CN110455895B - 硫堇功能化复合膜电化学dna传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种硫堇功能化还原的氧化石墨烯/类水滑石电化学DNA传感器及其制备方法和应用。先以ZIF‑67为模板制备了钴铝类水滑石，经与氧化石墨烯静电组装制备了氧化石墨烯/类水滑石复合物，通过硫堇功能化和水合肼还原制得了硫堇功能化还原的氧化石墨烯/类水滑石纳米复合物，制备了修饰电极，再将副溶血弧菌探针ssDNA通过静电作用固定在修饰电极表面，制备所述的副溶血弧菌DNA传感器。该DNA传感器具有良好的灵敏性和选择性、较低的检测限和较宽的线性范围。该制备方法包括：电极修饰材料的制备；电化学副溶血弧菌DNA传感器的制备；电化学副溶血弧菌DNA传感器与目标DNA的杂交；传感器电化学信号检测。
Description
技术领域：
本发明属于生物电化学传感器技术领域，具体涉及一种硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石的无标记电化学DNA传感器及其制备方法，以及用于高灵敏检测致病性副溶血弧菌的特异性DNA。
背景技术：
近年来，DNA在基因筛选和检测中的应用引起了人们的广泛关注。尽管到目前为止进行了大量的研究，但仍然希望能够开发出更稳定、更灵敏、更快速的传感器。最近，由于基于荧光的传感器需要染料标记过程且标记过程中效率低，因此许多人致力于开发无标签的DNA传感器。电化学DNA传感器作为荧光传感器的替代物，已经得到了广泛的研究，它们显示出高灵敏度、高特异性、快速反应和简易化等优点。纳米材料由于表面体积比大、电子转移快速、生物相容性强、信号强度高等特点被广泛应用于电化学DNA传感器平台。
沸石咪唑酯骨架结构(ZIF)是金属有机骨架(MOF)的一个子类，它由自组装过渡金属离子和有机配体组成具有周期性多孔结构，在许多领域被认为是一类有前途的先进材料。此外，具有高比表面积的多孔结构赋予ZIF可作为制备过渡金属复合材料的模板。在此基础上，提出了衍生自ZIF模板的LDH的制备方法。然而，电子传导能力差的主要问题仍未得到解决，因此电化学性能不佳。
单层石墨烯作为一种二维材料，由于其独特的物理化学性质，如比表面积大、导电性好、机械强度高、易于功能化等特点，受到越来越多的关注。当石墨烯与其他纳米结构结合进行电化学检测时，利用石墨烯和其它纳米结构的固有特性，可以大大提高目标DNA的灵敏度。然而，由于范德华力的存在，GO容易发生团聚，使其难以在复合材料中很好地分散。为了克服这一缺陷，在表面改性方面做了大量的工作，结果表明，用LDH对GO表面改性后再进行还原，可明显阻止石墨烯纳米片的聚集，从而提高其导电性能和电化学传感性能。
各种基于石墨烯或其衍生物的电化学DNA生物传感器通常需要杂交指示剂或标记的DNA探针，制备过程繁复杂。为了克服探针标记或指示剂的使用，人们越来越多地研究开发无标记电化学DNA生物传感器。硫堇(Thi)是一种具有电化学活性的阳离子吩噻嗪染料，由于其平面芳香结构，它可以通过π-π相互作用与GO结合。并且，在电极上修饰时，它可以与双链DNA通过插层和静电相互作用结合，使其自身的氧化还原信号减少。Thi的这一性质使其不仅可以用于修饰GO纳米片，而且可作为信号指示构建DNA电化学传感器。
本发明介绍了一种利用Thi的电化学性质进行DNA检测的无标签电化学检测的方法。采用简单的离子交换法将金属-有机骨架衍生制备CoAl-LDH，再通过静电组装、水合肼还原和硫堇功能化制备Thi-rGO-LDH，将Thi-rGO-LDH复合物修饰到金电极上，并通过静电作用将DNA固定到修饰电极表面。由于Thi-rGO-LDH复合材料具有良好的导电性和较大的比表面积，为电化学检测提供了信号放大功能。与其它报道的方法相比，该方法对目标DNA的检出限较低，线性范围宽，选择性好，可实现对副溶血弧菌特征DNA的高灵敏无标记检测。
发明内容：
针对现有DNA传感检测技术的不足以及本领域研究和应用的需求，本发明的目的之一是提供一种硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石的无标记电化学DNA传感器，所述电化学DNA传感器以金电极为基底电极，以硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石复合膜为电极修饰材料；探针ssDNA通过静电作用及非价键相互作用固定在修饰电极表面；所述硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石复合膜是先以ZIF-67模板衍生制备类水滑石，然后再通过静电相互作用与氧化石墨烯复合，再通过硫堇功能化和水合肼还原氧化石墨烯/类水滑石复合物，制得硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石纳米复合物；所述类水滑石为钴铝型类水滑石，记为CoAl-LDH；所述金电极记为GE；所述还原氧化石墨烯记为rGO；所述硫堇记为Thi；所述硫堇功能化还原氧化石墨烯水滑石记为Thi-rGO-LDH；
本发明的目的之二是提供一种硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石的电化学DNA传感器的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：
(1)CoAl-LDH的制备
将含有720mg Co(NO3)2·6H2O和20mg CTAB分散于50mL甲醇溶液中，在25～60℃搅拌条件下将50mL浓度为32mg/mL的2-甲基咪唑甲醇溶液滴加至上述甲醇溶液中，搅拌15min，在相同温度下老化24h，离心收集沉淀，分别用水和甲醇依次洗涤3次，干燥后即为ZIF-67；称取40mg ZIF-67分散于20mL乙醇中，超声30min，在搅拌条件下，将50～200mg的Al(NO3)3·9H2O溶于10mL乙醇中缓慢滴加到上述溶液中，混合物在50～150℃下搅拌回流1.5h，紫色溶液慢慢变成淡粉色，通过离心收集沉淀，用乙醇洗涤3次后即为CoAl-LDH；
(2)Thi-rGO-LDH复合物的制备
将一定量所得GO分散于去离子水中，超声分散2h，得到浓度为1.0mg/mL的GO分散液；再将20mg CoAl-LDH分散于20mL水中，超声分散均匀，在搅拌条件下，将10mL上述GO分散液缓慢滴加上述分散液中，搅拌1h，离心收集沉淀，分别用水和无水乙醇洗涤3次后即为GO-LDH复合物；50mL浓度0.1～0.5mg/mL GO-LDH溶液与10mL浓度为2mM的Thi溶液室温条件下混合搅拌16h，然后200μL 80％的NH2NH2·H2O溶液逐滴加入其中，继续搅拌10min，将所得混合物在50～150℃回流1h；离心收集黑色沉淀，经去离子水洗涤3次，室温干燥即得Thi-rGO-LDH；
(3)Thi-rGO-LDH修饰金电极的制备
金电极分别用0.3μm和0.05μm的A12O3抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，分别用去离子水和乙醇进行超声处理；将步骤(2)中得到的Thi-rGO-LDH复合物超声分散于去离子中，配制成浓度为2mg/mL的分散液，取0.5～50μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到Thi-rGO-LDH修饰的金电极，记为Thi-rGO-LDH/GE；
(4)DNA传感器的制备
将1～100μL浓度为1μM的探针ssDNA滴涂到修饰电极表面，25～70℃下孵育2h，由于ssDNA与Thi的静电作用，将DNA固定到修饰电极上，然后用PBS进行冲洗，除去未固定的探针DNA；然后在35℃将10μL不同浓度的互补DNA滴加到上述修饰电极表面孵育60分钟，用PBS进行冲洗，去除未杂交的目标DNA完成电化学DNA传感器的制备。
步骤(1)中制备ZIF-67的过程中，加热温度为30-50℃；步骤(2)中用NH2NH2·H2O还原时的温度为80-120℃，该步骤所得Thi-rGO-LDH复合物中LDH保持了多面体结构，其粒径大小为20-50nm；步骤(4)中使用的PBS的浓度为0.1mol/L，pH为7；该步骤所得DNA传感器克服了探针的标记或指示剂的使用，同时保持了传感器良好的灵敏度和选择性。
本发明目的之三是提供一种硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石的电化学DNA传感器用于副溶血弧菌的检测应用。
与现有技术相比，本发明的主要优点在于：所述硫堇功能化还原氧化石墨烯水滑石的电化学DNA传感器的修饰材料中，由于模板作用，复合物中LDH保留了ZIF的多孔结构和形貌，与Thi和rGO发挥了相互的协同作用，提高了复合膜的比表面积、导电性和分散性，增加了活性位点，大大增强了对探针ssDNA的固定能力；保留了Thi-rGO-LDH复合膜中Thi的电化学活性，无需额外探针的标记或指示剂的使用。以上优点整体上简化了DNA电化学传感器的制备，并提高了其检测特征DNA的性能，对高灵敏无标记检测致病性副溶血弧菌具有重要的理论意义和潜在的应用价值。该传感器具有灵敏度高选择性好，尤其具有较低的检测限和较宽的线性范围；制备方法简单，检测速度快。
附图说明：
图1为实施例1所得Thi-rGO-LDH的扫描电镜图。
图2为对比例1、对比例4和实施例1分别对应的GE(a)、GO-LDH/GE(b)、Thi-GO-LDH/GE(c)、ssDNA/Thi-rGO-LDH/GE(d)和dsDNA/Thi-rGO-LDH/GE(e)在PBS(0.1M,pH＝7)缓冲液中以及对比例1对应的GE(f)在2.0mM Thi的PBS缓冲液中的CV结果。
图3为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和实施例1分别对应的GE(a)、ZIF-67/GE(b)、LDH/GE(c)、GO-LDH/GE(d)、Thi-GO-LDH/GE(e)、ssDNA/Thi-rGO-LDH/GE(f)和dsDNA/Thi-rGO-LDH/GE(g)在5mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl的PBS(0.1M,pH＝7)缓冲液中的CV结果。
图4为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和实施例1分别对应的GE(a)、ZIF-67/GE(b)、LDH/GE(c)、GO-LDH/GE(d)、Thi-GO-LDH/GE(e)、ssDNA/Thi-rGO-LDH/GE(f)和dsDNA/Thi-rGO-LDH/GE(g)在5mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl的PBS(0.1M,pH＝7)缓冲液中的电化学阻抗结果。
图5为实施例1对应的固定有探针ssDNA的Thi-rGO-LDH/GE(a)、与非互补DNA杂交(b)、与三碱基错配DNA杂交(c)、与单碱基错配DNA杂交(d)和完全互补DNA杂交后(e)的DPV结果。
图6为不同浓度目标ssDNA与实施例1对应DNA传感器杂交后的DPV响应结果(a-l):0，1.0×10-17，1.0×10-16，1.0×10-15，1.0×10-14，1.0×10-13，1.0×10-12，1.0×10-11，1.0×10-10，1.0×10-9，1.0×10-8，1.0×10-7M，插图为Ipc与logC之间的线性关系图。
具体实施方式：
为进一步理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但并不以任何方式限制本发明。
本发明解决所述电化学副溶血性弧菌DNA传感器的技术方案是，通过简单的滴涂法将Thi-rGO-LDH复合材料组装在GE表面，并通过共价键合法将氨基化DNA固定在电极上，制得基于Thi-rGO-LDH纳米材料的电化学生物传感器。以金电极为基底电极，依次进行电极的修饰和探针ssDNA的组装，探针ssDNA是识别元件。生物连接剂是EDC和NHS。所述的ssDNA探针序列可以根据A-T，G-C对应的原则得出。
上述DNA链段是下述DNA编码序列：
从副溶血性弧菌tlh基因序列中筛选的DNA编码序列，例如：
探针ssDNA：5’-NH2-GATGACACTGCCAGATGCGACGA-3’；
目标ssDNA：5’-TCGTCGCATCTGGCAGTGTCATC-3’；
单碱基错配DNA：5’-TCGTCGCATCTAGCAGTGTCATC-3’；
三碱基错配DNA：5’-TAGTCGCATCTAGCAGTGTCAGC-3’；
非互补DNA：5’-ATCCTTTGCAATTGCCCAGTCGG-3’
实施例1：
(1)CoAl-LDH的制备
将720mg Co(NO3)2·6H2O和20mg CTAB溶于50mL甲醇溶液中，在35℃搅拌条件下将50mL浓度为32mg/mL的2-甲基咪唑甲醇溶液滴加至上述甲醇溶液中，搅拌15min，在相同温度下老化24h，离心收集沉淀，分别用水和甲醇依次洗涤3次，干燥后即为ZIF-67；称取40mgZIF-67分散于20mL乙醇中，超声30min，在搅拌条件下，将100mg的Al(NO3)3·9H2O溶于10mL乙醇中缓慢滴加到上述溶液中，混合物在85℃下搅拌回流1.5h，紫色溶液慢慢变成淡粉色，通过离心收集沉淀，用乙醇洗涤3次后即为CoAl-LDH；
(2)Thi-rGO-LDH复合物的制备
将一定量所得GO分散于去离子水中，超声分散2h，得到浓度为1.0mg/mL的GO分散液；再将20mg CoAl-LDH分散于20mL水中，超声分散均匀，在搅拌条件下，将10mL浓度为上述GO分散液缓慢滴加上述分散液中，搅拌1h，离心收集沉淀，分别用水和无水乙醇洗涤3次后即为GO-LDH复合物；50mL浓度0.2mg/mL的GO-LDH溶液与10mL浓度为2mM的Thi溶液室温条件下混合搅拌16h，然后将200μL 80％的NH2NH2·H2O溶液逐滴加入其中，继续搅拌10min，将所得混合物在95℃回流1h；离心收集黑色沉淀，经去离子水洗涤3次，室温干燥即得Thi-rGO-LDH；
(3)Thi-rGO-LDH修饰金电极的制备
金电极分别用0.3μm和0.05μm的A12O3抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，分别用去离子水和和乙醇进行超声处理；将步骤(2)中得到的Thi-rGO-LDH复合物超声分散于去离子中，配制成浓度为2mg/mL的分散液，取4μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到Thi-rGO-LDH修饰的金电极，记为Thi-rGO-LDH/GE；
(4)DNA传感器的制备
将10μL浓度为1μM的探针ssDNA滴涂到修饰电极表面，25℃下孵育2h，由于DNA与Thi的静电作用，将ssDNA固定到修饰电极上，然后用PBS(0.1M,pH＝7)进行冲洗，除去未固定的探针DNA；然后在35℃将10μL不同浓度的互补DNA滴加到上上述修饰电极表面孵育60分钟，用PBS(0.1M,pH＝7)进行冲洗，去除未杂交的目标DNA完成电化学DNA传感器的制备。
实施例2：
(1)CoAl-LDH的制备
将720mg Co(NO3)2·6H2O和20mg CTAB溶于50mL甲醇溶液中，在35℃搅拌条件下将50mL浓度为32mg/mL的2-甲基咪唑甲醇溶液滴加至上述甲醇溶液中，搅拌15min，在相同温度下老化24h，离心收集沉淀，分别用水和甲醇依次洗涤3次，干燥后即为ZIF-67；称取40mgZIF-67分散于20mL乙醇中，超声30min，在搅拌条件下，将50mg的Al(NO3)3·9H2O溶于10mL乙醇中缓慢滴加到上述溶液中，混合物在85℃下搅拌回流1.5h，紫色溶液慢慢变成淡粉色，通过离心收集沉淀，用乙醇洗涤3次后即为CoAl-LDH；
(2)Thi-rGO-LDH复合物的制备
按照实施例1中步骤(2)的方法和条件制备；
(3)Thi-rGO-LDH修饰金电极的制备
按照实施例1中步骤(3)的方法和条件制备；
(4)DNA传感器的制备
按照实施例1中步骤(4)的方法和条件制备；
实施例3：
(1)CoAl-LDH的制备
将720mg Co(NO3)2·6H2O和20mg CTAB溶于50mL甲醇溶液中，在35℃搅拌条件下将50mL浓度为32mg/mL的2-甲基咪唑甲醇溶液滴加至上述甲醇溶液中，搅拌15min，在相同温度下老化24h，离心收集沉淀，分别用水和甲醇依次洗涤3次，干燥后即为ZIF-67；称取40mgZIF-67分散于20mL乙醇中，超声30min，在搅拌条件下，将200mg的Al(NO3)3·9H2O溶于10mL乙醇中缓慢滴加到上述溶液中，混合物在85℃下搅拌回流1.5h，紫色溶液慢慢变成淡粉色，通过离心收集沉淀，用乙醇洗涤3次后即为CoAl-LDH；
(2)Thi-rGO-LDH复合物的制备
按照实施例1中步骤(2)的方法和条件制备；
(3)Thi-rGO-LDH修饰金电极的制备
按照实施例1中步骤(3)的方法和条件制备；
(4)DNA传感器的制备
按照实施例1中步骤(4)的方法和条件制备。
实施例4：
(1)CoAl-LDH的制备
将720mg Co(NO3)2·6H2O和20mg CTAB溶于50mL甲醇溶液中，在50℃搅拌条件下将50mL浓度为32mg/mL的2-甲基咪唑甲醇溶液滴加至上述甲醇溶液中，搅拌15min，在相同温度下老化24h，离心收集沉淀，分别用水和甲醇依次洗涤3次，干燥后即为ZIF-67；称取40mgZIF-67分散于20mL乙醇中，超声30min，在搅拌条件下，将100mg的Al(NO3)3·9H2O溶于10mL乙醇中缓慢滴加到上述溶液中，混合物在95℃下搅拌回流1.5h，紫色溶液慢慢变成淡粉色，通过离心收集沉淀，用乙醇洗涤3次后即为CoAl-LDH；
(2)Thi-rGO-LDH复合物的制备
按照实施例1中步骤(2)的方法和条件制备；
(3)Thi-rGO-LDH修饰金电极的制备
按照实施例1中步骤(3)的方法和条件制备；
(4)DNA传感器的制备
按照实施例1中步骤(4)的方法和条件制备。
实施例5：
(1)CoAl-LDH的制备
按照实施例1中步骤(1)的方法和条件制备；
(2)Thi-rGO-LDH复合物的制备
按照实施例1中步骤(2)的方法和条件制备；
(3)Thi-rGO-LDH修饰金电极的制备
金电极分别用0.3μm和0.05μm的A12O3抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，分别用去离子水和和乙醇进行超声处理；将步骤(2)中得到的Thi-rGO-LDH复合物超声分散于去离子中，配制成浓度为2mg/mL的分散液，取8μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到Thi-rGO-LDH修饰的金电极，记为Thi-rGO-LDH/GE；
(4)DNA传感器的制备
按照实施例1中步骤(4)的方法和条件制备。
对比例1：
按照实施例1中步骤(4)的方法和条件，直接将探针ssDNA固定在裸的GE表面。
对比例2：
(1)ZIF-67修饰金电极的制备
按照实施例1中步骤(3)的方法和条件，配制浓度为2mg/mL的ZIF-67分散液，取4μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到ZIF-67/GE；
(2)DNA传感器的制备
按照实施例1中步骤(4)的方法和条件，将探针ssDNA固定在裸的ZIF-67/GE表面。
对比例3：
(1)LDH修饰金电极的制备
按照实施例1中步骤(3)的方法和条件，配制浓度为2mg/mL的LDH分散液，取4μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到LDH/GE；
(2)DNA传感器的制备
按照实施例1中步骤(4)的方法和条件，将探针ssDNA固定在裸的LDH/GE表面。
对比例4：
(1)GO-LDH复合物的制备
按照实施例1中步骤(1)和(2)中前半段描述的方法和条件制备GO-LDH复合物；
(2)GO-LDH修饰金电极的制备
按照实施例1中步骤(3)的方法和条件，配制浓度为2mg/mL的GO-LDH分散液，取4μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到GO-LDH/GE；
(3)DNA传感器的制备
按照实施例1中步骤(4)的方法和条件，将探针ssDNA固定在GO-LDH/GE表面。
图1为实施例1所得Thi-rGO-LDH的扫描电镜图。将ZIF-67衍生制备的CoAl-LDH与GO复合，通过Thi功能化和水合肼还原后制备得了Thi-rGO-LDH复合物，其表面生长的粗糙的LDH纳米粒子保持了ZIF-67模板的多面体结构，粒径大小为20-50nm，它们均匀地锚定在GO纳米片上。结果表明，在ZIF-67与Co(NO3)2高温反应生成CoAl-LDH的过程中，ZIF-67的多面体结构没有被破坏，而是转化为空心纳米晶体结构，并且在表面生成了LDH纳米片状结构。
图2为对比例1、对比例4和实施例1分别对应的GE(a)、GO-LDH/GE(b)、Thi-GO-LDH/GE(c)、ssDNA/Thi-rGO-LDH/GE(d)和dsDNA/Thi-rGO-LDH/GE(e)在PBS(0.1M,pH＝7)缓冲液中以及对比例1对应的GE(f)在2.0mM Thi的PBS缓冲液中的CV结果。由图2可知，在缓冲溶液中裸的GE(a)和GO-LDH/GE(b)上均未观察到氧化还原峰，但GO-LDH/GE的背景电流信号明显高于裸GE，这可归因于GO-LDH复合膜的电化催化活性。然而，Thi-rGO-LDH/GE(c)中有一对可逆的氧化还原峰，这与在含2.0mM Thi的PBS溶液中裸GE处获得的氧化还原峰相似，但峰电流最大。上述结果表明硫堇存在于Thi-rGO-LDH复合物中，并保持了其优异的氧化还原活性。将探针ssDNA组装到修饰电极表面形成ssDNA/Thi-rGO-LDH/GE(d)后，由于Thi的电子传递受到ssDNA的阻碍，导致其氧化峰电流降低。当探针ssDNA与目标DNA成功杂交并形成dsDNA/Thi-rGO-LDH/GE(e)后，考虑到双链DNA的进一步阻碍电子传递，因此氧化还原峰电流进一步降低，但仍然保持良好的氧化还原峰形。这些结果表明，Thi在复合膜中很好地保持了电化学活性，使其适用于电化学生物传感领域。
图3为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和实施例1分别对应的GE(a)、ZIF-67/GE(b)、LDH/GE(c)、GO-LDH/GE(d)和Thi-GO-LDH/GE(e)，以及实施例1中对应的ssDNA/Thi-rGO-LDH/GE(f)和dsDNA/Thi-rGO-LDH/GE(g)在5mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol L-1KCl的PBS(0.1M,pH＝7)缓冲液中的CV结果。由图3可知，裸GE(a)有一对可逆的氧化还原峰。当在GE电极表面组装ZIF-67薄膜(b)后，氧化还原峰电流升高，这是由于ZIF-67具有高的比表面积和多的孔隙率促进了电子传递。将LDH组装到裸金电极表面(c)后，氧化还原电流进一步增强，这是由于以ZIF-67为模板生长的LDH纳米片，不仅具有高的孔隙度和比表面积，而且还具有特殊的层状结构。在GE表面修饰GO-LDH薄膜(d)后，电流信号明显增强，这是由于GO纳米片和LDH相互抑制彼此的聚集，使得两种纳米片得到了很好的分散，它们的协同效应促进了电子的传递速率。当在GE表面组装Thi-rGO-LDH薄膜(e)后，与其它修饰电极相比氧化还原电流增强，这是由于GO还原后，导电性增强所致。通过静电作用将探针ssDNA组装到Thi-rGO-LDH/GE表面(f)后，氧化还原峰电流值减小，表明非导电的ssDNA固定在修饰电极表面。当目标DNA和探针DNA杂交后，峰电流进一步下降。结果可归因于负电荷DNA分子阻断了[Fe(CN)6]3-/4-的电子转移。显然，这种峰电流变化与目标DNA的选择性结合可以作为DNA传感器的传感信号。
图4为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和实施例1分别对应的GE(a)、ZIF-67/GE(b)、LDH/GE(c)、GO-LDH/GE(d)和Thi-GO-LDH/GE(e)，以及实施例1对应的ssDNA/Thi-rGO-LDH/GE(f)和dsDNA/Thi-rGO-LDH/GE(g)在5mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol L-1KCl的PBS(0.1M,pH＝7)缓冲液中的电化学阻抗结果。电化学阻抗谱图中的半圆直径可表示电子转移电阻(Ret)，低频线性部分代表扩散过程。从图中可以看出，裸GE的Ret值较大(a)，而在GE表面修饰ZIF-67薄膜(b)后，与裸GE相比Ret值变小，可归因于ZIF-67具有大的孔隙率，从而提高了电极的活性面积。当在GE表面修饰由ZIF-67衍生而得的LDH纳米片(c)后，Ret值进一步变小，这是由于所得LDH纳米片高的孔隙度、大的比表面积和特殊的层状结构有效降低了电子传递阻力。将GO-LDH复合物修饰到GE表面(d)后，Ret值大大减小，表明GO和LDH纳米片复合后具有协同作用，增强了复合膜的导电能力和电子传递速率。当Thi-rGO-LDH复合物修饰到GE表面(e)后，与其它修饰电极相比Ret值最小，结果表明，Thi-rGO-LDH具有更佳的导电性能和更快的电子传递速率。在Thi-rGO-LDH/GE表面固定探针ssDNA(f)后，[Fe(CN)6]3-/4-的氧化还原峰电流降低，这是由于带负电荷的探针DNA和[Fe(CN)6]3-/4-之间的静电斥力阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-到达电极表面。这表明探针DNA已成功地固定在电极表面。当ssDNA/Thi-rGO-LDH/GE与目标DNA杂交后(g)峰电流进一步降低，表明目标DNA的引入增加了DNA中磷酸骨架的负电荷，这导致电极表面氧化还原物质的排斥性增加。上述结果表明，目标DNA成功与Thi-rGO-LDH/GE上的探针DNA杂交。
实施例5：
分别将不同浓度互补DNA滴加到对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和实施例1对应的固定有探针ssDNA的GE、ZIF-67/GE、LDH/GE、GO-LDH/GE和Thi-rGO-LDH/GE表面，在35℃下孵育60min进行杂交，杂交后依次用pH为7的PBS和去离子水对电极进行冲洗，去除为杂交的目标DNA，完成DNA分子在电极表面的杂交。
以固定有探针ssDNA的不同修饰金电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，Thi-rGO-LDH复合物中的Thi作为指示剂，检测底液为PBS(0.1M,pH＝7)缓冲液，在电化学工作站测试不同修饰电极的CV和DPV曲线，扫描电位为-0.5～0.2V，扫描速度为100mV/s。观察峰型变化，记录还原峰电流值。
图5为实施例1对应的固定有探针ssDNA的Thi-rGO-LDH/GE(a)、与非互补DNA杂交(b)、与三碱基错配DNA杂交(c)、与单碱基错配DNA杂交(d)和完全互补DNA杂交后(e)的DPV结果。由图可看出，当固定有探针ssDNA的Thi-rGO-LDH/GE与单碱基错配的DNA杂交后(d)，其伏安响应和与完全互补DNA杂交后(e)的结果相比，其峰电流信号有所增强。与此类似，探针ss DNA与三碱基错配的DNA杂交后(c)，峰电流信号进一步增强。当与完全非互补DNA杂交后(b)，峰电流信号明显变大，但固定有ssDNA的Thi-rGO-LDH/GE(a)给出了最大峰电流。这说明基于Thi-rGO-LDH/GE的DNA传感器具有很高的选择性，可以区分出单碱基、三碱基错配和非互补DNA。
图6为不同浓度目标ssDNA与实施例1对应DNA传感器杂交后的DPV响应结果(a-l):0，1.0×10-17，1.0×10-16，1.0×10-15，1.0×10-14，1.0×10-13，1.0×10-12，1.0×10-11，1.0×10-10，1.0×10-9，1.0×10-8，1.0×10-7M，插图为Ipc与logC之间的线性关系图。由图看出，DPV的峰电流值随着目标DNA浓度的增加而降低，这表明探针DNA和目标DNA的特异性识别增多，进而阻碍了Thi的电子传递速率。插图显示DPV的峰电流值与目标DNA浓度在1.0×10-17-1.0×10-7M范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为Ipc(μA)＝-0.467logC(M)–0.609，相关系数(R2)为0.996，其中Ipc和C分别代表氧化峰电流和目标DNA浓度，检测限为6.83×10-18M(S/N＝3)。表明本发明构建电化学DNA传感器线性范围宽，检测限较低，具有灵敏检测DNA的潜力。
表1为本发明Thi-rGO-LDH/GE的副溶血弧菌DNA传感器与其DNA传感器分析性能比较
从表1可看出，采用本发明所述的基于Thi-rGO-LDH/GE的电化学DNA传感器与其它电化学DNA传感器相比，具有线性范围宽和检测限低的特点和优势，说明Thi-rGO-LDH纳米复合膜促进了电子转移，增加了探针DNA的固定量，降低了检出限。
序列表
<120> 硫堇功能化还原的氧化石墨烯/类水滑石的电化学DNA传感器及其制备方法和应用
<140> 2019107686908
<141> 2019-08-20
<160> 0
<170> SIPOSequenceListing 1.0
GATGACACTGCCAGATGCGACGA
TCGTCGCATCTGGCAGTGTCATC
TCGTCGCATCTAGCAGTGTCATC
TAGTCGCATCTAGCAGTGTCATC
ATCCTTTGCAATTGCCCAGTCGG
Claims (3)
1.一种硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石的电化学DNA传感器，其特征在于所述电化学DNA传感器以金电极为基底电极，以硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石复合膜为电极修饰材料；探针ssDNA通过静电作用及非价键相互作用固定在修饰电极表面；所述硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石复合膜是先以ZIF-67模板衍生制备类水滑石，然后再通过静电相互作用与氧化石墨烯复合，再通过硫堇功能化和水合肼还原氧化石墨烯/类水滑石复合物，制得硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石纳米复合物；所述类水滑石为钴铝型类水滑石，记为CoAl-LDH；所述金电极记为GE；所述还原氧化石墨烯记为rGO；所述硫堇记为Thi；所述硫堇功能化还原氧化石墨烯水滑石记为Thi-rGO-LDH；
硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石的电化学DNA传感器的制备方法包括以下具体步骤：
(1)CoAl-LDH的制备
将720mg Co(NO3)2·6H2O和20mg CTAB溶于50mL甲醇溶液中，在25～60℃搅拌条件下将50mL浓度为32mg/mL的2-甲基咪唑甲醇溶液滴加至上述甲醇溶液中，搅拌15min，在相同温度下老化24h，离心收集沉淀，分别用水和甲醇依次洗涤3次，干燥后即为ZIF-67；称取40mgZIF-67分散于20mL乙醇中，超声30min，在搅拌条件下，将50～200mg的Al(NO3)3·9H2O溶于10mL乙醇中缓慢滴加到上述溶液中，混合物在50～150℃下搅拌回流1.5h，紫色溶液慢慢变成淡粉色，通过离心收集沉淀，用乙醇洗涤3次后即为CoAl-LDH；
(2)Thi-rGO-LDH复合物的制备
将一定量所得GO分散于去离子水中，超声分散2h，得到浓度为1.0mg/mL的GO分散液；再将20mg CoAl-LDH分散于20mL水中，超声分散均匀，在搅拌条件下，将10mL上述GO分散液缓慢滴加上述分散液中，搅拌1h，离心收集沉淀，分别用水和无水乙醇洗涤3次后即为GO-LDH复合物；50mL浓度0.1～0.5mg/mL GO-LDH溶液与10mL浓度为2mM的Thi溶液室温条件下混合搅拌16h，然后200μL 80％的NH2NH2·H2O溶液逐滴加入其中，继续搅拌10min，将所得混合物在50～150℃回流1h；离心收集黑色沉淀，经去离子水洗涤3次，室温干燥即得Thi-rGO-LDH；
(3)Thi-rGO-LDH修饰金电极的制备
金电极分别用0.3μm和0.05μm的A12O3抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，分别用去离子水和乙醇进行超声处理；将步骤(2)中得到的Thi-rGO-LDH复合物超声分散于去离子中，配制成浓度为2mg/mL的分散液，取0.5～50μL该分散液滴涂在处理好的金电极表面，室温下自然晾干，得到Thi-rGO-LDH修饰的金电极，记为Thi-rGO-LDH/GE；
(4)DNA传感器的制备
将1～100μL浓度为1μM的探针ssDNA滴涂到修饰电极表面，25～70℃下孵育2h，由于DNA与Thi的静电作用，将ssDNA固定到修饰电极上，然后用PBS进行冲洗，除去未固定的探针DNA；然后在35℃将10μL不同浓度的互补DNA滴加到上述修饰电极表面孵育60分钟，用PBS进行冲洗，去除未杂交的目标DNA完成电化学DNA传感器的制备。
2.根据权利要求1所述硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石的电化学DNA传感器，其特征在于制备方法步骤(1)中制备ZIF-67的过程中，加热温度为30-50℃；步骤(2)中用NH2NH2·H2O还原时的温度为80-120℃，该步骤所得Thi-rGO-LDH复合物中LDH保持了多面体结构，其粒径大小为20-50nm；步骤(4)中使用的PBS的浓度为0.1mol/L，pH为7；该步骤所得DNA传感器克服了探针的标记或指示剂的使用，同时保持了传感器良好的灵敏度和选择性。
3.根据权利要求1或2所述的一种硫堇功能化还原氧化石墨烯/类水滑石的电化学DNA传感器用于副溶血弧菌的检测。
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