとする緩衝液、アルカリ緩衝液、塩化リチウム、及びこれに限定されることはないがドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮＰ−４０、Ｎ−ラウロイルサルコシン及びその他一般的な界面活性剤を含む界面活性剤をベースとする緩衝液、を含むグループから選択された緩衝液を加えることを含んで成る。
【００２９】
或いは、本発明はまたＤＮＡとＲＮＡの両方を含むサンプルを、マトリックスがＲＮＡのみを結合する条件の下に固相マトリックスと接触させることを含んで成る核酸のアーカイブ方法も提供する。この実施態様では、条件にはＤＮＡ分解試薬、例えばＤＮａｓｅの様なＤＮＡ分解酵素を、緩衝液存在下にサンプルに加えて細胞を溶解すると同時にＤＮＡを分解することを構成ステップとして含む。
【００３０】
別の実施態様では、強固に結合した核酸により、結合核酸の手順操作の間に徹底的な水洗、緩衝液交換、容積の減少を可能にする。即ち、固相マトリックスは、水性緩衝液を用いて複数回洗浄した後でさえ大部分の核酸がマトリックスに強固に結合し続けるのに十分な強さで核酸を結合する。この様にして、本発明は緩衝液交換と容積の減少に好都合な手順を提供する。
【００３１】
別の実施態様では、本発明は核酸の抽出と精製を核酸ハイブリダイゼーション及び／又は核酸増幅と直接結びつけるＤＮＡ及びＲＮＡの新規の迅速捕捉法を提供する。
抽出は手法又は自動で実施できる。本明細書では「核酸ハイブリダイゼーション」には（ａ）マトリックスに結合した核酸プローブとサンプル中に存在する標的核酸とのハイブリダイゼーション、（ｂ）マトリックスに結合した標的核酸とプライマ核酸とのハイブリダイゼーション、及び（ｃ）マトリックスに結合した標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションが包含される。
【００３２】
例えば、本発明の実施態様の１つは、（ａ）１又はそれ以上の標的核酸を含むサンプルを本発明の固相マトリックス及び標的核酸配列（１つ又は複数）を一本鎖の核酸の形でマトリックスと強固に結合するようにさせる緩衝液と接触させること；（ｂ）マトリックスに結合した標的核酸をプライマ核酸配列の１セットと緩衝液とに接触させて、このプライマのセットをマトリックスに結合した標的核酸とハイブリダイゼーションさせること；及び（ｃ）標的核酸（１つ又は複数）を増幅して、その中で標的核酸配列がマトリックスと強固に結合し続けている増幅反応混合物を生成すること含んで成る。
【００３３】
固相増幅の実施態様の１つでは、標的核酸配列がマトリックスに強固に結合するようになる緩衝液が用いられる。この様な緩衝液の例としては、グアニジンチオシアネートをベースとする緩衝液、アルカリ緩衝液、塩化リチウム、及びこれに限定されることはないがＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮＰ−４０、ＮＰ−ラウロイルサクロシン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ２０及びその他一般的な界面活性剤を含む界面活性剤をベースとする緩衝液を挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、リン酸緩衝液については、固相マトリックスへのプライマ配列の結合を減らし、その後の消失を効果的にすることが知られている。
【００３４】
別の実施態様では、２又はそれ以上の種類の標的核酸を固相マトリックスに結合し、この標的核酸を連続して増幅する。
【００３５】
本発明の方法による高親和性固相マトリックスを用いて二本鎖ＤＮＡを捕捉する場合には、核酸を二本鎖の核酸として水性の生物試料又は緩衝液から直接捕捉してもよい。或いは、場合によってはＤＮＡを固相マトリックスに一本鎖ＤＮＡとして捕捉する必要がある。
従って本発明は以下詳細に記載するように、緩衝液の状態を変更し、マトリックスに二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとして結合させる方法を包含する。
【００３６】
例えば一本鎖の形で核酸を結合することは、ハイブリダイゼーション法及び／又は等温増幅法と整合させるのに必要である。
即ち、標的核酸が二本鎖ＤＮＡの場合、サンプルをアルカリｐＨ又は高カオトロピック塩濃度に調整すれば、二本鎖の核酸を一本鎖の核酸として固相マトリックスに結合することができる。
【００３７】
様々な核酸増幅法が本発明の直接固相核酸増幅に好適である。そのような方法としては、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＩｓｏＣＲ、ＣＲＣＡ、Ｑベータレプリカーゼ、分枝鎖ＤＮＡ及びＲＴ−ＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。この種の方法は当業者に周知であり、更に詳しい説明を要しない。更に本発明には「巻き戻しコイル（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ ｃｏｉｌ）増幅法」（又は「ＵＮＣＡ」）を応用してもよい。「巻き戻し増幅法」は２００１年６月１９日に出願され、「巻き戻しコイル増幅とその利用方法」と題された、参照によりここに組み込む係属出願中の米国特許仮出願番号６０／２９９，４１０号に開示されている。簡単に説明すると、この方法は同一配列が多数繰り返し一列に並んだ環状の鋳型より長い増幅生成物を形成している点で、ローリングサークル型の増幅法に似ている。しかし巻き戻し増幅はローリングサークルと鋳型が環状ではなく直鎖状のＤＮＡである点で異なっており、そのＤＮＡがそれ自体の上に巻き戻って、その分子の両端同士がハイブリダイゼーションした時にだけ環状になる。
【００３８】
固相マトリックス上にある標的核酸配列を増幅する本発明の方法には、更にマトリックスに結合したサンプルが複数の標的核酸配列を含んでいる方法もある。この方法では、標的核酸は、参照によりここに組み込む２０００年６月６日出願の「マルチプレキシング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ：多重）増幅反応法」と題するＧｅｒｄｅｓらによる係属出願中の米国特許出願番号０９／５８９，５６０に記載の方法で前増幅される。ゲルデスらの方法では、２ステップの多重増幅が行われ、第１ステップでは標準的な第１多重増幅反応を行って、標的中のサンプルコピー数を「ブースト」して１００から１０００倍に増加させる。複数の標的配列を前増幅するこのステップは、本発明の方法による固相上で直接実施される。さらに、複数の標的配列を同時に増幅する。前増幅ステップ後、増幅生成物を分け、最適化された第２の単一固相増幅反応にかけられるが、各反応混合液は第１又は多重ブーストステップで以前に使用されたプライマセットの１つを含む。
【００３９】
発明の別の実施態様は、固相に結合した、一本鎖又は二本鎖いずれかの標的核酸を直接分析するための新規の方法を提供する。この実施態様の例の１つとしては、サンプル中に存在する標的核酸の決定及び／又は定量化が挙げられる。より具体的には、本発明の別の実施態様は、（ａ）プローブが固相マトリックスに強固に結合できる条件下に標的核酸の特定配列に相補的である核酸配列を含んで成るプローブと固相マトリックスとを接触させること；及び（ｂ）標的核酸がマトリックスに結合したプローブとハイブリダイゼーション可能な条件下でマトリックス結合プローブとサンプルとを接触させることにより標的核酸をプローブで捕捉することを含んで成る、サンプルから標的核酸を捕捉する方法を包含する。 この捕捉法では、固相マトリックスへの標的核酸の結合を低下させるが、標的核酸とマトリックス結合プローブとの結合は可能であるリン酸緩衝液を用いてもよい。
【００４０】
そうすると当業者周知の方法によりハイブリダイゼーションした標的を検出及び／又は定量化できる。検出及び／又は定量化後、複合体を解離し、マトリックスを洗浄して標的核酸を取り除くことができる。この全ての操作の間も核酸プローブはマトリックスに強固に結合し続けており、従って繰り返し利用できる。この方法はマイクロアレイ、ラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）システム及び自動ロボティクスへの応用に特に好適である。
【００４１】
血液の様な高レベルの内因性又はバックグランド核酸を含む検体では、低レベルの特定標的の存在を分析することは極めて難しい。それ故に、本発明の別の実施態様は固相マトリックスを利用してこの様な検体中の低濃度核酸を不可逆的に捕捉する方法を提供する。この方法は、緩衝液状態を変更して固相材料が高濃度のバックグランド核酸が存在する場合でも標的配列を選択的に捕捉できるようにすることを含んで成る。従ってこのプローブハイブリダイゼーションの実施態様は、高感度を得るために低いバックグランドを要求するマイクロアレイハイブリダイゼーションの様な商業応用に最適な高い厳密性を提供する。
【００４２】
更に別の実施態様では、本発明は大容積の検体から核酸を捕捉及び／又は濃縮する、又は水性緩衝液又は溶液より汚染核酸を除去する手段としての重力若しくは高流速固相クロマトグラフィを可能にする。より具体的には、本発明の実施態様の１つは、本発明の固相マトリックスの上にサンプルを流し込むか又はその上を通過させることにより、サンプルから低濃度且つ高流速で核酸を捕捉し強固に結合する方法を提供する。この方法では、核酸はマトリックス上に強固に結合し、その上に濃縮するが、サンプル中の不要成分はマトリックスから洗い流される。実施態様の１つでは、サンプルは約０．５ｍＬ／分から２ｍＬ／分の間の速度でマトリックス上を流れる。結合した核酸は、固相から溶出すること無しに水性緩衝液で徹底的に洗うことができ、精製核酸がもたらされる。
【００４３】
当分野ではこれまでＲＮＡの高親和性固相マトリックスへの結合特性は研究されてこなかった。本発明の別の局面は、ＲＮＡが本明細書記載の固相マトリックスに強固に結合することを示す。本発明は更に、マトリックスに結合したＲＮＡを増幅する方法及びマトリックスに結合したＲＮＡの安定した保存を提供する。
【００４４】
本発明の方法はまた核酸抽出の自動化、高容積検体からの低コピー核酸の濃縮、及び抽出と精製を増幅又はハイブリダイゼーション核酸捕捉と結びつけることを目的とする商業応用にも有益である。
商業的用途としては、ロボットによる自動化が効果的である高処理型核酸検査、又はプール検体を検査することで罹病率が低い標的を経済的にスクリーニングすること等が挙げられる。
【００４５】
本発明は高流速で核酸を迅速に捕捉し、強固に結合する方法を記載する。結合は、たとえ大容積及び／又は低標的濃度でも、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方で起こる。強固に結合した核酸は、固相マトリックスからの核酸の重大な遊離なしに、厳格な水洗浄にかけ、その後の分析用に保管し、繰り返し増幅又は分析し、或いは操作することができる。緩衝液での度重なる洗浄、ハイブリダイゼーション反応、増幅反応等の後でも核酸は固相に結合し続けることから、核酸は何度でも分析することができる。核酸の固相での繰り返し操作は、本発明の方法及び当業者周知のその他の核酸操作法により達成できるだろう。本発明の方法により同一核酸検体を繰り返し分析できる能力は、結果確認及び拡大分析の手段を提供する。
【００４６】
ハイブリダイゼーション及び増幅を含む操作に関する一般原理及び条件は当分野周知である。方法の細目は、本発明の特定の応用に影響されることなく、当業者周知の操作手順及び本明細書記載の手順に従い計画される。これら必要な計画を改良することは、特段の実験なしに当業者により日常行われている。
【００４７】
当業者は本明細書記載の様な、固相マトリックス上への核酸の強固な結合は、広範囲のサンプルに実施できることを理解するだろう。この様なサンプルとしては、農業、細菌及びウイルス、及びヒト若しくはその他動物からもたらされる生物サンプル、並びに廃水若しくは飲料水、農産物、加工食品及び空気等が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、サンプルとしては、例えば血液、便、痰、粘膜、頸部又は膣検体、脳脊髄液、血清、尿、唾液、涙、生検サンプル、組織学組織サンプル、組織培養生成物、培養細菌、農産物、環境サンプル、廃水若しくは飲料水、加工食品、及び空気が挙げられる。本発明は、天然又は汚染物を問わず、核酸を含むサンプルより固相マトリックス上に核酸を不可逆的に結合するのに有用である。
【００４８】
本発明は更に、基材表面を本発明の固相マトリックスでコーティングする方法を包含する。このような基材としては、ポリマ（例えばプラスチック）やガラスなどの酸化物材料が挙げられる。これら基材の形状としては、チューブ、プレート、膜、毛細管、スライド、ビーズ、微小粒子、ファイバ、マイクロチャネル及びマイクロアレイなどが挙げられるが、核酸アーカイブ、分析、及び／又は操作に好適であればいかなる形状でもよく、これらの形状に限定されない。従って、上記いずれの方法による核酸のアーカイブ、直接固相分析及び／又は操作は、本明細書記載のように調製されたコーティング表面及び基材を利用して実施できる。
【００４９】
標準的なＰＣＲチューブのようなポリマ基材に固相マトリックスをコーティングする方法の１つに、接着剤を使用する方法がある。しかし接着剤は、増幅反応、特に低コピー数を検出する必要があるアッセイでの増幅反応を阻害する場合がある。従って、本発明は接着剤中に存在しうる増幅阻害物質を排除しつつ、固相マトリックスをポリマ又はプラスチック表面に接着するための改良方法を提供する。プラスチック表面はポリマで形成されるいかなる表面でもよく、ポリマから作られたチューブ、プレート、膜、ビーズ、微小粒子、マイクロチャネル、マイクロアレイやその他の好適な形状を包含する。ポリマ基材のコーティングに関する本発明の方法は実施例１３に詳しく記載されている。
【００５０】
上記ポリマに加えて、本発明は更にガラス（二酸化ケイ素）又は酸化アルミニウム若しくは二酸化チタンなどの他の酸化物基材を、本明細書記載の固相マトリックスでコーティングする方法も提供する。核酸操作に使用するのは、ガラス又は酸化物基材のいかなる形状でも好適であり、ガラス毛細管、グラスファイバーフィルタ、顕微鏡用スライド、多孔性ガラスウール及びアルミナフィルターなどが例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。固相マトリックスのコーティングは、実施例１４に詳述するいくつかの方法により、毛細管、スライド及びその他の形状をしたガラス表面、及びその他の酸化物表面上に付着できる。
【００５１】
本発明は更に、本発明による核酸のアーカイブ、分析及び／又は操作するためのキットも提供する。キットは一般に、固相マトリックスで１つ又は複数の表面をコーティングしたポリマ又はガラスなどの基材を構成要素として含む。この基材は核酸操作に好適ないずれの形状でもよく、ＰＣＲチューブ、プレート、ビーズ、膜、ビーズ、マクロチャネル、マイクロアレイ等が挙げられるが、これらに限定されない。好適な固相マトリックスとしては、本発明に従って親水性を得たいかなる電気陽性材料でもよく、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、アルファ酸化アルミニウム、ガンマ酸化アルミニウム、薄膜酸化アルミニウム混合組成物（ＡｉｘＯｙ）、酸化チタン（Ｔｉ２Ｏ３）、修飾酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）等が包含されるが、これらに限定されない。固相マトリックスは実施例１４記載の方法に従ってポリマ又はガラスの表面上にコーティングできる。
【００５２】
キットは更に核酸操作及び／又は分析に必要な試薬の入った１つ又は複数の容器を構成要素として含んでも良い。
このような試薬の例としては、溶解緩衝液、洗浄緩衝液及び側法流動緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明のキットは手動操作に好適であるが、自動或いは半自動工程へも組込まれる。別のキット組立体は、ロボットを使った大量処理及び分析に好適である。
【００５４】
実施態様の１つでは、キットは（ａ）その内面が酸化アルミニウムでコーティングされた１つ又は複数のＰＣＲチューブ、並びに（ｂ）溶解緩衝液及び洗浄緩衝液の入った１つ又は複数の容器を構成要素として含む。キットは更にキットの使用に関する取扱説明書を含んでも良い。本実施態様のキットは、核酸が抽出チューブ内に結合したまま残り、同一チューブ内でその核酸を直接増幅できる核酸抽出に関する革新的なシステムを提供する。
【００５５】
プロトコルは、増大する様々な標的分子、及び全血、バフィーコート、尿、培養細胞、菌細胞、マウスの尾及び頬側スワブを含む様々なタイプのサンプルで評価されている。
【００５６】
本明細書では様々な用語が使用されているが、それらを定義することは有用であろう。これらの用語については以下に定義するが、これらの用語が次の例や本明細書の中で使用される場合には、その定義を念頭に置く必要がある。
【００５７】
本発明では用語「アーカイブ」は、核酸を本発明の固相マトリックスに強固に結合し、続いて結合した核酸を保存及び／又は操作する方法を意味する。「保存」は、同一の核酸を時間を置いて分析する場合と、繰返し分析する場合の双方の能力と、複数の標的核酸を同時に、又は連続的に拡大分析する能力を包含する。この場合の操作方法としては固相核酸酵素反応、オリゴヌクレオチドもしくはプローブのハイブリダイゼーション及び／又は核酸増幅反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明で使用する場合、「鋳型依存的工程」は特定プローブを利用した鋳型依存的認識、シグナル増幅反応を利用したコピー操作、又は鋳型依存的プライマ分子の伸長を利用する標的増幅を含む工程と定義される。鋳型依存的伸長とは核酸の合成及び標的のＲＮＡ又は、ＤＮＡ配列のコピー伸展を意味するが、この場合新たに合成される核酸鎖の配列は標的核酸とプライマとの相補的な塩基対合の規則によって規定される。特定配列を持つオリゴヌクレオチド又はプローブを特異的に用いる、相補的塩基対合に基づく鋳型依存的工程は「ハイブリダイゼーション」検出として知られている。
【００５９】
「プライマ」分子とは、標的配列／コントロール配列の既知部分に対し相補的であり、ＤＮＡポリメラーゼ又はその他のポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、又はその他の核酸依存酵素による合成開始に必要な核酸配列を意味する。
【００６０】
「標的核酸配列」、「標的核酸」又は「標的」とは、捕捉、検出、増幅、操作及び／又は分析の対象となる核酸を意味する。標的核酸は精製した、或いは部分精製した状態、又は未精製の状態でサンプル中に存在しうる。
【００６１】
「核酸」とは、分離した断片又はより大きな構造体の成分のいずれかの形状をとりうる、２個以上の修飾及び／又は未修飾デオキシリボヌクレオチド或いはリボヌクレオチドのポリマである。ポリヌクレオチドの例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡ（ペプチド核酸）の様なＤＮＡ類似体、及びその化学的修飾物が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡは一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は増幅技術により増幅されたＤＮＡでもよい。ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、又はいずれかのＲＮＡポリマでよい。
【００６２】
１つの実施態様においては、用語「捕捉」は、核酸分子の固相マトリックス上への直接結合を意味する。結合は適切な緩衝液の中で、核酸の持つ化学的及び／又は物理的特性に基づいて直接行うことができる。
或いは、用語「捕捉」はサンプル中に存在する標的核酸とマトリックスに結合した核酸プローブとのハイブリダイゼーションを意味する。
【００６３】
本発明は、核酸を強固に結合する材料にＤＮＡ及びＲＮＡを結合することと、固相に結合したＤＮＡ及びＲＮＡの各種利用を目的としている。この中には、固相捕捉のために、強固に核酸を結合する酸化アルミニウム又はその他の材料の使用方法が含まれる。この方法は、固相捕捉と、水性緩衝液、単一増幅反応又はハイブリダイゼーションに基づく反応と、連続する多重増幅反応又はハイブリダイゼーションに基づく反応の使用を含む様々な操作とを直接結びつけるものである。さらに、核酸捕捉は汚染核酸の除去、或いは大容積検体又はプール検体分析のいずれかの検出を目的とした低コピー核酸の濃縮の用途に好適である。
酸化アルミニウムは、低濃度及び高流速、例えば５ｍＬ／分の核酸でも結合できる十分な親和力を示す。このように本発明は大容積の、重力を利用した又は高流速の捕捉、並びに増幅反応を妨害する可能性のある阻害物質を含まない、極めて清浄な核酸を得るための徹底した水洗に適合した形の核酸の捕捉に有用である。
【００６４】
本明細書に開示するハイブリダイゼーション反応は、固相マトリックス上に捕捉されたオリゴヌクレオチドプローブへの標的核酸の直接ハイブリダイゼーションを包含するが、この場合マトリックスはビーズ又はブロット又は、マイクロアレイチップのような平坦な表面の形状でよい。ハイブリダイゼーションは更に最初に捕捉プローブ（例えばオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、クローン化プラスミド、転写又は、合成ＲＮＡ、又はＰＮＡ）を固相マトリックスに強固に結合し、続いて検体から相補的な標的配列を捕捉することによる、特定標的配列の特異的捕捉も包含する。この方法は非特定核酸のバックグランドレベルが高い複合検体を分析する場合特に有用である。捕捉ビーズ法は、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）に結合したポリ−Ｔオリゴヌクレオチドを利用してポリＡメッセンジャーＲＮＡを精製するなどの特定標的配列の捕捉に有用である。適切な捕捉オリゴヌクレオチドを利用することにより、様々なタイプの検体からいかなる特定標的核酸も選択的に除去し、濃縮することができる。
【００６５】
本発明により、固相に強固に結合した核酸を用いた酵素認識及び特定操作又は増幅反応が可能になる。これには、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＩｓｏＣＲ又はＣＲＣＡなどの標的増幅反応とＱベータレプリカーゼ、又は分枝鎖ＤＮＡ（本明細書に具体的に引用した、Ｕｒｄｅａ他に付与された米国特許第５，５９４，１１８を参照。）などのシグナル増幅反応の両方が包含される。本発明は更に標準的なＰＣＲチューブの反応表面に付着した結合基材としての酸化アルミニウムを取り込む方法、及び同一のＰＣＲチューブを用いてＰＣＲのサーマルサイクル反応と直接且つ簡便に接続する高速核酸抽出プロトコルも提供する。ハイスループットロボット工学を利用することで、ＰＣＲチューブ又は容器は、自動化のプラットフォームを提供する。
【００６６】
酸化アルミニウムを別の核酸応用で利用可能にする緩衝液システムも本発明の範囲内に含まれる。この種の緩衝液システムとしては、例えばクリプトスポラジウムパルヴム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）のような極度に硬い検体を破壊する特定の還元剤も含むチオシアン酸グアニジンをベースとする緩衝液が挙げられる。本発明の目的に適したその他の緩衝液システムには、迅速且つ経済的なＤＮＡ結合緩衝液を提供する、ＮａＯＨのようなアルカリ性緩衝液が挙げられる。ＮａＯＨ緩衝液中で、ＲＮＡは破壊される。従ってＮａＯＨ緩衝液の使用は、ＤＮＡのみの選択的に結合する手段を提供する。本発明の目的に適した更に別のシステムには、リン酸緩衝液など、核酸の酸化アルミニウムへの結合を低減する緩衝液がある。これらの緩衝液システムは、高感度で効率的なマイクロアレイ、ビーズ及びブロットハイブリダイゼーションに、シグナル対ノイズが低いバックグランドを提供する。
【００６７】
本発明の固相マトリックスの強固な結合特性は、同一又は異なる遺伝子の連続的な繰返し分析を提供する。これにはＤＮＡとＲＮＡ双方の同時分析、又はＤＡＮとＲＮＡの個別で連続的な分析が包含される。ハイブリダイゼーション捕捉は複数のプローブを結合することで、特定標的のために多重化される。即ち本発明はハイブリダイゼーション反応、又は増幅反応による核酸の繰返し又は連続分析に有用である。ひとたび強固に結合すると核酸は安定化し、室温、冷蔵又は冷凍して長期間保存できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
当業者は本発明が核酸抽出、精製及び検出に広範囲に応用可能であることは容易に認識できる。以下実施例は本発明を説明、例示するものであり、従って本発明にいかなる制限を加えるものではない。様々な変更が発明の範囲内に於いて可能である。
【実施例１】
【００６９】
方法と材料
ＤＮＡ結合は３２Ｐ放射能標識を使用して測定した。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社より得た４３６１塩基対長のＰＢＲ３２２プラスミドを、Ｐｒｉｍｅ−ＩｔIIストラタジーンキットを使用してランダムプライム法により標識した。このプラスミドをＨｉｎｄIIIで切断し、未標識のヌクレオチドをＢｉｏＲａｄ Ｂｉｏｓｐｉｎ６を使用して除去し、濃度を１ナノグラム／マイクロリットル（ｎｇ／μＬ）に調整した。より高いＤＮＡ濃度はサケ精子ＤＮＡを加えて調整した。放射能標識実験のデータは５回のレプリカデータの平均値を表している。
【００７０】
Ａｌｄｒｉｃｈ社より得た酸化アルミニウムビーズ（サイズ、７４〜１４９μｍカタログ番号３４、２６５−３）を室温で１時間０．１ＮのＮａＯＨで処理し、水酸化アルミニウムビーズを生成した。水（ｄｄＨ２Ｏ）、０．１ＮのＮａＯＨ又は４Ｍのチオシアン酸グアニジン緩衝液（１２ｇのＧｕＳＣＮ、２７７μＬのＴｒｉｔｏｎＴＭＸ−１００、２．２ｍｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡｐＨ８．０及び１０ｍｌの０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．４）を含むＤＮＡ結合バッファーを用いた。結合は密封した微量遠心チューブ内での回転と、重力フロー濾過のいずれでも可能である。大型のビーズは遠心分離しなくてもチューブ底に容易に沈殿するので、洗浄が容易である。重力フロー実験ではＳｐｅｃｔｒｕｍ ＳｐｅｃｔｒａＭｅｓｈ ４３μｍフィルタ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社、カタログ番号１４６５３０）をＡＮＳＹＳ ４ｍＭクロマトグラフィーカラム内に圧入した。
水酸化アルミニウムビーズをこのカラム内にスラリ液の形で充填し、排水して、吸い取り紙で水を取り、１ｍｌの７０％のＥｔＯＨで１回洗浄し、乾燥させてから各種結合緩衝液に加えたＤＮＡを添加した。
【００７１】
ＸｔｒａＢｉｎｄＴＭ（Ｘｔｒａｎａ，Ｉｎｃ．、ブルームフィールド、コロラド）は、α−酸化アルミニウム（α−Ａｌ２Ｏ３）の固相マトリックスである。ＸｔｒａＢｉｎｄ ＡｍｐＴＭ（Ｘｔｒａｎａ，Ｉｎｃ、ブルームフィールド、コロラド）は内壁表面をＸｔｒａ ＢｉｎｄＴＭでコーティングしたＰＣＲチューブである。
【００７２】
固相増幅では、座に好適な特性を持たせるために、公開されている配列及び方法を使用した。以下記載の実験手順で使用している配列を表１に掲載した（配列番号１〜１０）。具体的には、ＨＩＶのＰＣＲではＳＫ３８／ＳＫ３９プライマセット（配列番号８〜９；Ｋｅｌｌｏｇ ａｎｄ Ｋｗｏｋ、ＰＣＲプロトコル内：方法及び応用ガイド、ＭＡ．Ｉｎｎｉｓ他 編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． ３３７〜３４７項（１９９０年）、これら具体的な本明細書への引用記載を参照）、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社より得たコントロールＨＩＶ ＤＮＡプラスミド（カタログ番号Ｎ８０８−００１６）及びｒｔＴＨ逆転写酵素増幅を使用した。鎖置換増幅ではマイコバクテリウムプラスミドを標的とし、Ｗａｌｋｅｒ他、 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２巻：９〜１３項（１９９６年）に記載（具体的な本明細書への引用記載を参照）のプライマセット（配列番号４〜７）を用いた。ヒトのショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プライマセットとプロトコルはＰｒｏｍｅｇａ社より市販されているＣＴＴ及びＦＦＶマルチプレックスである。
【００７３】
【表１】
【実施例２】
【００７４】
ＤＮＡが固相マトリックスに強固に結合することの確認
放射能標識ＤＮＡ（１ｎｇ）は室温で１時間、水（ｄｄＨ２Ｏ）、０．１ＮのＮａＯＨ又は４Ｍのグアニジンチオシアネート緩衝液中で、回転しながら酸化アルミニウムと結合することができる。１９８ｍｇの酸化アルミニウムの結合能力を測定するために、１ｎｇの放射能標識ＤＮＡを各種濃度のサケ精子ＤＮＡに加えた（図２）。サケ精子ＤＮＡの量を増やしていくと、やがてＤＮＡ結合は最大値に達し、液相のＤＮＡはそれ以上結合できなくなるために、結合ＤＮＡの割合は次第に減少する。このＤＮＡ結合の不可逆性は、続く１０回の洗浄後に除去された放射標識を測定することで示される（図３）。図３に示すように、９５℃のＰＣＲ緩衝液で１０回洗浄した後でも、９２％を越えるＤＮＡは強固に結合したまま保持される。溶出した数値の大部分（６％）は最初の４回の洗浄中に生じたものであり、残り６回の洗浄で溶出された数値は２％に過ぎなかった。従って、図３のデータよりＤＮＡが酸化アルミニウムに強固に結合し、９５℃での７０％エタノール、水又はＰＣＲ緩衝液による１０回の洗浄でも９０％を越えるＤＮＡが保持されることが示された。従って酸化アルミニウムに結合したＤＮＡは遠心分離にかけることなく，またＤＮＡを損失する恐れなしに、簡単に水洗浄及び緩衝液交換に従う。
大容積のサンプルから選別した固相に結合した核酸は、洗浄してから所望の容積に再懸濁することができる。例えばグアニジンチオシアネート緩衝液を含む３ミリリットル（ｍＬ）のサンプルからＤＮＡを酸化アルミニウムに結合し、リン酸又はＴｒｉｓ緩衝液で洗浄してから少量（５０μＬ）の増幅反応混合液内にビーズを再懸濁することができる。この特性により、ＤＮＡの精製と増幅とを簡単に結びつける方法が導かれる。
【実施例３】
【００７５】
重力フロークロマトグラフ
大容積かつ低濃度の検体からＤＮＡを検出する感度は、高速のフロークロマトグラフィーにおける酸化アルミニウムの効率的なＤＮＡ結合能力を利用して、大幅に改善することができる。７４〜１４９μｍの酸化アルミニウムビーズ（Ａｌ２Ｏ３）或いは１５０〜２１２μｍの二酸化ケイ素ビーズ（ＳｉＯ２）（シグマ社、カタログ番号Ｇｌ１４５）を使用した重力濾過にかけ、放射能標識ＤＮＡを結合した。二酸化ケイ素又は酸化アルミニウムの量は、ＤＮＡ結合に利用可能な表面積が共に同じになるように調整した。１ｍＬのグアニジンチオシアネート結合緩衝液（流れ時間、１．５〜２分、約０．５ｍＬ／分）又は１０ｍＬのグアニジンチオシアネート緩衝液（流れ時間、５〜８分、約２ｍＬ／分）に希釈して重力濾過中にＤＮＡ（５０ｎｇ）を結合した。図４は、二酸化ケイ素に結合するＤＮＡと、二酸化アルミニウムに結合するＤＮＡそれぞれに及ぼす流速と濃度の影響を比較したものである。１ｍＬ容積の重力フロークロマトグラフィー中のＤＮＡ結合には、酸化アルミニウムがより効果的であった。４Ｍグアニジンチオシアネート結合緩衝液中の二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）の結合効率は６％であったのに対し、同一緩衝液中での酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）の効率は５２％であった。
ＳｉＯ２とＡｌ２Ｏ３の結合効率は共に１ｍｌのＮａＯＨ結合緩衝液で改善した（ＳｉＯ２の結合効率は１２．４％であり、これに対しＡｌ２Ｏ３の結合効率は６０％であった）。容積を１０ｍＬにして流速を４倍に上げ、同一のＤＮＡ５０ｎｇ（即ち１ｍＬ当たりの濃度は１ｍＬ検体に比べ１０分の１になる）を使用すると二酸化ケイ素の結合効率は大幅に低下し、２％未満となった。これに対し酸化アルミニウムの場合、測定総回収率中の低下は１０％に過ぎなかった。他の実験方法では、大容積検体を２回又は３回通過させてクロマトグラフィを繰り返すと、酸化アルミニウムについては最高で８０％の結合効率が得られることが示された。（データ非掲載）
これらの結果から、酸化アルミニウムが二酸化ケイ素に比べてＤＮＡ結合固相として遙かに優れており、ＤＮＡは高流速、低濃度のＤＮＡクロマトグラフィで捕捉できることがわかる。
このように酸化アルミニウムの特性を利用することで、プールされた、或いは大容積の検体からＤＮＡを濃縮することができ、ミリリットル当たりのＤＮＡ検出感度を大幅に上げることができる。またＤＮＡに対する酸化アルミニウムの高親和力は、水、緩衝液又はその他の試薬からの低レベルの汚染ＤＮＡの除去にも有効である。
【実施例４】
【００７６】
固相増幅
酸化アルミニウムは核酸を強固に結合するため、酸化アルミニウムは結合したＤＮＡが固相上で直接増幅可能な場合にのみ有益である。様々な増幅法に適応することを例示するために、１０６コピーのＨＩＶ ＤＮＡと１μＬのマイコバクテリウムＤＮＡ標本を同時に水中にて酸化アルミニウムと結合した。これら結合した標的ＤＮＡを次にＨＩＶの配列について、まず３５サイクルのポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）（図５のパネル（Ａ）参照）を用いて増幅し、次に鎖置換増幅（ＳＤＡ）を用いて標的マイコバクテリアの増幅（図５パネル（Ｂ）参照）を行った。図５、パネル（Ａ）に示すＨＩＶ ＰＣＲのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色アガロースゲルは良好な増幅産物を示している。図５のパネル（Ａ）の中のウエル１は分子量ラダーであり、ウエル２及び３は陽性の１０００コピー水を用いたコントロール増幅であり、ウエル４、５、６及び７は酸化アルミニウム固相ＰＣＲ増幅であり、ウエル８、９、１０及び１１は酸化アルミニウム固相の陰性コントロールであり、ウエルの１２及び１３は陰性コントロールである。ＨＩＶのＰＣＲ増幅に続いて、この酸化アルミニウムを４回７０％ＥｔＯＨで洗浄し、５５Ｃで１０分間乾燥してから標的マイコバクテリウムをＳＤＡ増幅した。ＳＤＡ増幅のＥｔＢｒ染色アガロースゲルもまた、コントロール水に観察されたのと同等レベルの増幅産物を示した（図５、パネル（Ｂ））。図５のパネル（Ｂ）では、ウエル１及び２は陽性コントロール水であり、ウエル３、４、５及び６は酸化アルミニウム固相ＤＮＡ増幅であり、ウエル７、８、９及び１０は酸化アルミニウム固相の陰性コントロールであり、ウエルの１１及び１２は陰性コントロール水である。
【００７７】
追加実験手順より（図示せず）、マイコバクテリウムプラスミドＤＮＡは４Ｍのグアニジンチオシアネート緩衝液、又は０．１ＮのＮａＯＨ結合緩衝液を用いても結合すること、そしてこれら固相でＳＤＡ増幅が起こることが示されている。
アルカリ条件は一本鎖を生成することが広く知られている。
ＤＮＡは４Ｍグアニジンチオシアネート結合緩衝液中でも一本鎖である（トンプソンとギレスピー、分析生化学、１６３巻：２８１〜２９１項（１９８７年）、参照により本明細書への具体的記載に替える）。ＮａＯＨ又はグアニジンチオシアネート緩衝液中での酸化アルミニウムに結合したＤＮＡのＳＤＡ増幅は、溶融ステップなしに進む。これらのデータは、これら結合緩衝液中ではＤＮＡが一本鎖の形で結合しており、酸化アルミニウムを使ったＤＮＡ精製と一本鎖状の標的核酸を必要とする等、温増幅方法とを直接結びつける手段となることを確認するものである。
【００７８】
酸化アルミニウムがＲＮＡも効率よく結合できることを示すために、酸化アルミニウムと共に４Ｍのグアニジンチオシアネート結合緩衝液を用いてエイズ患者の酸クエン酸塩デキストロース（ＡＣＤ）血漿検体から直接ＨＩＶを精製した。この検体は既にウイルス負荷定量ＰＣＲにより２×１０４ＲＮＡコピー／ミリリットルの力価を持つことが分かっている。酸化アルミニウム抽出では、０．５ｍＬの血漿を４Ｍのグアニジンチオシアネート結合緩衝液を用いて５ｍＬに希釈してから、４０ｍｇの酸化アルミニウムを用いて重力濾過した。
【００７９】
図６はｒｔＴＨ逆転写酵素増幅後のＥｔＢｒ染色アガロースゲルで良好なＰＣＲ産物形成が検出されたことを示している。図６ではウエル１は分子量ラダーであり、ウエル２は１０００コピーの陽性ＨＩＶ ＤＮＡ水であり、ウエル３、４及び５は別々に行った３回のグアニジンチオシアネート緩衝液／酸化アルミニウム抽出後のｒｔＴＨ逆転写酵素増幅産物であり、ウエル６及び７は酸化アルミニウム陰性コントロールであり、ウエルの８は陰性コントロール水である。４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液プロトコルは血漿中に存在するＨＩＶウイルス粒子からＲＮＡを放出させることが可能であり、そのＲＮＡは大容積（５ｍＬ）重力濾過を利用して酸化アルミニウム上に増幅可能な状態で捕捉される。酸化アルミニウムは一般に核酸を結合する。
【実施例５】
【００８０】
ＤＮＡアーカイブ
本発明によれば、固相マトリックスに核酸を強固に結合する能力を直接固相増幅とを組み合わせることで、同一ＤＮＡサンプルを回数に限りなく繰り返し分析できる。このことを例示するために、１０μＬの酸クエン酸塩デキストロース（ＡＣＤ）血を４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液中で酸化アルミニウムに結合した。次に結合したＤＮＡを、５種類の連続するショートタンデムリピート（ＳＴＲ）増幅と５種類のプライマセット（プロメガ）とを用いて、次の順番で各３０サイクルのＰＣＲ増幅に５回かけた：１）Ｆ１３Ｂ、２）ＦＥＳＦＰＳ、３）ＶＷＡ、４）ＣＣＴマルチプレックス及び５）ＦＦＶマルチプレックス。最後の増幅セットの後、ＤＮＡサンプルをそのまま１５０回のＰＣＲサイクルにかけた。
【００８１】
図７は４番目の遺伝子セットの増幅であるプロメガＳＴＥ ＣＣＴマルチプレックスを用いた増幅と、５番目の遺伝子セット増幅であるプロメガＦＦＶマルチプレックスを用いた増幅のパターンを示す銀染色ゲルである。図７ではレーン１、８、９及び１６はアレルラダーであり、レーン１７はヒトゲノム陽性コントロール水であり、レーン２、３及び４は酸化アルミニウム結合ＤＮＡの４番目の増幅（ＣＴＴマルチプレックス）であり、レーン５、６及び７は酸化アルミニウムＣＴＴ陰性コントロールであり、レーン１０、１１及び１２は酸化アルミニウム結合ＤＮＡの５番目の増幅（ＦＦＶマルチプレックス）であり、そしてレーン１３、１４及び１５は酸化アルミニウムＦＦＶマルチプレックス陰性コントロールである。図７の銀染色ゲルに示される結果からは、増幅が５種類全てのＰＣＲで起こっていることが示された。これらデータから、ＤＡＮのアーカイブと、４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液プロトコルとそれに続く５種類の連続ショートタンデムリピート（ＳＴＭ）増幅（合計１５０ＰＣＲサイクル）を利用したＰＣＲによる増幅により、同一の結合ＤＮＡを反復して酸化アルミニウム増幅できることが確認された。
【００８２】
まとめると、ＤＮＡは更なる増幅分析が可能な形で酸化アルミニウム上にアーカイブされている。そのような利用としては、同一遺伝子の反復分析、異なる遺伝子の連続増幅、例えば異なる感染性病原体の検出、又は拡大分析、例えばヒト識別分析を目的としたより高度な鑑別力が挙げられる。
【実施例６】
【００８３】
酸化アルミニウムへの核酸の不可逆的結合を促進又は阻止する緩衝液
放射線標識ＤＮＡ（５０ｎｇ）を、１９８ｍｇの酸化アルミニウム存在下に表２に掲載の各種緩衝水溶液５００μＬに加えた。酸化アルミニウムへの放射線標識ＤＮＡの排他的結合をより正確に測定するために、実施例１記載のＢｉｏｓｐｉｎ６を使った精製後に残った遊離状態の取り込まれていないヌクレオチドをトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿にて判定した。表２に示すように、このより正確な手順を利用した場合、４Ｍグアニジンシアネート緩衝液又は水酸化ナトリウム中でＤＮＡは酸化アルミニウムに１００％の効率で結合する。
ブロッキング緩衝液の添加といった、その他特定の物質及び／又は条件は、ＤＮＡの結合を低下する。表２では、例えば、その様な例として１０％ウシ血清アルブミン又はＫ２ＨＰＯ４緩衝液を挙げている。
【００８４】
【表２】
結合及びブロッキング条件は共に規定されているので、最初に特異的なオリゴヌクレオチド又はプローブに固相マトリックスへ強固に結合し、次に固相に結合した核酸へのハイブリダイゼーションによる特異的標的捕捉が可能なブロッキング緩衝液を添加することで反応条件を変える、便利且つ特異的な方法を開発できる。例えば第１の核酸配列は、サンプルをこの第１核酸をマトリックスに強固に結合させる緩衝液中にマトリックスと接触させることで、本発明の固相マトリックスに強固に結合できる。次に、第２核酸配列を結合した第１核酸にハイブリダイズしたい場合には、緩衝液条件をリン酸緩衝液の様な、固相的リックスに結合する第２核酸の量を減らすと同時に、第１核酸への第２核酸のハイブリダイゼーションを可能にするブロッキング緩衝液に変える。この様にブロッキング緩衝液は、固相に結合した第一核酸への核酸配列ハイブリダイズに関し、バックグランド信号が低いハイブリダイゼーション緩衝液として機能する。所望の操作（例えば増幅、検出等）を実行した後、ハイブリダイズした第２核酸配列を取り除く。
【００８５】
こうした後、固相に結合した第１核酸は複数回再使用することができる。ＲＮＡは０．１ＮのＮａＯＨ内で破壊されることは周知である。従ってこの結合緩衝液を利用することで、ＤＮＡだけが捕捉される。グアニジンチオシアネート緩衝液と水酸化ナトリウム緩衝液を用いた効果的な細胞の破壊と迅速な結合は、血液、頬側スワブ、尿、及び血漿又は血清内に飛散したＨＩＶウイルス粒子に効果的である。しかし、ある種の感染菌、例えばクリプトスポラジウムパルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）については、細胞を効果的に破壊するために検体を９５℃に加熱し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の様なタンパク質還元剤を加える必要がある（配列番号１〜３；表１）。
【実施例７】
【００８６】
高流速での迅速結合とＰＣＲチューブへの酸化アルミニウムの取込
酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）の高流速でのＤＮＡ結合能力を、同じ総ｃｐｍの放射線標識ＤＮＡを１ｍＬ、５ｍＬ又は１０ｍＬの４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液に顕濁し、その顕濁液を酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）又は二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）に一定速度で通した。図８に示すように、結果からは酸化アルミニウムが二酸化ケイ素に比べ遙かに優れていることが確認された。酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）は流し濃度で核酸を効率的に結合し、大容積（１０ｍＬ）の検体を１ｍＬまで、１ｍｌ当たり１０倍の濃縮し、容積を１／１０まで小さくした。ＤＮＡの結合は図９に示す実験結果より明らかなように迅速であった。ここでは５０μＬの酸クエン酸塩デキストロース（ＡＣＤ）抗凝固血を、０．１ＮのＮａＯＨ結合緩衝液中に酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）に加えた。ＤＮＡが結合した直後、又は様々なインキュベーション時間後にこの固相に結合したＤＮＡよりＨＬＡ ＤＲベータ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
図９では、増幅効率で表された結合は結合直後（レーン１〜４）、１分後（レーン５〜８）又は２分後（）レーン１４）で同一であった。レーン１３は陰性コントロール水である。
【００８７】
これら実験結果は、ＰＣＲ増幅と直接結びつく自動化可能な核酸抽出に極めて簡単且つ迅速なプロトコルの基礎である。このために、酸化アルミニウムを、図１０に示す様に、シリコン又はＰＣＲを阻害しないことが分かっているその他接着物質を介してＰＣＲチューブ内に接着した。或いは、より多数を処理するために、酸化アルミニウムを９６ＰＣＲチューブプレートに取り込んでも良い。これら代替法はいずれも１）結合緩衝液を酸化アルミニウムＰＣＲチューブに加えること、２）検体を各チューブに添加し、混合してから液体を吸引して捨てること、３）洗浄緩衝液を繰り返しピペットで吸引、排出して洗浄し（３回）、その後洗浄緩衝液を吸引して捨てること、４）ＰＣＲ増幅マスターミックスを添加すること、及び５）サーマルサイクラーにて増幅することを含んで成るプロトコルによる単純な核酸抽出法を提供する。このプロトコルのピペット吸引ステップはロボットシステムを用いて行う多数処理のために簡単に自動化される。
【実施例８】
【００８８】
酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）への精製ＲＮＡの結合の確認
実施例４では、患者の血漿検体からＨＩＶを検出したことに基づきＲＮＡが酸化アルミニウムに強固に結合し、増幅できることを記載した。この結果は、血清中のプロウイルスＤＮＡを汚染したことによるものである可能性がある。純粋な標的ＲＮＡを使ったＲＮＡ結合は、不可逆的な結合と固相増幅を確認した。図１１は４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液中に結合したａｐＡＷ１０９純粋標的ＲＮＡの増幅及び酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）固相上で増幅したｒｔＰＣＲの結果を示している。ＩＬ−２ ｍＲＮＡ及びＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｄｓＲＮＡが同様の様式で酸化アルミニウム上に結合及び増幅することが示された（図示せず）。
【実施例９】
【００８９】
ハイブリダイゼーションによる特異標的捕捉を目的とする強固に結合した核酸プローブの利用
検出限界を判定するために実施した実験より、ＰＣＲ増幅による酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）に結合したＤＮＡの検出では１０００コピーが必要であり、結合ＲＮＡでは１０３コピーが必要であることが示された（図１１）。検出感度は、核酸プローブを本発明の固相マトリックスに結合し、続いてこのプローブをサンプル中に存在する標的核酸とハイブリダイゼーションさせることでＲＮＡ又はＤＮＡのいずれについても１００コピー未満まで大きく向上した。検出を望む標的核酸に隣接する配列に相補的な２０〜１００塩基対長の高コピー数核酸プローブを０．１ＮのＮａＯＨ緩衝液中で酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）に強固に結合した。洗浄後このプローブを用い、高いレベルのバックグランド核酸を含む検体の中に標的核酸があるものについても、ハイブリダイゼーションで捕捉した。この方法では、検体はマトリックス結合プローブが存在する状態で、４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液で破壊され３倍に希釈された。ハイブリダイゼーションは起こった。洗浄ステップ後、標的を直接ＰＣＲで増幅した。図１１に示すように、これにより約１０から１００コピー標的の検出限界を得た。
【実施例１０】
【００９０】
大容積又はプール検体中の低コピー標的の捕捉
酸化アルミニウムに強固に結合した核酸プローブによるハイブリダイゼーション捕捉は、初期検体容積が大きな場合での標的配列の特異的選別にも有効である。図１２に示す様に、上記ハイブリダイゼーション固相捕捉法により、血漿で初期容積を５．５ｍＬに希釈してもエイズ患者血漿検体由来の１０００コピーが検出可能であった。血漿は希釈を最小限に抑えて抽出するために、乾燥グアニジンチオシアネート粉末に直接加えられた。
この調整により、捕捉ビーズへのハイブリダイゼーションの最終容積は３０ｍＬになった。更に、１００μＬのＨＩＶ陽性血漿は、追加された２４の陰性血漿検体（１００μＬ）と一緒にプールしても検出された。これらプール実験より、検出感度が４８ＨＩＶウイルス粒子／ミリリットルであることが確認された。同様の方法から、３０ｍＬの水にプールされた１００コピーのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｕｍ ｐａｒｖｕｍが検出されることが示された（図示せず）。従ってハイブリダイゼーション捕捉プローブプロトコルを利用することで、個別検体で行った場合とほぼ等しい感度でプール検体をスクリーニングでき、そのため高感度のプール検体検査を可能にするため大きな商業的可能性を持っており、大幅なコスト削減をもたらす。
【実施例１１】
【００９１】
酸化アルミニウムに強固に結合した核酸の保管
５０μＬの酸クエン酸塩デキストロース（ＡＣＤ）血液由来の核酸を４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液又は０．１ＮのＮａＯＨ緩衝液を用いて酸化アルミニウムに結合した。次に結合した核酸を乾燥状態、又は７０％ＥｔＯＨ中、若しくはＴｒｉｓ ＥＤＴＡ緩衝液中で、室温、４℃又は−２０Ｃで保管した。核酸は一般にこれら条件では３ヶ月間安定であったが、本発明を利用すると更に長期間安定であり、おそらくは無期限に安定である。
【実施例１２】
【００９２】
核酸アーカイブの可能なその他材料の同定
本実施例は選択した材料が核酸アーカイブの一般的な目的に適うことが確認されたことを示している。これら材料は高結合定数でＤＮＡ及びＲＮＡを結合すると同時に、標的の増幅を目的に結合した核酸にアクセスする酵素増幅法も可能である。核酸を強固に結合できる材料を同定するために、前記放射性同位元素実験の替わりとなるより便利な代替法として蛍光法を計画した。ＤＮＡの場合、５’末端にフルオロセインの様な標識蛍光色素を持つ合成オリゴヌクレオチドを用いた。ＲＮＡの場合、色素標識ヌクレオチド存在下に、ＲＮＡポリメラーゼを使ったランオフ転写を利用して標識鎖を生成した。
これら蛍光標識鎖を結合緩衝液と混合し、各種材料にさらし、所定時間放置した後洗浄した。結合有り無しでの材料からの蛍光発光及び各種溶液（標識核酸、洗浄液）からの発光が測定できた。マトリックスへの結合を確認した後、結合核酸の増幅能をＤＮＡ又はＲＮＡを用いた抽出及び増幅法、精製核酸又は各種媒体（血液、細胞培養等）中の核酸、及びＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ及びＳＤＡといった各種増幅法について検討した。
【００９３】
好ましい本発明の固相マトリックスの１つは、アルファ酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）であり、これは商標名ＸｔｒａＢｉｎｄＴＭ（エクストラナインク、ブルームフィールド、コロラド）で核酸結合マトリックスとして販売されている。酸化アルミニウムはそれぞれ固有の特性を持つ様々な化学形状で存在することを記すことは重要である。記載の核酸アーカイブの場合には、標準的条件での結合及び増幅にはアルファ酸化アルミニウムが好適である。その他の形状の酸化アルミニウムはＤＮＡ又はＲＮＡを結合するが、結合した核酸を増幅するには増幅反応を変更しなければならない。例えばガンマ酸化アルミニウムに結合したＤＮＡのＰＣＲ増幅は、マグネシウムイオンの濃度を約５０％以上に増加すれば上手くいく。ポリメラーゼの濃度を上げることも役立つだろう。アルファ酸化アルミニウムは時に溶融体又は焼体として参照されるが、これら用語は一般に明瞭ではなく、或いは用語「アルファ」で良く定義される。
【００９４】
酸化アルミニウム、特にアルファ酸化アルミニウム以外にも、その他の材料が核酸アーカイブマトリックスとして有用であることが確認されている。
それら材料は酸化チタン（Ｔｉ２Ｏ３）、一般にはＡｌＯｙと呼ばれる酸化アルミニウム混合組成物の薄膜、及び変性二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）である。変性ＺｒＯ２を調製するために、ＺｒＯ２を酸性又は塩基性溶液にさらしてからＤＮＡと混合し、洗浄後酵素増幅により結合ＤＮＡが増幅することが示された。これら各種材料の能力を図１３〜１６に示した。
【００９５】
図１３は各種固相材料に結合した蛍光標識ＤＮＡ及びＲＮＡからの蛍光シグナルを表す棒グラフである。
本実施例で使用した固相材料は１００〜２００メッシュのアルファ酸化アルミニウム（アルファ−Ａｌ２Ｏ３）、１５０メッシュのガンマ酸化アルミニウム、１００〜２００メッシュの二酸化ジルコニウム、ガラスビーズ（１５０〜２１２μｍ）、１０００メッシュのアルファＡｌ２Ｏ３でコーティングしたガラスビーズ、１０００メッシュのアルファＡｌ２Ｏ３のＳｉＯ２薄膜でコーティングしたガラスビーズ、その上に酸化アルミニウムの薄膜を有するガラスビーズである。ガラス（ＳｉＯ２）ビーズも最小結合コントロールとして使用し、ＤＮＡ及びＲＮＡに関する結果をそれぞれに対応するガンマＡｌ２Ｏ３シグナルで正規化されている。
【００９６】
図１４は各種材料に結合したＤＮＡをＰＣＲ増幅した後の、エチジウムブロマイド染色アガロースゲルである。示したゲルは増幅前に４回及び８回洗浄したが、洗浄回数が５回、６回及び７回についても同様の結果を得た。標的ＤＮＡは精製された胎盤ＤＮＡであり、増幅域はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｇタンパク質共役受容体５７（ＧＰＲ５７）である。本図では、試験材料は１）酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）コーティングＰＣＲチューブ；２）アルファ−Ａｌ２Ｏ３；３）Ｔｉ２Ｏ３；４）酸化アルミニウム薄膜コーティングガラスビーズである。各マトリックス及び洗浄回数について、２回行った反応を示した。
【００９７】
図１５は酸化アルミニウム薄膜でコーティングしたガラス毛細管内壁に結合したＤＮＡのＰＲＡ増幅後のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルである。結合ＤＮＡは総時間約４５分の迅速サーマルサイクリングで増幅した。結合標的は精製胎盤ＤＮＡで、増幅域はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓＧタンパク質共役受容体５７遺伝子である。
【００９８】
図１６は大腸菌由来のＲＮＡをＮＡＳＢＡ増幅して得た、顕著なバンドを示す側方流動ストリップである。Ａｌ２Ｏ３又はＴｉ２Ｏ３スラリでコーティングされたＰＣＲチューブを使用した大腸菌希釈物を処理し、その結果を示している。
【実施例１３】
【００９９】
プラスチック表面を固相マトリックスでコーティングする別の方法
材料（Ａ）本発明のプラスチック表面コーティング法の１つは、加熱した固相マトリックスを冷却したプラスチックと接触させることを包含する。
これによりプラスチックは部分的に溶融し、固相マトリックスの埋込が起こる。固相マトリックスをるつぼの中で７００℃から８００℃に加熱してから、約０℃から１０℃の間の温度に冷却されているプラスチック材料（例えばＰＣＲチューブ）の上又は中に注ぎ込んだ。例えばプラスチック材料は氷槽（４℃）の中に入れることができる。過剰の固相マトリックスを払い落とし、チューブを包装した。マニフォールドを使用して複数のチューブを同時にコーティングするといった、この一般的な加熱・溶融法の代替法も開発されている。
【０１００】
（Ｂ）ＰＣＲチューブ又はその他プラスチック材料内に固相マトリックスを溶融すること以外に、プラスチック表面上に薄膜コーティングを溶着する方法もある。プラズマエッチング、化学蒸着法（ＣＶＤ）及び加熱蒸発法といった通常の処理及び溶着法を用いて、金属酸化物の薄膜を下張りのプラスチック材料に溶着、結合することができる。溶着条件を調整することで、膜に核酸を結合させ、結合したＤＮＡ又はＲＮＡを増幅することができた。
【０１０１】
（Ｃ）代替法として、プラスチック表面を、例えばプラズマエッチング或いは強酸／塩基処理、及びアルミニウムｓ−ブトキシドといった液体の金属酸化物前駆物質を用いて化学的に活性化するか、又はその他のアルコキシ金属試薬を導入して活性化プラスチック表面と反応させる方法がある。プラスチック表面活性化の方法は当分野周知であり、更なる説明は必要ない。この方法でも所望する結合及び増幅コーティングを作ることができる。
【実施例１４】
【０１０２】
酸化物表面への固相マトリックスコーティング法
固相マトリックスは以下の様な幾つかの方法により、毛細管、スライド及びその他形状のガラス表面、並びにその他の酸化物表面上に溶着できる。
【０１０３】
（Ａ）実施態様の１つでは大小の酸化アルミニウム顆粒を、加水分解を促進する酸性又は塩基性条件を持つガラス表面に溶着し、続いて乾燥した。酸性液の例としては、容積で９５％のエタノール、０．５％の濃塩酸（ＨＣｌ）及び４．５％の水を含む液がある。
【０１０４】
（Ｂ）別の実施態様では酸化アルミニウム顆粒を、酸性アルミニウムを二酸化ケイ素、酸化アルミニウム又はテトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン若しくはアルミニウムｓ−ブトキシドといった金属酸化物前駆物質を含むゾルと混合し、この混合物をガラス表面上でゲル化させてガラス表面上に溶着した。これにより金属酸化物結合剤の中に酸化アルミニウム顆粒のフィルムを得た。
【０１０５】
（Ｃ）別の実施態様では、Ｔｉ２Ｏ３顆粒を本実施例のＡ及びＢの方法でガラス表面に溶着した。
【０１０６】
（Ｄ）既存の酸化アルミニウム又は酸化チタンの顆粒を溶着することに加えて、アルミニウムｓ−ブトキシド若しくはチタンエトキシドといった金属酸化物前駆物質を、この前駆物質が加水分解して金属水酸化物を形成する液相反応液内で反応してガラス表面上に金属酸化物フィルムを溶着した。次に金属水酸化物同士を縮合して、ガラス又はその他の下張りしている金属酸化物基材に酸化層を共有結合した。例えば酸化アルミニウムゾルは、Ａ．Ｃ．ＰｉｅｒｒｅとＤ．Ｒ．Ｕｈｌｍａｎｎ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｅｒａｍ．Ｓｏｃ．７０：２８〜３２項（１９８７年））に記載の手順に従ってアルミニウムｓ−ブトキシドを加水分解してペプチド化することで調製した。次にガラス表面をこの液体にさらしてから乾燥した。これによりアルミニウムと酸素の混合組成物を有する酸化アルミニウムのフィルムコーティングができた。例えば、このフィルムのある部分はＡｌ２Ｏ３を、別の部分はＡｌ2.3Ｏ3.1を含むといった具合になっている。
【０１０７】
本実施例に記載のコーティングは、侵漬、液浸、スピンキャスティング又は基材を材料の懸濁液／ゾルにさらす同様の方法を含む当分野周知のいずれの好適な方法でも溶着できるが、もとよりこれらの方法に限定されるものではない。
【実施例１５】
【０１０８】
アーカイブしたＤＮＡ及びＲＮＡの長期保管
（Ａ）実施例１１では血液から抽出したゲノムＤＮＡが３ヶ月間安定して保管できることが確認された。今回、本研究ではこの期間を１８ヶ月に延長した。実施例１１に記載のサンプルを１８ヶ月間乾燥保管したでも、正確に増幅ができた（データ図示せず）。
【０１０９】
（Ｂ）同様の実験を計画して、酸化アルミニウムが安定してＲＮＡを保管できることを確認した。ＲＮＡは研究株である大腸菌ｓｉｔ１のみより得て、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキットで精製した。得たＲＮＡ抽出物（３１６ｎｇ）を１：２、１：４及び１：１０に希釈してから、ＭｇＣｌ２を含まない１０ｘＰＣＲ緩衝液５０ｍＬと各ＲＮＡ希釈液を５ｍｌ加えてＸｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブに結合した。３０分インキュベーションした後、上清を取り除き、チューブを５〜１０分間風乾した。全てのチューブにキャップを付け、室温、４℃又は−２０℃で保管した。１週間毎にチューブを取り出し、そして大腸菌ｓｚ ａｎｄ ｓｉｔｌマルチプレックス、ＮＡＳＢＡマスターミックスを加えた。以下の条件に従い、４２℃で９０分間ＮＡＳＢＡ反応を行った：８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ ＫＣＩ、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰミックス、２ｍＭのｒＮＴＰミックス、２００ｍＭのプライマミックス、１５％ソルビトール及び１５％のＤＭＳＯ。結果は参照により本明細書への具体的記載に変える米国特許第５，９８９，８１３号に記載の方法を利用した側方流動検出法で視覚化した。精製ＲＮＡは４℃及び−２０℃で保管した場合には８週間安定であり、室温で保管した場合には、特により高い希釈率１；１０で若干の分解が認められた。
【実施例１６】
【０１１０】
マトリックスからの外した核酸の液相増幅
遺伝子型判定といった幾つかの応用では、上記記載の本発明の方法による簡素化されたサンプル調製及び固相アーカイブが有益である。別の実施態様では、増幅は固相上ではなく液相で精製核酸を用いて行われる。本例では、本明細書記載の固相マトリックス材料を利用した方法を示す。標的核酸は固相に強固に結合しているが、マトリックスをＴＥ緩衝液、水又はその他好適緩衝液で洗浄すると少量の核酸が精製核酸の形で溶液中に放出（解離）する。この溶液は標準的な増幅反応に使用できる。放出と増幅を複数回繰り返すことも可能であり、複数の増幅標的を個別に分析できる。
【０１１１】
標準的な置換法としては、溶解緩衝液と混合した血液を５から１０ｐＬのＡｌ２Ｏ３、Ｔｉ２Ｏ３、又はコーティングガラスビーズを含むＸｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブに入れ、標準的なインキュベーションと洗浄を行うことを包含した。洗浄後、５０から１００μＬのＴＥ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ／ＥＤＴＡ）をチューブに加えた。この溶液を約３０分間インキュベーションした後、ＴＥ液を取り出した。取り出した解離ＤＮＡを含むＴＥ溶液の一部（５〜１０μＬ）を通常のＰＣＲマスターミックス（プライマ、酵素、緩衝液等）と混合して、温度サイクルにかけた。ＴＥ緩衝液を加え得る操作と溶液の一部を取り出す操作を最低５回繰り返したところ、予想通りの正確な増幅を得た。図１７は本実施例による解離核酸（「解離物」）ＰＣＲ増幅及び以下の固相マトリックス材料に結合した固相核酸増幅後に得たエチジウムブロマイド染色アガロースゲルを示す；（１）Ｘｔｒａ ＡｍｐＴＭ（ＸＡ）チューブ：（２）１００〜２００メッシュのアルファ酸化アルミニウム（ａ−Ａｌ２Ｏ３）；（３）Ｔｉ２Ｏ３、及び（４）酸化アルミニウム薄膜。図１７に示す例では、結合標的は精製胎盤ＤＮＡであり、増幅域はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓＧタンパク質共役受容体５７遺伝子である。
【実施例１７】
【０１１２】
同一アーカイブマトリックスを用いたマルチプレックスＰＣＲ増幅法
本発明によれば、アーカイブした核酸サンプルは、短時間又は長期間かけ同一サンプルを繰り返し処理する機会を提供する。更にアーカイブされたサンプルを利用すると、同一増幅域を何度も研究すること、及び／又は異なる標的のシリーズを研究することが可能である。
【０１１３】
（Ａ）同一マトリックスに結合した標的を繰り返し増幅できるプロトコルを開発した。同一標的域を繰り返し増幅するために、精製核酸又は溶解した生物サンプルをＸｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブ又は酸化アルミニウム、酸化チタン若しくはその他顆粒のスラリを含む別のチューブに加えた。標準的な結合及び洗浄操作を行った。次に標的アンプリコンに合ったプライマ及びＰＣＲミックスをチューブに加え、標準的な３２から４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。生成物溶液を取り出し、チューブを９５Ｃで洗浄緩衝液にて洗った。同一標的を増幅する追加のラウンドでは、プライマとＰＣＲミックスを加えるが必要な増幅サイクル数はより少なかった。
【０１１４】
図１８と１９は、マトリックスに結合したＤＮＡの同一領域を繰り返し増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲルを示している。ゲノムＤＮＡ（ヒト）は全血からＸｔｒａＡｍｐＴＭチューブを使って抽出した。ＨＬＡ−ＤＲベータ遺伝子に関し標準的なＰＣＲ条件を使って、ＨＬＡ−ＤＲベータ遺伝子のＰＣＲ増幅（３５サイクル）を行った（図１８）。次にＸｔｒａ Ａｍｐチューブを１０分間、９５℃で洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＬｉＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１０％のＴｗｅｅｎ−２０）とインキュベーションした。
洗浄緩衝液を取り出し、新しいＰＣＲ増幅試薬を加えてＨＬＡ−ＤＲｓｓを再増幅した。２回目の増幅反応のＰＣＲ試薬濃度及びサイクルパラメータは、ＰＣＲサイクル数を減らしたこと以外は、初回の反応と同じであった。図１９は１０及び１５ＰＣＲサイクル後のゲルを示している。
エチジウムブロマイド染色アガロースゲルで見た場合に鮮明に見え且つ比較的清浄であるアンプリコンを生成するには、約１０回のサイクルで十分であった（図１８）。
【０１１５】
（Ｂ）異なる標的核酸のシリーズを増幅するために、標準的な操作による第一ラウンドを此方：サンプルを固相マトリックス（例えば酸化アルミニウム）でコーティングしたＰＣＲチューブの様な容器に入れた。
標準的な結合及び洗浄操作を行った。次に標的のアンプリコンに合ったプライマ及びＰＣＲミックスをチューブに加えて、標準的な３２から４０サイクルのＰＣＲ反応を実施した。別の標的にあったプライマと使用すること以外はこれと同じ基本操作に従って続くラウンドを実施し、各ラウンドに先立って高温（通常は９５℃）インキュベーションと洗浄を行い、前のラウンドでハイブリダイズしたプライマ及び生成物を除いた。この操作により複数の異なるアンプリコンが生成された。
【０１１６】
図２０、２１、２２及び２３は、同一マトリックスに結合したＤＮＡの異なる領域を連続的にＰＣＲ増幅反応したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲルを示す。ゲノムＤＮＡ（ヒト）は全血からＸｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブを使って抽出した。ＰＣＲ増幅は対象となる遺伝子の増幅について標準的であるＰＣＲ反応条件を用い、１種類の遺伝子を増幅した。次にｐチューブを１０分間、９５℃で洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＬｉＣＩ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１０％のＴｗｅｅｎ−２０）とインキュベーションした。洗浄緩衝液を取り出し、別の遺伝子について標準的であるＰＣＲ条件を用いて別の遺伝子を増幅した。マトリックスに結合したＤＮＡの複数の異なる領域について、この洗浄緩衝液との加熱インキュベーションと標準的なＰＣＲ反応条件を繰り返した。図２０、２１、２２及び２３に示す増幅した標的はそれぞれＨＵＧＡＬＰＣＲ２、ＨＧＨ ＰＣＲ５、ＨＤＹＳＴ３及びＨＬＡ Ａである。
【実施例１８】
【０１１７】
ランダムプライマとマルチプレックス増幅初期ステップを利用した広範囲のゲノムのサンプルブースト
（Ａ）固相に結合した核酸は複数のプライマを同時に利用すること、及び単一のプライマセットを利用して増幅できる。複数のプライマを使って増幅することで、多数の異なるアンプリコンを同時に生成できる。各プライマセットの条件は必ずしも最適化されておらず得られる増幅は均一ではないが、得られた溶液を更に、特定の標的に関しより特異的な増幅に利用することができる。
【０１１８】
（Ｂ）複数のプライマが存在する状態で最初にサイクル数が限定された「ブースト」を行う方法はゲルデスらが２０００年６月６日に出願し、参照により本明細書への具体的記述に替える、「マルチプレキシング増幅反応の方法」と題する係属中の米国特許出願、連続番号第０９／５８９，５６０号に記載されている。この方法では、２ステップのマルチプレックス増幅反応が実施されるが、この場合第一ステップは標準的な第一マルチプレックス増幅ラウンドを中断して、標的のサンプルコピー数を１００〜１０００倍だけブーストする。この第１ステップ後に産物を分け、それぞれが第１又はマルチプレックスブースターステップで使用されたプライマセットの１組を含み且つ最適化されている、単一の第２増幅反応にかける。
【０１１９】
かくして本発明の別の実施態様は、「ブースト」プライマの集合を一般化することである。即ち、本発明の方法は後のラウンドの標的アンプリコンに特異的なプライマセットの集合を、ランダムプライマの集合に置き換える。ランダムプライマを使って「ブースト」した後、この前増幅されたサンプルを小分けした。小分けされたものそれぞれを個々の標的に特異的なプライマのセット及び反応ミックスと混合した。本実施例では、ランダムな９−ｍｅｒの集合（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたが、熱安定性の様なハイブリダイゼーション及び増幅の基本法則に従うものである限りに於いて、別のランダムな９−ｍｅｒの集合或いはその他プライマ長の集合も機能するだろう。この応用に関して用語「ランダム」とは、「ブースト」ステップの間にゲノム全体又は少なくともその大きな画分が増幅されるように、十分に多様なプライマの大きな集合がグループ化されていることを意味する。
【０１２０】
図２４、２５及び２６はランダム増幅プライマの集合を用いた第１「ブースター」ステップ後の特異的ＰＣＲ増幅標的のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルを示している。ゲノムＤＮＡは全血（ヒト）からＸｔｒａＡｍｐＴＭチューブを使って抽出した。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ反応混合液中にランダム９ｍｅｒプライマを加え、プログラムの１０サイクルについて適度の厳密度で増幅するＰＣＲプログラムを用い実施した。この「ブースターＰＣＲ」後に、ＰＣＲ反応混合液を５μＬに小分けして、各ＰＣＲ反応にかけた（「第２ＰＣＲ反応」）。これら第２ＰＣＲ反応は標準的なＰＣＲ反応で使用する各ＰＣＲプライマペアを含んでおり、そしてそれぞれが標準的なＰＣＲサイクルプログラムにかけられた。図２４に示した増幅された標的はＨＵＧＡＬＰＣＲ２及びＧＡＰＤＨ１４であり、図２５に示した増幅標的はＨＧＨ−ＰＣＲ５であり、図２６に示す増幅標的はＨＤＹＳＴ３である。
【０１２１】
上記は多くの具体例を含むが、これら具体例は本発明の範囲を制限することを意図しておらず、その好適実施態様の例示を意図したものである。
換言すれば、本発明に関するこれまでの記述は描写及び説明を目的とした例示である。本発明の精神及び範囲から逸脱することなしに、当業者は様々な変更及び改良を発明に加え、様々な利用及び条件に発明を適合させることができる。この様な変更及び改良は、正当且つ当然に、以下に示す請求範囲の等価の範囲に入ると考えられるものである。即ち、本発明の範囲は添付の請求の範囲及びその合法的な等価物により決定されるものであり、本明細書に記載の実施例によるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】水中、０．１Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａｏＨ）結合緩衝液、又は４Ｍグアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）結合緩衝液中にて回転しながら１時間、室温でインキュベーションした後の酸化アルミニウム又は水酸化アルミニウムに結合した３２ｐ放射線標識ＤＮＡのパーセンテージを示す棒グラフ。
【図２】水中、０．１ＮのＮａＯＨ結合緩衝液、又は４ＭのＧｕＳＣＮ結合緩衝液中にて回転しながら１時間、室温でインキュベーションした後のナノグラム単位で示すＤＮＡに対し、酸化アルミニウム又は水酸化アルミニウムに結合した３２Ｐ放射線標識ＤＮＡのパーセンテージを示すグラフ。
【図３】酸化アルミニウムに結合した放射線標識ＤＮＡ量を、結合ＤＮＡの洗浄回数に対する毎分当たりの残存カウント数（ｃｐｍ）として表したグラフ。
【図４】酸化アルミニウム又は二酸化ケイ素に結合したＤＮＡの割合を比較したグラフで、ここではＤＮＡはグアニジンチオシアネート緩衝液又は水酸化ナトリウム緩衝液で希釈している。
【図５】パネルＡとＢは水中で酸化アルミニウムに１０６コピーのＨＩＶ ＤＮＡとマイコバクテリウムＤＮＡを結合させた後に、続けて直接固相増幅を行ったＨＩＶ ＤＮＡ及びマイコバクテリウムのアガロースゲル。パネルＡは固相ＨＩＶ ＰＣＲ増幅産物をエチジウムブロマイド染色したアガロースゲルである。パネルＢは固相マイコバクテリウムＤＮＡ ＳＤＡ増幅産物のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルである。
【図６】グアニジンチオシアネート緩衝液内にて酸化アルミニウムに結合させ、続いて酸化アルミニウム上のＨＩＶ ＲＮＡを固相ｒｔＴＨ ＰＣＲ増幅したＨＩＶ ＲＮＡ のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルである。
【図７】ショートタンデムリピートマーカーのＣＴＴマルチプレックスとショートタンデムリピートマーカーのＦＦＶマルチプレックスを用いた、酸化アルミニウム上でのＤＮＡ固相増幅後の銀染色ゲル。
【図８】各種始動ボリウム及び異なる流量での、酸化アルミニウム又は二酸化ケイ素に結合した放射線標識ＤＮＡの割合。
【図９】０．１ＮのＮａＯＨと酸化アルミニウム存在下に酸クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）で抗凝固処理した血液を加えた後、様々な捕捉時間で強く固相に捕捉してからＨＬＡ ＤＲｂｃｔａプライマを使って行い、エチジウムブロマイド染色ゲルにより確認した固相ＰＣＲ増幅。
【図１０】自動核酸抽出を目的とする、固相マトリックスを組み入れたＰＣＲ増幅チューブ。
【図１１】酸化アルミニウムに直接ＲＮＡ標的（ｐＡＷ１０９）を結合させるか、又は酸化アルミニウムに強く結合しているオリゴヌクレオチドプローブに純化ＲＮＡ標的をハイブリダイゼーションしてから行った、純化ＲＮＡ標的の固相ＰＣＲ増幅後のアガロースゲル。
【図１２】血漿を希釈してから酸化アルミニウムビーズに強く結合しているオリゴヌクレオチド捕捉プローブとハイブリダイゼーションする、１０００コピーの低コピーＨＩＶの検出。
【図１３】各種固相材料に結合した蛍光標識ＤＮＡ及びＲＮＡからの蛍光シグナルを示す棒グラフ。材料は１００〜２００メッシュのアルファ−酸化アルミニウム（アルファ−Ａｌ２Ｏ３）、ガンマ−酸化アルミニウム、二酸化ジルコニウム、コーティング又は処理加工されたＳｉＯ２ビーズのシリーズ、及び未処理のｄＳｉＯ２ビーズである。
【図１４】価格腫固相材料に結合したＤＮＡをＰＣＲ増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。示したゲルは増幅前に４回から８回洗浄した。試験した材料はＸｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブ（ＸＡ）、アルファ−Ａｌ２Ｏ３、Ｔｉ２Ｏ３及びＳｉＯ２ビーズ上に酸化アルミニウムの薄層をコーティングしたものである。各マトリックス及び各線上回数について反応は２回繰り返し行った。
【図１５】ガラス製毛細管の内壁にコーティングされた酸化アルミニウムの薄層に結合したＤＮＡをＰＣＲ増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。
【図１６】Ｘｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブ又はＴｉ２Ｏ３スラリを固相マトリックスに利用した大腸菌希釈液からのＲＮＡのＮＳＡＢＡ増幅で得られた明瞭なバンドを示す側方流動ストリップ。
【図１７】マトリックス結合ＤＮＡ（上のゲル）及び表記のマトリックス表面から置換したＤＮＡ（下のゲル）をＰＣＲ増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。試験した材料は：Ｘｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブ（ＸＡ）、アルファＡｌ２Ｏ３、Ｔｉ２Ｏ３及び酸化アルミニウムが薄層コーティングされたガラスビーズ。
【図１８】同一マトリックスに結合したＤＮＡから得た同一の標的領域（ＨＬＡ−ＤＲ）をＰＣＲで初期増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。
【図１９】図１８記載と同一の標的領域（ＨＬＡ−ＤＲ（３）を再増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。
【図２０】マトリックスに結合した同一ＤＮＡの各種領域を連続ＰＣＲ増幅反応にかけたもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。増幅標的はＨＵＧＡＬＰＣＲ２。
【図２１】マトリックスに結合した同一ＤＮＡの各種領域を連続ＰＣＲ増幅反応にかけたもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。増幅標的はＨＧＨ ＰＣＲ５。
【図２２】マトリックスに結合した同一ＤＮＡの各種領域を連続ＰＣＲ増幅反応にかけたもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。増幅標的はＨＤＹＳＴ３。
【図２３】マトリックスに結合した同一ＤＮＡの各種領域を連続ＰＣＲ増幅反応にかけたもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。増幅標的はＨＬＡＡ。
【図２４】ランダム増幅プライマの集合体を利用する初期「ブースト」ステップを行った後に特異的ＰＣＲを実施したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。図２４に示す増幅標的はＨＵＧＡＬＰＣＲ２及びＧＡＰＤＨ１４。
【図２５】ランダム増幅プライマの集合体を利用する初期「ブースト」ステップを行った後に特異的ＰＣＲを実施したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。図２５に示す増幅標的はＨＧＨ−ＰＣＲ５。
【図２６】ランダム増幅プライマの集合体を利用する初期「ブースト」ステップを行った後に特異的ＰＣＲを実施したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。図２６に示す増幅標的はＨ ＤＹＳＴ３。
【０００１】
本発明は分子生物学、生化学、遺伝学及び生物学的研究の一般分野に関する。より詳細には、本発明はいかなる生物試料に由来した核酸をも固相マトリックス上に捕捉し、強固に結合する方法に関する。固相に結合した核酸は固相核酸酵素反応、オリゴヌクレオチド又はプローブハイブリダイゼーション、及び／又は信号増幅反応又は標的増幅反応を含む様々な操作に利用できる基質として、直接複数回利用することができる。本発明は、更に、核酸ハイブリダイゼーション及び／又は増幅と核酸捕捉とを結合させる商業上の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の分子構造は、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマと特定の標的器官又は組織に固有の配列との相補的塩基対合手段により、特異的な検出を提供する。全ての生物体又は種は、特異的且つ特徴的な核酸配列を含んでいることから、核酸検出全般に共通なストラテジは、様々な研究・開発分野及び商工業に極めて広範囲な用途を有している。核酸検出の実用化の可能性は、低濃度で存在する核酸配列を高い信頼度で、正確且つより高いコピー数まで増幅又はコピーする方法が開発されたことで更に高められ、その結果核酸配列は検出法でより簡単に検出されるようになった。
【０００３】
最初の核酸増幅法はＭｕｌｌｉｓらが記載したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である（米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第４，９６５，１８８号であり、これらの特許全ては、本願に参照によって具体的に組み込まれる）。ＰＣＲが紹介されてより、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）（Ｍａｌｅｋに付与された米国特許第５，１３０，２３８号）、等温法（Ａｕｅｒｂａｃｈに付与された米国特許第５，３５４，６６８号）、リガーゼチェインリアクション法（Ｂｕｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒに付与された米国特許第５，４２７，９３０号）及び鎖置換増幅法（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒに付与された米国特許第５，４５５，１６６号）といった増幅に関する様々なストラテジが報告されており、それらは全て参照によりここに組み込まれている。ＳＤＡ又はＮＡＳＢＡといった一部の増幅方法は、一本鎖標的核酸を必要とする。通常この標的は増幅前に高温を利用した溶融操作により一本鎖にされる。
【０００４】
核酸の増幅及び検出前に、標的核酸を生物試料より抽出してから精製し、増幅反応酵素の阻害因子を取り除く。更に標的核酸を解離し、アニールするプライマを常に利用可能なように準備しなければならない。核酸の精製については様々な方式が知られている。
その中には、例えばフェノール−クロロホルム及び／又はエタノール沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、コールド・スプリング・ハーバー研究所、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９年））、高塩析沈殿（Ｄｙｋｅｓ、電気泳動９：３５９〜３６８項（１９８８年）、プロテイネースＫ消化法（Ｇｒｉｍｂｅｒｇら、核酸研究、２２：８３９０項（１９８９年）、キレックス（ｃｈｅｌｅｘ）及びその他煮沸法（Ｗａｌｓｈら、バイオ／テクニーク１０：５０６〜５１３項（１９９１年））並びに固相結合及び溶出法（ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎとＧｉｌｌｅｓｐｉｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：６１５〜６１９項（１９７９年））が挙げられ、これらの特許全ては、本願に参照によって具体的に組み込まれる。
【０００５】
従って標的核酸の分析は３ステップから構成される：即ち生物試料からの核酸の抽出／精製、特異標的配列の直接プローブハイブリダイゼーション及び／又は増幅、並びにその特異的検出である。これら３ステップの従来のプロトコルは別々に実施されるので、その結果核酸の分析は手間のかかるものになっている。さらに各ステップを実施するには、様々な操作、装置及び試薬が必要である。現状の方策に対するその他の懸念は、試料の２次汚染の可能性である。例えば同時に取り扱っている試料間或いは、前もって増幅されたサンプルからの２次汚染である。
【０００６】
分析を目的とする場合、追加の確認用検体を入手することが、たとえ不可能ではないものの困難であるため、極少量の検体から核酸を抽出しなければならないということがたびたびある。例としては、犯罪現場証拠の分析や臨床試験向けの細針生検などがある。従ってこの様な例では、核酸検体のサイズによって遺伝子鑑定やレプリカ試験による確認の程度が限定されている。この様な少量検体に従来の抽出プロトコルを用いると、核酸を失ってしまったり、１回或いは数回だけの増幅分析が可能であるような収量しかないということが起り得る。
【０００７】
固相へＤＮＡを結合させ、続いてそこからＤＮＡを溶出する条件はＢｏｏｍ（米国特許第５，２３４，８０９号、これは参照によりここに組み込まれている）やＷｏｏｄａｒｄ（米国特許第５，４０５，９５１号、米国特許第５，４３８，１２９号、米国特許第５，４３８，１２７号、これらは全て参照によりここに組み込まれている）によって記載されている。具体的には、ＤＮＡは電気陽性又は親水性である固相に結合する。電気陽性元素はヒドロキシル（−ＯＨ）或いはその他の基により十分に親水性にすることができ、その結果ＤＮＡと強固に結合する固相マトリックスができるが、この固相マトリックスにはタンパク質或いは阻害物質とは結合しない。通常の精製方法は結合した核酸の溶出を必要とするため、核酸は結合するものの実質的に完全な溶出が不可能な固相マトリックスはＤＮＡ精製には不向きであると報告されている。実際、十分な親水性を有し、適度に核酸を結合しながら、それより核酸を溶出することができる固相マトリックスを得ようと多くの努力が払われてきた（例えばいずれもＷｏｏｄａｒｄに付与され、この参照によりここに組み込まれている米国特許第５，５２３，３９２号、第５，５２５，３１９号及び第５，５０３，８１６号を参照）。
【０００８】
上記のブームは、高カオトロピック塩を使用し、可逆的にシリカにＤＮＡを結合する固相ＤＮＡ増幅を記載している。しかし、核酸は実際にはシリカ結合ＤＮＡを増幅反応緩衝液中に加える時にシリカより溶出する。従ってこのブームの方法による増幅は溶液内で起こっており、固相上で起こるものではない。更に核酸は増幅前に固相から溶出されるため、増幅は１回しか行われない。
【０００９】
Ｄｅｌ ＲＩｏら、バイオ／テクニーク２０：９７０〜９７４項（１９９６年）は、反復増幅を可能にする、核酸の取り込みフィルタについて記述している。
しかし彼らは不可逆的な結合の仕組みを記載しておらず、そのため高濃度の核酸分析にのみ推奨されるものであり、そして限られた分析回数にのみ推奨されるものである。
【００１０】
核酸の精製及び／又は抽出とその他の核酸分析工程及び／又は操作とを直接統合し、分析手順及び方策を簡素化すること、並びに相互汚染のリスクを減らし、そして／又は取り除くことは有益だろう。更に、プローブハイブリダイゼーション又は増幅プライマをアニールするために、一本鎖核酸を生成するのに必要な融解ステップを除去することも有益であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この様な背景より、本発明は核酸精製及び／又は抽出と、その他の核酸分析及び／又は操作に関する方策を相互作用させる方法を提供する。
【００１２】
本発明は更に直接固相核酸操作法及び／又は分析法も提供するが、この方法では操作及び／又は分析は核酸を固相から溶出することなしに行われる。本発明は核酸が高親和性を有する固相材料を得るために、親水性が付与された１又はそれ以上の高電気陽性元素よりなる固相材料の仕様を包含する。
【００１３】
本発明は更に試料から核酸を抽出して強固に結合させ、核酸を取り外せないようにアーカイブする方法も提供する。
【００１４】
本発明の方法では、マトリックスに結合した核酸を繰り返し分析し、そして／又は操作することができ、この時結合した核酸が分析中に変化することも消耗することもない。
【００１５】
本発明はまた生物試料中から低濃度で高流量の核酸を捕捉して強固に結合する方法も提供する。
【００１６】
本発明は、いかなる溶融ステップを行うことなく、二本鎖核酸を１本鎖核酸に変換する新規な機構を提供する。
【００１７】
従って、本発明の実施態様の１つは、酵素認識、ハイブリダイゼーション及びプライマの依存増幅を含むが、これらに限定されない直接固相操作及び分析をする核酸に、強固に結合する固相マトリックスを使用する方法であって、操作及び分析を繰り返す間、核酸を固相マトリックスから洗い流さない方法を提供する。
【００１８】
本発明は更に各種基材の表面を本発明の固相マトリックスでコーティングする方法、及びその利用を提供する。
【００１９】
本発明はまた、その表面を固相マトリックスで覆う基材からなる、少なくとも１種類の容器を含む、核酸分析又は操作用のキットを提供する。
【００２０】
本発明のその他の特徴及び利点は、添付の図面と結びつけることで、本発明の原理を例示の形で説明している以下の詳細な説明より明らかになるであろう。
前記の概要説明及び以下の詳細な説明は典型的な例示と説明を目的とするにすぎず、請求する発明を制限するものではないと理解すべきである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明はＲＮＡ、ＤＮＡ又はその他の核酸を固相マトリックスに強固に結合させる新規方法及びマトリックスに結合した核酸の使用に基づくものである。本明細書記載の方法により、固相マトリックスに直接結合した核酸をマトリックスから核酸を溶出せずに、核酸を長期間保存し、及び／又は繰り返し分析し、及び／又は拡大分析を行い、及び／又は複数操作を行うことができる。本明細書に開示された各方策は従来技術の持つ欠点を克服している。
【００２２】
本発明のある実施態様は、固相材料に強固に結合した核酸の具体的な応用を示す。これら既知材料は、核酸がこの固相材料より溶出できないことから、従来当業者からは核酸分析及び／又は操作には不向きであると考えられていた。更に、従来の方法に比べ、本発明のある実施態様での核酸の操作は、核酸が固相マトリックスにまだ結合した状態で行われる。
【００２３】
より具体的には、本発明は水酸（ＯＨ）基又はそれ以外の基によって親水性を付与された１又はそれ以上の強い電気陽性元素を構成元素として含む固相マトリックスを使用し、結果として核酸に対し強い親和性を有する固相マトリックスを生成することを含んで成る。
本明細書で用いる場合、用語「電気陽性」とは、電子を引きつける元素又は材料を意味する。本発明の目的に適した電気陽性材料の例としては、アルミニウム、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、スカンジウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、タンタル、クロム、モリブデン、タングステン、ホウ素、ガリウム、インジウム、ゲルマニウム、錫及び鉛から成るグループより選択された１又はそれ以上の元素を一般的に含む材料を挙げることができるが、もとよりこれに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の目的に好適な固相マトリックスとしては、上記電気陽性材料の酸化物を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
例としては、アルファ酸化アルミニウム（ａ−Ａｌ２Ｏ３）、ガンマ酸化アルミニウム（ｙ−Ａｌ２Ｏ３）及び酸化アルミニウムの混合組成物（ＡｌｘＯｙ）の薄膜を含む酸化アルミニウムを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本明細書で用いる用語「混合組成物」とは、式ＭｘＯｙで表すことができ、式中の「ｘ」及び「ｙ」が化合物の元素組成を表し、「ｘ」及び「ｙ」は整数でも分数でもよい金属酸化物の各種組成物を構成要素として含む組成物を表す。例えば酸化アルミニウムの混合組成物は式ＡｌｘＯｙで表される酸化アルミニウムの混合物を含んで成る。好ましいマトリックスの更なる例としては、酸化チタン（Ｔｉ２Ｏ３）及び変性酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）が挙げられる。本明細書では用語「変性酸化ジルコニウム」は、塩酸や硝酸といった酸又は水酸化カリウムといった塩基にさらされ、加水分解表面組成を生成する酸化ジルコニウムを指す。
【００２５】
本発明の固相マトリックスは核酸に対し高い親和性を有している。そのため適当な条件の下に本発明の固相マトリックスと接触した核酸は、このマトリックスと強固に結合するようになる。本明細書では用語「強固に結合」は、核酸が固相マトリックスに十分に結合し、結合した核酸の大部分が、結合した核酸の操作及び／又は分析中にもマトリックスに結合したままの状態を保つことを意味する。即ち、マトリックスに結合した核酸の極少量だけが、操作及び／分析中に、特定緩衝液条件下に固相マトリックスから遊離する。
【００２６】
本発明は特定の応用を目的として、これら固相マトリックスへの核酸の不可逆的結合を活用する。強固に結合した核酸は、以下に詳しく説明し、実施例を示す様に、核酸操作及び／又は分析のために用意された反応混合物と直接接触させることができる。
【００２７】
実施態様の１つでは、本発明は核酸を固相マトリックスに捕捉してから、結合核酸を繰り返し、及び／又は詳しく分析する方法を提供する（核酸アーカイブ）。本明細書に記載する強固に結合した核酸は室温に於いて、おそらくは無期限に安定している。従って本発明は、核酸保存の有益な方法を提供する。こうして保存した核酸は、その後必要に応じて分析し、又は操作することができる。このことは生物試料の量が限られている場合及び／又は代替が効かない場合、そして直後或いは元の試料の保管後のいずれにおいても再分析が有益な場合に役立つ。この様な事態が発生する分野としては、例えば科学捜査、医学及び生物学的研究、家畜又はヒトの臨床診断、歯科学、環境、食品又は水中微生物学、並びに農業又はその他産業応用が挙げられる。
【００２８】
別の実施態様では、本発明はＤＮＡとＲＮＡの両方を含むサンプルから、固相マトリックスにＤＮＡ又はＲＮＡのみを結合する方法を提供する。例えば、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含むサンプルを、マトリックスがＤＮＡのみ結合する条件下に固相マトリックスと接触させることを含んで成る、核酸をアーカイブする方法である。この実施態様では、上記の条件は、前記サンプルを固相マトリックスに接触させる前に、サンプル又はマトリックスに、グアニジンチオシアネートをベースとする緩衝液、アルカリ緩衝液、塩化リチウム、及びこれに限定されることはないがドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮＰ−４０、Ｎ−ラウロイルサルコシン及びその他一般的な界面活性剤を含む界面活性剤をベースとする緩衝液、を含むグループから選択された緩衝液を加えることを含んで成る。
【００２９】
或いは、本発明はまたＤＮＡとＲＮＡの両方を含むサンプルを、マトリックスがＲＮＡのみを結合する条件の下に固相マトリックスと接触させることを含んで成る核酸のアーカイブ方法も提供する。この実施態様では、条件にはＤＮＡ分解試薬、例えばＤＮａｓｅの様なＤＮＡ分解酵素を、緩衝液存在下にサンプルに加えて細胞を溶解すると同時にＤＮＡを分解することを構成ステップとして含む。
【００３０】
別の実施態様では、強固に結合した核酸により、結合核酸の手順操作の間に徹底的な水洗、緩衝液交換、容積の減少を可能にする。即ち、固相マトリックスは、水性緩衝液を用いて複数回洗浄した後でさえ大部分の核酸がマトリックスに強固に結合し続けるのに十分な強さで核酸を結合する。この様にして、本発明は緩衝液交換と容積の減少に好都合な手順を提供する。
【００３１】
別の実施態様では、本発明は核酸の抽出と精製を核酸ハイブリダイゼーション及び／又は核酸増幅と直接結びつけるＤＮＡ及びＲＮＡの新規の迅速捕捉法を提供する。
抽出は手法又は自動で実施できる。本明細書では「核酸ハイブリダイゼーション」には（ａ）マトリックスに結合した核酸プローブとサンプル中に存在する標的核酸とのハイブリダイゼーション、（ｂ）マトリックスに結合した標的核酸とプライマ核酸とのハイブリダイゼーション、及び（ｃ）マトリックスに結合した標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションが包含される。
【００３２】
例えば、本発明の実施態様の１つは、（ａ）１又はそれ以上の標的核酸を含むサンプルを本発明の固相マトリックス及び標的核酸配列（１つ又は複数）を一本鎖の核酸の形でマトリックスと強固に結合するようにさせる緩衝液と接触させること；（ｂ）マトリックスに結合した標的核酸をプライマ核酸配列の１セットと緩衝液とに接触させて、このプライマのセットをマトリックスに結合した標的核酸とハイブリダイゼーションさせること；及び（ｃ）標的核酸（１つ又は複数）を増幅して、その中で標的核酸配列がマトリックスと強固に結合し続けている増幅反応混合物を生成すること含んで成る。
【００３３】
固相増幅の実施態様の１つでは、標的核酸配列がマトリックスに強固に結合するようになる緩衝液が用いられる。この様な緩衝液の例としては、グアニジンチオシアネートをベースとする緩衝液、アルカリ緩衝液、塩化リチウム、及びこれに限定されることはないがＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮＰ−４０、ＮＰ−ラウロイルサクロシン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ２０及びその他一般的な界面活性剤を含む界面活性剤をベースとする緩衝液を挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、リン酸緩衝液については、固相マトリックスへのプライマ配列の結合を減らし、その後の消失を効果的にすることが知られている。
【００３４】
別の実施態様では、２又はそれ以上の種類の標的核酸を固相マトリックスに結合し、この標的核酸を連続して増幅する。
【００３５】
本発明の方法による高親和性固相マトリックスを用いて二本鎖ＤＮＡを捕捉する場合には、核酸を二本鎖の核酸として水性の生物試料又は緩衝液から直接捕捉してもよい。或いは、場合によってはＤＮＡを固相マトリックスに一本鎖ＤＮＡとして捕捉する必要がある。
従って本発明は以下詳細に記載するように、緩衝液の状態を変更し、マトリックスに二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとして結合させる方法を包含する。
【００３６】
例えば一本鎖の形で核酸を結合することは、ハイブリダイゼーション法及び／又は等温増幅法と整合させるのに必要である。
即ち、標的核酸が二本鎖ＤＮＡの場合、サンプルをアルカリｐＨ又は高カオトロピック塩濃度に調整すれば、二本鎖の核酸を一本鎖の核酸として固相マトリックスに結合することができる。
【００３７】
様々な核酸増幅法が本発明の直接固相核酸増幅に好適である。そのような方法としては、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＩｓｏＣＲ、ＣＲＣＡ、Ｑベータレプリカーゼ、分枝鎖ＤＮＡ及びＲＴ−ＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。この種の方法は当業者に周知であり、更に詳しい説明を要しない。更に本発明には「巻き戻しコイル（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ ｃｏｉｌ）増幅法」（又は「ＵＮＣＡ」）を応用してもよい。「巻き戻し増幅法」は２００１年６月１９日に出願され、「巻き戻しコイル増幅とその利用方法」と題された、参照によりここに組み込む係属出願中の米国特許仮出願番号６０／２９９，４１０号に開示されている。簡単に説明すると、この方法は同一配列が多数繰り返し一列に並んだ環状の鋳型より長い増幅生成物を形成している点で、ローリングサークル型の増幅法に似ている。しかし巻き戻し増幅はローリングサークルと鋳型が環状ではなく直鎖状のＤＮＡである点で異なっており、そのＤＮＡがそれ自体の上に巻き戻って、その分子の両端同士がハイブリダイゼーションした時にだけ環状になる。
【００３８】
固相マトリックス上にある標的核酸配列を増幅する本発明の方法には、更にマトリックスに結合したサンプルが複数の標的核酸配列を含んでいる方法もある。この方法では、標的核酸は、参照によりここに組み込む２０００年６月６日出願の「マルチプレキシング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ：多重）増幅反応法」と題するＧｅｒｄｅｓらによる係属出願中の米国特許出願番号０９／５８９，５６０に記載の方法で前増幅される。ゲルデスらの方法では、２ステップの多重増幅が行われ、第１ステップでは標準的な第１多重増幅反応を行って、標的中のサンプルコピー数を「ブースト」して１００から１０００倍に増加させる。複数の標的配列を前増幅するこのステップは、本発明の方法による固相上で直接実施される。さらに、複数の標的配列を同時に増幅する。前増幅ステップ後、増幅生成物を分け、最適化された第２の単一固相増幅反応にかけられるが、各反応混合液は第１又は多重ブーストステップで以前に使用されたプライマセットの１つを含む。
【００３９】
発明の別の実施態様は、固相に結合した、一本鎖又は二本鎖いずれかの標的核酸を直接分析するための新規の方法を提供する。この実施態様の例の１つとしては、サンプル中に存在する標的核酸の決定及び／又は定量化が挙げられる。より具体的には、本発明の別の実施態様は、（ａ）プローブが固相マトリックスに強固に結合できる条件下に標的核酸の特定配列に相補的である核酸配列を含んで成るプローブと固相マトリックスとを接触させること；及び（ｂ）標的核酸がマトリックスに結合したプローブとハイブリダイゼーション可能な条件下でマトリックス結合プローブとサンプルとを接触させることにより標的核酸をプローブで捕捉することを含んで成る、サンプルから標的核酸を捕捉する方法を包含する。 この捕捉法では、固相マトリックスへの標的核酸の結合を低下させるが、標的核酸とマトリックス結合プローブとの結合は可能であるリン酸緩衝液を用いてもよい。
【００４０】
そうすると当業者周知の方法によりハイブリダイゼーションした標的を検出及び／又は定量化できる。検出及び／又は定量化後、複合体を解離し、マトリックスを洗浄して標的核酸を取り除くことができる。この全ての操作の間も核酸プローブはマトリックスに強固に結合し続けており、従って繰り返し利用できる。この方法はマイクロアレイ、ラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）システム及び自動ロボティクスへの応用に特に好適である。
【００４１】
血液の様な高レベルの内因性又はバックグランド核酸を含む検体では、低レベルの特定標的の存在を分析することは極めて難しい。それ故に、本発明の別の実施態様は固相マトリックスを利用してこの様な検体中の低濃度核酸を不可逆的に捕捉する方法を提供する。この方法は、緩衝液状態を変更して固相材料が高濃度のバックグランド核酸が存在する場合でも標的配列を選択的に捕捉できるようにすることを含んで成る。従ってこのプローブハイブリダイゼーションの実施態様は、高感度を得るために低いバックグランドを要求するマイクロアレイハイブリダイゼーションの様な商業応用に最適な高い厳密性を提供する。
【００４２】
更に別の実施態様では、本発明は大容積の検体から核酸を捕捉及び／又は濃縮する、又は水性緩衝液又は溶液より汚染核酸を除去する手段としての重力若しくは高流速固相クロマトグラフィを可能にする。より具体的には、本発明の実施態様の１つは、本発明の固相マトリックスの上にサンプルを流し込むか又はその上を通過させることにより、サンプルから低濃度且つ高流速で核酸を捕捉し強固に結合する方法を提供する。この方法では、核酸はマトリックス上に強固に結合し、その上に濃縮するが、サンプル中の不要成分はマトリックスから洗い流される。実施態様の１つでは、サンプルは約０．５ｍＬ／分から２ｍＬ／分の間の速度でマトリックス上を流れる。結合した核酸は、固相から溶出すること無しに水性緩衝液で徹底的に洗うことができ、精製核酸がもたらされる。
【００４３】
当分野ではこれまでＲＮＡの高親和性固相マトリックスへの結合特性は研究されてこなかった。本発明の別の局面は、ＲＮＡが本明細書記載の固相マトリックスに強固に結合することを示す。本発明は更に、マトリックスに結合したＲＮＡを増幅する方法及びマトリックスに結合したＲＮＡの安定した保存を提供する。
【００４４】
本発明の方法はまた核酸抽出の自動化、高容積検体からの低コピー核酸の濃縮、及び抽出と精製を増幅又はハイブリダイゼーション核酸捕捉と結びつけることを目的とする商業応用にも有益である。
商業的用途としては、ロボットによる自動化が効果的である高処理型核酸検査、又はプール検体を検査することで罹病率が低い標的を経済的にスクリーニングすること等が挙げられる。
【００４５】
本発明は高流速で核酸を迅速に捕捉し、強固に結合する方法を記載する。結合は、たとえ大容積及び／又は低標的濃度でも、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方で起こる。強固に結合した核酸は、固相マトリックスからの核酸の重大な遊離なしに、厳格な水洗浄にかけ、その後の分析用に保管し、繰り返し増幅又は分析し、或いは操作することができる。緩衝液での度重なる洗浄、ハイブリダイゼーション反応、増幅反応等の後でも核酸は固相に結合し続けることから、核酸は何度でも分析することができる。核酸の固相での繰り返し操作は、本発明の方法及び当業者周知のその他の核酸操作法により達成できるだろう。本発明の方法により同一核酸検体を繰り返し分析できる能力は、結果確認及び拡大分析の手段を提供する。
【００４６】
ハイブリダイゼーション及び増幅を含む操作に関する一般原理及び条件は当分野周知である。方法の細目は、本発明の特定の応用に影響されることなく、当業者周知の操作手順及び本明細書記載の手順に従い計画される。これら必要な計画を改良することは、特段の実験なしに当業者により日常行われている。
【００４７】
当業者は本明細書記載の様な、固相マトリックス上への核酸の強固な結合は、広範囲のサンプルに実施できることを理解するだろう。この様なサンプルとしては、農業、細菌及びウイルス、及びヒト若しくはその他動物からもたらされる生物サンプル、並びに廃水若しくは飲料水、農産物、加工食品及び空気等が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、サンプルとしては、例えば血液、便、痰、粘膜、頸部又は膣検体、脳脊髄液、血清、尿、唾液、涙、生検サンプル、組織学組織サンプル、組織培養生成物、培養細菌、農産物、環境サンプル、廃水若しくは飲料水、加工食品、及び空気が挙げられる。本発明は、天然又は汚染物を問わず、核酸を含むサンプルより固相マトリックス上に核酸を不可逆的に結合するのに有用である。
【００４８】
本発明は更に、基材表面を本発明の固相マトリックスでコーティングする方法を包含する。このような基材としては、ポリマ（例えばプラスチック）やガラスなどの酸化物材料が挙げられる。これら基材の形状としては、チューブ、プレート、膜、毛細管、スライド、ビーズ、微小粒子、ファイバ、マイクロチャネル及びマイクロアレイなどが挙げられるが、核酸アーカイブ、分析、及び／又は操作に好適であればいかなる形状でもよく、これらの形状に限定されない。従って、上記いずれの方法による核酸のアーカイブ、直接固相分析及び／又は操作は、本明細書記載のように調製されたコーティング表面及び基材を利用して実施できる。
【００４９】
標準的なＰＣＲチューブのようなポリマ基材に固相マトリックスをコーティングする方法の１つに、接着剤を使用する方法がある。しかし接着剤は、増幅反応、特に低コピー数を検出する必要があるアッセイでの増幅反応を阻害する場合がある。従って、本発明は接着剤中に存在しうる増幅阻害物質を排除しつつ、固相マトリックスをポリマ又はプラスチック表面に接着するための改良方法を提供する。プラスチック表面はポリマで形成されるいかなる表面でもよく、ポリマから作られたチューブ、プレート、膜、ビーズ、微小粒子、マイクロチャネル、マイクロアレイやその他の好適な形状を包含する。ポリマ基材のコーティングに関する本発明の方法は実施例１３に詳しく記載されている。
【００５０】
上記ポリマに加えて、本発明は更にガラス（二酸化ケイ素）又は酸化アルミニウム若しくは二酸化チタンなどの他の酸化物基材を、本明細書記載の固相マトリックスでコーティングする方法も提供する。核酸操作に使用するのは、ガラス又は酸化物基材のいかなる形状でも好適であり、ガラス毛細管、グラスファイバーフィルタ、顕微鏡用スライド、多孔性ガラスウール及びアルミナフィルターなどが例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。固相マトリックスのコーティングは、実施例１４に詳述するいくつかの方法により、毛細管、スライド及びその他の形状をしたガラス表面、及びその他の酸化物表面上に付着できる。
【００５１】
本発明は更に、本発明による核酸のアーカイブ、分析及び／又は操作するためのキットも提供する。キットは一般に、固相マトリックスで１つ又は複数の表面をコーティングしたポリマ又はガラスなどの基材を構成要素として含む。この基材は核酸操作に好適ないずれの形状でもよく、ＰＣＲチューブ、プレート、ビーズ、膜、ビーズ、マクロチャネル、マイクロアレイ等が挙げられるが、これらに限定されない。好適な固相マトリックスとしては、本発明に従って親水性を得たいかなる電気陽性材料でもよく、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、アルファ酸化アルミニウム、ガンマ酸化アルミニウム、薄膜酸化アルミニウム混合組成物（ＡｉｘＯｙ）、酸化チタン（Ｔｉ２Ｏ３）、修飾酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）等が包含されるが、これらに限定されない。固相マトリックスは実施例１４記載の方法に従ってポリマ又はガラスの表面上にコーティングできる。
【００５２】
キットは更に核酸操作及び／又は分析に必要な試薬の入った１つ又は複数の容器を構成要素として含んでも良い。
このような試薬の例としては、溶解緩衝液、洗浄緩衝液及び側法流動緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明のキットは手動操作に好適であるが、自動或いは半自動工程へも組込まれる。別のキット組立体は、ロボットを使った大量処理及び分析に好適である。
【００５４】
実施態様の１つでは、キットは（ａ）その内面が酸化アルミニウムでコーティングされた１つ又は複数のＰＣＲチューブ、並びに（ｂ）溶解緩衝液及び洗浄緩衝液の入った１つ又は複数の容器を構成要素として含む。キットは更にキットの使用に関する取扱説明書を含んでも良い。本実施態様のキットは、核酸が抽出チューブ内に結合したまま残り、同一チューブ内でその核酸を直接増幅できる核酸抽出に関する革新的なシステムを提供する。
【００５５】
プロトコルは、増大する様々な標的分子、及び全血、バフィーコート、尿、培養細胞、菌細胞、マウスの尾及び頬側スワブを含む様々なタイプのサンプルで評価されている。
【００５６】
本明細書では様々な用語が使用されているが、それらを定義することは有用であろう。これらの用語については以下に定義するが、これらの用語が次の例や本明細書の中で使用される場合には、その定義を念頭に置く必要がある。
【００５７】
本発明では用語「アーカイブ」は、核酸を本発明の固相マトリックスに強固に結合し、続いて結合した核酸を保存及び／又は操作する方法を意味する。「保存」は、同一の核酸を時間を置いて分析する場合と、繰返し分析する場合の双方の能力と、複数の標的核酸を同時に、又は連続的に拡大分析する能力を包含する。この場合の操作方法としては固相核酸酵素反応、オリゴヌクレオチドもしくはプローブのハイブリダイゼーション及び／又は核酸増幅反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明で使用する場合、「鋳型依存的工程」は特定プローブを利用した鋳型依存的認識、シグナル増幅反応を利用したコピー操作、又は鋳型依存的プライマ分子の伸長を利用する標的増幅を含む工程と定義される。鋳型依存的伸長とは核酸の合成及び標的のＲＮＡ又は、ＤＮＡ配列のコピー伸展を意味するが、この場合新たに合成される核酸鎖の配列は標的核酸とプライマとの相補的な塩基対合の規則によって規定される。特定配列を持つオリゴヌクレオチド又はプローブを特異的に用いる、相補的塩基対合に基づく鋳型依存的工程は「ハイブリダイゼーション」検出として知られている。
【００５９】
「プライマ」分子とは、標的配列／コントロール配列の既知部分に対し相補的であり、ＤＮＡポリメラーゼ又はその他のポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、又はその他の核酸依存酵素による合成開始に必要な核酸配列を意味する。
【００６０】
「標的核酸配列」、「標的核酸」又は「標的」とは、捕捉、検出、増幅、操作及び／又は分析の対象となる核酸を意味する。標的核酸は精製した、或いは部分精製した状態、又は未精製の状態でサンプル中に存在しうる。
【００６１】
「核酸」とは、分離した断片又はより大きな構造体の成分のいずれかの形状をとりうる、２個以上の修飾及び／又は未修飾デオキシリボヌクレオチド或いはリボヌクレオチドのポリマである。ポリヌクレオチドの例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡ（ペプチド核酸）の様なＤＮＡ類似体、及びその化学的修飾物が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡは一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は増幅技術により増幅されたＤＮＡでもよい。ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、又はいずれかのＲＮＡポリマでよい。
【００６２】
１つの実施態様においては、用語「捕捉」は、核酸分子の固相マトリックス上への直接結合を意味する。結合は適切な緩衝液の中で、核酸の持つ化学的及び／又は物理的特性に基づいて直接行うことができる。
或いは、用語「捕捉」はサンプル中に存在する標的核酸とマトリックスに結合した核酸プローブとのハイブリダイゼーションを意味する。
【００６３】
本発明は、核酸を強固に結合する材料にＤＮＡ及びＲＮＡを結合することと、固相に結合したＤＮＡ及びＲＮＡの各種利用を目的としている。この中には、固相捕捉のために、強固に核酸を結合する酸化アルミニウム又はその他の材料の使用方法が含まれる。この方法は、固相捕捉と、水性緩衝液、単一増幅反応又はハイブリダイゼーションに基づく反応と、連続する多重増幅反応又はハイブリダイゼーションに基づく反応の使用を含む様々な操作とを直接結びつけるものである。さらに、核酸捕捉は汚染核酸の除去、或いは大容積検体又はプール検体分析のいずれかの検出を目的とした低コピー核酸の濃縮の用途に好適である。
酸化アルミニウムは、低濃度及び高流速、例えば５ｍＬ／分の核酸でも結合できる十分な親和力を示す。このように本発明は大容積の、重力を利用した又は高流速の捕捉、並びに増幅反応を妨害する可能性のある阻害物質を含まない、極めて清浄な核酸を得るための徹底した水洗に適合した形の核酸の捕捉に有用である。
【００６４】
本明細書に開示するハイブリダイゼーション反応は、固相マトリックス上に捕捉されたオリゴヌクレオチドプローブへの標的核酸の直接ハイブリダイゼーションを包含するが、この場合マトリックスはビーズ又はブロット又は、マイクロアレイチップのような平坦な表面の形状でよい。ハイブリダイゼーションは更に最初に捕捉プローブ（例えばオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、クローン化プラスミド、転写又は、合成ＲＮＡ、又はＰＮＡ）を固相マトリックスに強固に結合し、続いて検体から相補的な標的配列を捕捉することによる、特定標的配列の特異的捕捉も包含する。この方法は非特定核酸のバックグランドレベルが高い複合検体を分析する場合特に有用である。捕捉ビーズ法は、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）に結合したポリ−Ｔオリゴヌクレオチドを利用してポリＡメッセンジャーＲＮＡを精製するなどの特定標的配列の捕捉に有用である。適切な捕捉オリゴヌクレオチドを利用することにより、様々なタイプの検体からいかなる特定標的核酸も選択的に除去し、濃縮することができる。
【００６５】
本発明により、固相に強固に結合した核酸を用いた酵素認識及び特定操作又は増幅反応が可能になる。これには、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＩｓｏＣＲ又はＣＲＣＡなどの標的増幅反応とＱベータレプリカーゼ、又は分枝鎖ＤＮＡ（本明細書に具体的に引用した、Ｕｒｄｅａ他に付与された米国特許第５，５９４，１１８を参照。）などのシグナル増幅反応の両方が包含される。本発明は更に標準的なＰＣＲチューブの反応表面に付着した結合基材としての酸化アルミニウムを取り込む方法、及び同一のＰＣＲチューブを用いてＰＣＲのサーマルサイクル反応と直接且つ簡便に接続する高速核酸抽出プロトコルも提供する。ハイスループットロボット工学を利用することで、ＰＣＲチューブ又は容器は、自動化のプラットフォームを提供する。
【００６６】
酸化アルミニウムを別の核酸応用で利用可能にする緩衝液システムも本発明の範囲内に含まれる。この種の緩衝液システムとしては、例えばクリプトスポラジウムパルヴム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）のような極度に硬い検体を破壊する特定の還元剤も含むチオシアン酸グアニジンをベースとする緩衝液が挙げられる。本発明の目的に適したその他の緩衝液システムには、迅速且つ経済的なＤＮＡ結合緩衝液を提供する、ＮａＯＨのようなアルカリ性緩衝液が挙げられる。ＮａＯＨ緩衝液中で、ＲＮＡは破壊される。従ってＮａＯＨ緩衝液の使用は、ＤＮＡのみの選択的に結合する手段を提供する。本発明の目的に適した更に別のシステムには、リン酸緩衝液など、核酸の酸化アルミニウムへの結合を低減する緩衝液がある。これらの緩衝液システムは、高感度で効率的なマイクロアレイ、ビーズ及びブロットハイブリダイゼーションに、シグナル対ノイズが低いバックグランドを提供する。
【００６７】
本発明の固相マトリックスの強固な結合特性は、同一又は異なる遺伝子の連続的な繰返し分析を提供する。これにはＤＮＡとＲＮＡ双方の同時分析、又はＤＡＮとＲＮＡの個別で連続的な分析が包含される。ハイブリダイゼーション捕捉は複数のプローブを結合することで、特定標的のために多重化される。即ち本発明はハイブリダイゼーション反応、又は増幅反応による核酸の繰返し又は連続分析に有用である。ひとたび強固に結合すると核酸は安定化し、室温、冷蔵又は冷凍して長期間保存できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
当業者は本発明が核酸抽出、精製及び検出に広範囲に応用可能であることは容易に認識できる。以下実施例は本発明を説明、例示するものであり、従って本発明にいかなる制限を加えるものではない。様々な変更が発明の範囲内に於いて可能である。
【実施例１】
【００６９】
方法と材料
ＤＮＡ結合は３２Ｐ放射能標識を使用して測定した。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社より得た４３６１塩基対長のＰＢＲ３２２プラスミドを、Ｐｒｉｍｅ−ＩｔIIストラタジーンキットを使用してランダムプライム法により標識した。このプラスミドをＨｉｎｄIIIで切断し、未標識のヌクレオチドをＢｉｏＲａｄ Ｂｉｏｓｐｉｎ６を使用して除去し、濃度を１ナノグラム／マイクロリットル（ｎｇ／μＬ）に調整した。より高いＤＮＡ濃度はサケ精子ＤＮＡを加えて調整した。放射能標識実験のデータは５回のレプリカデータの平均値を表している。
【００７０】
Ａｌｄｒｉｃｈ社より得た酸化アルミニウムビーズ（サイズ、７４〜１４９μｍカタログ番号３４、２６５−３）を室温で１時間０．１ＮのＮａＯＨで処理し、水酸化アルミニウムビーズを生成した。水（ｄｄＨ２Ｏ）、０．１ＮのＮａＯＨ又は４Ｍのチオシアン酸グアニジン緩衝液（１２ｇのＧｕＳＣＮ、２７７μＬのＴｒｉｔｏｎＴＭＸ−１００、２．２ｍｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡｐＨ８．０及び１０ｍｌの０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．４）を含むＤＮＡ結合バッファーを用いた。結合は密封した微量遠心チューブ内での回転と、重力フロー濾過のいずれでも可能である。大型のビーズは遠心分離しなくてもチューブ底に容易に沈殿するので、洗浄が容易である。重力フロー実験ではＳｐｅｃｔｒｕｍ ＳｐｅｃｔｒａＭｅｓｈ ４３μｍフィルタ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社、カタログ番号１４６５３０）をＡＮＳＹＳ ４ｍＭクロマトグラフィーカラム内に圧入した。
水酸化アルミニウムビーズをこのカラム内にスラリ液の形で充填し、排水して、吸い取り紙で水を取り、１ｍｌの７０％のＥｔＯＨで１回洗浄し、乾燥させてから各種結合緩衝液に加えたＤＮＡを添加した。
【００７１】
ＸｔｒａＢｉｎｄＴＭ（Ｘｔｒａｎａ，Ｉｎｃ．、ブルームフィールド、コロラド）は、α−酸化アルミニウム（α−Ａｌ２Ｏ３）の固相マトリックスである。ＸｔｒａＢｉｎｄ ＡｍｐＴＭ（Ｘｔｒａｎａ，Ｉｎｃ、ブルームフィールド、コロラド）は内壁表面をＸｔｒａ ＢｉｎｄＴＭでコーティングしたＰＣＲチューブである。
【００７２】
固相増幅では、座に好適な特性を持たせるために、公開されている配列及び方法を使用した。以下記載の実験手順で使用している配列を表１に掲載した（配列番号１〜１０）。具体的には、ＨＩＶのＰＣＲではＳＫ３８／ＳＫ３９プライマセット（配列番号８〜９；Ｋｅｌｌｏｇ ａｎｄ Ｋｗｏｋ、ＰＣＲプロトコル内：方法及び応用ガイド、ＭＡ．Ｉｎｎｉｓ他 編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． ３３７〜３４７項（１９９０年）、これら具体的な本明細書への引用記載を参照）、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社より得たコントロールＨＩＶ ＤＮＡプラスミド（カタログ番号Ｎ８０８−００１６）及びｒｔＴＨ逆転写酵素増幅を使用した。鎖置換増幅ではマイコバクテリウムプラスミドを標的とし、Ｗａｌｋｅｒ他、 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２巻：９〜１３項（１９９６年）に記載（具体的な本明細書への引用記載を参照）のプライマセット（配列番号４〜７）を用いた。ヒトのショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プライマセットとプロトコルはＰｒｏｍｅｇａ社より市販されているＣＴＴ及びＦＦＶマルチプレックスである。
【００７３】
【表１】
【００７４】
ＤＮＡが固相マトリックスに強固に結合することの確認
放射能標識ＤＮＡ（１ｎｇ）は室温で１時間、水（ｄｄＨ２Ｏ）、０．１ＮのＮａＯＨ又は４Ｍのグアニジンチオシアネート緩衝液中で、回転しながら酸化アルミニウムと結合することができる。１９８ｍｇの酸化アルミニウムの結合能力を測定するために、１ｎｇの放射能標識ＤＮＡを各種濃度のサケ精子ＤＮＡに加えた（図２）。サケ精子ＤＮＡの量を増やしていくと、やがてＤＮＡ結合は最大値に達し、液相のＤＮＡはそれ以上結合できなくなるために、結合ＤＮＡの割合は次第に減少する。このＤＮＡ結合の不可逆性は、続く１０回の洗浄後に除去された放射標識を測定することで示される（図３）。図３に示すように、９５℃のＰＣＲ緩衝液で１０回洗浄した後でも、９２％を越えるＤＮＡは強固に結合したまま保持される。溶出した数値の大部分（６％）は最初の４回の洗浄中に生じたものであり、残り６回の洗浄で溶出された数値は２％に過ぎなかった。従って、図３のデータよりＤＮＡが酸化アルミニウムに強固に結合し、９５℃での７０％エタノール、水又はＰＣＲ緩衝液による１０回の洗浄でも９０％を越えるＤＮＡが保持されることが示された。従って酸化アルミニウムに結合したＤＮＡは遠心分離にかけることなく，またＤＮＡを損失する恐れなしに、簡単に水洗浄及び緩衝液交換に従う。
大容積のサンプルから選別した固相に結合した核酸は、洗浄してから所望の容積に再懸濁することができる。例えばグアニジンチオシアネート緩衝液を含む３ミリリットル（ｍＬ）のサンプルからＤＮＡを酸化アルミニウムに結合し、リン酸又はＴｒｉｓ緩衝液で洗浄してから少量（５０μＬ）の増幅反応混合液内にビーズを再懸濁することができる。この特性により、ＤＮＡの精製と増幅とを簡単に結びつける方法が導かれる。
【実施例３】
【００７５】
重力フロークロマトグラフ
大容積かつ低濃度の検体からＤＮＡを検出する感度は、高速のフロークロマトグラフィーにおける酸化アルミニウムの効率的なＤＮＡ結合能力を利用して、大幅に改善することができる。７４〜１４９μｍの酸化アルミニウムビーズ（Ａｌ２Ｏ３）或いは１５０〜２１２μｍの二酸化ケイ素ビーズ（ＳｉＯ２）（シグマ社、カタログ番号Ｇｌ１４５）を使用した重力濾過にかけ、放射能標識ＤＮＡを結合した。二酸化ケイ素又は酸化アルミニウムの量は、ＤＮＡ結合に利用可能な表面積が共に同じになるように調整した。１ｍＬのグアニジンチオシアネート結合緩衝液（流れ時間、１．５〜２分、約０．５ｍＬ／分）又は１０ｍＬのグアニジンチオシアネート緩衝液（流れ時間、５〜８分、約２ｍＬ／分）に希釈して重力濾過中にＤＮＡ（５０ｎｇ）を結合した。図４は、二酸化ケイ素に結合するＤＮＡと、二酸化アルミニウムに結合するＤＮＡそれぞれに及ぼす流速と濃度の影響を比較したものである。１ｍＬ容積の重力フロークロマトグラフィー中のＤＮＡ結合には、酸化アルミニウムがより効果的であった。４Ｍグアニジンチオシアネート結合緩衝液中の二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）の結合効率は６％であったのに対し、同一緩衝液中での酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）の効率は５２％であった。
ＳｉＯ２とＡｌ２Ｏ３の結合効率は共に１ｍｌのＮａＯＨ結合緩衝液で改善した（ＳｉＯ２の結合効率は１２．４％であり、これに対しＡｌ２Ｏ３の結合効率は６０％であった）。容積を１０ｍＬにして流速を４倍に上げ、同一のＤＮＡ５０ｎｇ（即ち１ｍＬ当たりの濃度は１ｍＬ検体に比べ１０分の１になる）を使用すると二酸化ケイ素の結合効率は大幅に低下し、２％未満となった。これに対し酸化アルミニウムの場合、測定総回収率中の低下は１０％に過ぎなかった。他の実験方法では、大容積検体を２回又は３回通過させてクロマトグラフィを繰り返すと、酸化アルミニウムについては最高で８０％の結合効率が得られることが示された。（データ非掲載）
これらの結果から、酸化アルミニウムが二酸化ケイ素に比べてＤＮＡ結合固相として遙かに優れており、ＤＮＡは高流速、低濃度のＤＮＡクロマトグラフィで捕捉できることがわかる。
このように酸化アルミニウムの特性を利用することで、プールされた、或いは大容積の検体からＤＮＡを濃縮することができ、ミリリットル当たりのＤＮＡ検出感度を大幅に上げることができる。またＤＮＡに対する酸化アルミニウムの高親和力は、水、緩衝液又はその他の試薬からの低レベルの汚染ＤＮＡの除去にも有効である。
【実施例４】
【００７６】
固相増幅
酸化アルミニウムは核酸を強固に結合するため、酸化アルミニウムは結合したＤＮＡが固相上で直接増幅可能な場合にのみ有益である。様々な増幅法に適応することを例示するために、１０６コピーのＨＩＶ ＤＮＡと１μＬのマイコバクテリウムＤＮＡ標本を同時に水中にて酸化アルミニウムと結合した。これら結合した標的ＤＮＡを次にＨＩＶの配列について、まず３５サイクルのポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）（図５のパネル（Ａ）参照）を用いて増幅し、次に鎖置換増幅（ＳＤＡ）を用いて標的マイコバクテリアの増幅（図５パネル（Ｂ）参照）を行った。図５、パネル（Ａ）に示すＨＩＶ ＰＣＲのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色アガロースゲルは良好な増幅産物を示している。図５のパネル（Ａ）の中のウエル１は分子量ラダーであり、ウエル２及び３は陽性の１０００コピー水を用いたコントロール増幅であり、ウエル４、５、６及び７は酸化アルミニウム固相ＰＣＲ増幅であり、ウエル８、９、１０及び１１は酸化アルミニウム固相の陰性コントロールであり、ウエルの１２及び１３は陰性コントロールである。ＨＩＶのＰＣＲ増幅に続いて、この酸化アルミニウムを４回７０％ＥｔＯＨで洗浄し、５５Ｃで１０分間乾燥してから標的マイコバクテリウムをＳＤＡ増幅した。ＳＤＡ増幅のＥｔＢｒ染色アガロースゲルもまた、コントロール水に観察されたのと同等レベルの増幅産物を示した（図５、パネル（Ｂ））。図５のパネル（Ｂ）では、ウエル１及び２は陽性コントロール水であり、ウエル３、４、５及び６は酸化アルミニウム固相ＤＮＡ増幅であり、ウエル７、８、９及び１０は酸化アルミニウム固相の陰性コントロールであり、ウエルの１１及び１２は陰性コントロール水である。
【００７７】
追加実験手順より（図示せず）、マイコバクテリウムプラスミドＤＮＡは４Ｍのグアニジンチオシアネート緩衝液、又は０．１ＮのＮａＯＨ結合緩衝液を用いても結合すること、そしてこれら固相でＳＤＡ増幅が起こることが示されている。
アルカリ条件は一本鎖を生成することが広く知られている。
ＤＮＡは４Ｍグアニジンチオシアネート結合緩衝液中でも一本鎖である（トンプソンとギレスピー、分析生化学、１６３巻：２８１〜２９１項（１９８７年）、参照により本明細書への具体的記載に替える）。ＮａＯＨ又はグアニジンチオシアネート緩衝液中での酸化アルミニウムに結合したＤＮＡのＳＤＡ増幅は、溶融ステップなしに進む。これらのデータは、これら結合緩衝液中ではＤＮＡが一本鎖の形で結合しており、酸化アルミニウムを使ったＤＮＡ精製と一本鎖状の標的核酸を必要とする等、温増幅方法とを直接結びつける手段となることを確認するものである。
【００７８】
酸化アルミニウムがＲＮＡも効率よく結合できることを示すために、酸化アルミニウムと共に４Ｍのグアニジンチオシアネート結合緩衝液を用いてエイズ患者の酸クエン酸塩デキストロース（ＡＣＤ）血漿検体から直接ＨＩＶを精製した。この検体は既にウイルス負荷定量ＰＣＲにより２×１０４ＲＮＡコピー／ミリリットルの力価を持つことが分かっている。酸化アルミニウム抽出では、０．５ｍＬの血漿を４Ｍのグアニジンチオシアネート結合緩衝液を用いて５ｍＬに希釈してから、４０ｍｇの酸化アルミニウムを用いて重力濾過した。
【００７９】
図６はｒｔＴＨ逆転写酵素増幅後のＥｔＢｒ染色アガロースゲルで良好なＰＣＲ産物形成が検出されたことを示している。図６ではウエル１は分子量ラダーであり、ウエル２は１０００コピーの陽性ＨＩＶ ＤＮＡ水であり、ウエル３、４及び５は別々に行った３回のグアニジンチオシアネート緩衝液／酸化アルミニウム抽出後のｒｔＴＨ逆転写酵素増幅産物であり、ウエル６及び７は酸化アルミニウム陰性コントロールであり、ウエルの８は陰性コントロール水である。４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液プロトコルは血漿中に存在するＨＩＶウイルス粒子からＲＮＡを放出させることが可能であり、そのＲＮＡは大容積（５ｍＬ）重力濾過を利用して酸化アルミニウム上に増幅可能な状態で捕捉される。酸化アルミニウムは一般に核酸を結合する。
【実施例５】
【００８０】
ＤＮＡアーカイブ
本発明によれば、固相マトリックスに核酸を強固に結合する能力を直接固相増幅とを組み合わせることで、同一ＤＮＡサンプルを回数に限りなく繰り返し分析できる。このことを例示するために、１０μＬの酸クエン酸塩デキストロース（ＡＣＤ）血を４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液中で酸化アルミニウムに結合した。次に結合したＤＮＡを、５種類の連続するショートタンデムリピート（ＳＴＲ）増幅と５種類のプライマセット（プロメガ）とを用いて、次の順番で各３０サイクルのＰＣＲ増幅に５回かけた：１）Ｆ１３Ｂ、２）ＦＥＳＦＰＳ、３）ＶＷＡ、４）ＣＣＴマルチプレックス及び５）ＦＦＶマルチプレックス。最後の増幅セットの後、ＤＮＡサンプルをそのまま１５０回のＰＣＲサイクルにかけた。
【００８１】
図７は４番目の遺伝子セットの増幅であるプロメガＳＴＥ ＣＣＴマルチプレックスを用いた増幅と、５番目の遺伝子セット増幅であるプロメガＦＦＶマルチプレックスを用いた増幅のパターンを示す銀染色ゲルである。図７ではレーン１、８、９及び１６はアレルラダーであり、レーン１７はヒトゲノム陽性コントロール水であり、レーン２、３及び４は酸化アルミニウム結合ＤＮＡの４番目の増幅（ＣＴＴマルチプレックス）であり、レーン５、６及び７は酸化アルミニウムＣＴＴ陰性コントロールであり、レーン１０、１１及び１２は酸化アルミニウム結合ＤＮＡの５番目の増幅（ＦＦＶマルチプレックス）であり、そしてレーン１３、１４及び１５は酸化アルミニウムＦＦＶマルチプレックス陰性コントロールである。図７の銀染色ゲルに示される結果からは、増幅が５種類全てのＰＣＲで起こっていることが示された。これらデータから、ＤＡＮのアーカイブと、４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液プロトコルとそれに続く５種類の連続ショートタンデムリピート（ＳＴＭ）増幅（合計１５０ＰＣＲサイクル）を利用したＰＣＲによる増幅により、同一の結合ＤＮＡを反復して酸化アルミニウム増幅できることが確認された。
【００８２】
まとめると、ＤＮＡは更なる増幅分析が可能な形で酸化アルミニウム上にアーカイブされている。そのような利用としては、同一遺伝子の反復分析、異なる遺伝子の連続増幅、例えば異なる感染性病原体の検出、又は拡大分析、例えばヒト識別分析を目的としたより高度な鑑別力が挙げられる。
【実施例６】
【００８３】
酸化アルミニウムへの核酸の不可逆的結合を促進又は阻止する緩衝液
放射線標識ＤＮＡ（５０ｎｇ）を、１９８ｍｇの酸化アルミニウム存在下に表２に掲載の各種緩衝水溶液５００μＬに加えた。酸化アルミニウムへの放射線標識ＤＮＡの排他的結合をより正確に測定するために、実施例１記載のＢｉｏｓｐｉｎ６を使った精製後に残った遊離状態の取り込まれていないヌクレオチドをトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿にて判定した。表２に示すように、このより正確な手順を利用した場合、４Ｍグアニジンシアネート緩衝液又は水酸化ナトリウム中でＤＮＡは酸化アルミニウムに１００％の効率で結合する。
ブロッキング緩衝液の添加といった、その他特定の物質及び／又は条件は、ＤＮＡの結合を低下する。表２では、例えば、その様な例として１０％ウシ血清アルブミン又はＫ２ＨＰＯ４緩衝液を挙げている。
【００８４】
【表２】
【００８５】
こうした後、固相に結合した第１核酸は複数回再使用することができる。ＲＮＡは０．１ＮのＮａＯＨ内で破壊されることは周知である。従ってこの結合緩衝液を利用することで、ＤＮＡだけが捕捉される。グアニジンチオシアネート緩衝液と水酸化ナトリウム緩衝液を用いた効果的な細胞の破壊と迅速な結合は、血液、頬側スワブ、尿、及び血漿又は血清内に飛散したＨＩＶウイルス粒子に効果的である。しかし、ある種の感染菌、例えばクリプトスポラジウムパルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）については、細胞を効果的に破壊するために検体を９５℃に加熱し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の様なタンパク質還元剤を加える必要がある（配列番号１〜３；表１）。
【実施例７】
【００８６】
高流速での迅速結合とＰＣＲチューブへの酸化アルミニウムの取込
酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）の高流速でのＤＮＡ結合能力を、同じ総ｃｐｍの放射線標識ＤＮＡを１ｍＬ、５ｍＬ又は１０ｍＬの４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液に顕濁し、その顕濁液を酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）又は二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）に一定速度で通した。図８に示すように、結果からは酸化アルミニウムが二酸化ケイ素に比べ遙かに優れていることが確認された。酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）は流し濃度で核酸を効率的に結合し、大容積（１０ｍＬ）の検体を１ｍＬまで、１ｍｌ当たり１０倍の濃縮し、容積を１／１０まで小さくした。ＤＮＡの結合は図９に示す実験結果より明らかなように迅速であった。ここでは５０μＬの酸クエン酸塩デキストロース（ＡＣＤ）抗凝固血を、０．１ＮのＮａＯＨ結合緩衝液中に酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）に加えた。ＤＮＡが結合した直後、又は様々なインキュベーション時間後にこの固相に結合したＤＮＡよりＨＬＡ ＤＲベータ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
図９では、増幅効率で表された結合は結合直後（レーン１〜４）、１分後（レーン５〜８）又は２分後（）レーン１４）で同一であった。レーン１３は陰性コントロール水である。
【００８７】
これら実験結果は、ＰＣＲ増幅と直接結びつく自動化可能な核酸抽出に極めて簡単且つ迅速なプロトコルの基礎である。このために、酸化アルミニウムを、図１０に示す様に、シリコン又はＰＣＲを阻害しないことが分かっているその他接着物質を介してＰＣＲチューブ内に接着した。或いは、より多数を処理するために、酸化アルミニウムを９６ＰＣＲチューブプレートに取り込んでも良い。これら代替法はいずれも１）結合緩衝液を酸化アルミニウムＰＣＲチューブに加えること、２）検体を各チューブに添加し、混合してから液体を吸引して捨てること、３）洗浄緩衝液を繰り返しピペットで吸引、排出して洗浄し（３回）、その後洗浄緩衝液を吸引して捨てること、４）ＰＣＲ増幅マスターミックスを添加すること、及び５）サーマルサイクラーにて増幅することを含んで成るプロトコルによる単純な核酸抽出法を提供する。このプロトコルのピペット吸引ステップはロボットシステムを用いて行う多数処理のために簡単に自動化される。
【実施例８】
【００８８】
酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）への精製ＲＮＡの結合の確認
実施例４では、患者の血漿検体からＨＩＶを検出したことに基づきＲＮＡが酸化アルミニウムに強固に結合し、増幅できることを記載した。この結果は、血清中のプロウイルスＤＮＡを汚染したことによるものである可能性がある。純粋な標的ＲＮＡを使ったＲＮＡ結合は、不可逆的な結合と固相増幅を確認した。図１１は４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液中に結合したａｐＡＷ１０９純粋標的ＲＮＡの増幅及び酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）固相上で増幅したｒｔＰＣＲの結果を示している。ＩＬ−２ ｍＲＮＡ及びＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｄｓＲＮＡが同様の様式で酸化アルミニウム上に結合及び増幅することが示された（図示せず）。
【実施例９】
【００８９】
ハイブリダイゼーションによる特異標的捕捉を目的とする強固に結合した核酸プローブの利用
検出限界を判定するために実施した実験より、ＰＣＲ増幅による酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）に結合したＤＮＡの検出では１０００コピーが必要であり、結合ＲＮＡでは１０３コピーが必要であることが示された（図１１）。検出感度は、核酸プローブを本発明の固相マトリックスに結合し、続いてこのプローブをサンプル中に存在する標的核酸とハイブリダイゼーションさせることでＲＮＡ又はＤＮＡのいずれについても１００コピー未満まで大きく向上した。検出を望む標的核酸に隣接する配列に相補的な２０〜１００塩基対長の高コピー数核酸プローブを０．１ＮのＮａＯＨ緩衝液中で酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）に強固に結合した。洗浄後このプローブを用い、高いレベルのバックグランド核酸を含む検体の中に標的核酸があるものについても、ハイブリダイゼーションで捕捉した。この方法では、検体はマトリックス結合プローブが存在する状態で、４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液で破壊され３倍に希釈された。ハイブリダイゼーションは起こった。洗浄ステップ後、標的を直接ＰＣＲで増幅した。図１１に示すように、これにより約１０から１００コピー標的の検出限界を得た。
【実施例１０】
【００９０】
大容積又はプール検体中の低コピー標的の捕捉
酸化アルミニウムに強固に結合した核酸プローブによるハイブリダイゼーション捕捉は、初期検体容積が大きな場合での標的配列の特異的選別にも有効である。図１２に示す様に、上記ハイブリダイゼーション固相捕捉法により、血漿で初期容積を５．５ｍＬに希釈してもエイズ患者血漿検体由来の１０００コピーが検出可能であった。血漿は希釈を最小限に抑えて抽出するために、乾燥グアニジンチオシアネート粉末に直接加えられた。
この調整により、捕捉ビーズへのハイブリダイゼーションの最終容積は３０ｍＬになった。更に、１００μＬのＨＩＶ陽性血漿は、追加された２４の陰性血漿検体（１００μＬ）と一緒にプールしても検出された。これらプール実験より、検出感度が４８ＨＩＶウイルス粒子／ミリリットルであることが確認された。同様の方法から、３０ｍＬの水にプールされた１００コピーのＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｕｍ ｐａｒｖｕｍが検出されることが示された（図示せず）。従ってハイブリダイゼーション捕捉プローブプロトコルを利用することで、個別検体で行った場合とほぼ等しい感度でプール検体をスクリーニングでき、そのため高感度のプール検体検査を可能にするため大きな商業的可能性を持っており、大幅なコスト削減をもたらす。
【実施例１１】
【００９１】
酸化アルミニウムに強固に結合した核酸の保管
５０μＬの酸クエン酸塩デキストロース（ＡＣＤ）血液由来の核酸を４Ｍグアニジンチオシアネート緩衝液又は０．１ＮのＮａＯＨ緩衝液を用いて酸化アルミニウムに結合した。次に結合した核酸を乾燥状態、又は７０％ＥｔＯＨ中、若しくはＴｒｉｓ ＥＤＴＡ緩衝液中で、室温、４℃又は−２０Ｃで保管した。核酸は一般にこれら条件では３ヶ月間安定であったが、本発明を利用すると更に長期間安定であり、おそらくは無期限に安定である。
【実施例１２】
【００９２】
核酸アーカイブの可能なその他材料の同定
本実施例は選択した材料が核酸アーカイブの一般的な目的に適うことが確認されたことを示している。これら材料は高結合定数でＤＮＡ及びＲＮＡを結合すると同時に、標的の増幅を目的に結合した核酸にアクセスする酵素増幅法も可能である。核酸を強固に結合できる材料を同定するために、前記放射性同位元素実験の替わりとなるより便利な代替法として蛍光法を計画した。ＤＮＡの場合、５’末端にフルオロセインの様な標識蛍光色素を持つ合成オリゴヌクレオチドを用いた。ＲＮＡの場合、色素標識ヌクレオチド存在下に、ＲＮＡポリメラーゼを使ったランオフ転写を利用して標識鎖を生成した。
これら蛍光標識鎖を結合緩衝液と混合し、各種材料にさらし、所定時間放置した後洗浄した。結合有り無しでの材料からの蛍光発光及び各種溶液（標識核酸、洗浄液）からの発光が測定できた。マトリックスへの結合を確認した後、結合核酸の増幅能をＤＮＡ又はＲＮＡを用いた抽出及び増幅法、精製核酸又は各種媒体（血液、細胞培養等）中の核酸、及びＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ及びＳＤＡといった各種増幅法について検討した。
【００９３】
好ましい本発明の固相マトリックスの１つは、アルファ酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）であり、これは商標名ＸｔｒａＢｉｎｄＴＭ（エクストラナインク、ブルームフィールド、コロラド）で核酸結合マトリックスとして販売されている。酸化アルミニウムはそれぞれ固有の特性を持つ様々な化学形状で存在することを記すことは重要である。記載の核酸アーカイブの場合には、標準的条件での結合及び増幅にはアルファ酸化アルミニウムが好適である。その他の形状の酸化アルミニウムはＤＮＡ又はＲＮＡを結合するが、結合した核酸を増幅するには増幅反応を変更しなければならない。例えばガンマ酸化アルミニウムに結合したＤＮＡのＰＣＲ増幅は、マグネシウムイオンの濃度を約５０％以上に増加すれば上手くいく。ポリメラーゼの濃度を上げることも役立つだろう。アルファ酸化アルミニウムは時に溶融体又は焼体として参照されるが、これら用語は一般に明瞭ではなく、或いは用語「アルファ」で良く定義される。
【００９４】
酸化アルミニウム、特にアルファ酸化アルミニウム以外にも、その他の材料が核酸アーカイブマトリックスとして有用であることが確認されている。
それら材料は酸化チタン（Ｔｉ２Ｏ３）、一般にはＡｌＯｙと呼ばれる酸化アルミニウム混合組成物の薄膜、及び変性二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）である。変性ＺｒＯ２を調製するために、ＺｒＯ２を酸性又は塩基性溶液にさらしてからＤＮＡと混合し、洗浄後酵素増幅により結合ＤＮＡが増幅することが示された。これら各種材料の能力を図１３〜１６に示した。
【００９５】
図１３は各種固相材料に結合した蛍光標識ＤＮＡ及びＲＮＡからの蛍光シグナルを表す棒グラフである。
本実施例で使用した固相材料は１００〜２００メッシュのアルファ酸化アルミニウム（アルファ−Ａｌ２Ｏ３）、１５０メッシュのガンマ酸化アルミニウム、１００〜２００メッシュの二酸化ジルコニウム、ガラスビーズ（１５０〜２１２μｍ）、１０００メッシュのアルファＡｌ２Ｏ３でコーティングしたガラスビーズ、１０００メッシュのアルファＡｌ２Ｏ３のＳｉＯ２薄膜でコーティングしたガラスビーズ、その上に酸化アルミニウムの薄膜を有するガラスビーズである。ガラス（ＳｉＯ２）ビーズも最小結合コントロールとして使用し、ＤＮＡ及びＲＮＡに関する結果をそれぞれに対応するガンマＡｌ２Ｏ３シグナルで正規化されている。
【００９６】
図１４は各種材料に結合したＤＮＡをＰＣＲ増幅した後の、エチジウムブロマイド染色アガロースゲルである。示したゲルは増幅前に４回及び８回洗浄したが、洗浄回数が５回、６回及び７回についても同様の結果を得た。標的ＤＮＡは精製された胎盤ＤＮＡであり、増幅域はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｇタンパク質共役受容体５７（ＧＰＲ５７）である。本図では、試験材料は１）酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）コーティングＰＣＲチューブ；２）アルファ−Ａｌ２Ｏ３；３）Ｔｉ２Ｏ３；４）酸化アルミニウム薄膜コーティングガラスビーズである。各マトリックス及び洗浄回数について、２回行った反応を示した。
【００９７】
図１５は酸化アルミニウム薄膜でコーティングしたガラス毛細管内壁に結合したＤＮＡのＰＲＡ増幅後のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルである。結合ＤＮＡは総時間約４５分の迅速サーマルサイクリングで増幅した。結合標的は精製胎盤ＤＮＡで、増幅域はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓＧタンパク質共役受容体５７遺伝子である。
【００９８】
図１６は大腸菌由来のＲＮＡをＮＡＳＢＡ増幅して得た、顕著なバンドを示す側方流動ストリップである。Ａｌ２Ｏ３又はＴｉ２Ｏ３スラリでコーティングされたＰＣＲチューブを使用した大腸菌希釈物を処理し、その結果を示している。
【実施例１３】
【００９９】
プラスチック表面を固相マトリックスでコーティングする別の方法
材料（Ａ）本発明のプラスチック表面コーティング法の１つは、加熱した固相マトリックスを冷却したプラスチックと接触させることを包含する。
これによりプラスチックは部分的に溶融し、固相マトリックスの埋込が起こる。固相マトリックスをるつぼの中で７００℃から８００℃に加熱してから、約０℃から１０℃の間の温度に冷却されているプラスチック材料（例えばＰＣＲチューブ）の上又は中に注ぎ込んだ。例えばプラスチック材料は氷槽（４℃）の中に入れることができる。過剰の固相マトリックスを払い落とし、チューブを包装した。マニフォールドを使用して複数のチューブを同時にコーティングするといった、この一般的な加熱・溶融法の代替法も開発されている。
【０１００】
（Ｂ）ＰＣＲチューブ又はその他プラスチック材料内に固相マトリックスを溶融すること以外に、プラスチック表面上に薄膜コーティングを溶着する方法もある。プラズマエッチング、化学蒸着法（ＣＶＤ）及び加熱蒸発法といった通常の処理及び溶着法を用いて、金属酸化物の薄膜を下張りのプラスチック材料に溶着、結合することができる。溶着条件を調整することで、膜に核酸を結合させ、結合したＤＮＡ又はＲＮＡを増幅することができた。
【０１０１】
（Ｃ）代替法として、プラスチック表面を、例えばプラズマエッチング或いは強酸／塩基処理、及びアルミニウムｓ−ブトキシドといった液体の金属酸化物前駆物質を用いて化学的に活性化するか、又はその他のアルコキシ金属試薬を導入して活性化プラスチック表面と反応させる方法がある。プラスチック表面活性化の方法は当分野周知であり、更なる説明は必要ない。この方法でも所望する結合及び増幅コーティングを作ることができる。
【実施例１４】
【０１０２】
酸化物表面への固相マトリックスコーティング法
固相マトリックスは以下の様な幾つかの方法により、毛細管、スライド及びその他形状のガラス表面、並びにその他の酸化物表面上に溶着できる。
【０１０３】
（Ａ）実施態様の１つでは大小の酸化アルミニウム顆粒を、加水分解を促進する酸性又は塩基性条件を持つガラス表面に溶着し、続いて乾燥した。酸性液の例としては、容積で９５％のエタノール、０．５％の濃塩酸（ＨＣｌ）及び４．５％の水を含む液がある。
【０１０４】
（Ｂ）別の実施態様では酸化アルミニウム顆粒を、酸性アルミニウムを二酸化ケイ素、酸化アルミニウム又はテトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン若しくはアルミニウムｓ−ブトキシドといった金属酸化物前駆物質を含むゾルと混合し、この混合物をガラス表面上でゲル化させてガラス表面上に溶着した。これにより金属酸化物結合剤の中に酸化アルミニウム顆粒のフィルムを得た。
【０１０５】
（Ｃ）別の実施態様では、Ｔｉ２Ｏ３顆粒を本実施例のＡ及びＢの方法でガラス表面に溶着した。
【０１０６】
（Ｄ）既存の酸化アルミニウム又は酸化チタンの顆粒を溶着することに加えて、アルミニウムｓ−ブトキシド若しくはチタンエトキシドといった金属酸化物前駆物質を、この前駆物質が加水分解して金属水酸化物を形成する液相反応液内で反応してガラス表面上に金属酸化物フィルムを溶着した。次に金属水酸化物同士を縮合して、ガラス又はその他の下張りしている金属酸化物基材に酸化層を共有結合した。例えば酸化アルミニウムゾルは、Ａ．Ｃ．ＰｉｅｒｒｅとＤ．Ｒ．Ｕｈｌｍａｎｎ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｅｒａｍ．Ｓｏｃ．７０：２８〜３２項（１９８７年））に記載の手順に従ってアルミニウムｓ−ブトキシドを加水分解してペプチド化することで調製した。次にガラス表面をこの液体にさらしてから乾燥した。これによりアルミニウムと酸素の混合組成物を有する酸化アルミニウムのフィルムコーティングができた。例えば、このフィルムのある部分はＡｌ２Ｏ３を、別の部分はＡｌ2.3Ｏ3.1を含むといった具合になっている。
【０１０７】
本実施例に記載のコーティングは、侵漬、液浸、スピンキャスティング又は基材を材料の懸濁液／ゾルにさらす同様の方法を含む当分野周知のいずれの好適な方法でも溶着できるが、もとよりこれらの方法に限定されるものではない。
【実施例１５】
【０１０８】
アーカイブしたＤＮＡ及びＲＮＡの長期保管
（Ａ）実施例１１では血液から抽出したゲノムＤＮＡが３ヶ月間安定して保管できることが確認された。今回、本研究ではこの期間を１８ヶ月に延長した。実施例１１に記載のサンプルを１８ヶ月間乾燥保管したでも、正確に増幅ができた（データ図示せず）。
【０１０９】
（Ｂ）同様の実験を計画して、酸化アルミニウムが安定してＲＮＡを保管できることを確認した。ＲＮＡは研究株である大腸菌ｓｉｔ１のみより得て、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキットで精製した。得たＲＮＡ抽出物（３１６ｎｇ）を１：２、１：４及び１：１０に希釈してから、ＭｇＣｌ２を含まない１０ｘＰＣＲ緩衝液５０ｍＬと各ＲＮＡ希釈液を５ｍｌ加えてＸｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブに結合した。３０分インキュベーションした後、上清を取り除き、チューブを５〜１０分間風乾した。全てのチューブにキャップを付け、室温、４℃又は−２０℃で保管した。１週間毎にチューブを取り出し、そして大腸菌ｓｚ ａｎｄ ｓｉｔｌマルチプレックス、ＮＡＳＢＡマスターミックスを加えた。以下の条件に従い、４２℃で９０分間ＮＡＳＢＡ反応を行った：８０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ ＫＣＩ、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰミックス、２ｍＭのｒＮＴＰミックス、２００ｍＭのプライマミックス、１５％ソルビトール及び１５％のＤＭＳＯ。結果は参照により本明細書への具体的記載に変える米国特許第５，９８９，８１３号に記載の方法を利用した側方流動検出法で視覚化した。精製ＲＮＡは４℃及び−２０℃で保管した場合には８週間安定であり、室温で保管した場合には、特により高い希釈率１；１０で若干の分解が認められた。
【実施例１６】
【０１１０】
マトリックスからの外した核酸の液相増幅
遺伝子型判定といった幾つかの応用では、上記記載の本発明の方法による簡素化されたサンプル調製及び固相アーカイブが有益である。別の実施態様では、増幅は固相上ではなく液相で精製核酸を用いて行われる。本例では、本明細書記載の固相マトリックス材料を利用した方法を示す。標的核酸は固相に強固に結合しているが、マトリックスをＴＥ緩衝液、水又はその他好適緩衝液で洗浄すると少量の核酸が精製核酸の形で溶液中に放出（解離）する。この溶液は標準的な増幅反応に使用できる。放出と増幅を複数回繰り返すことも可能であり、複数の増幅標的を個別に分析できる。
【０１１１】
標準的な置換法としては、溶解緩衝液と混合した血液を５から１０ｐＬのＡｌ２Ｏ３、Ｔｉ２Ｏ３、又はコーティングガラスビーズを含むＸｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブに入れ、標準的なインキュベーションと洗浄を行うことを包含した。洗浄後、５０から１００μＬのＴＥ緩衝液（ＴｒｉｓＨＣｌ／ＥＤＴＡ）をチューブに加えた。この溶液を約３０分間インキュベーションした後、ＴＥ液を取り出した。取り出した解離ＤＮＡを含むＴＥ溶液の一部（５〜１０μＬ）を通常のＰＣＲマスターミックス（プライマ、酵素、緩衝液等）と混合して、温度サイクルにかけた。ＴＥ緩衝液を加え得る操作と溶液の一部を取り出す操作を最低５回繰り返したところ、予想通りの正確な増幅を得た。図１７は本実施例による解離核酸（「解離物」）ＰＣＲ増幅及び以下の固相マトリックス材料に結合した固相核酸増幅後に得たエチジウムブロマイド染色アガロースゲルを示す；（１）Ｘｔｒａ ＡｍｐＴＭ（ＸＡ）チューブ：（２）１００〜２００メッシュのアルファ酸化アルミニウム（ａ−Ａｌ２Ｏ３）；（３）Ｔｉ２Ｏ３、及び（４）酸化アルミニウム薄膜。図１７に示す例では、結合標的は精製胎盤ＤＮＡであり、増幅域はＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓＧタンパク質共役受容体５７遺伝子である。
【実施例１７】
【０１１２】
同一アーカイブマトリックスを用いたマルチプレックスＰＣＲ増幅法
本発明によれば、アーカイブした核酸サンプルは、短時間又は長期間かけ同一サンプルを繰り返し処理する機会を提供する。更にアーカイブされたサンプルを利用すると、同一増幅域を何度も研究すること、及び／又は異なる標的のシリーズを研究することが可能である。
【０１１３】
（Ａ）同一マトリックスに結合した標的を繰り返し増幅できるプロトコルを開発した。同一標的域を繰り返し増幅するために、精製核酸又は溶解した生物サンプルをＸｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブ又は酸化アルミニウム、酸化チタン若しくはその他顆粒のスラリを含む別のチューブに加えた。標準的な結合及び洗浄操作を行った。次に標的アンプリコンに合ったプライマ及びＰＣＲミックスをチューブに加え、標準的な３２から４０サイクルのＰＣＲ反応を行った。生成物溶液を取り出し、チューブを９５Ｃで洗浄緩衝液にて洗った。同一標的を増幅する追加のラウンドでは、プライマとＰＣＲミックスを加えるが必要な増幅サイクル数はより少なかった。
【０１１４】
図１８と１９は、マトリックスに結合したＤＮＡの同一領域を繰り返し増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲルを示している。ゲノムＤＮＡ（ヒト）は全血からＸｔｒａＡｍｐＴＭチューブを使って抽出した。ＨＬＡ−ＤＲベータ遺伝子に関し標準的なＰＣＲ条件を使って、ＨＬＡ−ＤＲベータ遺伝子のＰＣＲ増幅（３５サイクル）を行った（図１８）。次にＸｔｒａ Ａｍｐチューブを１０分間、９５℃で洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＬｉＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１０％のＴｗｅｅｎ−２０）とインキュベーションした。
洗浄緩衝液を取り出し、新しいＰＣＲ増幅試薬を加えてＨＬＡ−ＤＲｓｓを再増幅した。２回目の増幅反応のＰＣＲ試薬濃度及びサイクルパラメータは、ＰＣＲサイクル数を減らしたこと以外は、初回の反応と同じであった。図１９は１０及び１５ＰＣＲサイクル後のゲルを示している。
エチジウムブロマイド染色アガロースゲルで見た場合に鮮明に見え且つ比較的清浄であるアンプリコンを生成するには、約１０回のサイクルで十分であった（図１８）。
【０１１５】
（Ｂ）異なる標的核酸のシリーズを増幅するために、標準的な操作による第一ラウンドを此方：サンプルを固相マトリックス（例えば酸化アルミニウム）でコーティングしたＰＣＲチューブの様な容器に入れた。
標準的な結合及び洗浄操作を行った。次に標的のアンプリコンに合ったプライマ及びＰＣＲミックスをチューブに加えて、標準的な３２から４０サイクルのＰＣＲ反応を実施した。別の標的にあったプライマと使用すること以外はこれと同じ基本操作に従って続くラウンドを実施し、各ラウンドに先立って高温（通常は９５℃）インキュベーションと洗浄を行い、前のラウンドでハイブリダイズしたプライマ及び生成物を除いた。この操作により複数の異なるアンプリコンが生成された。
【０１１６】
図２０、２１、２２及び２３は、同一マトリックスに結合したＤＮＡの異なる領域を連続的にＰＣＲ増幅反応したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲルを示す。ゲノムＤＮＡ（ヒト）は全血からＸｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブを使って抽出した。ＰＣＲ増幅は対象となる遺伝子の増幅について標準的であるＰＣＲ反応条件を用い、１種類の遺伝子を増幅した。次にｐチューブを１０分間、９５℃で洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＬｉＣＩ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１０％のＴｗｅｅｎ−２０）とインキュベーションした。洗浄緩衝液を取り出し、別の遺伝子について標準的であるＰＣＲ条件を用いて別の遺伝子を増幅した。マトリックスに結合したＤＮＡの複数の異なる領域について、この洗浄緩衝液との加熱インキュベーションと標準的なＰＣＲ反応条件を繰り返した。図２０、２１、２２及び２３に示す増幅した標的はそれぞれＨＵＧＡＬＰＣＲ２、ＨＧＨ ＰＣＲ５、ＨＤＹＳＴ３及びＨＬＡ Ａである。
【実施例１８】
【０１１７】
ランダムプライマとマルチプレックス増幅初期ステップを利用した広範囲のゲノムのサンプルブースト
（Ａ）固相に結合した核酸は複数のプライマを同時に利用すること、及び単一のプライマセットを利用して増幅できる。複数のプライマを使って増幅することで、多数の異なるアンプリコンを同時に生成できる。各プライマセットの条件は必ずしも最適化されておらず得られる増幅は均一ではないが、得られた溶液を更に、特定の標的に関しより特異的な増幅に利用することができる。
【０１１８】
（Ｂ）複数のプライマが存在する状態で最初にサイクル数が限定された「ブースト」を行う方法はゲルデスらが２０００年６月６日に出願し、参照により本明細書への具体的記述に替える、「マルチプレキシング増幅反応の方法」と題する係属中の米国特許出願、連続番号第０９／５８９，５６０号に記載されている。この方法では、２ステップのマルチプレックス増幅反応が実施されるが、この場合第一ステップは標準的な第一マルチプレックス増幅ラウンドを中断して、標的のサンプルコピー数を１００〜１０００倍だけブーストする。この第１ステップ後に産物を分け、それぞれが第１又はマルチプレックスブースターステップで使用されたプライマセットの１組を含み且つ最適化されている、単一の第２増幅反応にかける。
【０１１９】
かくして本発明の別の実施態様は、「ブースト」プライマの集合を一般化することである。即ち、本発明の方法は後のラウンドの標的アンプリコンに特異的なプライマセットの集合を、ランダムプライマの集合に置き換える。ランダムプライマを使って「ブースト」した後、この前増幅されたサンプルを小分けした。小分けされたものそれぞれを個々の標的に特異的なプライマのセット及び反応ミックスと混合した。本実施例では、ランダムな９−ｍｅｒの集合（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたが、熱安定性の様なハイブリダイゼーション及び増幅の基本法則に従うものである限りに於いて、別のランダムな９−ｍｅｒの集合或いはその他プライマ長の集合も機能するだろう。この応用に関して用語「ランダム」とは、「ブースト」ステップの間にゲノム全体又は少なくともその大きな画分が増幅されるように、十分に多様なプライマの大きな集合がグループ化されていることを意味する。
【０１２０】
図２４、２５及び２６はランダム増幅プライマの集合を用いた第１「ブースター」ステップ後の特異的ＰＣＲ増幅標的のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルを示している。ゲノムＤＮＡは全血（ヒト）からＸｔｒａＡｍｐＴＭチューブを使って抽出した。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ反応混合液中にランダム９ｍｅｒプライマを加え、プログラムの１０サイクルについて適度の厳密度で増幅するＰＣＲプログラムを用い実施した。この「ブースターＰＣＲ」後に、ＰＣＲ反応混合液を５μＬに小分けして、各ＰＣＲ反応にかけた（「第２ＰＣＲ反応」）。これら第２ＰＣＲ反応は標準的なＰＣＲ反応で使用する各ＰＣＲプライマペアを含んでおり、そしてそれぞれが標準的なＰＣＲサイクルプログラムにかけられた。図２４に示した増幅された標的はＨＵＧＡＬＰＣＲ２及びＧＡＰＤＨ１４であり、図２５に示した増幅標的はＨＧＨ−ＰＣＲ５であり、図２６に示す増幅標的はＨＤＹＳＴ３である。
【０１２１】
上記は多くの具体例を含むが、これら具体例は本発明の範囲を制限することを意図しておらず、その好適実施態様の例示を意図したものである。
換言すれば、本発明に関するこれまでの記述は描写及び説明を目的とした例示である。本発明の精神及び範囲から逸脱することなしに、当業者は様々な変更及び改良を発明に加え、様々な利用及び条件に発明を適合させることができる。この様な変更及び改良は、正当且つ当然に、以下に示す請求範囲の等価の範囲に入ると考えられるものである。即ち、本発明の範囲は添付の請求の範囲及びその合法的な等価物により決定されるものであり、本明細書に記載の実施例によるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】水中、０．１Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａｏＨ）結合緩衝液、又は４Ｍグアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）結合緩衝液中にて回転しながら１時間、室温でインキュベーションした後の酸化アルミニウム又は水酸化アルミニウムに結合した３２ｐ放射線標識ＤＮＡのパーセンテージを示す棒グラフ。
【図２】水中、０．１ＮのＮａＯＨ結合緩衝液、又は４ＭのＧｕＳＣＮ結合緩衝液中にて回転しながら１時間、室温でインキュベーションした後のナノグラム単位で示すＤＮＡに対し、酸化アルミニウム又は水酸化アルミニウムに結合した３２Ｐ放射線標識ＤＮＡのパーセンテージを示すグラフ。
【図３】酸化アルミニウムに結合した放射線標識ＤＮＡ量を、結合ＤＮＡの洗浄回数に対する毎分当たりの残存カウント数（ｃｐｍ）として表したグラフ。
【図４】酸化アルミニウム又は二酸化ケイ素に結合したＤＮＡの割合を比較したグラフで、ここではＤＮＡはグアニジンチオシアネート緩衝液又は水酸化ナトリウム緩衝液で希釈している。
【図５】パネルＡとＢは水中で酸化アルミニウムに１０６コピーのＨＩＶ ＤＮＡとマイコバクテリウムＤＮＡを結合させた後に、続けて直接固相増幅を行ったＨＩＶ ＤＮＡ及びマイコバクテリウムのアガロースゲル。パネルＡは固相ＨＩＶ ＰＣＲ増幅産物をエチジウムブロマイド染色したアガロースゲルである。パネルＢは固相マイコバクテリウムＤＮＡ ＳＤＡ増幅産物のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルである。
【図６】グアニジンチオシアネート緩衝液内にて酸化アルミニウムに結合させ、続いて酸化アルミニウム上のＨＩＶ ＲＮＡを固相ｒｔＴＨ ＰＣＲ増幅したＨＩＶ ＲＮＡ のエチジウムブロマイド染色アガロースゲルである。
【図７】ショートタンデムリピートマーカーのＣＴＴマルチプレックスとショートタンデムリピートマーカーのＦＦＶマルチプレックスを用いた、酸化アルミニウム上でのＤＮＡ固相増幅後の銀染色ゲル。
【図８】各種始動ボリウム及び異なる流量での、酸化アルミニウム又は二酸化ケイ素に結合した放射線標識ＤＮＡの割合。
【図９】０．１ＮのＮａＯＨと酸化アルミニウム存在下に酸クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）で抗凝固処理した血液を加えた後、様々な捕捉時間で強く固相に捕捉してからＨＬＡ ＤＲｂｃｔａプライマを使って行い、エチジウムブロマイド染色ゲルにより確認した固相ＰＣＲ増幅。
【図１０】自動核酸抽出を目的とする、固相マトリックスを組み入れたＰＣＲ増幅チューブ。
【図１１】酸化アルミニウムに直接ＲＮＡ標的（ｐＡＷ１０９）を結合させるか、又は酸化アルミニウムに強く結合しているオリゴヌクレオチドプローブに純化ＲＮＡ標的をハイブリダイゼーションしてから行った、純化ＲＮＡ標的の固相ＰＣＲ増幅後のアガロースゲル。
【図１２】血漿を希釈してから酸化アルミニウムビーズに強く結合しているオリゴヌクレオチド捕捉プローブとハイブリダイゼーションする、１０００コピーの低コピーＨＩＶの検出。
【図１３】各種固相材料に結合した蛍光標識ＤＮＡ及びＲＮＡからの蛍光シグナルを示す棒グラフ。材料は１００〜２００メッシュのアルファ−酸化アルミニウム（アルファ−Ａｌ２Ｏ３）、ガンマ−酸化アルミニウム、二酸化ジルコニウム、コーティング又は処理加工されたＳｉＯ２ビーズのシリーズ、及び未処理のｄＳｉＯ２ビーズである。
【図１４】価格腫固相材料に結合したＤＮＡをＰＣＲ増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。示したゲルは増幅前に４回から８回洗浄した。試験した材料はＸｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブ（ＸＡ）、アルファ−Ａｌ２Ｏ３、Ｔｉ２Ｏ３及びＳｉＯ２ビーズ上に酸化アルミニウムの薄層をコーティングしたものである。各マトリックス及び各線上回数について反応は２回繰り返し行った。
【図１５】ガラス製毛細管の内壁にコーティングされた酸化アルミニウムの薄層に結合したＤＮＡをＰＣＲ増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。
【図１６】Ｘｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブ又はＴｉ２Ｏ３スラリを固相マトリックスに利用した大腸菌希釈液からのＲＮＡのＮＳＡＢＡ増幅で得られた明瞭なバンドを示す側方流動ストリップ。
【図１７】マトリックス結合ＤＮＡ（上のゲル）及び表記のマトリックス表面から置換したＤＮＡ（下のゲル）をＰＣＲ増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。試験した材料は：Ｘｔｒａ ＡｍｐＴＭチューブ（ＸＡ）、アルファＡｌ２Ｏ３、Ｔｉ２Ｏ３及び酸化アルミニウムが薄層コーティングされたガラスビーズ。
【図１８】同一マトリックスに結合したＤＮＡから得た同一の標的領域（ＨＬＡ−ＤＲ）をＰＣＲで初期増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。
【図１９】図１８記載と同一の標的領域（ＨＬＡ−ＤＲ（３）を再増幅したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。
【図２０】マトリックスに結合した同一ＤＮＡの各種領域を連続ＰＣＲ増幅反応にかけたもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。増幅標的はＨＵＧＡＬＰＣＲ２。
【図２１】マトリックスに結合した同一ＤＮＡの各種領域を連続ＰＣＲ増幅反応にかけたもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。増幅標的はＨＧＨ ＰＣＲ５。
【図２２】マトリックスに結合した同一ＤＮＡの各種領域を連続ＰＣＲ増幅反応にかけたもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。増幅標的はＨＤＹＳＴ３。
【図２３】マトリックスに結合した同一ＤＮＡの各種領域を連続ＰＣＲ増幅反応にかけたもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。増幅標的はＨＬＡＡ。
【図２４】ランダム増幅プライマの集合体を利用する初期「ブースト」ステップを行った後に特異的ＰＣＲを実施したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。図２４に示す増幅標的はＨＵＧＡＬＰＣＲ２及びＧＡＰＤＨ１４。
【図２５】ランダム増幅プライマの集合体を利用する初期「ブースト」ステップを行った後に特異的ＰＣＲを実施したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。図２５に示す増幅標的はＨＧＨ−ＰＣＲ５。
【図２６】ランダム増幅プライマの集合体を利用する初期「ブースト」ステップを行った後に特異的ＰＣＲを実施したもののエチジウムブロマイド染色アガロースゲル。図２６に示す増幅標的はＨ ＤＹＳＴ３。
Claims (25)
- ａ）前記核酸を含むサンプルを、前記核酸が固相マトリックスと強固に結合するようになる条件の下に前記固相マトリックスと接触させるステップであって、前記マトリックスが１又はそれ以上の親水性を付与された電気陽性物質を有する特異結合材料であり、前記電気陽性材料がアルミニウム、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、スカンジウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、タンタル、クロム、モリブデン、タングステン、ホウ素、ガリウム、インジウム、ゲルマニウム、錫及び鉛より成るグループから選択される元素を含むステップと；ｂ）前記固相マトリックス上に強固に結合した核酸を保存するステップと；を含む核酸をアーカイブする方法。
- ａ）前記１又はそれ以上の標的核酸を含むサンプルを前記固相マトリックス及び前記１又はそれ以上の標的核酸配列が一本鎖標的核酸として前記マトリックスに強固に結合する様にする緩衝液と接触させるステップであって、前記マトリックスが１又はそれ以上の親水性を付与する電気陽性材料を有する特定結合材料であるステップと；ｂ）前記マトリックスに結合した標的核酸をプライマ核酸配列のセット及び前記プライマ配列を前記マトリックス結合核酸にハイブリダイゼーションできるようにする緩衝液とを接触させるステップと；ｃ）前記１又はそれ以上の標的核酸を増幅して増幅反応混合物を生成するステップであって、前記標的核酸配列が前記マトリックスに強固に結合したままであるステップと；を含む１又はそれ以上の標的核酸を増幅する方法。
- ステップ（ｂ）の前記緩衝液が前記プライマの前記固相マトリックスへの結合を低減する、請求項２記載の方法。
- 前記電気陽性材料がアルミニウム、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、スカンジウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、タンタル、クロム、モリブデン、タングステン、ホウ素、ガリウム、インジウム、ゲルマニウム、錫及び鉛より成るグループから選択される元素を含む、請求項２記載の方法。
- 前記マトリックスが酸化アルミニウム、酸化チタン（Ｔｉ２Ｏ３）及び変性二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）より成るグループから選択される、請求項４記載の方法。
- 前記マトリックスがアルファ酸化アルミニウム、ガンマ酸化アルミニウム及び混合組成物の酸化アルミニウム薄膜より成るグループから選択される、請求項２記載の方法。
- 前記マトリックスがＴｉ２Ｏ３である、請求項２記載の方法。
- 前記マトリックスが変性ＺｒＯ２である、請求項２記載の方法。
- 前記ステップ（ａ）の前記緩衝液が、グアニジンチオシアネートをベースとする緩衝液、アルカリ緩衝液、塩化リチウム及び界面活性剤をベースとする緩衝液からなるグループより選択される、請求項２記載の方法。
- 前記ステップ（ｂ）の前記緩衝液がリン酸緩衝液である、請求項２記載の方法。
- 前記標的核酸が二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡより成るグループから選択される、請求項２記載の方法。
- 前記標的核酸が二本鎖ＤＮＡであり、そしてステップ（ａ）の前記緩衝液が前記ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとして前記マトリックスに結合できるようにする、請求項２記載の方法。
- 前記増幅方法がＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＩｓｏＣＲ、ＣＲＣＡ、Ｑベータ、レプリカーゼ、分枝ＤＮＡ、ＲＴ−ＰＣＲ及び巻き戻しコイル増幅法より成るグループから選択される、請求項２記載の方法。
- ステップ（ｂ）及び（ｃ）を１回又はそれ以上更に繰り返すことを含んで成る、請求項２の方法。
- 前記サンプルが２又はそれ以上の核酸を構成要素として含み、且つ前記２又はそれ以上の標的核酸を連続して増幅する、請求項２記載の方法。
- 前記標的核酸が複数の標的核酸配列を含み、前記方法がさらにステップ（ｂ）の前記マトリックスに結合した標的核酸と複数のプライマセットとを接触して複数の標的配列を前増幅するステップを含み、前記複数の標的配列が同時に増幅される、請求項２記載の方法。
- 更に（ｄ）、ステップ（ｃ）の前記前増幅反応混合液を複数の小分け液に分割するステップと；（ｅ）少なくとも１つの前記プライマセットを各前記小分け液に加えるステップと；（ｆ）前記小分け液を増幅するステップと；を含む、請求項１６記載の方法。
- 前記固相マトリックスが基材表面上にコーティングされている、請求項２の方法。
- 前記基材がガラス又はポリマ材である、請求項１８記載の方法。
- 前記基材がチューブ、プレート、幕、毛細管、スライド、ビーズ、微粒子、ファイバ、マイクロチャネル及びマイクロアレイの形状である、請求項１８記載の方法。
- 前記マトリックスが親水性を付与された陽電気性材料を１又はそれ以上有する特異的結合材料であり、ａ）前記固相マトリックスを７００から８００℃の範囲の温度に加熱するステップと；ｂ）前記プラスチック材料を０から１０℃の範囲の温度に冷却するステップと；ｃ）前記加熱された固相マトリックスを前記冷却プラスチック材料と接触させて、前記固相マトリックスを前記プラスチック材料の表面にコーティングするステップと；を含むプラスチック材料表面を固相マトリックスでコーティングする方法。
- プラスチック材料の表面を固相マトリックスでコーティングする方法であって、前記マトリックスが１又はそれ以上の親水性付与電気陽性材料を有する特定結合材料であり、前記方法が前記マトリックス材料の薄膜を前記プラスチック材料の表面上に被覆するステップを含んで成る方法。
- 酸化物基材の表面を固相マトリックスでコーティングする方法であって、前記マトリックスが１又はそれ以上の親水性付与電気陽性材料を有する特異結合材料であり、前記方法が（ａ）前記マトリックスを前記マトリックスの加水分解を促進する酸性若しくは塩基性溶液と混合するステップと；（ｂ）前記酸化物基材の表面をステップ（ａ）の前記混合物でコーティングするステップと；（ｃ）前記コーティング表面を乾燥するステップと；を含んで成る方法。
- 前記マトリックスが１又はそれ以上の親水性付与電気陽性材料を有する特異結合材料であり、前記方法が（ａ）前記固相マトリックスとテトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、チタンエトキシド及びアルミニウムｓ−ブトキシドより成るグループから選択された金属酸化物前駆物質を構成要素として含むゾルと混合するステップと；（ｂ）ステップ（ａ）の前記混合物を前記酸化物基材の表面上に塗布するステップと；（ｄ）前記溶着混合物を前記酸化物基材の表面上でゲル化させるステップと；（ｅ）前記ゲル化混合物を前記表面上で乾燥させるステップと；を含む酸化物基材の表面を固相マトリックスでコーティングする方法。
- （ａ）固相マトリックスでコーティングされた表面を有する基材を含み；前記マトリックスが親水性を付与された電気陽性材料を１又はそれ以上有する特定結合材料である基材と；（ｂ）前記核酸を操作するのに必要な緩衝液又は試薬を構成要素として含む１又はそれ以上の容器と；を含んで成る核酸操作用キット。
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