CN109689869A - 无细胞dna的回收方法 - Google Patents

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Abstract

通过使用表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝作为载体，能够从少量的体液试样中高效地回收无细胞DNA。

Description

无细胞DNA的回收方法
技术领域
本发明涉及回收无细胞DNA的方法。
背景技术
由于使用核酸的实验技术的发展，新的基因探索及其分析成为可能。例如为了特定癌等疾病而分析人的基因组，为了特定病原体的感染而分析它们的基因组等，在医疗现场中进行利用基因分析的筛选检查、临床检查等。
近年来核酸中无细胞DNA特别受到瞩目，通过对肿瘤来源的无细胞DNA中存在的癌特有的基因突变进行分析来对治疗药判定有无效果等与临床直接联系的研究盛行。
例如，如下治疗药已经被承认：对于检测到EGFR基因突变的肺癌患者，厄洛替尼(Erlotinib)；对于检测到BRAF基因突变的皮肤癌患者，维罗非尼(Vemurafenib)；对于检测到BRCA基因突变的卵巢癌患者，Rubraca(rucaparib)。另外，已知针对这些基因突变的靶向治疗药效果超越癌的种类而共通，例如，针对BRAF基因的V600突变的治疗药达帕菲尼(Dabrafenib)在皮肤癌和非小细胞肺癌的患者的两方中都被推荐。
然而，到目前为止为了获得癌特有的基因，一般要从手术切除的癌组织中回收基因。切除组织的获得对患者的侵袭性高，有根据采取多种癌组织的哪一部位而结果不同的问题，还有不适合手术前的治疗等问题。近年来，报告了体液中存在的无细胞DNA中也可以存在癌特异的基因突变，迫切要求不切除癌组织地检测基因突变。
另外认为，一旦患癌，则无细胞DNA从癌细胞释放到血中，因而癌患者与未患癌者相比血中含有更多量的无细胞DNA(专利文献7)。因此，如果能够正确地测定无细胞DNA的量，则能够使用体液试样低侵袭且简便地进行癌的检测。专利文献7中记载了基于用硅胶膜回收的无细胞DNA的量来检测癌的方法。
然而，体液中存在的无细胞DNA为少量，而且为了分析无细胞DNA序列上存在的癌特有的突变点，在无细胞DNA中需要检测血中的总DNA中的等位基因频率仅为0.1％～几％左右的肿瘤细胞来源的被称为无细胞肿瘤DNA(cell-free tumor DNA，ctDNA)的无细胞DNA，需要以高收率回收无细胞DNA的技术。
现在，作为一般进行的核酸的回收方法，可列举酚-氯仿提取法、乙醇沉淀法和对二氧化硅的核酸吸附法等作为代表方法。其中最通用的方法是专利文献1中记载的使核酸吸附于包含二氧化硅的金属氧化物然后使其溶出而回收的Boom法。该方法具有在通过离心操作从吸附了核酸的二氧化硅回收核酸的同时能够浓缩核酸的特征。
专利文献2中记载了在Boom法的同时对二氧化硅使无细胞DNA吸附的技术。据此，如果将酚-氯仿提取在酸性条件下进行，则RNA被分离到水相中、DNA分离到被氯仿相中，如果在中性条件下进行，则RNA和DNA被分配到水相中。即，能够通过改变提取溶液的条件而选择性地提取想要获得的核酸。
然而，这些专利文献1、专利文献2所述的方法中，在核酸的吸附过程中醇等有机溶剂的使用是不可缺少的，因而有溶剂废弃的问题，回收操作也复杂。此外，还有在分离后的核酸中混入这些有机溶剂，然后影响检测反应的问题。
另外，专利文献3中记载了具有300碱基对～1000碱基对的碱基长的核酸对二氧化硅的吸附性比具有更短的碱基长的核酸的吸附性差，进而预计在回收短的无细胞DNA时，使用二氧化硅的方法不适用。
专利文献4和5没有关于无细胞DNA的记载，但记载了不利用有机溶剂的核酸的回收方法。专利文献4中记载了使核酸吸附于α-氧化铝粒子、氧化锆粒子、二氧化钛粒子等而有效地回收的方法。另外，专利文献5中记载了使用离子交换层析的原理使核酸吸附、回收的方法，显示作为阴离子交换材料可以利用氧化铝。
专利文献6中记载了依赖于溶解核酸的溶液，能够使核酸牢固地结合于α-氧化铝、和γ-氧化铝，或相反阻止结合。另外记载了，结合的核酸即使反复洗涤也基本不溶出。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第5234809号说明书
专利文献2：国际公开第2016/007755号
专利文献3：日本特表2011-522529号公报
专利文献4：国际公开第92/18514号
专利文献5：日本特表2013-505719号公报
专利文献6：日本特表2005-505269号公报
专利文献7：国际公开第2015/114641号
发明内容
发明要解决的课题
本发明者们为了以高收率回收无细胞DNA，研究了使用氧化铝的无细胞DNA的回收方法。在研究回收方法时，研究了通过使用上述的专利文献4、5所述的氧化铝的核酸的回收方法，是否能够回收无细胞DNA。但是，如后述的比较例1所述，这些方法不能回收无细胞DNA。
本发明的目的是确立使用氧化铝以高收率回收无细胞DNA的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们发现，通过使氧化铝的表面吸附水溶性的中性聚合物，能够有效地回收无细胞DNA。
本发明的构成为以下(1)～(9)。
(1)无细胞DNA的回收方法，是从体液试样中回收无细胞DNA的方法，包括以下工序：
工序a，将表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体与所述体液试样混合，使所述载体吸附无细胞DNA的工序，
工序b，从工序a中混合而成的混合物中分离吸附了所述无细胞DNA的载体的工序，和
工序c，在工序b中分离而得的吸附了所述无细胞DNA的载体中加入溶出液并回收无细胞DNA的工序。
(2)根据(1)所述的无细胞DNA的回收方法，所述体液试样是全血、血清、血浆、尿或唾液。
(3)根据(1)或(2)所述的无细胞DNA的回收方法，所述水溶性的中性聚合物是在pH7的溶液中具有-10mV～+10mV的ζ电位的聚合物。
(4)根据(1)～(3)的任一项所述的无细胞DNA的回收方法，所述聚合物是聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-噁唑啉)或羟基丙基甲基纤维素。
(5)根据(1)～(4)的任一项所述的无细胞DNA的回收方法，所述溶出液是缓冲液。
(6)根据(1)～(5)的任一项所述的无细胞DNA的回收方法，将所述体液试样用蛋白质变性剂进行处理。
(7)根据(6)所述的无细胞DNA的回收方法，所述蛋白质变性剂是离液盐(离液序列高的盐，chaotropic salts)或蛋白质变性酶。
(8)基因突变的检测方法，是分析无细胞DNA的基因序列、检测对癌特异的基因突变的方法，包括：
使用(1)～(7)的任一项所述的无细胞DNA的回收方法从受检者的体液试样中回收无细胞DNA的工序，和
从该回收而得的无细胞DNA中检测对癌特异的基因突变的工序。
(9)癌的检测方法，是通过将受检者来源的无细胞DNA量与未患癌样本来源的无细胞DNA量进行比较来检测癌的检测方法，包括：
使用(1)～(7)的任一项所述的无细胞DNA的回收方法从受检者和未患癌样本的体液试样回收无细胞DNA的工序，和
将该回收而得的受检者来源的无细胞DNA量与未患癌样本来源的无细胞DNA量进行比较来检测癌的工序。
发明的效果
通过本发明的无细胞DNA的回收方法，能够从少量的试样通过简便的方法高收率地回收无细胞DNA。另外，根据本发明的回收方法，能够以高收率回收无细胞DNA，因此对癌特异的基因突变的检测灵敏度、癌的检测灵敏度提高。
附图说明
图1是通过本发明的无细胞DNA回收方法回收的无细胞DNA与用市售无细胞DNA回收试剂盒回收的无细胞DNA的电泳图。
具体实施方式
用本发明的无细胞DNA的回收方法回收的无细胞DNA是漏出到体液中的正常细胞来源的无细胞正常DNA(cell-free normal DNA)和肿瘤细胞来源的无细胞肿瘤DNA(cell-free tumor DNA，ctDNA)的总称，在本说明书中记载为无细胞DNA。
无细胞DNA的碱基长一般为相当于组蛋白1单位的166bp左右，在癌、被寄生虫寄生的患者中有时能检测到特征的碱基长的无细胞DNA。例如，癌患者的样本也包含分解没有进行到组蛋白1单位、由数个166bp的单位连接而成的332bp(166bp×2)、498bp(166bp×3)、664bp(166bp×4)等的碱基长的无细胞DNA。另外，已知被恶性疟原虫寄生的患者血清中漏出205bp等的碱基长的无细胞DNA，被利什曼原虫寄生的患者尿中漏出70bp等的碱基长的无细胞DNA(Trends in Parasitology、May 2016，Vo.32，No.5)。
对本发明中回收的无细胞DNA的碱基长不特别限定，但如果使用本发明的方法，则能够高效地回收500bp以下的无细胞DNA。
本发明中使用的体液试样只要是包含无细胞DNA的任意体液试样就不特别限定，例如，可以利用全血、血浆、血清、尿、唾液等，优选为血浆或血清。
体液试样可以未处理直接使用，但为了更高效地回收无细胞DNA，也可以使用利用蛋白质变性剂处理后的试样。
对本发明中使用的蛋白质变性剂不特别限定，例如，优选可以使用SDS、十二烷基肌氨酸钠、CTAB等表面活性剂、作为丝氨酸蛋白酶的一种且具有广泛的切断特异性的蛋白酶K(ProteinaseK)等蛋白质变性酶、盐酸胍、异硫氰酸胍、和脲等离液盐(离液序列高的盐，chaotropic salts)、以及巯基乙醇等。另外，也可以优选使用包含蛋白质变性剂的市售缓冲液，例如，包含异硫氰酸胍等的RLT缓冲液(キアゲン株式会社制)可以作为离液盐蛋白质变性剂优选使用。这些蛋白质变性剂中，特别优选离液盐或蛋白质变性酶。
另外，蛋白质变性剂可以仅使用1种，也可以组合使用多种。作为蛋白质变性剂的组合，可列举如下处理。例如，可以对体液试样添加1％的SDS后，加入蛋白酶K，在60℃加温20分钟。另外，可以对体液试样添加4M以上的盐酸胍、异硫氰酸胍或脲后，加入十二烷基肌氨酸钠使得终浓度为0.5％以上，或加入巯基乙醇使得终浓度为50mM以上的浓度。
另外，上述的操作中，为了抑制体液试样所含的无细胞DNA的分解，可以添加分解核酸的酶的抑制剂。作为酶的抑制剂，例如可以相对于体液试样以终浓度1mM以下的浓度添加EDTA。另外，作为RNA分解酶的抑制剂可以使用市售的“RNasin”(注册商标)PlusRibonuclease Inhibitor(プロメガ株式会社)、Ribonuclease Inhibitor(タカラバイオ株式会社)、RNase inhibitor(东洋纺株式会社)等。
本发明中体液试样可以根据需要进行稀释。对稀释的溶液不特别限定，优选使用水、Tris-盐酸缓冲液等在包含核酸的溶液中通用的溶液。另外，也可以使用包含上述列举的蛋白质变性剂的溶液。在用包含蛋白质变性剂的溶液进行稀释的情况下，例如，可以用4M以上的盐酸胍、异硫氰酸胍或脲进行稀释。
本发明通过使用表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体，能够实现高收率的无细胞DNA的回收。本发明中，表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体是指水溶性的中性聚合物吸附于粒状的氧化铝的周围而成的载体。以后，记载为本发明的载体。
本发明中，使载体吸附无细胞DNA是指能够可逆地脱离的吸附。
作为定量无细胞DNA时的核酸量的定量的方法，可列举吸光度测定、荧光测定、发光测定、电泳、PCR、实时PCR、数字PCR、使用微阵列的分析、使用测序仪的分析等。具体地，利用吸光度测定的定量方法在针对非修饰的核酸时，可以通过测定260nm的吸光度来定量核酸量。利用荧光测定的定量方法可以通过对核酸用荧光色素进行修饰，将来自该荧光色素的荧光强度与浓度已知的溶液中的荧光强度进行比较来定量核酸量。利用电泳的定量方法可以将与浓度已知的样品同时进行回收操作的样品进行泳动，将凝胶染色而对条带的浓度通过图像分析进行比较，从而确定。
PCR是聚合酶链反应(polymerase chain reaction)的省略，能够从DNA样品中选择性地扩增特定的序列。PCR中核酸的扩增反应结束后，可以由其产物量求出核酸的初始浓度。
实时PCR也称为实时定量PCR，能够通过即时地测定利用PCR的扩增从而基于扩增率进行成为模板的DNA的相对定量。另外，如果使用标准样品制成扩增率的标准曲线，则能够定量绝对量。扩增率作为扩增循环数(Cq值)计算出，值越小，显示核酸量越多。
在数字PCR中，将DNA样品分配到微细的间隔中进行PCR反应，从各分级各自的PCR反应后的信号量，能够定量核酸量。
另外，在实时PCR中，通过适当地设计引物，也能够检测回收的无细胞DNA的碱基长。例如，通过扩增作为管家基因已知的肌动蛋白-β的任意序列能够检测无细胞DNA的碱基长。例如，为了确认回收了166bp的无细胞DNA，可以使用扩增肌动蛋白-β基因中100bp前后的引物(W.SUN等、The role of plasma cell-freeDNA detection in predictingoperative chemoradiotherapy response in rectal cancer patients.ONCOLOGYREPORTS 31：1466-1472，2014)。具体地，使用能够扩增肌动蛋白-β基因中93bp的碱基长的序列号1和2的引物，能够检测回收的无细胞DNA。
实时PCR中，一般认为扩增循环数(Cq值)40以上为检测限以下。
本发明中使用的聚合物是作为基本单位的被称为单体、monomer的重复单元多个连接而成的化合物的总称。上述聚合物包含由1种单体构成的均聚物和由2种以上的单体构成的共聚物的任一种，可以使用任意聚合度的聚合物。另外，上述聚合物包含天然聚合物和合成聚合物的任一种。
本发明中使用的水溶性的中性聚合物具有对水可溶的性质，是相对于水的溶解度为至少0.0001wt％以上的聚合物，优选为0.001wt％以上，更优选为0.01wt％以上，进一步优选为0.1wt％以上。
本发明中使用的水溶性的中性聚合物优选为在pH7的溶液中ζ电位为-10mV～+10mV的聚合物。更优选为-8mV～+8mV，进一步优选为-6mV～+6mV，特别优选为-4.0mV～+1.1mV的聚合物。
ζ电位是表示溶液中的胶体的界面的电性质的值之一。如果带电的胶体分散在溶液中，则在胶体的表面由相对于胶体的表面带电的对离子形成电双层。将此时的胶体表面的电位称为表面电位。电双层通过胶体的表面电荷的静电相互作用而形成，因而越向胶体侧离子越强地被固定。电双层中将通过静电相互作用而对离子被强地固定在胶体表面的层称为固定层，将固定层的电位称为固定电位。如果相对于溶液移动胶体，则固定层与胶体一起移动。此时，由胶体来观察，在固定层的外侧存在溶液由于所具有的粘性而与胶体一起移动的界面。将此称为滑动面(すべり面)或挪动面(ずり面)。以从胶体充分离开的位置的电位作为零点时的该滑动面的电位被定义为ζ电位。这样，ζ电位依赖于胶体的表面电荷而变化，表面电荷根据依赖于pH的质子的吸附脱附而变化，因此本发明中以pH7的溶液中的值作为基准。另外，一般与胶体的尺寸相比到滑动面的距离较小，所以可以将胶体的表面近似地表达为滑动面。本发明中使用的水溶性的中性聚合物的情况也同样，可以将分散在溶液中的胶体的表面电位看作ζ电位。
本发明中ζ电位的测定使用大塚电子株式会社的ELS-Z使用激光多普勒电泳法进行测定。激光多普勒电泳法是利用光、声波如果照射到通过电泳而运动的物体时散射或反射，则其频率数变化的多普勒效果的测定方法。
在测定聚合物的ζ电位时，可以作为胶体分散溶液调制聚合物溶液，测定ζ电位。使聚合物溶解在例如磷酸缓冲液、氯化钠溶液、柠檬酸缓冲液等电解质中而制备聚合物溶液，检测分散在溶液中的聚合物的散射光、反射光而进行测定。胶体的尺寸越大，则能够在越低的浓度检测散射光、反射光。
对用激光多普勒法测定聚合物的ζ电位的具体条件不特别限定，例如，可以使聚合物的浓度为1wt％～10wt％而溶解在磷酸缓冲液(10mM，pH7)中，将该溶液装入测定用池，放置在以激光多普勒电泳法为原理的ζ电位测定装置中，在室温进行测定。
作为本发明中使用的水溶性的中性聚合物，具体可列举以下物质。例如，可以使用聚乙烯醇或聚乙烯基吡咯烷酮等聚乙烯基系聚合物、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或聚(N-(羟基甲基)丙烯酰胺等聚丙烯酰胺系聚合物、聚乙二醇、聚乙二醇或聚四亚甲基醚二醇等聚亚烷基二醇系的聚合物、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、(羟基丙基)甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、2-羟基乙基纤维素或羟基丙基纤维素等纤维素等。另外，也可以使用包含上述的聚合物的共聚物。
另外，本发明的水溶性的中性聚合物也包含FICOLL、琼脂糖、几丁质和右旋糖酐等多糖或多糖类似物以及白蛋白等蛋白质、肽。
可以使水溶性的中性聚合物的官能基的一部分离子化，或替换成显示阳性、阴性的官能基，或在侧链导入乙酰基等表现水溶性的官能基。
本发明中，作为水溶性的中性聚合物的分子量，例如，优选使用0.4kD以上的聚合物，更优选为6kD以上。
本发明中使用的氧化铝是用Al2O3的组成式表示两性氧化物，也称为氧化铝(alumina)。
氧化铝可以使用天然产出的，也可以使用工业制作的。作为制作氧化铝的方法，可列举例如，以三水铝石作为出发原料的拜耳法(Bayer process)、醇盐法、中和法或油滴法等经由软水铝石形态的氢氧化物的方法(也称为溶胶-凝胶法)、铝盐热分解法或阳极氧化法等。
工业制作的氧化铝可以从试剂制造商、催化剂化学制造商、一般社团法人触媒学会的参照触媒部会等获得。
氧化铝根据它们所具有的结晶结构而分类为α-氧化铝、ρ-氧化铝、χ-氧化铝、κ-氧化铝、η氧化铝、γ-氧化铝、δ氧化铝、θ氧化铝等。本发明中优选使用具有高比表面积的γ-氧化铝。
进而氧化铝根据制作时的烧成温度，酸点(Al+、Al-OH2 +)和碱点(Al-O-)变化。氧化铝根据该酸点和碱点数，酸点多则成为酸性氧化铝，碱点多则成为碱性氧化铝，酸点与碱点为同程度则成为中性氧化铝。该特性的差异可以通过添加作为pH指示剂的BTB溶液来确认。如果加入BTB溶液氧化铝呈黄色，则可以确认为酸性氧化铝，呈绿色为中性氧化铝，呈蓝色为碱性氧化铝。虽然有这样的特性上的差异，但本发明中可以使用任一氧化铝。
本发明中使用的氧化铝可以为粒状。粒径可以均匀，也可以将不同粒径混合利用。可以优选使用粒径例如小于212μm的氧化铝，更优选使用小于100μm的氧化铝。
粒径在本发明中用基于日本工业规格中规定的JIS Z-8801-1：2006的筛孔大小的尺寸定义。例如，制成基于上述JIS标准的孔大小，通过40μm的筛、不能通过32μm的筛的粒子粒径为32μm以上且小于40μm。
本发明中使用的溶出液只要能够溶出吸附于本发明的载体的无细胞DNA就不特别限定，优选为缓冲液，缓冲液中可以包含螯合剂。具体可列举，包含柠檬酸和柠檬酸钠的柠檬酸缓冲液、包含磷酸和磷酸钠的磷酸缓冲液、在包含三羟基氨基甲烷和盐酸的Tris-盐酸缓冲液中添加了EDTA的Tris-EDTA缓冲液等。
缓冲液的pH优选为pH4～pH9，更优选为pH5～pH8。
本发明中使用的缓冲液可以如下制备。例如，0.5M的磷酸缓冲液(pH7)的制备如下。制备0.5M的磷酸氢二钠水溶液和0.5M的磷酸二氢钠。对0.5M的磷酸氢二钠水溶液，一边测定pH一边添加磷酸二氢钠溶液，在pH7时停止添加。用同样的方法也可以制备其他pH的缓冲液。
缓冲液所含的螯合剂可以使用具备具有多个配位位置的配位子，与金属离子结合而形成配合物的物质。
作为具体的螯合剂，可列举乙二胺四乙酸(EDTA)、氮川三乙酸(NTA)、乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、多磷酸、偏磷酸和/或和它们的盐等。对螯合剂的终浓度不特别限定，可以为50mM以上，优选为100mM以上，进一步优选为500mM以上。
另外，作为上述以外的成为螯合剂的化合物，可列举阴离子性的聚合物。侧链具有羧酸的聚合物配位金属离子，因而它们可以包含在缓冲液中。作为具有这样的功能的聚合物，可列举聚乙烯基磺酸和/或它们的盐。对其终浓度不特别限定，可以为1wt％以上，优选为10wt％以上。
本发明是从体液试样回收无细胞DNA的方法，包括工序a，将表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体与体液试样混合，使载体吸附无细胞DNA的工序；工序b，从工序a中混合而成的混合物中分离吸附了所述无细胞DNA的载体的工序；和工序c，在工序b中吸附了所述无细胞DNA的载体中加入溶出液并回收无细胞DNA的工序。以下，对于各个工序进行详细说明。
本发明中使用的载体通过使氧化铝的表面吸附水溶性的中性聚合物来制作。由聚合物带来的表面的被覆率可以为7％以上，优选为40％以上。另外，水溶性的中性聚合物也可以不以均匀的厚度吸附。
本发明中，由聚合物带来的氧化铝的被覆率可以通过分析利用表面电位显微镜(别名开尔文探针显微镜，Kelvin probe Force Microscopy；KFM)获得的电位分布图而计算出。表面电位显微镜可以利用例如，Bruker AXS社的Digital Instruments制的NanoScope Iva AFM Dimension 3100阶段AFM系统等。
由表面电位显微镜计算表面被覆率时，测定的视野尺度在0.5μm×1μm的范围进行。表面被覆率的计算方法是首先获得氧化铝的表面电位图像，求出视野内的平均电位。接着获得水溶性的中性聚合物的表面电位图像，求出视野内的平均电位。然后，获得吸附了水溶性的中性聚合物的氧化铝的表面电位图像，求出视野内的平均电位。将仅氧化铝的被覆率作为0％、仅水溶性的中性聚合物的被覆率作为100％，取吸附了水溶性的中性聚合物的氧化铝的平均电位与水溶性的中性聚合物的平均电位的比，从而计算出吸附了水溶性的中性聚合物的氧化铝的表面被覆率。在求出表面被覆率时，使用的视野内的平均电位是随机选择本发明的单体的粒子3个，使用测定值的平均值。
另外，作为计算表面被覆率时的图像分析软件，可以使用Adobe社的Photoshop等。这种情况下，在图像分析时，将氧化铝的表面电位的平均值作为尺度下端、将水溶性的中性聚合物的表面电位的平均值作为尺度上端，将下端色设定为黑(8bit、RGB值0)、上端色设定为红(R值255)、或绿(G值255)、或蓝(B值255)等。用设定的尺度显示吸附了水溶性的中性聚合物的氧化铝的表面电位图像，将R值、或G值、或B值的任一项的值除以255，将其比作为表面被覆率。
作为使表面吸附水溶性的中性聚合物的前阶段，可以预先将氧化铝用水、乙醇等溶液洗涤，预先除去吸附于表面的杂质，也可以省略本洗涤操作。
使氧化铝吸附水溶性的中性聚合物的方法可列举例如，溶解水溶性的中性聚合物而制备聚合物溶液，使其与氧化铝接触的方法。具体地，可以在聚合物溶液中浸泡氧化铝，将聚合物溶液滴加到氧化铝，将聚合物溶液涂布到氧化铝，将聚合物溶液制成雾状而喷涂到氧化铝。
对在聚合物溶液中浸泡氧化铝的方法不特别限定。例如，可以通过吹打、颠倒混合、利用搅拌机、混合机、涡流混合器、碾磨机等分散机、超声波处理装置等进行搅拌。
对水溶性的中性聚合物浓度不特别限定，优选为0.01wt％以上，更优选为0.1wt％以上。
搅拌时的混合时间只要能够将聚合物与氧化铝均匀混合就不特别限定混合时间，在涡流混合器的情况下优选搅拌1分钟以上、优选为5分钟以上。
另外，也可以使用筛、笊篱等进行浸涂。浸泡于溶液时的混合时间在0.1wt％以上的聚合物浓度下可以为5分钟以上，优选为30分钟以上。
在滴加聚合物溶液的情况下，可以使用注射器、滴液漏斗等。滴加聚合物溶液时，也可以振动、旋转氧化铝，也可以使用旋涂器等。
在涂布聚合物溶液的情况下，可以使用刷毛、辊、棒涂器。
在将聚合物溶液制成雾状而喷涂的情况下，可以使用空气喷雾器、气刷等。
通过上述例示的方法使氧化铝吸附水溶性的中性聚合物后，可以将多余的聚合物溶液通过离心分离等除去，也可以不除去而直接用于无细胞DNA的回收。另外，在溶剂中溶解聚合物溶液的情况下，使氧化铝吸附水溶性的中性聚合物之后，可以干燥而除去溶剂，也可以不干燥而直接用于无细胞DNA的回收。
所得的本发明的载体可以使用预先制作保存的，也可以用时制备而使用。
聚合物溶液在获得的聚合物是固体的情况下，可以通过溶解在水、有机溶剂中来制备，在获得的聚合物是溶液的情况可以通过稀释来制备。在聚合物难以溶解的情况、溶液的粘度高难以混合的情况下，可以进行加热处理、超声波处理。有机溶剂优选使用例如，乙醇、乙腈、甲醇、丙醇、叔丁醇、DMF、DMSO、丙酮、乙二醇、甘油等具有与水的双溶性的溶剂。另外，在不易溶于水的情况下，也可以添加上述的有机溶剂。
使氧化铝与水溶性的中性聚合物通过接头分子等共价结合而制作的载体不属于本发明的载体。具体的接头分子可列举硅烷偶联剂剂等。
以下，逐个工序对本发明进行说明。
工序a是将在通过上述的制作方法制作的氧化铝的表面吸附了水溶性的中性聚合物的载体(本说明书中记为本发明的载体)与体液试样混合，使本发明的载体吸附无细胞DNA的工序。对本发明的载体与体液试样的混合方法不特别限定，例如，可以通过吹打、颠倒混合来进行，也可以使用混合机、涡流混合器等装置。对混合时间不特别限定，可以为5分钟左右，也可以混合5分钟以上的时间。另外，可以将本发明的载体填充在柱中，使体液试样通过。进而，将本发明的载体与体液试样混合时，可以添加蛋白质变性剂。蛋白质变性剂也可以作为工序a的前阶段预先添加在体液试样中。
工序b是从工序a中混合而成的混合物中分离吸附了所述无细胞DNA的载体的工序。作为分离的方法，可列举将工序a中所得混合物进行离心分离，使吸附了无细胞DNA的载体沉淀，除去上清的方法。吸附了无细胞DNA的载体的比重大于水，因此可以通过离心操作容易地使其沉淀。离心分离的条件可以为6000G处理1分钟，更优选10000G处理1分钟。作为其他分离方法，可列举使用超滤膜的方法。对具有小于吸附了无细胞DNA的载体的粒径的孔径的超滤膜，使工序a中得到的混合物通过，分离载体。这样的超滤膜已经试剂盒化，可以获得以メルク株式会社的ウルトラフリー(注册商标)、Pall Corporation的ナノセップ(注册商标)为代表的离心过滤试剂盒来利用。
另外，在工序b的操作之后，可以根据需要进行如下处理。这是因为，本发明的载体的表面可能吸附除了成为目的的无细胞DNA以外的生物试样来源物。例如，为了更高纯度地分离无细胞DNA，可以进行洗涤、分解的处理。具体地，可以进行为了除去非特异地吸附的化合物而用水洗涤，为了除去非特异地吸附的蛋白质而用表面活性剂洗涤，为了除去离子、低分子化合物而用包含表面活性剂的溶液洗涤，为了除去非特异地吸附的疏水性化合物而用有机溶剂洗涤，为了分解非特异地吸附的蛋白质而添加蛋白质分解酶，为了仅分离DNA而添加RNA分解酶，和为了仅分离RNA而添加DNA分解酶等各种处理。
工序c是在工序b中分离而得的吸附了所述无细胞DNA的载体中加入溶出液并回收无细胞DNA的工序。是在吸附了无细胞DNA的载体中加入溶出液，使所吸附的无细胞DNA溶出到溶出液中，回收无细胞DNA的工序。
工序c中，作为将本发明的载体与溶出了无细胞DNA的溶液分离的方法，可列举在工序c中，将对吸附了无细胞DNA的载体加入溶出液而得的混合物进行离心分离，使本发明的载体沉淀，获得溶出有无细胞DNA的上清的方法。本发明的载体的比重大于水，因而能够通过离心操作容易地使其沉淀。离心分离的条件以6000G处理1分钟即可，优选以10000G处理1分钟。
作为其他分离方法，可列举使用超滤膜的方法。对具有小于本发明的载体的粒径的孔径的超滤膜，使工序c中得到的混合物通过，分离本发明的载体。这样的超滤膜已经试剂盒化，可以获得以メルク株式会社的ウルトラフリー(注册商标)、Pall Corporation的ナノセップ(注册商标)为代表的离心过滤试剂盒而利用。
回收的无细胞DNA可以根据需要进行化学修饰。化学修饰可列举对无细胞DNA的末端的荧光色素修饰、消光剂修饰、生物素修饰、氨基化、羧基化、马来酰亚胺化、琥珀酰亚胺化、磷酸化和去磷酸化等，还可列举利用嵌入剂的染色。这些修饰可以通过化学反应导入，也可以通过酶反应导入。在上述定量之前导入这些修饰基，不是定量回收的无细胞DNA自身，而是通过定量经由化学修饰导入的修饰基，可以间接地定量无细胞DNA。
利用使用本发明的无细胞DNA的回收方法回收的无细胞DNA，能够检测对癌特异的基因突变、检测癌。以下，对于这些检测进行说明。
使用本发明的无细胞DNA的回收方法从受检者的体液试样回收无细胞DNA，分析无细胞DNA的基因序列，能够检测对癌特异的基因突变。关于成为检测对象的癌、和在该癌中确认突变的基因序列，例如可以从“Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer”等数据库(http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)中报告的癌和序列中选择。具体可列举以下的基因为例。
作为在肺癌中确认突变的基因，可列举AKT1、ALK、APC、ATM、BAI3、BAP1、BRAF、CDKN2A、EGFR、EPHA5、ERBB2、ERBB4、FBXW7、FGFR1、FGFR2、GRM8、KDR、KEAP1、KIT、KMT2D、KRAS、LRP1B、MDM2、MET、MLH1、MUC16、MYC、NF1、NFE2L2、NOTCH1、PDGFRA、PIK3CA、PIK3CG、PKHD1、PTEN、RARB、RB1、RET、ROS1、RUNX1T1、SMAD4、SMARCA4、SOX2、STK11、TP53等基因。
作为在乳癌中确认突变的基因，可列举ACVR1B、AKT1、ATM、BAP1、BRCA1、BRCA2、CBFB、CDH1、CDKN2A、EGFR、EP300、ERBB2、ERBB3、ESR1、EXOC2、EXT2、FBXO32、FGFR1、FGFR2、GATA3、IRAK4、ITCH、KMT2C、MAP2K4、MAP3K1、MDM2、MUC16、MYC、NCOR1、NEK2、PBRM1、PCGF2、PIK3CA、PIK3R1、PPM1L、PTEN、PTGFR、RB1、RET、SEPT9、TP53、TRAF5、WEE1、ZBED4等基因。
作为在大肠癌中确认突变的基因，可列举ACVR1B、AKT1、APC、ATM、ATP6V0D2、BAX、BRAF、CASP8、CDC27、CTNNB1、DCC、DMD、EP300、ERBB2、FBXW7、FZD3、GPC6、KRAS、MAP2K4、MAP7、MIER3、MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MYO1B、NRAS、PIK3CA、PIK3R1、PTPN12、SLC9A9、SMAD2、SMAD4、TCERG1、TCF7L2、TGFBR2、TP53、WBSCR17等基因。
作为在骨髓增生性肿瘤中确认突变的基因，可列举ABL1、ASXL1、ATRX、BCOR、BCORL1、CBL、CBLB、DAXX、DNMT3A、EED、ETV6、EZH2、FLT3、GATA1、GNAS、IDH1、IDH2、IKZF1、JAK1、JAK2、JAK3、KAT6A、KIT、KMT2A、KRAS、MPL、NF1、NPM1、NRAS、PHF6、PRPF40B、PTPN11、RAD21、RB1、RUNX1、SETBP1、SF1、SF3A1、SF3B1、SH2B3、SMC1A、SMC3、STAG2、SUZ12、TET2、TP53、U2AF1、U2AF2、WT1、ZRSR2等基因。
作为在肝癌中确认突变的基因，可列举ALB、AMPH、APC、ARID1A、ARID2、ATM、AXIN1、BAZ2B、BRAF、CCDC178、CDKN2A、CSMD3、CTNNB1、DSE、ELMO1、ERBB2、ERRFI1、GXYLT1、HNF1A、IGF2R、IGSF10、KEAP1、KRAS、MET、OTOP1、PIK3CA、SAMD9L、TP53、UBR3、USP25、WWP1、ZIC3、ZNF226等基因。
作为在卵巢癌中确认突变的基因，可列举AKT1、ARID1A、BRAF、BRCA1、BRCA2、CBLC、CCNE1、CDK12、CDKN2A、CSMD3、CTNNB1、CUBN、EGFR、ERBB2、FAT3、GABRA6、KIT、KRAS、KREMEN1、MAS1L、MLH1、MSH2、NF1、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PIK3R1、PPP2R1A、PTEN、RB1、TP53、USP16等基因。
作为在前列腺癌中确认突变的基因，可列举AKAP9、APC、AR、CDK12、CDKN1B、CDKN2A、GLI1、IKZF4、KDM4B、KLF6、KMT2D、MED12、MYC、NCOA2、NIPA2、NKX3-1、NRCAM、OR5L1、PDZRN3、PIK3CA、PTEN、RB1、SCN11A、SPOP、SYNE3、TBX20、TFG、THSD7B、TP53、ZFHX3、ZNF473、ZNF595等基因。
作为在胃癌中确认突变的基因，可列举APC、ATP4A、BAI3、BRCA2、CCNE1、CDH1、CTNNB1、DCC、ERBB2、FBXW7、FGFR2、GPR78、LPAR2、LRP1B、LRRK2、MET、MYC、NOTCH1、PIK3CA、PRKDC、RET、S1PR2、SPEG、SSTR1、STK11、TP53、TRIO、TRRAP、WNK2等基因。
作为这些基因突变的检测方法，可以使用已有的核酸检测方法。具体地，选择成为对象的基因突变，使用能够特异性地检测成为对象的基因的基因突变的引物或探针，使用PCR、实时PCR、数字PCR、测序仪、微阵列等的核酸检测装置进行检测。关于基因突变的有无，在测定到比各检测法中的阴性对照测定值显著高的信号的情况下，可以判定为有基因突变。更优选为对于预先判明了不存在基因突变的样本和受检者的样本通过同样的方法测定基因突变，在将从预先判明了不存在基因突变的样本得到的测定值与从受检者的样本得到的测定值之间有统计学上的显著性差异、且从受检者的样本得到的测定值高的情况下，判定检测到了对象基因的突变。
另外，可以通过使用本发明的无细胞DNA的回收方法从受检者和未患癌样本的体液试样回收无细胞DNA，将受检者来源的无细胞DNA量与未患癌样本来源的无细胞DNA量进行比较来检测癌。具体地，将受检者来源的无细胞DNA量与未患癌样本来源的无细胞DNA量进行比较，在受检者来源的无细胞DNA量多于未患癌样本来源的无细胞DNA量的情况下，可以判定从受检者的样本检测到癌。期望在受检者来源的无细胞DNA量与未患癌样本来源的无细胞DNA量之间有统计学上的显著性差异、且受检者来源的无细胞DNA量多的情况下，可以判定检测到癌。
本发明中使用的未患癌样本是指没有临床诊断、病理检查确认为有恶性肿瘤的过往的人来源的样本。未患癌样本的身体条件优选与受检者相同或近似。身体条件是指例如人种等。
另外，受检者与未患癌样本的体液试样的种类优选使用同种体液试样。具体地，在受检者的样本是血浆的情况下，优选未患癌样本也使用血浆。另外，在受检者的样本是血清的情况下，优选未患癌样本也使用血清。
另外，未患癌样本可以是一个也可以是多个。在利用多个未患癌样本的情况下，无细胞DNA量可以使用平均值、刨除了离群值的平均值、或中位值等。
定量回收的无细胞DNA量的方法，可以使用作为核酸量的定量方法在上述记载的方法。
此时，对成为定量对象的无细胞DNA的碱基长不特别限定，优选为长于100bp的碱基长的无细胞DNA，更优选为300bp以上的碱基长的无细胞DNA。另外，定量对象的基因序列只要是无细胞DNA所含的序列就不特别限定，例如可以是ACTB、GAPDH等管家基因，也可以是癌特征的基因。未患癌样本与受检者的无细胞DNA量优选利用通过相同方法测定的值。
本说明书中，“统计学上的显著性差异”是指例如将对照组的95％置信下限区间设定为基线，可以判定受检者的测定值是否达到该基线。另外，所得的值的临界值(显著性水平)小的情况，具体可列举p＜0.05、p＜0.01或p＜0.001的情况。其中，作为临界值的“p”或“p值”显示在统计学检验中，统计量在假定的分布中，假定偶然正确的概率。因此“p”或“p值”越小，则假定越接近真实。统计学处理的检验方法可以适宜采用能够判定显著性的有无的公知的检验方法，不特别限定。例如，可以使用学生t检验法、多重比较检验法。
实施例
通过以下的实施例更具体地说明本发明。
＜材料与方法＞
聚乙二醇从メルク株式会社购买，碱性的γ-氧化铝(N613N)从日挥触媒化成株式会社购买。实施例中使用聚合物水溶液以各自的浓度用水使其溶解。另外，实施例中只要不特别说明，γ-氧化铝使用碱性的。氧化铝不进行筛分等直接将购买的用于实验。
作为变性剂，从キアゲン株式会社购买QIAGEN蛋白酶K和RLT，从和光纯药工业株式会社购买脲。
另外，电泳中使用的20bp DNA ladder(梯状标志物)从タカラバイオ株式会社购买，丙烯酰胺凝胶NOVEX-TBE-Gells 8％15well和DNA染色剂SYBR-Gold Nucleic Acid Gel Stain从サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社购买。实时PCR测定使用タカラバイオ株式会社的SYBR(注册商标)Premix Ex TaqII。为了检测无细胞DNA，作为用于扩增肌动蛋白-β的基因序列中93bp部分的碱基长(ACTIN93)的引物，使用序列号1和2。另外，利用无细胞DNA量的癌的检测中，作为用于扩增肌动蛋白-β的基因序列中306bp部分的碱基长的引物，使用序列号1和3。引物基于PrimePCR Assays，Panels，and Controls InstructionManual(バイオ·ラッド·ラボラトリーズ株式会社)的记载设计，从ユーロフィンジェノミクス株式会社购买，不进行特别纯化而直接使用。对于其他试剂，从和光纯药株式会社、东京化成株式会社、シグマーアルドリッチジャパン合同会社购买，不进行特别纯化而直接使用。
涡流混合器使用东京理化器械株式会社的CUTE MIXER CM-1000，ζ电位的测定使用大塚电子株式会社的ELS-Z。电泳使用ミニゲルスラブ电泳装置(アズワン株式会社)。热循环仪使用タカラバイオ株式会社的PCR ThermalCycler SP TP-400，实时PCR使用バイオラッド社的CFX96-Real Time System。筛使用アズワン株式会社的MVS-1。染色的凝胶使用GEヘルスケア·ジャパン株式会社的TyphoonFLA9500进行分析。凝胶的图像分析使用Molecular Dynamics社的ImageQuant TL(注册商标)。
另外，在通过实时PCR定量无细胞DNA时，在实时PCR的结果是扩增循环数(Cq值)为35以下的情况下，判定为能够回收无细胞DNA。另外，在40以上的情况下，作为测定下限以下，记载为N.D。
作为体液试样，作为未患癌样本使用从Tennessee Blood Services社购买的多种人来源的混合血浆、从CureLine社获得的未患癌的女性和男性来源的血浆。作为患癌的样本，使用从CureLine社获得的癌患者的血浆。
＜比较例1＞使用未进行聚合物涂布的氧化铝载体进行的无细胞DNA回收
使用与专利文献4(实施例4、Table2)所述的氧化铝A组成相近的碱性的γ-氧化铝(N613N：日挥触媒化成株式会社)，研究是否能够有效地回收无细胞DNA。作为体液试样，使用从Tennessee Blood Services社购买的多种人来源的混合血浆。作为使吸附于氧化铝的无细胞DNA溶出的溶出液，专利文献4、5中记载了可以利用磷酸缓冲液、或Tris-EDTA缓冲液作为溶出液，专利文献6中记载了磷酸溶液阻碍核酸与氧化铝的结合，因此以磷酸缓冲液(0.5M，pH7)作为溶出液，进行以下的实验。
在1.5mL管中量取各0.5mg的γ-氧化铝。在其中添加乙醇400μL，用涡流混合器搅拌，用离心机离心(10000G、1分钟)而除去上清。将该操作再次重复，用乙醇除去珠表面的垃圾等。
对洗涤后的γ-氧化铝添加血浆300μL，用涡流混合器搅拌15分钟。用离心机离心(10000G、1分钟)除去上清，除去血浆。接着添加灭菌蒸馏水400μL，用涡流混合器搅拌，用离心机离心(10000G、1分钟)而除去上清。将该操作再次重复，用灭菌蒸馏水完全除去管内的残余血浆。尽量除去管内的灭菌蒸馏水后，作为溶出液添加磷酸缓冲液(0.5M，pH7.0)50μL，立即用涡流混合器搅拌15分钟。用离心机离心(10000G、1分钟)，回收包含无细胞DNA的上清。
为了确认回收的无细胞DNA量，通过实时PCR扩增肌动蛋白-β的基因序列中的93bp部分的碱基长(ACTIN93)。作为扩增引物使用序列号1和2。实时PCR通过如下步骤实施。
首先，在冰上将SYBR Premix Ex Taq 12.5μL、制备成0.5μM的引物1.0μL、灭菌蒸馏水8.5μL、将用上述的方法回收的包含无细胞DNA的样品用灭菌蒸馏水稀释10倍后的产物中的2μL在1.5mL管内混合(计25μL)。将25μL总量添加到实时PCR用板中，用板片盖好，放置到装置中。实时PCR测定条件是在95℃30秒使双链DNA分离成单链DNA后→将95℃5秒、56℃1分钟的延伸反应进行40个循环，从扩增曲线(Amplification Curve)获得扩增循环数。PCR反应后，使反应液的温度从60℃缓缓上升到95℃，进行熔解曲线分析，由所得的熔解曲线确认了未形成引物二聚体。
结果示于表1。实时PCR的扩增循环数(Cq值)为检测限以下的40以上。
根据该结果可知，在使用未吸附聚合物的γ-氧化铝作为载体的情况下，不能回收无细胞DNA。因此可知，专利文献4和5所述的方法不能回收无细胞DNA。
表1
＜比较例2＞使用吸附了除了水溶性的中性聚合物以外的水溶性的聚合物的氧化铝载体进行的无细胞DNA回收
在1.5mL管中量取各0.5mg的γ-氧化铝。在其中作为聚合物溶液，分别加入聚丙烯酸(PAcA，5.1kD，10wt％)、右旋糖酐硫酸酯(DS，4kD，10wt％)、聚乙烯基磺酸(PVSA，10wt％)、聚烯丙基胺(PAA，17kD，10wt％)、聚-L-赖氨酸(PLL，150kD，1wt％)各50μL，用混合机搅拌10分钟。用离心机离心(10000G，1分钟)而除去上清，得到吸附了各个聚合物的γ-氧化铝。
对吸附了除了水溶性的中性聚合物以外的水溶性的聚合物的氧化铝载体，将比较例1中使用的血浆300μL与作为蛋白质变性剂包含盐酸胍的RLT(株式会社キアゲン、BufferRLT)450μL预先混合之后，添加到表面吸附了聚合物的γ-氧化铝载体中。其他操作与比较例1同样地进行。另外，回收的无细胞DNA的检测通过与比较例1同样的方法确认。
结果示于表2。由这些结果可知，在使用任一载体的情况下，都是实时PCR的检测下限以下的回收。由这些结果可知，在使用吸附了除了水溶性的中性聚合物以外的水溶性的聚合物的γ-氧化铝作为载体的情况下，扩增循环数(Cq值)为35以上或检测限以下(N.D)，不能回收无细胞DNA。
表2
＜比较例3＞使用二氧化硅载体进行的无细胞DNA回收
利用使用二氧化硅载体的无细胞DNA回收试剂盒(サーモフィッシャー株式会社、MagMax cell-FreeDNA Isolation kit)研究是否能够有效地回收血浆无细胞DNA。
作为蛋白质变性剂，使用如试剂盒说明书的蛋白酶K、或包含盐酸胍的RLT(株式会社キアゲン、Buffer RLT)。体液试样使用与比较例1同样的血浆。在作为蛋白质变性剂使用RLT的情况下，将比较例1中使用的血浆300μL与RLT450μL预先混合之后添加到二氧化硅载体中。除此以外的回收操作按照试剂盒说明书进行。
另外，回收的无细胞DNA的检测通过与比较例1同样的方法确认。
结果示于表3。由这些结果，在使用二氧化硅载体的情况下Cq值为35以上。
进而，图1显示回收的无细胞DNA的凝胶电泳的结果。凝胶电泳的结果没能确认回收的无细胞DNA的条带。
表3
＜实施例1＞使用表面吸附了水溶性的中性聚合物PEG的γ-氧化铝载体进行的无细胞DNA回收(蛋白质变性剂：蛋白酶K)
在1.5mL管中量取各0.5mg的γ-氧化铝。在其中添加乙醇400μL，用涡流混合器搅拌，用离心机离心(10000G、1分钟)而除去上清。将该操作再次重复，用乙醇除去珠表面的垃圾等。在其中作为聚合物水溶液加入水溶性的中性聚合物聚乙二醇(PEG，10kD，10wt％)50μL，用混合机搅拌10分钟。用离心机离心(10000G、1分钟)而除去上清，得到表面吸附了聚合物的γ-氧化铝载体。
接下来，在包含表面吸附了聚合物的γ-氧化铝载体的溶液中，添加为了制成与比较例3的试剂盒说明书相同的血浆条件，而作为蛋白质变性剂用蛋白酶K在60℃变性处理20分钟后的比较例1中使用的血浆300μL，用涡流混合器搅拌15分钟。之后的操作与比较例1同样地进行。回收的无细胞DNA量与比较例1同样地确认。结果示于表3。
＜实施例2＞使用表面吸附了水溶性的中性聚合物PEG的γ-氧化铝载体进行的无细胞DNA回收(蛋白质变性剂：Buffer RLT)
将实施例1进行的血浆的蛋白质变性处理的变性剂变更为包含盐酸胍的RLT(株式会社キアゲン、Buffer RLT)。使用方法是在将比较例1中使用的血浆300μL与RLT450μL预先混合之后添加到表面吸附了聚合物的γ-氧化铝载体中。其他操作与比较例1同样。结果示于表3。
进而，图1显示回收的无细胞DNA的凝胶电泳的结果。由这些结果可知，比较例3中回收的无细胞DNA不能确认条带，与此相对，实施例2中回收的无细胞DNA能够在160bp附近确认条带，本发明的方法能够以高纯度回收无细胞DNA。
＜实施例3＞使用表面吸附了水溶性的中性聚合物PEG的γ-氧化铝载体进行的无细胞DNA回收(蛋白质变性剂：脲)
将实施例1中进行的血浆的蛋白质变性处理的变性剂的种类变更为脲。使用方法是将比较例1中使用的血浆300μL与脲(终浓度6M)450μL预先混合之后添加到表面吸附了聚合物的γ-氧化铝载体中。其他操作与比较例1同样。结果示于表3。
＜实施例4＞使用表面吸附了水溶性的中性聚合物PEG的γ-氧化铝载体进行的无细胞DNA回收(蛋白质变性剂：无)
不进行实施例1中进行的血浆的蛋白质变性处理，将血浆添加到表面吸附了聚合物的γ-氧化铝载体。在比较例1中使用的血浆300μL中添加蒸馏水45μL，除此以外的操作与实施例1同样。结果示于表3。
由表3的实施例1、2、3、4的结果可知，Cq值为35以下，如果使用表面吸附了水溶性的中性聚合物的γ-氧化铝载体，则无论蛋白质变性剂的有无、种类，都能够从300μL的血浆回收无细胞DNA。
＜实施例5＞使用表面吸附了水溶性的中性聚合物的γ-氧化铝载体进行无细胞DNA回收
作为水溶性的中性聚合物，将ζ电位各异的以下所列举的各种聚合物制成各10wt％水溶液。PEG(聚乙二醇)、PVA(聚乙烯醇)、PEOz(聚(2-乙基-2噁唑啉))、HPMC(羟基丙基甲基纤维素)、PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)。将制备的各聚合物溶液与γ-氧化铝载体混合，制作各表面吸附了聚合物的γ-氧化铝载体。除此以外的操作与实施例1同样。
其结果示于表4。实时PCR的扩增循环数(Cq值)为35以下，由此可知，使用使ζ电位为±10mV的范围的中性的水溶性聚合物吸附于γ-氧化铝表面而得的载体，能够从300μL这样少量的血浆有效地回收无细胞DNA。
表4
＜比较例4＞使用二氧化硅载体进行的无细胞DNA回收
作为体液试样使用从CureLine社获得的未患癌的女性和男性来源的血浆、以及从CureLine社获得的乳癌患者(女性)的血浆，除此以外，通过与比较例3同样的方法进行无细胞DNA的回收，使用Quantus Fluorometer(注册商标)测定DNA浓度。结果示于表5。
由这些结果可知，任一样本均为测定限界以下的值0.005ng/μL，在使用二氧化硅载体的情况下，不能从300μL的未患癌样本来源的血浆和癌患者来源的血浆回收无细胞DNA。
＜实施例6＞使用表面吸附了水溶性的中性聚合物PEG的γ-氧化铝载体进行的无细胞DNA回收(蛋白质变性剂：脲)
除了使用实施例1中使用的载体以外，从与比较例4同样的样本通过与比较例4同样的操作进行无细胞DNA的回收。将回收的无细胞DNA的浓度用与比较例4同样的方法确认。结果示于表5。
其结果是，从未患癌的男性来源的血浆得到0.0149pg/μL，从未患癌的女性来源的血浆得到0.0077pg/μL，从乳癌患者来源的血浆得到0.0323pg/μL。
表5
*N.D.(小于0.005ng/μl)
＜比较例5＞使用二氧化硅载体从癌患者来源血浆来源无细胞DNA进行的基因突变的检测
利用使用二氧化硅载体的无细胞DNA回收试剂盒(サーモフィッシャー株式会社、MagMax cell-FreeDNA Isolation kit)，从体液试样300μL回收无细胞DNA，检测癌特异的基因突变。作为体液试样，使用从CureLine社获得的未患癌的女性和男性来源的血浆、以及从CureLine社获得的肺癌(男性)患者的血浆。无细胞DNA的回收方法与比较例3中作为变性剂使用RLT的方法同样地实施。将所得的溶出液的1/25的体积制成20μL使用，通过数字PCR检测肺癌患者特异的EGFR exon19 deletion(EGFR第19外显子删除)突变。结果示于表6。其结果是，在未患癌的男性、女性的样本中未检测到基因突变，但从肺癌患者的无细胞DNA以49.45％的频率检测到EGFR exon19 deletion突变。
＜实施例7＞从使用表面吸附了PEG的γ-氧化铝载体回收的无细胞DNA进行的基因突变的检测
使用与比较例3中作为变性剂使用RLT的方法同样的方法，从与比较例5相同的样本未患癌的男性、女性、和肺癌患者的血浆300μL回收无细胞DNA，检测癌特异的基因突变。将所得的溶出液的1/25的体积制成20μL使用，通过数字PCR检测肺癌患者特异的EGFRexon19 deletion突变。其结果是，在未患癌的男性、女性的样本中未检测到基因突变，但从肺癌患者的无细胞DNA以55.82％的频率检测到EGFR exon19 deletion突变。该数值比通过比较例5的方法得到的基因突变检测频率(49.45％)高(表6)，因此显示本发明的方法能够比已有的方法更高灵敏度地检测癌特异的基因突变。
表6
＜比较例6＞根据使用二氧化硅载体回收的无细胞DNA量进行的癌的检测
利用使用二氧化硅载体的无细胞DNA回收试剂盒(サーモフィッシャー株式会社、MagMax cell-FreeDNA Isolation kit)，从体液试样300μL回收无细胞DNA，使用通过实时PCR测定的无细胞DNA量来检测癌的有无。作为体液试样，使用从CureLine社获得的未患癌的女性和男性来源的血浆、以及从CureLine社获得的肺癌(男性)、乳癌(女性)、和大肠癌(男性)的血浆。无细胞DNA的回收方法与比较例3中作为变性剂使用RLT的方法同样地实施。DNA溶出到50μL中，分取10倍稀释后的4μL，通过实时PCR检测由为了更容易检测癌来源的无细胞DNA而设计的序列1和序列3的引物扩增的、肌动蛋白序列基因的片段约306bp。通过使检测对象的碱基长比300bp长，从而捕捉非癌细胞难以释放、但癌细胞释放的无细胞DNA，尝试区分非癌与癌。以未患癌的男性、和未患癌的女性来源的样本测定值的95％置信下限区间作为基线，由此将无细胞DNA量多达1.5倍以上(PCR循环数约少至0.59)样本作为检测到癌，判定为癌阳性，将不是这样的样本作为检测不到癌，判定为癌阴性。
在上述的判断基准中应用各个样本的PCR循环数，则肺癌患者和大肠癌患者来源的样本与未患癌样本的基线相比更多地检测到细胞DNA量，因此判定为癌阳性。另一方面，乳癌患者来源的样本与未患癌样本来源的测定值的基线重合，判定为阴性。因此，本法对于3个癌样本中的1个样本不能判定为癌，因此灵敏度为66％。
＜实施例8＞利用使用表面吸附了PEG的γ-氧化铝载体回收的无细胞DNA量进行的癌的检测
使用与实施例2中作为变性剂使用RLT的方法同样的方法，从与比较例6相同的体液试样300μL回收无细胞DNA，使用通过实时PCR测定的无细胞DNA量来检测癌的有无。无细胞DNA的回收方法与比较例3中作为变性剂使用RLT的方法同样地实施。DNA溶出到50μL中，分取10倍稀释后的4μL，通过实时PCR检测由为了更容易检测癌来源的无细胞DNA而设计的序列1和序列3的引物扩增的肌动蛋白序列基因的片段。关于癌的有无的判定，与比较例6同样地实施。其结果是，肺癌(男性)、乳癌(女性)、大肠癌(男性)患者的血浆分别比未患癌样本的基线更多地检测到无细胞DNA量，全部样本判定为癌阳性。因此，本法中3个癌样本中的3个样本全部为阳性，因此灵敏度为100％。该灵敏度比比较例6的方法中得到的灵敏度(66％)高(表7)，显示本发明的方法能够比已有的方法更高灵敏度地从无细胞DNA检测癌。
表7

Claims (9)

1.无细胞DNA的回收方法，是从体液试样中回收无细胞DNA的方法，包括以下工序：
工序a，将表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝的载体与所述体液试样混合，使所述载体吸附无细胞DNA的工序，
工序b，从工序a中混合而成的混合物中分离吸附了所述无细胞DNA的载体的工序，和
工序c，在工序b中分离而得的吸附了所述无细胞DNA的载体中加入溶出液并回收无细胞DNA的工序。
2.根据权利要求1所述的无细胞DNA的回收方法，所述体液试样是全血、血清、血浆、尿或唾液。
3.根据权利要求1或2所述的无细胞DNA的回收方法，所述水溶性的中性聚合物是在pH7的溶液中具有-10mV～+10mV的ζ电位的聚合物。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的无细胞DNA的回收方法，所述聚合物是聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-噁唑啉)或羟基丙基甲基纤维素。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的无细胞DNA的回收方法，所述溶出液是缓冲液。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的无细胞DNA的回收方法，将所述体液试样用蛋白质变性剂进行处理。
7.根据权利要求6所述的无细胞DNA的回收方法，所述蛋白质变性剂是离液盐或蛋白质变性酶。
8.基因突变的检测方法，是分析无细胞DNA的基因序列、检测对癌特异的基因突变的方法，包括：
使用权利要求1～7的任一项所述的无细胞DNA的回收方法从受检者的体液试样中回收无细胞DNA的工序，和
从该回收而得的无细胞DNA中检测对癌特异的基因突变的工序。
9.癌的检测方法，是通过将受检者来源的无细胞DNA量与未患癌样本来源的无细胞DNA量进行比较来检测癌的检测方法，包括：
使用权利要求1～7的任一项所述的无细胞DNA的回收方法从受检者和未患癌样本的体液试样回收无细胞DNA的工序，和
将该回收而得的受检者来源的无细胞DNA量与未患癌样本来源的无细胞DNA量进行比较来检测癌的工序。
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