KR20190049717A - 무세포 dna의 회수 방법 - Google Patents

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Abstract

수용성의 중성 중합체를 표면에 흡착시킨 산화알루미늄을 담체로서 사용함으로써, 소량의 체액 시료로부터 무세포 DNA를 효율적으로 회수하는 것을 가능하게 한다.

Description

무세포 DNA의 회수 방법
본 발명은 무세포 DNA를 회수하는 방법에 관한 것이다.
핵산을 이용한 실험 기술의 발전에 의해 신규 유전자 탐색이나 그의 해석이 가능하게 되었다. 암 등의 질환을 특정하기 위하여 인간의 게놈이 해석되고, 병원체의 감염을 특정하기 위하여 그것들의 게놈이 해석되는 등, 의료 현장에 있어서도 유전자 해석을 이용한 스크리닝 검사나 임상 검사 등이 행해지고 있다.
근년에는 핵산 중에서도 특히 무세포 DNA가 주목받아, 종양 유래의 무세포 DNA에 존재하는 암 특유의 유전자 변이를 해석함으로써 치료약에 대한 효과의 유무를 판정하는 등의, 임상에 직결되는 연구가 활발히 행해지고 있다.
예를 들어, EGFR 유전자 변이가 검출된 폐암 환자에게는 에를로티닙, BRAF 유전자 변이가 검출된 피부암 환자에게는 베무라페닙, BRCA 유전자 변이가 검출된 난소암 환자에게는 루카파립과 같은 치료약이 승인되어 있다. 또한, 이들 유전자 변이에 대한 표적 치료약 효과는 암의 종류를 초과하여 공통된 것이 알려져 있고, 예를 들어 BRAF 유전자의 V600 변이에 대한 치료약 다브라페닙은 피부암 및 비소 세포 폐암 환자 모두에게 권장된다.
그러나, 지금까지 암 특유의 유전자를 얻기 위해서는, 수술 절제한 암 조직에서 유전자를 회수하는 것이 일반적이었다. 절제 조직의 입수는 환자에 대한 침습성이 높고, 다양한 암 조직의 어느 부위를 채취하느냐에 따라 결과가 상이해져 버리는 문제가 있는 것, 또한 수술 전의 치료에는 적합하지 않은 것 등의 문제가 있었다. 근년, 체액 중에 존재하는 무세포 DNA에도 암 특이적인 유전자 변이가 존재할 수 있는 것이 보고되어, 암 조직을 절제하지 않고 유전자 변이를 검출하는 것이 갈망되고 있다.
또한, 암에 이환되면, 암 세포로부터 무세포 DNA가 혈중으로 방출되기 때문에, 암 환자는 암에 이환되지 않은 사람과 비교해 혈중에 보다 다량의 무세포 DNA를 함유하게 된다(특허문헌 7). 따라서, 무세포 DNA의 양을 정확하게 측정할 수 있다면, 체액 시료를 사용하여 저침습적으로 간편하게 암의 검출이 가능하게 된다. 특허문헌 7에는, 실리카겔 멤브레인으로 회수된 무세포 DNA의 양을 기준으로 암을 검출하는 방법이 기재되어 있다.
그러나, 체액 중에 존재하는 무세포 DNA는 소량인데다가, 무세포 DNA 서열 상에 존재하는 암 특유의 변이점을 해석하기 위해서는, 무세포 DNA 중에서도 혈중의 총 DNA에 있어서의 대립유전자 빈도가 0.1％ 내지 수％ 정도밖에 없는 종양 세포 유래의 cell-free tumor DNA(ctDNA)라 불리는 무세포 DNA를 검출할 필요가 있어, 높은 수율로 무세포 DNA를 회수하는 기술이 필요해진다.
현재, 일반적으로 행해지고 있는 핵산의 회수 방법으로는, 페놀·클로로포름 추출법, 에탄올 침전법 및 실리카로의 핵산 흡착법 등을 대표적인 방법으로 들 수 있다. 그 중에서도 가장 범용적인 방법은, 특허문헌 1에 기재되어 있는, 실리카를 포함하는 금속 산화물에 핵산을 흡착, 용출시켜 회수하는 Boom법이다. 이 방법은, 원심 조작에 의해 핵산이 흡착된 실리카로부터 핵산을 회수하는 동시에 핵산의 농축을 할 수 있는 특징이 있다.
특허문헌 2에는 Boom법을 바탕으로, 실리카에 대하여 무세포 DNA를 흡착시키는 기술이 기재되어 있다. 이것에 의하면, 페놀·클로로포름 추출을 산성 조건화에서 행하면, RNA는 수상으로, DNA는 클로로포름상으로 분리되고, 중성 조건에서 행하면, 수상으로 RNA와 DNA가 분배된다. 즉, 추출 용액의 조건을 바꿈으로써 취득하고 싶은 핵산을 선택적으로 추출할 수 있는 것으로 한다.
그러나, 이들 특허문헌 1, 특허문헌 2에 기재된 방법에서는, 핵산의 흡착 과정에 있어서 알코올 등의 유기 용매의 사용이 불가결하기 때문에, 용매 폐기의 문제가 있고, 회수 조작도 번잡하다. 또한, 단리한 핵산에 이들 유기 용매가 혼입되어, 그 후의 검출 반응에 영향을 미치는 문제도 있다.
또한, 특허문헌 3에는, 300염기쌍 이상 1000염기쌍 이하의 염기 길이를 갖는 핵산의 실리카에 대한 흡착성은, 그것보다 짧은 염기 길이를 갖는 핵산의 흡착성이 저하되는 것이 기재되어 있어, 더욱 짧은 무세포 DNA를 회수함에 있어서, 실리카를 사용한 방법은 적합하지 않을 것도 예상된다.
특허문헌 4 및 5에는, 무세포 DNA에 관한 기재는 없지만, 유기 용매를 이용하지 않는 핵산의 회수 방법이 기재되어 있다. 특허문헌 4에는, 알파 산화알루미늄 입자, 지르코니아 입자, 티타니아 입자 등에, 핵산을 흡착시켜, 효율적으로 회수하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 5에는, 이온 교환 크로마토그래피의 원리를 사용하여, 핵산을 흡착시켜, 회수하는 방법이 기재되어 있으며, 음이온 교환 재료로서 산화알루미늄을 이용할 수 있다고 나타나 있다.
특허문헌 6에는, 핵산을 용해시키는 용액에 의존하여, 알파 산화알루미늄 및 감마 산화알루미늄에 핵산을 견고하게 결합시키거나, 반대로 결합을 저지시키거나 할 수 있다고 기재되어 있다. 또한, 결합한 핵산은, 반복 세정해도 거의 용출되지 않는다고 기재되어 있다.
미국 특허 제5234809호 명세서 국제 공개 제2016/007755호 일본 특허 공표 제2011-522529호 공보 국제 공개 제92/18514호 공보 일본 특허 공표 제2013-505719호 공보 일본 특허 공표 제2005-505269호 공보 국제 공개 제2015/114641호 공보
본 발명자들은 무세포 DNA를 높은 수율로 회수하기 위해서, 산화알루미늄을 사용한 무세포 DNA의 회수 방법을 검토했다. 회수 방법의 검토에 있어서, 상기 특허문헌 4, 5에 기재된 산화알루미늄을 사용한 핵산의 회수 방법에 의해, 무세포 DNA의 회수가 가능한지를 검토했다. 그러나, 후술하는 비교예 1대로, 이들 방법에서는, 무세포 DNA를 회수할 수 없었다.
본 발명은 산화알루미늄을 사용하여 무세포 DNA를 높은 수율로 회수하는 방법을 확립하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 산화알루미늄의 표면에 수용성의 중성 중합체를 흡착시킴으로써, 무세포 DNA를 효율적으로 회수할 수 있음을 알아냈다.
본 발명의 구성은, 이하 (1) 내지 (9)이다.
(1) 체액 시료로부터 무세포 DNA를 회수하는 방법으로서, 이하의 공정:
공정 a) 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체와 상기 체액 시료를 혼합하고, 상기 담체에 무세포 DNA를 흡착시키는 공정,
공정 b) 공정 a)에 있어서 혼합한 혼합물로부터, 상기 무세포 DNA가 흡착된 담체를 분리하는 공정, 및
공정 c) 공정 b)에 있어서 분리한 상기 무세포 DNA가 흡착된 담체에 용출액을 첨가하여 무세포 DNA를 회수하는 공정
을 포함하는 무세포 DNA의 회수 방법.
(2) 상기 체액 시료가, 전혈, 혈청, 혈장, 소변 또는 타액인 (1)에 기재된 무세포 DNA의 회수 방법.
(3) 상기 수용성의 중성 중합체가, pH7의 용액 중에서 -10mV 이상 +10mV 이하의 제타 전위를 갖는 중합체인 (1) 또는 (2)에 기재된 무세포 DNA의 회수 방법.
(4) 상기 중합체가, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) 또는 히드록시프로필메틸셀룰로오스인 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 무세포 DNA의 회수 방법.
(5) 상기 용출액이 완충액인 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 무세포 DNA의 회수 방법.
(6) 상기 체액 시료를 단백질 변성제로 처리하는 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 무세포 DNA의 회수 방법.
(7) 상기 단백질 변성제가, 카오트로픽 염 또는 단백질 변성 효소인 (6)에 기재된 무세포 DNA의 회수 방법.
(8) 무세포 DNA의 유전자 서열을 해석하여, 암에 특이적인 유전자 변이를 검출하는 방법으로서, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 무세포 DNA의 회수 방법을 사용하여 피험자의 체액 시료로부터 무세포 DNA를 회수하는 공정, 및 당해 회수된 무세포 DNA로부터 암에 특이적인 유전자 변이를 검출하는 공정을 포함하는 유전자 변이의 검출 방법.
(9) 피험자 유래의 무세포 DNA양과, 암에 이환되어 있지 않은 검체 유래의 무세포 DNA양을 비교함으로써 암을 검출하는 방법으로서, (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 무세포 DNA의 회수 방법을 사용하여 피험자 및 암에 이환되어 있지 않은 검체의 체액 시료로부터 무세포 DNA를 회수하는 공정, 및 당해 회수된 피험자 유래의 무세포 DNA양과, 암에 이환되어 있지 않은 검체 유래의 무세포 DNA양을 비교하여 암을 검출하는 공정을 포함하는 암의 검출 방법.
본 발명의 무세포 DNA의 회수 방법에 의해, 소량의 시료로부터, 간편한 방법으로 무세포 DNA를 높은 수율로 회수하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 회수 방법에 의하면, 무세포 DNA를 높은 수율로 회수할 수 있으므로, 암에 특이적인 유전자 변이의 검출 감도나, 암의 검출 감도가 향상된다.
도 1은 본 발명의 무세포 DNA 회수 방법에 의해 회수된 무세포 DNA와 시판 무세포 DNA 회수 키트로 회수된 무세포 DNA의 전기 영동도.
본 발명의 무세포 DNA의 회수 방법으로 회수하는 무세포 DNA는, 체액 중에 누출된 정상 세포 유래의 cell-free normal DNA 및 종양 세포 유래의 cell-free tumor DNA(ctDNA)의 총칭이며, 본 명세서에서는 무세포 DNA라 기재한다.
무세포 DNA의 염기 길이는, 일반적으로 히스톤 1단위에 상당하는 166bp 정도이지만, 암이나, 기생충에 기생된 환자에서는, 특징적인 염기 길이의 무세포 DNA가 검출되는 경우가 있다. 예를 들어, 암 환자의 검체에는, 히스톤 1단위까지 분해가 진행되지 않고, 166bp의 단위가 몇개 연결된 332bp(166bp×2), 498bp(166bp×3), 664bp(166bp×4) 등의 염기 길이의 무세포 DNA도 포함되어 있다. 또한, 열대열 말라리아 원충에 기생된 환자의 경우, 혈청 중의 205bp 등의 염기 길이의 무세포 DNA가, 리슈마니아에 기생된 환자의 경우는 소변 중에 70bp 등의 염기 길이의 무세포 DNA를 누출하는 것이 알려져 있다(Trends in Parasitology, May 2016, Vo.32, No.5).
본 발명에서 회수하는 무세포 DNA의 염기 길이는 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 방법을 사용하면 500bp 이하의 무세포 DNA를 효율적으로 회수할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 체액 시료는, 무세포 DNA를 포함하는 임의의 체액 시료라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 타액 등을 이용할 수 있고, 바람직하게는 혈장 또는 혈청이다.
체액 시료는, 미처리인 채로 사용할 수도 있지만, 보다 수율 좋게 무세포 DNA를 회수하기 위해서, 단백질 변성제를 사용하여 처리한 것을 사용해도 된다.
본 발명에서 사용하는 단백질 변성제는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어SDS, 사루코실, CTAB 등의 계면 활성제, 세린프로테아제의 1종이며 넓은 절단 특이성을 갖는 ProteinaseK 등의 단백질 변성 효소, 염화구아니디늄, 구아니딘티오시안산염 및 요소 등의 카오트로픽 염, 그밖의 머캅토에탄올 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 단백질 변성제가 포함되는 시판되고 있는 완충액도 바람직하게 사용할 수 있고, 예를 들어 구아디닌티오시안산염 등을 포함하는 RLT 버퍼(퀴아젠 가부시키가이샤제)는, 카오트로픽 염의 단백질 변성제로서 바람직하게 사용할 수 있다. 이들의 단백질 변성제 중에서도 특히 카오트로픽 염 또는 단백질 변성 효소가 바람직하다.
또한, 단백질 변성제는, 1종류만 사용해도 되고, 복수 종류 조합해서 사용해도 된다. 단백질 변성제의 조합으로서는, 이하와 같은 처리를 들 수 있다. 예를 들어, 체액 시료에 대하여, 1％의 SDS를 첨가한 후, ProteinaseK를 첨가해 60℃ 20min 가온할 수 있다. 또한, 체액 시료에 대하여, 4M 이상의 염화구아니디늄, 구아니딘티오시안산염 또는 요소를 첨가한 후, 사루코실을 최종 농도 0.5％ 이상이 되도록 또는 머캅토에탄올을 최종 농도 50mM 이상의 농도가 되도록 첨가할 수 있다.
또한, 상기 조작에 있어서, 체액 시료에 포함되는 무세포 DNA의 분해를 억제하기 위해서, 핵산을 분해하는 효소의 저해제를 첨가해도 된다. 효소의 저해제는, 예를 들어 EDTA를 체액 시료에 대하여, 최종 농도 1mM 이하의 농도로 첨가할 수 있다. 또한, RNA 분해 효소의 저해제로서 시판되고 있는 "RNasin"(등록 상표) Plus Ribonuclease Inhibitor(프로메가 가부시키가이샤), Ribonuclease Inhibitor(다카라 바이오 가부시키가이샤), RNase inhibitor(도요보 가부시키가이샤) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 체액 시료는 필요에 따라 희석해도 된다. 희석하는 용액은 특별히 한정되지 않지만, 물이나 Tris-염산 완충액 등의 핵산을 포함하는 용액에 범용되는 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기에 예를 든 단백질 변성제를 포함하는 용액을 사용해도 된다. 단백질 변성제를 포함하는 용액으로 희석하는 경우에는, 예를 들어 4M 이상의 염화구아니디늄, 구아니딘티오시안산염 또는 요소로 희석할 수 있다.
본 발명은 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체를 사용함으로써 고수율인 무세포 DNA의 회수가 달성된다. 본 발명에 있어서, 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체란, 수용성의 중성 중합체가 입상의 산화알루미늄의 주위에 흡착된 담체이다. 이후, 본 발명의 담체라고 기재한다.
본 발명에 있어서, 담체에 무세포 DNA를 흡착시킨다는 것은 가역적으로 탈리 가능하게 되는 흡착을 가리킨다.
무세포 DNA를 정량할 때의 핵산량의 정량 방법으로는, 흡광도 측정, 형광 측정, 발광 측정, 전기 영동, PCR, 실시간 PCR, 디지털 PCR, 마이크로 어레이를 사용한 해석, 시퀀서를 사용한 해석 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 흡광도 측정에 의한 정량 방법은, 비수식의 핵산이면, 260㎚에 있어서의 흡광도를 측정함으로써 핵산량을 정량할 수 있다. 형광 측정에 의한 정량 방법은, 핵산에 형광 색소로 수식하고, 그 형광 색소에서 유래하는 형광 강도를 농도 기지의 용액에 있어서의 형광 강도와 비교함으로써 핵산량을 정량할 수 있다. 전기 영동에 의한 정량 방법은, 농도 기지의 샘플과 동시에 회수 조작을 행한 샘플을 영동하고, 겔을 염색하여 밴드의 농도를 화상 해석에 의해 비교함으로써 결정할 수 있다.
PCR은, polymerase chain reaction의 약자로 DNA 샘플 중에서 특정의 서열을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. PCR에서는 핵산의 증폭 반응 종료 후, 그의 산물량으로부터 핵산의 초기 농도를 구할 수 있다.
실시간 PCR은 정량적 실시간 PCR이라고도 불리며, PCR에 의한 증폭을 단시적으로 측정함으로써 증폭률에 기초하여 주형이 되는 DNA의 상대 정량을 행할 수 있다. 또한, 표준 샘플을 사용하여, 증폭률의 검량선을 작성하면, 절대량을 정량할 수도 있다. 증폭률은 증폭 사이클수(Cq값)로서 산출되어 값이 작을수록, 핵산량이 많은 것을 나타내고 있다.
디지털 PCR에서는, DNA 샘플을 미세한 구획 중에 분배해 PCR 반응을 행하고, 각 분획마다의 PCR 반응 후의 시그널양으로부터, 핵산량을 정량할 수 있다.
또한, 실시간 PCR에서는 적절하게 프라이머를 설계함으로써, 회수된 무세포 DNA의 염기 길이도 검출할 수 있다. 예를 들어, 하우스키핑 유전자로서 알려진 액틴-β의 임의의 서열을 증폭함으로써 무세포 DNA의 염기 길이를 검출할 수 있다. 예를 들어, 166bp의 무세포 DNA를 회수한 것을 확인하기 위해서는, 액틴-β 유전자 중 100bp 전후를 증폭시키는 프라이머를 사용할 수 있다(W. SUN 외, Therole of plasma cell-freeDNA detection in predicting operative chemoradiotherapy response in rectal cancer patients. ONCOLOGY REPORTS 31:1466-1472, 2014). 구체적으로는, 액틴-β 유전자 중 93bp의 염기 길이를 증폭시킬 수 있는 서열 번호 1 및 2의 프라이머를 사용하여, 회수된 무세포 DNA를 검출할 수 있다.
실시간 PCR에서는, 일반적으로 증폭 사이클수(Cq값)가 40 이상은 검출 한계 이하로 되어 있다.
본 발명에서 사용되는 중합체는 기본 단위인 단량체나 모노머라고 불리는 반복 단위가 다수 연결된 화합물의 총칭이다. 상기 중합체에는, 1종류의 단량체를 포함하는 단독중합체와 2종류 이상의 단량체를 포함하는 공중합체 모두가 포함되고, 임의의 중합도의 중합체를 사용할 수 있다. 또한, 상기 중합체에는 천연 중합체와 합성 중합체의 모두가 포함된다.
본 발명에서 사용되는 수용성의 중성 중합체는, 물에 대하여 용해 가능한 성질을 갖고, 물에 대한 용해도가 적어도 0.0001wt％ 이상인 중합체이며, 바람직하게는 0.001wt％ 이상, 보다 바람직하게는 0.01wt％ 이상, 더욱 바람직하게는 0.1wt％ 이상이다.
본 발명에서 사용되는 수용성의 중성 중합체는, 바람직하게는 pH7의 용액 중에서 제타 전위가 -10mV 이상 +10mV 이하인 중합체이다. 보다 바람직하게는 -8mV 이상 +8mV 이하이고, 더욱 바람직하게는 -6mV 이상 +6mV 이하, 특히 바람직하게는 -4.0mV 이상 +1.1mV 이하인 중합체이다.
제타 전위란, 용액 중에 있어서의 콜로이드 계면의 전기적 성질을 나타내는 값의 하나이다. 하전된 콜로이드가 용액에 분산되어 있으면, 콜로이드의 표면에서는 콜로이드의 표면 하전에 대한 반대 이온에 의해 전기 이중층이 형성되어 있다. 이때의 콜로이드 표면의 전위를 표면 전위라고 칭한다. 전기 이중층은, 콜로이드의 표면 전하의 정전 상호 작용에 의해 형성되어 있기 때문에, 콜로이드측일수록 이온이 강하게 고정되어 있다. 전기 이중층 중에서도 정전 상호 작용에 의해 반대 이온이 콜로이드 표면에 강하게 고정되어 있는 층을 고정층, 고정층의 전위를 고정 전위라고 칭한다. 용액에 대하여 콜로이드를 이동시키면 고정층은 콜로이드와 함께 이동한다. 이때, 콜로이드에서 보아 고정층보다도 외측에, 용액이 갖는 점성을 이유로 콜로이드와 함께 이동하는 경계면이 있다. 이것을 미끄럼면 또는 전단면이라고 칭한다. 콜로이드에서 충분히 떨어진 지점의 전위를 제로점으로 했을 때의, 이 미끄럼면의 전위는 제타 전위라고 정의되어 있다. 이와 같이, 제타 전위는 콜로이드의 표면 전하에 의존하여 변화하고, 표면 전하는 pH에 의존하는 프로톤의 착탈에 의해 변화하기 때문에, 본 발명에서는 pH7의 용액 중에서의 값을 기준으로 한다. 또한, 일반적으로 콜로이드의 사이즈와 비교하여 미끄럼면까지의 거리는 작으므로, 콜로이드의 표면을 미끄럼면으로 근사적으로 표현할 수도 있다. 본 발명에서 사용하는 수용성의 중성 중합체의 경우도 마찬가지로, 용액 중에 분산된 콜로이드의 표면 전위를 제타 전위로 간주할 수 있다.
본 발명에 있어서, 제타 전위의 측정은 오츠카 덴시 가부시키가이샤의 ELS-Z를 사용한 레이저·도플러 전기 영동법을 사용하여 측정한다. 레이저·도플러 전기 영동법은, 광이나 음파가 전기 영동에 의해 운동하고 있는 물체에 부딪혀, 산란또는 반사하면 그의 주파수가 변화하는 도플러 효과를 이용한 측정 방법이다.
중합체의 제타 전위를 측정하는 경우에는, 콜로이드 분산 용액으로서 중합체 용액을 제조하고, 제타 전위를 측정할 수 있다. 중합체를 예를 들어, 인산 완충액이나, 염화나트륨 용액, 시트르산 완충액 등의 전해질에 용해시켜서 중합체 용액을 조제하고, 용액 중에 분산된 중합체의 산란광이나, 반사광을 검출하여 측정을 행한다. 콜로이드의 사이즈가 클수록, 낮은 농도에서 산란광이나 반사광을 검출하는 것이 가능하게 된다.
중합체의 제타 전위를 레이저·도플러 법으로 측정하는 구체적인 조건은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 중합체의 농도를 1wt％ 이상 10wt％ 이하가 되도록 인산 완충액(10mM, pH7)에 용해하고, 이 용액을 측정용 셀에 넣고, 레이저·도플러 전기 영동법을 원리로 하는 제타 전위의 측정 장치에 설치하여 실온에서 측정할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 수용성의 중성 중합체로서는, 구체적으로는, 이하의 것을 들 수 있다. 예를 들어, 폴리비닐알코올 또는 폴리비닐피롤리돈 등의 폴리비닐계 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 또는 폴리(N-(히드록시메틸)아크릴아미드 등의 폴리아크릴아미드계 중합체, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 또는 폴리테트라메틸렌에테르글리콜 등의 폴리알킬렌글리콜계의 중합체, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), (히드록시프로필)메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 2-히드록시에틸셀룰로오스 또는 히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기의 중합체가 포함되는 공중합체도 사용할 수 있다.
또한, 피콜, 아가로오스, 키틴 및 덱스트란 등의 폴리사카라이드 또는 폴리사카라이드 유사체 및 알부민 등의 단백질이나 펩티드도 본 발명의 수용성 중성 중합체에 포함된다.
수용성의 중성 중합체의 관능기 일부를 이온화시키거나, 양성이나 음성을 나타내는 관능기로 치환하거나, 측쇄에 아세틸기 등 수용성을 발현하는 관능기를 도입해도 된다.
본 발명에 있어서, 수용성의 중성 중합체의 분자량으로는, 예를 들어 0.4kD 이상의 중합체를 바람직하게 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 6kD 이상이다.
본 발명에서 사용하는 산화알루미늄은, Al2O3의 조성식으로 표시되는 양성 산화물이며, 알루미나라고도 불린다.
산화알루미늄은, 천연으로 산출하는 것을 사용해도 되고, 공업적으로 제조한 것을 사용해도 된다. 산화알루미늄을 제조하는 방법으로는, 예를 들어 깁사이트를 출발 원료로 하는 바이어법, 알콕시드법, 중화법 또는 오일 액적법 등의 베마이트 형태의 수산화물을 경유하는 방법(졸겔법이라고도 불림), 알루미늄염 열분해법 또는 양극 산화법 등을 들 수 있다.
공업적으로 제조한 산화알루미늄은, 시약 메이커나, 촉매 화학 메이커, 일반 사단 법인 촉매 학회의 참조 촉매부회 등으로부터 입수할 수 있다.
산화알루미늄은, 그것들이 갖는 결정 구조에 의해, 알파 산화알루미늄, 로 산화알루미늄, 카이 산화알루미늄, 카파 산화알루미늄, 에타 산화알루미늄, 감마 산화알루미늄, 델타 산화알루미늄, 세타 산화알루미늄 등으로 분류된다. 본 발명에서는, 고 비표면적을 갖는 감마 산화알루미늄이 바람직하다.
또한 산화알루미늄은, 제작 시의 소성 온도에 따라, 산점(Al+, Al-OH2 +)과 염기점(Al-O-)이 변화한다. 산화알루미늄은 이 산점과 염기점의 수에 따라, 산점이 많으면 산성 알루미나, 염기점이 많으면 염기성 알루미나, 산점과 염기점이 동일한 정도의 중성 알루미나가 된다. 이 특성의 차이는, pH 지시약인 BTB 용액을 첨가함으로써 확인할 수 있다. BTB 용액을 첨가하여, 산화알루미늄이 황색으로 정색하면 산성 알루미나, 녹색으로 정색하면 중성 알루미나, 청색으로 정색하면 염기성 알루미나인 것을 확인할 수 있다. 이러한 특성상의 차이가 있지만, 본 발명에 있어서는, 어느쪽의 산화알루미늄도 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 산화알루미늄은, 입상인 것이 좋다. 입경은 정렬되어 있어도, 다른 입경을 혼합하여 이용해도 된다. 입경은, 예를 들어 212㎛ 미만의 산화알루미늄을 바람직하게 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 100㎛ 미만의 산화알루미늄을 사용할 수 있다.
입경은, 본 발명에서는 일본 공업 규격에 규격하는 JISZ-8801-1:2006에 기초한 체 눈 크기의 치수로 정의한다. 예를 들어, 상기 JIS 표준에 의한 눈 크기로 하여 40㎛의 체를 통과하고, 32㎛의 체를 통과할 수 없는 입자는, 32㎛ 이상 40㎛ 미만의 입경이 된다.
본 발명에서 사용하는 용출액은, 본 발명의 담체에 흡착된 무세포 DNA를 용출시킬 수 있으면, 특별히 한정되지 않지만, 완충액이 바람직하고, 완충액에는 킬레이트제가 포함되어 있어도 된다. 구체적으로는, 시트르산과 시트르산나트륨을 포함하는 시트르산 완충액, 인산과 인산나트륨을 포함하는 인산 완충액이나, 트리스히드록시메틸아미노메탄과 염산을 포함하는 Tris-염산 완충액에 EDTA를 첨가한 Tris-EDTA 완충액 등을 들 수 있다.
완충액의 pH는 pH4 이상 pH9 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는, pH5 이상 pH8 이하이다.
본 발명에서 사용하는 완충액은, 이하와 같이 조제할 수 있다. 예를 들어, 0.5M의 인산 완충액(pH7)의 조제는, 이하와 같다. 0.5M의 인산수소이나트륨 수용액과 0.5M의 인산이수소나트륨을 조제한다. 0.5M의 인산수소이나트륨 수용액에 대하여, pH를 측정하면서 인산이수소나트륨 용액을 첨가하고, pH7이 된 곳에서 첨가를 멈춘다. 마찬가지의 방법으로, 다른 pH의 완충액도 조제할 수 있다.
완충액에 포함되는 킬레이트제는, 복수의 배위좌를 갖는 배위자를 갖고 있고, 금속 이온에 결합하여, 착체를 형성하는 물질을 사용할 수 있다.
구체적인 킬레이트제로서는, 에틸렌디아민사아세트산(EDTA), 니트릴로삼아세트산(NTA), 글리콜에테르디아민사아세트산(EGTA), 폴리인산, 메타인산 및/또는 그들의 염 등을 들 수 있다. 킬레이트제의 최종 농도는 특별히 한정되지 않지만, 50mM 이상이면 되고, 바람직하게는 100mM 이상, 더욱 바람직하게는 500mM 이상이다.
또한, 상기 이외의 킬레이트제가 되는 화합물로서, 음이온성의 중합체를 들 수 있다. 카르복실산을 측쇄에 갖는 중합체는 금속 이온을 배위하기 위해서, 이들이 완충액에 포함되어 있어도 된다. 이러한 기능을 갖는 중합체로서, 폴리비닐술폰산 및/또는 그들의 염을 들 수 있다. 그의 최종 농도는 특별히 한정되지 않지만, 1wt％ 이상이면 되고, 바람직하게는 10wt％ 이상이다.
본 발명은 체액 시료로부터 무세포 DNA를 회수하는 방법으로서, 공정 a) 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체와 체액 시료를 혼합하고, 담체에 무세포 DNA를 흡착시키는 공정, 공정 b) 공정 a)에 있어서 혼합한 혼합물로부터, 상기 무세포 DNA가 흡착된 담체를 분리하는 공정, 공정 c) 공정 b)에 있어서 상기 무세포 DNA가 흡착된 담체에 용출액을 첨가하여 무세포 DNA를 회수하는 공정을 포함한다. 이하, 각각의 공정에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용하는 담체는, 산화알루미늄의 표면에 수용성의 중성 중합체를 흡착시킴으로써 제조한다. 중합체에 의한 표면의 피복률은 7％ 이상이면 되고, 40％ 이상인 것이 바람직하다. 또한, 수용성의 중성 중합체는 균일한 두께로 흡착하고 있지 않아도 된다.
본 발명에 있어서, 중합체에 의한 산화알루미늄의 피복률은, 표면 전위 현미경(별칭 켈빈 프로브 포스 현미경; KFM)에 의해 취득한 전위 분포도를 해석함으로써 산출한다. 표면 전위 현미경은 예를 들어, Bruker AXS사의 Digital Instruments제의 Nano Scope Iva AFM Dimension 3100 스테이지 AFM 시스템 등을 이용할 수 있다.
표면 전위 현미경으로부터 표면 피복률을 산출하는 데 있어서, 측정의 시야 스케일은, 0.5㎛×1㎛의 범위에서 행한다. 표면 피복률의 산출 방법은, 먼저 산화알루미늄의 표면 전위 화상을 취득하여 시야 내의 평균 전위를 구한다. 다음으로 수용성의 중성 중합체의 표면 전위 화상을 취득하여 시야 내의 평균 전위를 구한다. 그리고, 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 표면 전위 화상을 취득하여 시야 내의 평균 전위를 구한다. 산화알루미늄만의 피복률을 0％, 수용성의 중성 중합체만의 피복률을 100％로 하고, 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 평균 전위와 수용성의 중성 중합체의 평균 전위의 비를 취함으로써, 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 표면 피복률을 산출한다. 표면 피복률을 구하는 데 있어서, 사용하는 시야 내의 평균 전위는, 본 발명의 단체(單體) 입자를 랜덤하게 3개 선택하여, 각각의 측정값의 평균값을 사용한다.
또한, 표면 피복률을 산출할 때의 화상 해석 소프트웨어로서, Adobe사의 Photoshop 등을 사용할 수 있다. 이 경우, 화상 해석에 있어서, 산화알루미늄의 표면 전위의 평균값을 스케일 하단, 수용성의 중성 중합체의 표면 전위의 평균값을 스케일 상단으로 하고, 하단의 색을 흑색(8bit, RGB값 0), 상단의 색을 적색(R값 255) 또는 녹색(G값 255) 또는 청색(B값 255) 등으로 설정한다. 설정한 스케일로 수용성의 중성 중합체가 흡착된 산화알루미늄의 표면 전위 화상을 표시하고, R값 또는 G값 또는 B값 중 어느 하나의 값을 255로 나누어, 그 비를 표면 피복률로 한다.
수용성의 중성 중합체를 표면에 흡착시키는 전단계로서, 미리 산화알루미늄을 물이나 에탄올 등의 용액으로 세정하여, 표면에 흡착되어 있는 불순물을 제거해 두어도 되고, 본 세정 조작을 생략해도 된다.
수용성의 중성 중합체를 산화알루미늄에 흡착시키는 방법은, 예를 들어 수용성의 중성 중합체를 용해시켜 중합체 용액을 조제하고, 산화알루미늄에 접촉시키는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는, 중합체 용액에 산화알루미늄을 침지시키거나, 중합체 용액을 산화알루미늄에 적하하거나, 중합체 용액을 산화알루미늄에 도포하거나, 중합체 용액을 안개 상태로 하여 산화알루미늄에 분사하거나 할 수 있다.
중합체 용액에, 산화알루미늄을 침지시키는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 피펫팅, 전도 혼합, 교반기, 믹서, 볼텍스, 밀 등의 분산기나 초음파 처리 장치 등으로 교반해도 된다.
수용성의 중성 중합체 농도는 특별히 한정되지 않지만, 0.01wt％ 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 0.1wt％ 이상이다.
교반할 때의 혼합 시간은, 중합체와 산화알루미늄이 균일하게 혼합되면, 특히 혼합 시간은 한정되지는 않지만, 볼텍스의 경우 1분 이상, 바람직하게는 5분 이상 교반하는 것이 바람직하다.
또한, 체나, 소쿠리 등을 사용하여 딥 코팅할 수도 있다. 용액에 침지할 때의 혼합 시간은, 0.1wt％ 이상의 중합체 농도라면 5분 이상이면 되고, 30분 이상인 것이 바람직하다.
중합체 용액을 적하하는 경우에는, 스포이트, 적하 깔때기, 등을 사용할 수 있다. 중합체 용액을 적하할 때에는, 산화알루미늄을 진동시키거나, 회전시키거나해도 되고, 스핀 코터 등을 사용해도 된다.
중합체 용액을 도포하는 경우에는, 솔, 롤러, 와이어 바를 사용할 수 있다.
중합체 용액을 안개 상태로 하여 분사하는 경우에는, 에어 스프레이나 에어 브러쉬 등을 사용할 수 있다.
상기에 예시한 방법에서, 산화알루미늄에 수용성의 중성 중합체를 흡착시킨 후에는 여분의 중합체 용액을 원심 분리 등에 의해 제거해도 되고, 제거하지 않고 그대로 무세포 DNA의 회수에 사용해도 된다. 또한, 중합체 용액을 용매에 용해시키고 있는 경우, 산화알루미늄에 수용성의 중성 중합체를 흡착시킨 후, 건조시켜 용매를 제거해도 되고, 건조시키지 않고 무세포 DNA의 회수에 사용해도 된다.
얻어진 본 발명의 담체는, 제작하여 보존해 둔 것을 사용해도 되고, 사용 시 제조하여 사용해도 된다.
중합체 용액은, 입수한 중합체가 고체라면 물이나 유기 용매에 용해함으로써 조제할 수 있고, 용액이라면 희석함으로써 조제할 수 있다. 중합체가 용해되기 어려운 경우나, 용액의 점도가 높아 혼합하기 어려운 경우, 가열 처리나 초음파 처리를 행해도 된다. 유기 용매는, 예를 들어 에탄올, 아세토니트릴, 메탄올, 프로판올, tert-부탄올, DMF, DMSO, 아세톤, 에틸렌글리콜, 글리세롤 등, 물과 쌍용성이 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 물에 용해되기 어려운 경우에는, 상기 유기 용매를 첨가해도 된다.
산화알루미늄과 수용성의 중성 중합체를, 링커 분자 등에 의해 공유 결합시켜서 제조한 담체는, 본 발명의 담체에 해당하지 않는다. 구체적인 링커 분자에는 실란 커플링제 등을 들 수 있다.
이후, 본 발명을 공정마다 설명한다.
공정 a)는, 상기 제작 방법에 의해 제작한 산화알루미늄의 표면에 수용성의 중성 중합체가 흡착된 담체(본 명세서 중에서는, 본 발명의 담체라고 기재함)와, 체액 시료를 혼합하고, 본 발명의 담체에 무세포 DNA를 흡착시키는 공정이다. 본 발명의 담체와 체액 시료의 혼합 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 피펫팅이나 전도 혼합에 의해 행해도 되고, 믹서, 볼텍스 등의 장치를 사용해도 된다. 혼합 시간은, 특별히 한정되지 않지만, 5분 정도이면 되고, 그 이상의 시간 혼합해도 된다. 또한, 본 발명의 담체를 칼럼에 충전하고, 체액 시료를 통과시켜도 된다. 또한, 본 발명의 담체와 체액 시료를 혼합할 때에 단백질 변성제를 첨가해도 된다. 단백질 변성제는, 공정 a)의 전단계로서, 미리 체액 시료에 첨가해 둘 수도 있다.
공정 b)는, 공정 a)에 있어서 혼합한 혼합물로부터, 상기 무세포 DNA가 흡착된 담체를 분리하는 공정이다. 분리의 방법으로는, 공정 a)에서 얻어지는 혼합물을 원심 분리하고, 무세포 DNA가 흡착된 담체를 침전시키고, 상청을 제거한 방법을 들 수 있다. 무세포 DNA가 흡착된 담체의 비중은 물보다 무겁기 때문에, 원심 조작에 의해 용이하게 침전시킬 수 있다. 원심 분리의 조건은, 6000G로 1분간 처리하면 되며, 10000G로 1분간 처리하는 것이 보다 바람직하다. 다른 분리 방법으로는, 한외 여과막을 사용하는 방법을 들 수 있다. 무세포 DNA가 흡착된 담체의 입경보다 작은 구멍 직경을 갖는 한외 여과막에 대하여, 공정 a)에서 얻어진 혼합물을 통과시켜, 담체를 분리한다. 이러한 한외 여과막은 키트화되어 있고, 메르크 가부시키가이샤의 울트라 프리(등록 상표)나 Pall Corporation의 나노셉(등록 상표)으로 대표되는 원심 여과 키트를 입수하여 이용할 수 있다.
또한, 공정 b)의 조작 후에, 필요에 따라 이하와 같은 처리를 해도 된다. 이것은, 본 발명의 담체 표면에 목적이 되는 무세포 DNA 이외의 생물학적 시료 유래물이 흡착되어 있을 가능성이 있기 때문이다. 예를 들어, 보다 고순도로 무세포 DNA를 단리하기 위해서, 세정이나 분해의 처리를 행할 수 있다. 구체적으로는, 비특이적으로 흡착된 화합물을 제거하기 위해서 물로 세정하는, 비특이적으로 흡착된 단백질을 제거하기 위해서 계면 활성제로 세정하는, 이온이나 저분자 화합물을 제거하기 위해서 계면 활성제를 포함하는 용액으로 세정하는, 비특이적으로 흡착된 소수성 화합물을 제거하기 위해서 유기 용매로 세정하는, 비특이적으로 흡착된 단백질을 분해하기 위해서 단백질 분해 효소를 첨가하는, DNA만을 단리하기 위해서 RNA 분해 효소를 첨가하는 그리고 RNA만을 단리하기 위해서 DNA 분해 효소를 첨가하는, 등의 다양한 처리를 할 수 있다.
공정 c)는, 공정 b)에 있어서 분리한 상기 무세포 DNA가 흡착된 담체에 용출액을 첨가하여 무세포 DNA를 회수하는 공정이다. 무세포 DNA가 흡착된 담체에 용출액을 추가하여, 흡착되어 있는 무세포 DNA를 용출액 중에 용출시켜, 무세포 DNA를 회수하는 공정이다.
공정 c)에 있어서, 본 발명의 담체와, 무세포 DNA를 용출시킨 용액을 분리하는 방법으로는, 공정 c)에 있어서, 무세포 DNA가 흡착된 담체에 용출액을 첨가하여 얻어진 혼합물을 원심 분리하고, 본 발명의 담체를 침전시켜, 무세포 DNA가 용출하고 있는 상청을 취득하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 담체의 비중은 물보다 무겁기 때문에, 원심 조작에 의해 용이하게 침전시킬 수 있다. 원심 분리의 조건은, 6000G로 1분간 처리하면 되며, 10000G로 1분간 처리하는 것이 바람직하다.
다른 분리 방법으로는, 한외 여과막을 사용하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 담체 입경보다 작은 구멍 직경을 갖는 한외 여과막에 대하여, 공정 c)에 있어서 얻어진 혼합물을 통과시켜, 본 발명의 담체를 분리한다. 이러한 한외 여과막은 키트화되어 있고, 메르크 가부시키가이샤의 울트라 프리(등록 상표)나 Pall Corporation의 나노셉(등록 상표)으로 대표되는 원심 여과 키트를 입수하여 이용할 수 있다.
회수된 무세포 DNA는, 필요에 따라, 화학 수식을 행할 수 있다. 화학 수식에는, 무세포 DNA의 말단에 대한 형광 색소 수식, 소광제 수식, 비오틴 수식, 아미노화, 카르복실화, 말레인이미드화, 숙신이미드화, 인산화 및 탈인산화 등을 들 수 있고, 이외에는 인터칼레이터에 의한 염색을 들 수 있다. 이들의 수식은 화학 반응에 의해 도입되어도 되고, 효소 반응에 의해 도입되어도 된다. 상기 정량 전에 이들의 수식기를 도입하여, 회수된 무세포 DNA 자신을 정량하는 것은 아니고, 화학 수식을 거쳐서 도입된 수식기를 정량함으로써, 간접적으로 무세포 DNA를 정량할 수 있다.
본 발명의 무세포 DNA의 회수 방법을 사용하여 회수된 무세포 DNA를 사용하여, 암에 특이적인 유전자 변이를 검출하거나, 암을 검출하거나 할 수 있다. 이후, 이들 검출에 대하여 설명한다.
본 발명의 무세포 DNA의 회수 방법을 사용하여 피험자의 체액 시료로부터 무세포 DNA를 회수하고, 무세포 DNA의 유전자 서열을 해석하고, 암에 특이적인 유전자 변이를 검출할 수 있다. 검출 대상이 되는 암과, 그 암으로 변이가 인정되는 유전자 서열은, 예를 들어 "Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer" 등의 데이터베이스(http: //cancer.sanger.ac.uk/cosmic)에 보고되어 있는 암과, 서열로부터 선택할 수 있다. 구체적으로는, 이하의 유전자를 예로 들 수 있다.
폐암으로 변이가 인정되는 유전자로서, AKT1, ALK, APC, ATM, BAI3, BAP1, BRAF, CDKN2A, EGFR, EPHA5, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, GRM8, KDR, KEAP1, KIT, KMT2D, KRAS, LRP1B, MDM2, MET, MLH1, MUC16, MYC, NF1, NFE2L2, NOTCH1, PDGFRA, PIK3CA, PIK3CG, PKHD1, PTEN, RARB, RB1, RET, ROS1, RUNX1T1, SMAD4, SMARCA4, SOX2, STK11, TP53 등의 유전자를 들 수 있다.
유방암으로 변이가 인정되는 유전자로서, ACVR1B, AKT1, ATM, BAP1, BRCA1, BRCA2, CBFB, CDH1, CDKN2A, EGFR, EP300, ERBB2, ERBB3, ESR1, EXOC2, EXT2, FBXO32, FGFR1, FGFR2, GATA3, IRAK4, ITCH, KMT2C, MAP2K4, MAP3K1, MDM2, MUC16, MYC, NCOR1, NEK2, PBRM1, PCGF2, PIK3CA, PIK3R1, PPM1L, PTEN, PTGFR, RB1, RET, SEPT9, TP53, TRAF5, WEE1, ZBED4 등의 유전자를 들 수 있다.
대장암으로 변이가 인정되는 유전자로서, ACVR1B, AKT1, APC, ATM, ATP6V0D2, BAX, BRAF, CASP8, CDC27, CTNNB1, DCC, DMD, EP300, ERBB2, FBXW7, FZD3, GPC6, KRAS, MAP2K4, MAP7, MIER3, MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, MYO1B, NRAS, PIK3CA, PIK3R1, PTPN12, SLC9A9, SMAD2, SMAD4, TCERG1, TCF7L2, TGFBR2, TP53, WBSCR17 등의 유전자를 들 수 있다.
골수증식성 종양으로 변이가 인정되는 유전자로서, ABL1, ASXL1, ATRX, BCOR, BCORL1, CBL, CBLB, DAXX, DNMT3A, EED, ETV6, EZH2, FLT3, GATA1, GNAS, IDH1, IDH2, IKZF1, JAK1, JAK2, JAK3, KAT6A, KIT, KMT2A, KRAS, MPL, NF1, NPM1, NRAS, PHF6, PRPF40B, PTPN11, RAD21, RB1, RUNX1, SETBP1, SF1, SF3A1, SF3B1, SH2B3, SMC1A, SMC3, STAG2, SUZ12, TET2, TP53, U2AF1, U2AF2, WT1, ZRSR2 등의 유전자를 들 수 있다.
간암으로 변이가 인정되는 유전자로서, ALB, AMPH, APC, ARID1A, ARID2, ATM, AXIN1, BAZ2B, BRAF, CCDC178, CDKN2A, CSMD3, CTNNB1, DSE, ELMO1, ERBB2, ERRFI1, GXYLT1, HNF1A, IGF2R, IGSF10, KEAP1, KRAS, MET, OTOP1, PIK3CA, SAMD9L, TP53, UBR3, USP25, WWP1, ZIC3, ZNF226 등의 유전자를 들 수 있다.
난소암으로 변이가 인정되는 유전자로서, AKT1, ARID1A, BRAF, BRCA1, BRCA2, CBLC, CCNE1, CDK12, CDKN2A, CSMD3, CTNNB1, CUBN, EGFR, ERBB2, FAT3, GABRA6, KIT, KRAS, KREMEN1, MAS1L, MLH1, MSH2, NF1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PIK3R1, PPP2R1A, PTEN, RB1, TP53, USP16 등의 유전자를 들 수 있다.
전립선암으로 변이가 인정되는 유전자로서, AKAP9, APC, AR, CDK12, CDKN1B, CDKN2A, GLI1, IKZF4, KDM4B, KLF6, KMT2D, MED12, MYC, NCOA2, NIPA2, NKX3-1, NRCAM, OR5L1, PDZRN3, PIK3CA, PTEN, RB1, SCN11A, SPOP, SYNE3, TBX20, TFG, THSD7B, TP53, ZFHX3, ZNF473, ZNF595 등의 유전자를 들 수 있다.
위암으로 변이가 인정되는 유전자로서, APC, ATP4A, BAI3, BRCA2, CCNE1, CDH1, CTNNB1, DCC, ERBB2, FBXW7, FGFR2, GPR78, LPAR2, LRP1B, LRRK2, MET, MYC, NOTCH1, PIK3CA, PRKDC, RET, S1PR2, SPEG, SSTR1, STK11, TP53, TRIO, TRRAP, WNK2 등의 유전자를 들 수 있다.
이들 유전자 변이의 검출 방법으로서, 기존의 핵산 검출 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 대상이 되는 유전자 변이를 선택하고, 대상이 되는 유전자의 유전자 변이를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 사용하여 PCR, 실시간 PCR, 디지털 PCR, 시퀀서, 마이크로 어레이 등의 핵산 검출 장치를 사용하여 검출한다. 유전자 변이의 유무는, 각 검출법에 있어서의 네거티브 컨트롤 측정값보다도 유의미하게 높은 시그널이 측정된 경우에, 유전자 변이가 있다고 판정할 수 있다. 보다 바람직하게는, 유전자 변이가 존재하지 않는 것이 미리 판명되어 있는 검체와 피험자의 검체에 대하여 마찬가지의 방법으로 유전자 변이를 측정하고, 유전자 변이가 존재하지 않는 것이 미리 판명되어 있는 검체로부터 얻어진 측정값과, 피험자의 검체로부터 얻어진 측정값 사이에 통계학적으로 유의한 차가 있는 경우이며, 피험자의 검체로부터 얻어진 측정값의 쪽이 높은 경우에 대상 유전자의 변이가 있는 것으로 검출되었다고 판정한다.
또한, 본 발명의 무세포 DNA의 회수 방법을 사용하여 피험자 및 암에 이환되어 있지 않은 검체의 체액 시료로부터 무세포 DNA를 회수하고, 피험자 유래의 무세포 DNA양과, 암에 이환되어 있지 않은 검체 유래의 무세포 DNA양을 비교함으로써 암을 검출할 수 있다. 구체적으로는, 피험자 유래의 무세포 DNA양과, 암에 이환되어 있지 않은 검체 유래의 무세포 DNA양을 비교하여, 피험자 유래의 무세포 DNA양이, 암에 이환되어 있지 않은 검체 유래의 무세포 DNA양보다도 많은 경우에, 피험자의 검체로부터 암이 검출되었다고 판정할 수 있다. 바람직하게는, 피험자 유래의 무세포 DNA양과, 암에 이환되어 있지 않은 검체 유래의 무세포 DNA양 사이에 통계학적으로 유의한 차가 있는 경우이며, 피험자 유래의 무세포 DNA양의 쪽이 많은 경우에 암이 검출되었다고 판정할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 암에 이환되어 있지 않은 검체란, 악성 종양이 있는 것을 임상적으로 진단되거나, 병리 검사로 확인되기도 했던 기왕이 없는 인간 유래의 검체이다. 암에 이환되어 있지 않은 검체의 신체적 조건은, 피험자와 동일하거나 또는 근사한 것이 바람직하다. 신체적 조건이란, 예를 들어 인종 등이 해당된다.
또한, 피험자와 암에 이환되어 있지 않은 검체의 체액 시료의 종류는, 동종의 체액 시료를 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 피험자의 검체가 혈장인 경우, 암에 이환되어 있지 않은 검체도 혈장을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 피험자의 검체가 혈청인 경우는, 암에 이환되어 있지 않은 검체도 혈청을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 암에 이환되어 있지 않은 검체는, 단수여도 복수여도 된다. 암에 이환되어 있지 않은 검체를 복수 이용하는 경우에는, 무세포 DNA양은 평균값, 열외값을 제외한 평균값 또는 중앙값 등을 사용할 수 있다.
회수된 무세포 DNA양을 정량하는 방법은, 핵산량의 정량 방법으로 상기에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
이 경우, 정량 대상이 되는 무세포 DNA의 염기 길이는, 특별히 한정되지 않지만, 100bp보다 긴 염기 길이의 무세포 DNA가 바람직하고, 300bp 이상의 염기 길이의 무세포 DNA가 보다 바람직하다. 또한, 정량 대상의 유전자 서열은, 무세포 DNA에 포함되는 서열이면 특별히 한정되지 않고 예를 들어 ACTB나 GAPDH 등의 하우스키핑 유전자여도 되고, 암 특징적인 유전자여도 된다. 암에 이환되어 있지 않은 검체와 피험자의 무세포 DNA양은, 동일한 방법으로 측정된 값을 이용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, 「통계학적으로 유의한 차」란, 예를 들어 컨트롤 군의 95％ 신뢰 하한 구간을 베이스 라인으로 설정하고, 피험자의 측정값이 당해 베이스 라인에 달하는지를 판정할 수 있다. 또한, 얻어진 값의 위험율(유의 수준)이 작은 경우, 구체적으로는, p<0.05, p<0.01 또는 p<0.001의 경우를 들 수 있다. 여기서, 위험율인 「p」 또는 「p값」이란, 통계학적 검정에 있어서, 통계량이 가정한 분포 중에서, 가정이 우연히 정확해질 확률을 나타낸다. 따라서 「p」 또는 「p값」이 작을수록, 가정이 실제로 가까운 것을 의미한다. 통계학적 처리의 검정 방법은, 유의성의 유무를 판단 가능한 공지된 검정 방법을 적절히 사용하면 되며, 특별히 한정하지 않는다. 예를 들어, 스튜던트 t검정법, 다중 비교 검정법을 사용할 수 있다.
실시예
본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.
<재료와 방법>
폴리에틸렌글리콜은 메르크 가부시키가이샤에서, 염기성의 감마 산화알루미늄(N613N)은 닛키 쇼쿠바이 가세이 가부시키가이샤에서 구입했다. 실시예 중에서 사용한 중합체 수용액은 각각의 농도가 되도록 물로 용해시켰다. 또한, 실시예 중에서 특별히 언급하지 않는 한, 감마 산화알루미늄은 염기성의 것을 사용했다. 산화알루미늄은, 체 분류 등 하지 않고 구입한 채 실험에 사용했다.
변성제로서는, 퀴아젠 가부시키가이샤로부터 QIAGEN PtoreinaseK 및 RLT를, 요소는 와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤로부터 구입했다.
또한, 전기 영동에서 사용한 20bp DNA ladder는 다카라 바이오 가부시키가이샤에서, 아크릴아미드겔 NOVEX-TBE-Gells 8％ 15well과 DNA 염색제 SYBR-Gold Nucleic Acid Gel Stain을 서모 피셔 사이언티픽 가부시키가이샤로부터 구입했다. 실시간 PCR 측정에는, 다카라 바이오 가부시키가이샤의 SYBR(등록 상표) Premix Ex TaqII를 사용했다. 무세포 DNA를 검출하기 위해서, 액틴-β의 유전자 서열 중 93bp분의 염기 길이(ACTIN93)를 증폭시키기 위한 프라이머로서, 서열 번호 1 및 2를 사용했다. 또한, 무세포 DNA양에 의한 암의 검출에는, 액틴-β의 유전자 서열 중 306bp분의 염기 길이를 증폭시키기 위한 프라이머로서, 서열 번호 1 및 3을 사용했다. 프라이머는 Prime PCR Assays, Panels, and Controls Instruction Manual(바이오·래드·래브러토리즈 가부시키가이샤)의 기재를 바탕으로 설계하고, 유로핀 제노믹스 가부시키가이샤로부터 구입하며, 특별히 정제하지 않고 그대로 사용했다. 그 밖의 시약에 대해서는, 와코 준야쿠 가부시키가이샤, 도쿄 카세이 가부시키가이샤, 시그마 알드리치 재팬 고도 가이샤로부터 구입하고, 특별히 정제하지 않고 그대로 사용했다.
볼텍스는 도쿄 리카 기카이 가부시키가이샤의 CUTE MIXER CM-1000을, 제타 전위의 측정에는 오츠카 덴시 가부시키가이샤의 ELS-Z를 사용했다. 전기 영동은 미니겔스 라브 전기 영동 장치(애즈원 가부시키가이샤)를 사용했다. 서멀 사이클러는 다카라 바이오 가부시키가이샤의 PCR Thermal Cycler SPTP-400을, 실시간 PCR은 바이오래드사의 CFX96-Real Time System을 사용했다. 체는 애즈원 가부시키가이샤의 MVS-1을 사용했다. 염색한 겔은 GE 헬스케어 재팬 가부시키가이샤의 TyphoonFLA9500을 사용하여 해석했다. 겔의 화상 해석은, Molecular Dynamics사의 ImageQuantTL(등록 상표)을 사용했다.
또한, 실시간 PCR에서 무세포 DNA를 정량했을 때는, 실시간 PCR의 결과, 증폭 사이클수(Cq값)가 35 이하인 경우에, 무세포 DNA를 회수할 수 있다고 판정했다. 또한, 40 이상의 경우는, 측정 하한 이하가 되기 때문에, N.D라고 기재한다.
체액 시료로서는, 암에 이환되어 있지 않은 검체로서는, Tennessee Blood Services사에서 구입한 복수인 유래의 혼합 혈장, CureLine사에서 입수한 암에 이환되어 있지 않은 여성 및 남성 유래의 혈장을 사용했다. 암에 이환되어 있는 검체로서는, CureLine사에서 입수한 암 환자의 혈장을 사용했다.
<비교예 1> 중합체 코팅하지 않은 산화알루미늄 담체를 사용한 무세포 DNA 회수
특허문헌 4(실시예 4, 표 2)에 기재된 산화알루미늄 A와 조성이 가까운 염기성의 감마 산화알루미늄(N613N: 닛키 쇼쿠바이 가세이 가부시키가이샤)을 사용하여, 무세포 DNA를 효율적으로 회수할 수 있을지를 검토했다. 체액 시료로서는, Tennessee Blood Services사에서 구입한 복수인 유래의 혼합 혈장을 사용했다. 산화알루미늄에 흡착시킨 무세포 DNA를 용출시키는 용출액으로서, 특허문헌 4, 5에, 인산 완충액, 또는 Tris-EDTA 완충액을 용출액으로서 이용할 수 있음이 기재되어 있고, 특허문헌 6에는, 인산 용액이 핵산과 산화알루미늄과의 결합을 저해하는 취지가 기재되어 있기 때문에, 인산 완충액(0.5M, pH7)을 용출액으로서, 이하의 실험을 행했다.
1.5mL 튜브에 0.5㎎씩 감마 산화알루미늄을 측량했다. 거기에 에탄올 400μL 첨가하고, 볼텍스로 교반하고, 원심기에서 원심(10000G, 1min)하여 상청을 제거했다. 이 조작을 다시 반복하고, 에탄올에 의해, 비즈 표면의 티끌 등을 제거했다.
세정을 종료한 감마 산화알루미늄에 혈장 300μL를 첨가하고, 15분간 볼텍스로 교반했다. 원심기에서 원심(10000G, 1min)하여 상청을 제거하고, 혈장을 제거했다. 다음에 멸균 증류수 400μL 첨가하고, 볼텍스로 교반하고, 원심기에서 원심(10000G, 1min)하여 상청을 제거했다. 이 조작을 다시 반복하고, 멸균 증류수에 의해, 튜브 내의 잔혈장을 완전히 제거했다. 튜브 내의 멸균 증류수를 최대한 제거한 후에, 용출액으로서 인산 완충액(0.5M, pH7.0)을 50μL 첨가하고, 바로 볼텍스로 15분간 교반했다. 원심기에서 원심(10000G, 1min)하고, 무세포 DNA가 포함된 상청을 회수했다.
회수된 무세포 DNA양을 확인하기 위해서, 실시간 PCR에서 액틴-β의 유전자 서열 중 93bp분의 염기 길이(ACTIN93)를 증폭시켰다. 증폭 프라이머로서, 서열 번호 1 및 2를 사용했다. 실시간 PCR은 이하와 같은 수순으로 실시했다.
우선, 빙상에서 SYBR Premix Ex Taq을 12.5μL, 0.5μM로 조제한 프라이머를1.0μL, 멸균 증류수를 8.5μL, 상기 방법으로 회수한 무세포 DNA를 포함하는 샘플을 멸균 증류수에서 10배 희석한 것 중 2μL를, 1.5mL 튜브 내에서 혼합했다(계 25μL). 25μL 전량을 실시간 PCR용 플레이트에 첨가하고, 플레이트 시트로 덮개를 덮고, 장치에 세트했다. 실시간 PCR 측정 조건은, 95℃ 30sec로 2본쇄 DNA를 1본쇄 DNA로 분리시킨 후→95℃ 5sec, 56℃ 1min의 신장 반응을 40 사이클 행하고, 증폭 커브(Amplification Curve)로부터, 증폭 사이클수를 얻었다. PCR 반응 후, 반응액의 온도를 60℃에서 95℃까지 서서히 상승시키고 융해 곡선 분석을 하고, 얻어진 용융 커브(Melt Curve)로부터 프라이머 이량체가 되지 않은 것을 확인했다.
결과를 표 1에 나타낸다. 실시간 PCR의 증폭 사이클수(Cq값)가 검출 한계 이하인 40 이상이 되었다.
이 결과에 의해, 중합체가 흡착되어 있지 않은 감마 산화알루미늄을 담체로서 사용한 경우, 무세포 DNA를 회수 가능하지 않은 것을 알 수 있었다. 따라서, 특허문헌 4 및 5에 기재된 방법에서는 무세포 DNA가 회수 가능하지 않은 것을 알 수 있었다.
Figure pct00001
<비교예 2> 수용성의 중성 중합체 이외의 수용성의 중합체가 흡착된 산화알루미늄 담체를 사용한 무세포 DNA 회수
1.5ml 튜브에, 0.5㎎씩 감마 산화알루미늄을 측량했다. 여기에 중합체 용액으로서, 폴리아크릴산(PAcA, 5.1kD, 10wt％), 덱스트란황산(DS, 4kD, 10wt％), 폴리비닐술폰산(PVSA, 10wt％), 폴리알릴아민(PAA, 17kD, 10wt％), 폴리-L-리신(PLL, 150kD, 1wt％)을 각각 50μL씩 첨가하여 10분간 믹서로 교반했다. 원심기에서 원심(10000G, 1min)하여 상청을 제거하고, 각각의 중합체가 흡착된 감마 산화알루미늄 얻었다.
수용성의 중성 중합체 이외의 수용성의 중합체가 흡착된 산화알루미늄 담체에 비교예 1에서 사용한 혈장 300μL와 단백질 변성제로서 구아디닌 염산염을 포함하는 RLT(가부시키가이샤 퀴아젠, Buffer RLT) 450μL를 미리 혼합한 후에 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체에 첨가했다. 그 밖의 조작은 비교예 1과 동일하게 행했다. 또한, 회수된 무세포 DNA의 검출은, 비교예 1과 마찬가지의 방법으로 확인했다.
결과를 표 2에 나타냈다. 이들 결과로부터, 어느 담체를 사용한 경우에도, 실시간 PCR의 검출 하한 이하의 회수였던 것을 알 수 있었다. 이들 결과로부터, 수용성의 중성 중합체 이외의 수용성의 중합체가 흡착된 감마 산화알루미늄을 담체로서 사용한 경우, 증폭 사이클수(Cq값)가 35 이상 또는 검출 한계 이하(N.D)가 되어, 무세포 DNA를 회수 가능하지 않은 것을 알 수 있었다.
Figure pct00002
<비교예 3> 실리카 담체를 사용한 무세포 DNA 회수
실리카 담체를 사용한 무세포 DNA 회수 키트(서모 피셔 가부시키가이샤, MagMax cell-FreeDNA Isolation kit)를 사용하여 혈장 무세포 DNA를 효율적으로 회수할 수 있을지를 검토했다.
단백질 변성제로서는, 키트 프로토콜대로의 ProteinaseK, 또는 구아디닌 염산염을 포함하는 RLT(가부시키가이샤 퀴아젠, Buffer RLT)를 사용했다. 체액 시료는, 비교예 1과 마찬가지의 혈장을 사용했다. 단백질 변성제로서, RLT를 사용한 경우는, 비교예 1에서 사용한 혈장 300μL와 RLT 450μL를 미리 혼합한 후에 실리카 담체에 첨가했다. 그 이외의 회수 조작은 키트 프로토콜대로 행했다.
또한, 회수된 무세포 DNA의 검출은, 비교예 1과 마찬가지의 방법으로 확인했다.
결과를 표 3에 나타낸다. 이들 결과로부터, 실리카 담체를 사용한 경우는 Cq값이 35 이상이 되었다.
또한, 도 1에서 회수된 무세포 DNA의 겔 전기 영동의 결과를 나타냈다. 겔 전기 영동의 결과, 회수된 무세포 DNA는 밴드를 확인할 수 없었다.
Figure pct00003
<실시예 1> 수용성의 중성 중합체인 PEG가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체를 사용한 무세포 DNA 회수(단백질 변성제: ProteinaseK)
1.5mL 튜브에 0.5㎎씩 감마 산화알루미늄을 측량했다. 여기에 에탄올 400μL 첨가하고, 볼텍스로 교반하고, 원심기에서 원심(10000G, 1min)하여 상청을 제거했다. 이 조작을 다시 반복하고, 에탄올에 의해, 비즈 표면의 티끌 등을 제거했다. 여기에 중합체 수용액으로서, 수용성의 중성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG, 10kD, 10wt％)을 50μL 첨가하여 10분간 믹서로 교반했다. 원심기에서 원심(10000G, 1min)하여 상청을 제거하고, 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체를 얻었다.
계속해서, 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체가 포함되는 용액에, 비교예 3의 키트 프로토콜과 동일한 혈장 조건으로 하기 위해서, 단백질 변성제로서 ProteinaseK에서 60℃ 20min 변성 처리한 비교예 1에서 사용한 혈장 300μL를 첨가하고, 15분간 볼텍스로 교반했다. 그 후의 조작은 비교예 1과 동일하게 행했다. 회수된 무세포 DNA양은 비교예 1과 동일하게 확인했다. 결과를 표 3에 나타낸다.
<실시예 2> 수용성의 중성 중합체인 PEG가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체를 사용한 무세포 DNA 회수(단백질 변성제: Buffer RLT)
실시예 1에서 행한, 혈장의 단백질 변성 처리의 변성제는, 구아디닌 염산염을 포함하는 RLT(가부시키가이샤 퀴아젠, Buffer RLT)로 변경했다. 사용 방법은, 비교예 1에서 사용한 혈장 300μL와 RLT 450μL를 미리 혼합한 후에 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체에 첨가했다. 그 밖의 작업은 비교예 1과 동일하다. 결과를 표 3에 나타낸다.
또한, 도 1에서 회수된 무세포 DNA의 겔 전기 영동의 결과를 나타냈다. 이들 결과로부터, 비교예 3에서 회수된 무세포 DNA는 밴드를 확인할 수 없는 것에 비하여, 실시예 2에서 회수된 무세포 DNA는 160bp 부근에서 밴드를 확인할 수 있고, 본 발명의 방법은, 무세포 DNA가 높은 순도로 회수되어 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 3> 수용성의 중성 중합체인 PEG가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체를 사용한 무세포 DNA 회수(단백질 변성제: 요소)
실시예 1에서 행한, 혈장의 단백질 변성 처리의 변성제의 종류를 요소로 변경했다. 사용 방법은, 비교예 1에서 사용한 혈장 300μL와 요소(최종 농도 6M) 450μL를 미리 혼합한 후에 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체에 첨가했다. 그 밖의 작업은 비교예 1과 동일하다. 결과를 표 3에 나타낸다.
<실시예 4> 수용성의 중성 중합체인 PEG가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체를 사용한 무세포 DNA 회수(단백질 변성제: 없음)
실시예 1에서 행한, 혈장의 단백질 변성 처리를 행하지 않고, 혈장을 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체에 첨가했다. 비교예 1에서 사용한 혈장 300μL에 증류수 45μL를 첨가한 것 이외의 작업은 실시예 1과 동일하다. 결과를 표 3에 나타낸다.
표 3의 실시예 1, 2, 3, 4의 결과로부터, Cq값은 35 이하가 되고, 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체를 사용하면, 단백질 변성제의 유무나 종류에 관계없이, 300μL의 혈장으로부터 무세포 DNA를 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5> 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체를 사용한 무세포 DNA 회수
수용성의 중성 중합체로서, 제타 전위가 상이한 이하에 드는 각종 중합체를 각 10wt％ 수용액에 조제했다. PEG(폴리에틸렌글리콜), PVA(폴리비닐알코올), PEOz(폴리(2-에틸-2옥사졸린)), HPMC(히드록시프로필메틸셀룰로오스), PVP(폴리비닐피롤리돈). 제조된 각 중합체 용액과 감마 산화알루미늄 담체를 혼합시키고, 각중합체가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체를 제작했다. 그 이외의 작업은 실시예 1과 동일하다.
그 결과를 표 4에 나타낸다. 실시간 PCR의 증폭 사이클수(Cq값)가 35 이하이기 때문에, 제타 전위가 ±10mV의 범위인 중성의 수용성 중합체를 감마 산화알루미늄 표면에 흡착시킨 담체를 사용하면, 300μL라는 소량의 혈장으로부터, 무세포 DNA를 효율적으로 회수할 수 있는 것을 알 수 있었다.
Figure pct00004
<비교예 4> 실리카 담체를 사용한 무세포 DNA 회수
체액 시료로서, CureLine사에서 입수한 암에 이환되어 있지 않은 여성 및 남성 유래의 혈장 및 CureLine사에서 입수한 유방암 환자(여성)의 혈장을 사용한 것 이외는, 비교예 3과 마찬가지의 방법으로 무세포 DNA의 회수를 행하고, Quantus Fluorometer(등록 상표)를 사용하여 DNA 농도를 측정했다. 결과를 표 5에 나타낸다.
이들 결과로부터, 어느 검체도 측정 한계 이하의 값인 0.005ng/μL가 되어, 실리카 담체를 사용한 경우, 300μL의 암에 이환되어 있지 않은 검체 유래의 혈장 및 암 환자 유래의 혈장으로부터 무세포 DNA를 회수 가능하지 않은 것을 알 수 있었다.
<실시예 6> 수용성의 중성 중합체인 PEG가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체를 사용한 무세포 DNA 회수(단백질 변성제: 요소)
실시예 1에서 사용한 담체를 사용한 것 이외는, 비교예 4와 마찬가지의 검체로부터, 비교예 4와 마찬가지 작업으로 무세포 DNA의 회수를 행했다. 회수된 무세포 DNA의 농도를 비교예 4와 마찬가지의 방법으로 확인했다. 결과를 표 5에 나타낸다.
그 결과, 암에 이환되어 있지 않은 남성 유래의 혈장에서는 0.0149pg/μL, 암에 이환되어 있지 않은 여성 유래의 혈장에서는 0.0077pg/μL, 유방암 환자 유래의 혈장에서는 0.0323pg/μL 얻어졌다.
Figure pct00005
<비교예 5> 실리카 담체를 사용한 암 환자 유래 혈장 유래 무세포 DNA로부터의 유전자 변이의 검출
실리카 담체를 사용한 무세포 DNA 회수 키트(서모 피셔 가부시키가이샤, MagMax cell-FreeDNA Isolation kit)를 사용하여, 체액 시료 300μL로부터 무세포 DNA를 회수하고, 암 특이적인 유전자 변이를 검출했다. 체액 시료로서, CureLine사에서 입수한 암에 이환되어 있지 않은 여성 및 남성 유래의 혈장 및 CureLine사에서 입수한 폐암(남성)환자의 혈장을 사용했다. 무세포 DNA의 회수 방법은, 비교예 3에 있어서 변성제에 RLT를 사용한 방법과 동일하게 실시했다. 얻어진 용출액의 1/25의 부피를 20μL로서 사용하여, 폐암 환자에게 특이적인 EGFR 엑손 19 결실(exon 19 deletion) 변이를 디지털 PCR에서 검출했다. 결과를 표 6에 나타낸다. 그 결과, 암에 이환되어 있지 않은 남성, 여성의 검체에서는 유전자 변이는 검출되지 않았지만, 폐암 환자의 무세포 DNA로부터는 49.45％의 빈도로 EGFR 엑손 19 결실 변이를 검출했다.
<실시예 7> PEG가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체를 사용하여 회수된 무세포 DNA로부터의 유전자 변이의 검출
비교예 3에 있어서 변성제에 RLT를 사용한 방법과 마찬가지의 방법을 사용하여, 비교예 5와 같은 검체인 암에 이환되어 있지 않은 남성, 여성 및 폐암 환자의 혈장 300μL로부터 무세포 DNA를 회수하고, 암 특이적인 유전자 변이를 검출했다. 얻어진 용출액의 1/25의 부피를 20μL로서 사용하여, 폐암 환자에게 특이적인 EGFR 엑손 19 결실 변이를 디지털 PCR에서 검출했다. 그 결과, 암에 이환되어 있지 않은 남성, 여성의 검체에서는 유전자 변이는 검출되지 않았지만, 폐암 환자의 무세포 DNA로부터는 55.82％의 빈도로 EGFR 엑손 19 결실 변이를 검출했다. 이 수치는 비교예 5의 방법으로 얻어진 유전자 변이 검출 빈도(49.45％)보다도 높은 점에서(표 6), 본 발명의 방법은 기존의 방법보다도 암 특이적인 유전자 변이를 고감도로 검출할 수 있음이 나타났다.
Figure pct00006
<비교예 6> 실리카 담체를 사용하여 회수된 무세포 DNA양에 의한 암의 검출
실리카 담체를 사용한 무세포 DNA 회수 키트(서모 피셔 가부시키가이샤, MagMax cell-FreeDNA Isolation kit)를 사용하여, 체액 시료 300μL로부터 무세포 DNA를 회수하고, 실시간 PCR에서 측정된 무세포 DNA양을 사용하여 암의 유무를 검출했다. 체액 시료로서, CureLine사에서 입수한 암에 이환되어 있지 않은 여성 및 남성 유래의 혈장 및 CureLine사에서 입수한 폐암(남성), 유방암(여성) 및 대장암(남성)의 혈장을 사용했다. 무세포 DNA의 회수 방법은, 비교예 3에 있어서 변성제에 RLT를 사용한 방법과 동일하게 실시했다. DNA는 50μL에 용출하여, 10배 희석한 것 중 4μL를 분취하고, 암 유래의 무세포 DNA를 보다 검출하기 쉬워지도록 설계한 서열 1과 서열 3의 프라이머로부터 증폭되는 액틴 서열 유전자의 단편인 약306bp를 실시간 PCR에서 검출했다. 검출 대상의 염기 길이를 300bp보다도 길게 함으로써, 비암 세포에서는 방출되기 어렵지만, 암 세포에서는 방출되는 무세포 DNA를 포착하고, 비암과 암의 구별을 시도했다. 암에 이환되어 있지 않은 남성 및 암에 이환되어 있지 않은 여성 유래의 검체 측정값의 95％ 신뢰 하한 구간을 베이스 라인으로 하고, 이것보다 무세포 DNA양이 1.5배 이상 많은(PCR 사이클수가 약 0.59 적은) 검체는 암이 검출되었다고 하여 암 양성, 그렇지 않은 검체는 암이 검출되지 않았다고 해서, 암 음성이라고 판정했다.
상기 판단 기준에, 각각의 검체의 PCR 사이클수 적용시키면, 폐암 환자와 대장암 환자 유래의 검체는, 암에 이환되어 있지 않은 검체의 베이스 라인보다도 무세포 DNA양이 많이 검출되었기 때문에, 암 양성이라 판정했다. 한편, 유방암 환자 유래의 검체는, 암에 이환되어 있지 않은 검체 유래의 측정값의 베이스 라인과 중복되어, 음성이라 판정했다. 따라서, 본 방법에서는 3개의 암 검체 중 1개의 검체에 대하여 암이라고 판정할 수 없었기 때문에, 감도는 66％였다.
<실시예 8> PEG가 표면에 흡착된 감마 산화알루미늄 담체를 사용하여 회수된 무세포 DNA양에 의한 암의 검출
실시예 2에서 변성제에 RLT를 사용한 방법과 마찬가지의 방법을 사용하여, 비교예 6과 같은 체액 시료 300μL로부터 무세포 DNA를 회수하고, 실시간 PCR에서 측정된 무세포 DNA양을 사용하여 암의 유무를 검출했다. 무세포 DNA의 회수 방법은, 비교예 3에 있어서 변성제에 RLT를 사용한 방법과 동일하게 실시했다. DNA는50μL에 용출하여, 10배 희석한 것 중 4μL를 분취하고, 암 유래의 무세포 DNA를 보다 검출하기 쉬워지도록 설계한 서열 1과 서열 3의 프라이머로부터 증폭되는 액틴 서열 유전자의 단편을 실시간 PCR에서 검출했다. 암의 유무에 관한 판정에 대해서는, 비교예 6과 동일하게 실시했다. 그 결과, 폐암(남성), 유방암(여성), 대장암(남성) 환자의 혈장은, 각각 암에 이환되어 있지 않은 검체의 베이스 라인보다 도 무세포 DNA양이 많이 검출되어, 전체 검체를 암 양성으로 판정했다. 따라서, 본 방법에서는 3개의 암 검체 중 3개의 검체 모두가 양성이었기 때문에, 감도는 100％였다. 이 감도는, 비교예 6의 방법으로 얻어진 감도(66％)보다도 높은 점에서(표 7), 본 발명의 방법은 기존의 방법보다도 고감도로 무세포 DNA로부터 암을 검출할 수 있음이 나타났다.
Figure pct00007
SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> The method for isolating cell free DNA <130> 17194WO01 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgagatgcgt tgttacagga ag 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtgtggactt gggagagga 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 caagtcagtg tacaggtaag cc 22

Claims (9)

  1. 체액 시료로부터 무세포 DNA를 회수하는 방법으로서, 이하의 공정:
    공정 a) 수용성의 중성 중합체가 표면에 흡착된 산화알루미늄의 담체와 상기 체액 시료를 혼합하고, 상기 담체에 무세포 DNA를 흡착시키는 공정,
    공정 b) 공정 a)에 있어서 혼합한 혼합물로부터, 상기 무세포 DNA가 흡착된 담체를 분리하는 공정, 및
    공정 c) 공정 b)에 있어서 분리한 상기 무세포 DNA가 흡착된 담체에 용출액을 첨가하여 무세포 DNA를 회수하는 공정,
    를 포함하는 무세포 DNA의 회수 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 체액 시료가, 전혈, 혈청, 혈장, 소변 또는 타액인 무세포 DNA의 회수 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 수용성의 중성 중합체가, pH7의 용액 중에서 -10mV 이상 +10mV 이하의 제타 전위를 갖는 중합체인 무세포 DNA의 회수 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(2-에틸-2-옥사졸린) 또는 히드록시프로필메틸셀룰로오스인 무세포 DNA의 회수 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출액이 완충액인 무세포 DNA의 회수 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체액 시료를, 단백질 변성제로 처리하는 무세포 DNA의 회수 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단백질 변성제가, 카오트로픽 염 또는 단백질 변성 효소인 무세포 DNA의 회수 방법.
  8. 무세포 DNA의 유전자 서열을 해석하여, 암에 특이적인 유전자 변이를 검출하는 방법으로서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 무세포 DNA의 회수 방법을 사용하여 피험자의 체액 시료로부터 무세포 DNA를 회수하는 공정, 및 당해 회수된 무세포 DNA로부터 암에 특이적인 유전자 변이를 검출하는 공정을 포함하는 유전자 변이의 검출 방법.
  9. 피험자 유래의 무세포 DNA양과, 암에 이환되어 있지 않은 검체 유래의 무세포 DNA양을 비교함으로써 암을 검출하는 방법으로서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 무세포 DNA의 회수 방법을 사용하여 피험자 및 암에 이환되어 있지 않은 검체의 체액 시료로부터 무세포 DNA를 회수하는 공정, 및 당해 회수된 피험자 유래의 무세포 DNA양과, 암에 이환되어 있지 않은 검체 유래의 무세포 DNA양을 비교하여 암을 검출하는 공정을 포함하는 암의 검출 방법.
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