KR20180068985A - 복합 증폭 검출 분석 및 혈장으로부터 dna의 분리 및 검출 방법 - Google Patents

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브라이언 아이젠스테인
타마라 제이. 샌더
마리아 지아코우모포우로스
미카엘 더블유. 카이저
멜리사 엠. 그레이
아브람 미카엘 바카로
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Abstract

바이설파이트-처리된 DNA의 증폭-계 검출과 관련된 기술 및 특히 샘플 DNA를 추가로 특성화하기 전에 저 수준의 샘플 DNA의 복합 증폭을 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 상기 기술은 또한 혈액 또는 혈액 생성물 샘플, 예컨대, 혈장 샘플로부터 DNA를 분리하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

복합 증폭 검출 분석 및 혈장으로부터 DNA의 분리 및 검출 방법
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 다음에 대한 우선권을 청구한다. 미국 가특허원 일련 번호제62/249,097호(2015년 10월 30일자로 출원됨), 이는 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
핵산의 증폭계 검출에 관한 기술 및 특히, 그러나 전적이지는 않지만, 샘플 DNA의 추가의 특성화 전 저-수준의 샘플 DNA의 복합 증폭 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 상기 기술은 또한 혈액 또는 혈액 생성물 샘플, 예컨대, 혈장 샘플로부터 DNA를 분리하는 방법을 추가로 제공한다.
핵산의 정량화 방법은 분자 생물학의 많은 분야 및 특히 분자 진단학에 있어서 중요하다. DNA 수준에서, 이러한 방법은 예를 들면, 변이체 대립형질의 존재 또는 부재, 게놈 내에서 증폭된 유전자 서열의 카피 수, 및 유전자를 가로질러서 또는 유전자 내의 특정 유전자자리에서 메틸화의 양, 존재, 또는 부재를 측정하기 위해 사용된다. 또한, 핵산의 정량화 방법이 유전자 발현의 척도로서 mRNA의 양을 측정하기 위해 사용된다.
핵산 또는 핵산 서열을 검출하고 정량화하는 다수의 상이한 분석 방법들 중에서, 폴리머라제 쇄 반응(PCR)의 변형이 가장 강력하고 광범위한 기술이 되고 있으며, 이의 원리는 다음에 개시되어 있다. 미국 특허 제4,683,195호; 제4,683,202호; 및 제4,965,188호.
샘플 속에서 낮은 수준으로 존재하는 핵산을 검출하는 것은(예컨대, 질병 유전자 자리, 예컨대, 질병 유전자 자리로부터 떨어진 샘플로부터 수집된 종양으로부터의 DNA, 예컨대, 대변, 객담, 뇨, 혈장등으로 들어가는 DNA, 즉, “원격 DNA 샘플”을 검출하는 것) 어려울 수 있으며, 부분적으로 이러한 샘플에서 발견된 많은 DNA는 단지 소량으로 존재하지 않기 때문에, 이들은 또한 일반적으로 단편화된다. 다음을 참고한다. 예컨대, Ballhause의 제WO 2006/113770호, 및 Davos의 미국 특허 공보 제US 201110009277 Al호(이들 각각은 이들의 전문이 참고로 본원에 포함된다). 예를 들면, 혈장 속에서 발견된 세포-유리된 DNA(cfDNA)는 크게 단편화될 수 있으며, 관심이 있을 수 있는 DNA의 많은 것, 예컨대, 종양-기원한 DNA는 매우 작을 수 있어서, 예컨대, 길이가 200개 이하로 적은 뉴클레오타이드일 수 있다. 당해 크기의 핵산은 예컨대, 정제 컬럼에 대한 불량한 결합 또는 비효율적인 알코올 침전으로 인하여, 통상의 정제 동안 손실될 수 있다.
이러한 샘플로부터 이러한 핵산의 분석은 핵산(들) 내에 다수의 표적 또는 유전자 자리를 검출해야 할 필요가 있을 경우 특히 어렵다. 예를 들면, 목적한 표적의 카피들을 소수 갖는 수집된 표본은 예컨대, 잘못된 부정적인 결과에 의해서 개개 표적에 대한 시험의 정밀도의 위험없이 모든 표적에 대해 시험하도록 하기에 충분한 수의 분취량으로 흔히 분리될 수 없다.
저-표적 샘플 중 표적 핵산(예컨대, 게놈 DNA, cDNA, 등)의 예비-증폭을 사용하여 추가의 특정 표적 분석을 위해 샘플을 나누기 전에 샘플 속에 DNA를 농축시킬 수 있다. 예를 들면, 간단한 프라이머(예컨대, 랜덤 헥사머)를 사용한 전체 게놈 증폭을 사용하여 목적한 어떠한 특수한 표적에 대해 특이적이지 않은 방식으로, 샘플 속에서 필수적으로 모든 DNA의 양을 증가시켜 왔다. (Sigma-Aldrich's GenomePlex systems, Arneson, 등, Cold Spring Harb. Protoc.; 2008; doi:10.1101/pdb.prot4920).
다른 시도는 특수한 목적의 하나 이상의 영역을 반-표적화된 방식으로 증폭시켜, 추가로 분석될 상이한 돌연변이 또는 유전자 자리를 함유하는 증폭된 단편(앰플리콘)의 혼합물을 생산하기 위한 것이다. 동일한 프라이머를 사용한 증폭의 성공적인 라운드는 비-특이적인 증폭의 고 배경, 및 인공물, 예컨대, 인공적으로 재조합된 분자, 고 비-특이적인 배경, 및 상이한 의도된 표적의 편향된 증폭이 생산되기 쉽다. 따라서, 이러한 예비-증폭 PCR은 전형적으로 특수한 조건 예컨대., 제한된 수의 사이클 하에서 수행하고/하거나, 저 농도의 프라이머(예컨대, 표준 PCR에서보다도 10 내지 20-배 더 낮은 농도)를 사용하여 수행함으로써 비-특이적인 배경 증폭에 있어서의 증가를 피할 수 있으며, 이는 복합 예비-증폭에 있어서 약 160nM에 걸친 농도의 각각의 프라이머의 사용이 음성인 대조군 반응에서 증폭 배경을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문이다(참고: 예컨대, Andersson, 등, Expert Rev. Mol. Diagn.Early online, 1-16 (2015)).
복합 PCR에서 증폭 제1 라운드 후에, 예비-증폭된 DNA는 전형적으로 희석시키고 표준 PCR의 대표적인 조건, 예컨대, 보다 높은 농도의 시약 및 보다 많은 사이클 수를 사용하여 정량적 또는 정성적 PCR 분석을 위한 새로운 증폭 반응물로 분취하고, 제2 증폭은 일반적으로 다음을 사용하여 수행한다. 상이한 프라이머 쌍, 예컨대, 앰플리콘의 말단에서 원래의 프라이머 부위에 대해 어닐링(annealing) 하기 보다는, 예비-증폭된 단편 내 부위에 어닐링하는 “네스티드(nested)” 프라이머.
DNA가 메틸화를 위해 시험되는 경우, 메틸화 검출용 샘플을 제조하기 위해 일반적으로 사용된 공정이 샘플 DNA의 실질적인 손실을 초래한다는 사실로 인하여 분석이 또한 복잡하다. 예를 들면, 바이설파이트 처리를 전형적으로 사용하여 메틸화되지 않은 사이토신 잔기를 우라실 잔기로 전환시키지만, 당해 공정은 전형적으로 투입된 DNA의 약 30% 만이 회수된다. 또한, 바이설파이트를 사용한 처리 후 DNA의 증폭은 특히 도전중이다. 예를 들면, 메틸화되지 않는 사이토신의 전환은 DNA 서열의 복잡성을 감소시키고 처리 자체는 DNA에 대해 유의적인 손상, 예컨대, 쇄 파괴를 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이들 둘 다는 증폭 반응, 특히 복합화된(multiplexed) 증폭에 있어서 증가된 배경(background)에 기여할 수 있다.
본원에 기술된 방법의 개발 과정에서, 저-표적 샘플로부터의 바이설파이트-처리된 DNA는 전체-게놈을 예비-증폭할 필요 없이 및 네스티드 또는 반-네스티드 프라이머의 사용 없이 실시간 검출을 위해 예비-증폭되고 증폭될 수 있음이 측정되어 왔다. 놀랍게도, 표적화된 예비-증폭은 개개의 표적 유전자 자리의 증폭의 제2 라운드에서, 예컨대, 정량적인 대립형질-특이적 실시간 표적 및 시그날 증폭(QuARTS) 검정에서 사용될 동일한 프라이머 쌍의 조합을 사용하여 복합화할 수 있으며(참고: 예컨대, 미국 특허제8,361,720호, 제8,715,937호 및 제8,916,344호), 상기 검정은 PCR 표적 증폭 및시그날 증폭을 위한 FEN-1-매개된 플랩 절단(flap cleavage)을 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 기술은 낮은 카피 수로 존재하는 다수의 상이한 표적이 샘플 쪼개짐(splitting)으로 인하여 거짓 음성 결과의 감소된 위험으로 개별적으로 검출될 수 있는 샘플의 분석 방법을 제공한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 상기 기술은 다음을 포함하는 다수의 표적 핵산에 대한 샘플을 분석하는 방법을 제공한다:
a) 다수의 n 개의 상이한 표적 영역 중 하나 이상을 함유하는 것으로 추측된 바이설파이트-처리된 DNA를 포함하는 샘플 인, 용적 x를 갖는 샘플을 제공하는 단계(여기서, 상기 표적 영역의 적어도 하나는 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 상기 샘플속에 다음과 같은 카피 수에서 존재하는 저-카피 표적이다:
i) 용적이 x/n인 상기 샘플 각각의 n개 분획 중에서, 상기 저 카피 표적은 상기 n 개 표적 중 하나 이상으로부터 부재하거나,
ii) 용적이 x/n인 상기 샘플 각각의 n개 분획 중에서, 상기 n 개 분획들 중 하나 이상에서 상기 저 카피 표적은 상기 저 카피 표적에 대한 검출 분석의 민감성의 수준 이하이다);
b) 상기 용적 x의 상기 샘플을 증폭 반응에 상기 n개의 상이한 표적 영역이 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 증폭하여 용적이 y인 예비-증폭된 혼합물을 형성하도록 하는 조건 하에서 처리하는 단계;
c) 상기 예비-증폭된 혼합물을 다수의 상이한 검출 분석 반응 혼합물로 분배하는 단계(여기서, 각각의 검출 분석 반응 혼합물은 용적이 y/n 이하인 상기 예비-증폭된 혼합물의 일부를 포함하고, 여기서 상기 저-카피 표적은 단계 a)에서 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 상기 검출 분석 반응 혼합물 각각에 존재한다); 및
d) 다수의 검출 분석을 상기 검출 반응 혼합물을 사용하여 수행하는 단계(여기서, 상기 상이한 표적 영역은, 단계 a)에서 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 상기 검출 분석 반응 혼합물 속에서 검출된다).
일부 구현예에서, 바이설파이트 처리된 DNA는 사람 대상체로부터 기원한다. 특정의 바람직한 구현예에서, 샘플은 대상체의 체액, 바람직하게는 혈장을 포함하는 체액으로부터 제조된다. 일부 구현예에서, 바이설파이트 처리된 DNA는 혈장으로부터 분리된 순환하는 세포-유리된 DNA(cfDNA), 예컨대, 길이가 200개 염기쌍 미만인 세포-유리된 DNA이다. 특히 바람직한 구현예에서, 세포-유리된 DNA는 다음을 포함하는 방법에 의해 혈장으로부터 분리된다. 혈장 샘플을 다음과 결합시켜 - 프로테아제(예컨대, 프로나제, 프로테이나제 K) 및 구아니딘 티오시아네이트 및 비-이온성 세제를 포함하는 제1의 분해 시약 - 단백질이 프로테아제에 의해 분해된 혼합물을 형성시키는 단계, 이후에 실리카 입자 및 제2 분해 시약(당해 제2 분해 시약은 구아니딘 티오시아네이트, 비-이온성 세제, 및 이소프로필 알코올의 혼합물을 포함한다) 을 DNA가 실리카 입자에 결합되는 조건 하에서 가하는 단계. 특정의 구현예에서, 제1 분해 시약 및 제2 분해 시약 속의 비-이온성 세제는 동일하거나 상이하며 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트 (트윈-20), 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(노니데트(Nonidet) P-40), 및 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올, 측쇄된 (IGEPAL CA-630)으로부터 선택된다.
상기 방법은 또한 혼합물로부터 DNA가 결합된 실리카 입자를 분리하는 단계, DNA가 결합된 분리된 실리카 입자를 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트 및 에틸 알코올을 포함하는 제1 세척 용액으로 세척하는 단계, 제1 세척 용액으로부터 DNA가 결합된 실리카 입자를 분리하는 단계 및 DNA가 결합된 실리카 입자를 다음을 포함하는 제2 세척 용액으로 세척하는 단계를 포함한다. 완충액, 예컨대, 트리스 pH 8.0 및 에틸 알코올. 바람직한 구현예에서, DNA가 결합된 실리카 입자는 다수 회 세척되는데, 예컨대, 제2 세척 완충액으로 2 내지 6회 세척된다. 특히 바람직한 구현예에서, 각각의 세척은 제2 완충액을 사용한 사전 세척보다 더 적은 용적의 제2 세척 완충액을 사용한다. 일부 구현예에서, 세척된 실리카 입자는 마지막 세척 완충액 처리로부터 분리되며 DNA는 실리카 입자로부터, 예컨대, 10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA와 같은 용출 완충액으로 용출된다. 바람직한 구현예에서, DNA가 결합된 실리카 입자는 DNA의 용출 전에 예컨대, 약 70 ℃까지 가열함에 의해 건조된다.
상기 기술은 어느 특수한 샘플 크기로 제한되지 않지만, 저-카피 표적이 큰 샘플속에 존재하는 샘플에서의 특수한 적용을 갖는다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 바이설파이트 처리된 DNA는 출발 용적이 적어도 1mL, 바람직하게는 적어도 5mL, 보다 바람직하게는 적어도 10mL인 체액, 예컨대, 혈장 샘플로부터 제조되고/되거나 여기서 바이설파이트 처리된 DNA의 샘플의 상기 용적 x은 적어도 10μl, 바람직하게는 적어도 25 μl, 보다 바람직하게는 적어도 50μl, 보다 바람직하게는 적어도 100 μl이다. 바람직한 구현예에서, 예비-증폭 반응물 속에 존재하는 처리된 DNA 샘플의 용적은 증폭 반응물의 총 용적의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10% 내지 60%, 바람직하게는 15% 내지 55%, 보다 바람직하게는 약 20% 내지 50%이다.
본 발명은 샘플이 나누어지는 분획의 특별한 수로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, n (분획의 수)는 적어도 3, 바람직하게는 적어도 5, 보다 바람직하게는 적어도 10, 보다 바람직하게는 적어도 20, 보다 바람직하게는 적어도 100이다.
일부 구현예에서, 상기 기술은 PCR 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석(flap assay)을 사용하여 샘플 속에서 다중 표적 핵산을 분석하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) PCR 증폭 시약을 포함하는 제1 반응 혼합물 속에서 다수의 상이한 표적 영역을 포함하는 바이설파이트-처리된 DNA(바람직한 구현예에서, 사람 DNA를 포함함)를 제공하는 단계(여기서, 상기 PCR 증폭 시약은 다음을 포함한다:
i) 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 상기 바이설파이트-처리된 DNA로부터 상기 다수의 상이한 표적 영역을 증폭시키기 위한 다수의 상이한 프라이머 쌍;
ii) 열안정성 DNA 폴리머라제;
iii) dNTP; 및
iv) Mg++를 포함하는 완충액
b) 상기 제1 반응 혼합물을 열 사이클링 조건(thermal cycling condition)에 노출시키는 단계(여기서 다수의 상이한 표적 영역은, 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 증폭되어 예비-증폭된 혼합물을 생산하고, 여기서 상기 열 사이클링 조건은 증폭을 기하급수적 범위, 바람직하게는 20회 미만, 보다 바람직하게는 15회 미만, 보다 바람직하게는 10회 이하의 열 사이클로 유지하는 열 사이클의 수로 제한된다);
c) 상기 예비-증폭된 혼합물을 다수의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물 내로 분배하는 단계(여기서 각각의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물은 다음을 포함한다:
i) 단계 a) i)의 상기 다수의 상이한 프라이머 쌍으로부터 선택된 추가량의 프라이머 쌍;
ii) 열안정성 DNA 폴리머라제;
iii) dNTP;
iv) Mg++을 포함하는 상기 완충액;
v) 플랩 엔도뉴클레아제, 바람직하게는 FEN-1 엔도뉴클레아제;
vi) 플랩 올리고뉴클레오타이드, 및
vi) 상기 플랩 올리고뉴클레오타이드의 일부에 대해 상보성인 영역을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오타이드, 바람직하게는 FRET 카세트 올리고뉴클레오타이드);
및
d) 상기 플랩 엔도뉴클레아제에 의해 상기 헤어핀 올리고뉴클레오타이드의 분해를 검출함으로써 PCR-플랩 분석 반응 동안 상기 바이설파이트-처리된 DNA로부터 하나 이상의 상이한 표적 영역의 증폭을 검출하는 단계.
바람직한 구현예에서, FEN-1 엔도뉴클레아제는 열안전성 FEN-1이며, 바람직하게는 다음으로부터 기원한다. 고세균 유기체, 예컨대, Afu FEN-1.
일부 구현예에서, 상기 기술된 예비-증폭된 혼합물은 PCR-플랩 분석 반응 혼합물을 분배하기 전에 희석액으로 희석되지만, 일부 구현예에서, 예비-증폭된 혼합물은 사전 희석없이 PCR-플랩 분석 반응 혼합물에 직접 가해진다.
일부 구현예에서, 필수적으로 PCR-플랩 분석 반응에 사용된 프라이머는 상기 제1 반응으로부터 이어진 특정 프라이머를 제외하고는, 이들 특수한 프라이머가 제1 반응 혼합물에서 사용된 것과 동일한 농도로 사용된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, PCR-플랩 분석 반응 혼합물에 가해진 프라이머 쌍의 추가 량 중 상기 프라이머는 PCR-플랩 분석에서 가해진 프라이머(즉, 예비-증폭된 혼합물로부터 유래하는 프라이머는 계수하지 않음)의 농도가 상기 PCR 증폭 시약 속의 상기 프라이머 쌍의 프라이머의 농도와 필수적으로 동일하도록 하는 농도로 가해진다. 다른 구현예에서, PCR-플랩 분석 반응 혼합물에 가해진 프라이머 쌍의 추가량 속의 프라이머는 PCR-플랩 분석에서 가해진 프라이머의 농도가 상기 제1 반응 혼합물 속의 상기 프라이머 쌍의 프라이머의 농도보다 더 낮거나 더 높은 농도가 되도록 하는 농도로 가해진다.
상기 방법이 상기 제1 반응 혼합물 및 상기 PCR-플랩 분석 반응 혼합물에 사용된 완충액 속의 Mg++의 특수한 농도로 제한되지 않지만, 바람직한 구현예에서, 완충액은 적어도 3 mM Mg++, 바람직하게는 4 mM 이상의 Mg++, 보다 바람직하게는 5 mM 이상의 Mg++, 보다 바람직하게는 6 mM 이상의 Mg++, 보다 바람직하게는 대략 7 mM 내지 7.5 mM의 Mg++를 포함한다. 특정의 구현예에서, 완충액은 약 1mM 미만의 KCl을 함유한다. 바람직한 구현예에서, 완충액은 10 mM의 3-(n-모르폴리노) 프로판설폰산(MOPS) 완충액 및 7.5 mM의 MgCl2를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 반응 혼합물 및/또는 상기 다수의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물은 외인성의 비-표적 DNA, 바람직하게는 거대한 어류(bulk fish) DNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 열안정성 DNA 폴리머라제는 바람직하게는 써무스(Thermus) 속, 보다 바람직하게는 서무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터의 유박테리아(eubacteria) DNA 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제가 가열시 활성화되도록, 예컨대, 시약, 예컨대, 항체, 화학적 부가물 등의 사용을 통해, 핫 스타트 출발 PCR을 위해 개질된다.
특정의 구현예에서, 바이설파이트-처리된 DNA는 사람 DNA를 포함하고, 다수의 상이한 표적 영역은 SFMBT2, VAV3, BMP3, 및 NDRG4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 상이한 프라이머 쌍은 이들 표적 영역 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 보다 바람직하게는 4개 모두에 대해 지시된다.
일부 구현예에서, 다수의 상이한 표적 영역은 참고 표적 영역을 포함하고, 특정의바람직한 구현예에서, 참고 표적 영역은 β-액틴 및/또는 ZDHHC1, 및/또는 B3GALT6를 포함한다.
일부 구현예에서, 다수의 상이한 프라이머 쌍 중 적어도 하나는 길이가 약 100개 염기쌍 미만, 바람직하게는 길이가 약 85개 염기쌍 미만인 표적 영역으로부터 앰플리콘을 생산하도록 선택된다. 일부 구현예에서, 상이한 프라이머 쌍 모두는 길이가 약 100개 염기쌍 미만인 표적 영역으로부터 앰플리콘을 생산하도록 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 샘플, 예컨대, 체액의 샘플의 공정 동안 생산된 바이설파이트-처리된 DNA 중 실질적으로 모두를 증폭하도록 지시된다. 일부 구현예에서, 바이설파이트 처리된 DNA의 제조는 제1 반응 혼합물의 실질적인 분획을 구성하는데, 예컨대, 일부 구현예에서, 제1 반응 혼합물 중 바이설파이트-처리된 DNA를 포함하는 샘플의 용적은 제1 반응 혼합물의 총 용적의 적어도 20 내지 50%를 구성한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 제1 반응 혼합물 중 바이설파이트-처리된 DNA의 용적은 제1 반응 혼합물의 총 용적의 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10% 내지 60%, 바람직하게는 15% 내지 55%, 보다 바람직하게는 약 20% 내지 50%이다.
일부 구현예에서, 상기 기술의 방법은 PCR 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석을 사용하여 사람 혈장의 샘플 속에서 다중 표적 핵산을 분석하기 위한 방법을 제공하며, 당해 방법은 다음을 포함한다:
a) 적어도 1 mL의 혈장으로부터 제조된 바이설파이트-처리된 DNA(당해 바이설파이트-처리된 DNA는 PCR 증폭 시약을 포함하는 제1 반응 혼합물 속에 다수의 상이한 표적 영역을 포함한다)를 제공하는 단계(여기서 상기 PCR 증폭 시약은 다음을 포함한다:
i) 상기 샘플 속에 존재할 경우, 상기 바이설파이트-처리된 DNA로부터 SFMBT2, VAV3, BMP3, 및 NDRG4a로부터 선택된 상기 다수의 상이한 표적 영역을 증폭시키기 위한 다수의 상이한 프라이머 쌍(여기서 당해 다수의 상이한 프라이머 쌍 각각은 길이가 약 100개 염기쌍 미만인 표적 영역으로부터 앰플리콘을 생산하기 위해 선택된다);
ii) 써무스 아쿠아티쿠스로부터의 DNA 폴리머라제;
iii) dNTP; 및
iv) 7.5 mM Mg++를 포함하는 완충액);
b) 상기 제1 반응 혼합물을 열 사이클링 조건(thermal cycling condition)에 노출시키는 단계(여기서 다수의 상이한 표적 영역은, 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 증폭되어 예비-증폭된 혼합물을 생산하고, 여기서 상기 열 사이클링 조건은 증폭을 기하급수적 범위, 바람직하게는 20회 미만, 보다 바람직하게는 15회 미만, 보다 바람직하게는 10회 이하의 열 사이클로 유지하는 열 사이클의 수로 제한된다);
c) 상기 예비-증폭된 혼합물을 다수의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물 내로 분배하는 단계(여기서 각각의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물은 다음을 포함한다:
i) 단계 a) i)의 상기 다수의 상이한 프라이머 쌍으로부터 선택된 추가량의 프라이머 쌍;
ii) 써무스 아쿠아티쿠스로부터의 DNA 폴리머라제;
iii) dNTP;
iv) 7.5 mM Mg++를 포함하는 상기 완충액
v) 열안정성 FEN-1 플랩 엔도뉴클레아제;
vi) 플랩 올리고뉴클레오타이드, 및
vi) 상기 플랩 올리고뉴클레오타이드의 일부에 대해 상보성인 영역을 포함하는 FRET 카세트 올리고뉴클레오타이드);
및
d) PCR-플랩 분석 반응 동안에 SFMBT2, VAV3, BMP3, 및 NDRG4로부터 선택된 하나 이상의 상이한 표적 영역의 증폭을 검출하는 단계.
바람직한 구현예에서, 다수의 상이한 표적 영역은 참고 표적 영역, 바람직하게는 β-액틴 및/또는 ZDHHC1을 포함한다. 특정의 구현예에서, 표적 영역 및/또는 프라이머 쌍 중 하나 이상은 도 5a 내지 도 5f에 나타낸 표적 영역 및 프라이머 쌍으로부터 선택된다.
혈액 또는 혈액 분획, 예컨대, 혈장 또는 혈청으로부터 DNA, 예컨대, 세포-유리된 DNA를 분리하는 개선된 방법이 또한 본원에 제공된다. 예를 들면, 양태들은 혈장 샘플을 가공하는 방법을 제공하며, 당해 방법은 혈장 샘플을 프로테아제 및 구아니딘 티오시아네이트 및 비-이온성 세제를 포함하는 제1 분해 시약과 합하여 단백질이 프로테아제에 의해 분해된 혼합물을 형성시키는 단계, 이어서 혼합가능한 실리카 입자 및 구아니딘 티오시아네이트, 비-이온성 세제, 및 이소프로필 알코올의 혼합물을 포함하는 제2 분해 시약을 DNA가 실리카 입자에 결합하는 조건 하에서 가하는 단계를 포함한다. 특정의 구현예에서, 제1 분해 시약 및 제2 분해 시약 속의 비-이온성 세제는 동일하거나 상이하며 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트 (트윈-20), 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(노니데트(Nonidet) P-40), 및 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올, 측쇄된 (IGEPAL CA-630)으로부터 선택된다. 특정의 바람직한 구현예에서, 실리카 입자는 자기 입자이다.
상기 방법은 또한 혼합물로부터 DNA가 결합된 실리카 입자를 분리하는 단계, DNA가 결합된 상기 분리된 실리카 입자를 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트 및 에틸 알코올을 포함하는 제1 세척 용액으로 세척하는 단계, DNA가 결합된 실리카 입자를 제1 세척 용액으로부터 분리하는 단계 및 DNA가 결합된 실리카 입자를 다음을 포함하는 제2 세척 용액으로 세척하는 단계를 또한 포함한다. 완충액, 예컨대, 트리스 pH 8.0, 및 에틸 알코올. 바람직한 구현예에서, DNA가 결합된 실리카 입자는 다수 회 세척되는데, 예컨대, 제2 세척 완충액으로 2 내지 6회 세척된다. 특히 바람직한 구현예에서, 각각의 세척은 제2 완충액을 사용한 사전 세척보다 더 적은 용적의 제2 세척 완충액을 사용한다. 일부 구현예에서, 세척된 실리카 입자는 마지막 세척 완충액 처리로부터 분리되며 DNA는 실리카 입자로부터, 예컨대, 물 또는 10 mM 트리스-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA와 같은 용출 완충액으로 용출된다. 바람직한 구현예에서, DNA가 결합된 실리카 입자는 마지막 세척 단계 후, 예컨대, DNA의 용출 전에, 가열(예를 들면, 37 ℃ 내지 75 ℃, 바람직하게는 약 45 ℃ 내지 70 ℃, 보다 바람직하게는 약 70 ℃까지) 가열함으로서 건조된다.
기술의 발달 동안, 과정 중 상이한 횟수로 가해진 2개의 상이한 분해 시약을 사용하는 것이 혈장으로부터 DNA의 수율을 증진시킴이 발견되었다. 바람직한 구현예에서, 제2 분해 시약의 분취량은 제1 분해 시약 및 프로테아제를포함하는 혼합물을 예컨대, 약 5 내지 60분, 바람직하게는 30 내지 60분 동안, 실온 내지 55 ℃에서 항온처리한 후 가해진다. 바람직한 구현예에서, 혼합물은 실온에서 항온처리된다. 특정의 구현예에서, 제1 분해 시약은 구아니딘 티오시아네이트 및 비-이온성 세제를 포함하고, 제2 분해 시약은 구아니딘 티오시아네이트, 비-이온성 세제, 및 알코올을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 제1 분해 시약은 약 4.3 M 구아니딘 티오시아네이트 및 10% w:v IGEPAL CA-630을 포함하고, 일부 구현예에서, 제2 분해 시약은 이소프로필 알코올과 합해진 4.3 M 구아니딘 티오시아네이트 및 10% w:v IGEPAL CA-630을 포함한다.
기술의 발달 동안에 과정의 상이한 단계에서 2개의 상이한 세척 용액을 사용하는것이 혈장으로부터 DNA의 수율을 개선시킴이 발견되었다. 일부 구현예에서, 상기 기술된 바와 같이 사용된 제1 세척 용액은 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트 및 에틸 알코올을 포함하고, 제2 세척 용액은 완충액 및 에틸 알코올을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 제1 세척 용액은 약 3 M 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트 및 약 57% 에틸 알코올을 포함하고 상기 기술된 바와 같이 사용된, 제2 세척 용액은 약 80% 에틸 알코올 및 약 20% 10 mM 트리스 pH 8.0 완충액을 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 모든 분해 단계 및 세척 단계는 실온에서 수행된다.
일부 구현예에서, 혈장 샘플은 DNA 공정 대조군, 예컨대, 혈장 샘플 속에서 발견된 DNA를 검출하도록 구성된 분석과 교차-반응하지 않는 DNA와 혼합된다. 예를 들면, 일부 구현예에서 혈장은 사람 혈장이고 DNA 공정 대조군은 제브라피쉬(zebrafish) RASSF1 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, DNA 공정 대조군은 합성 DNA, 예컨대, 제브라피쉬 RASSF1 서열을 포함하는 합성 DNA 단편이다. 특히 바람직한 구현예에서, DNA 공정 대조군은 이본쇄이다. 바람직한 구현예에서, 공정 대조군은 샘플로부터 DNA의 추출 전에, 예컨대, 제1 또는 제2 분해 시약 첨가와 함께 혈장 샘플에 가해진다.
일부 구현예에서, 거대한 외인성 DNA, 예컨대, 혈장 샘플 속에서 발견된 DNA를 검출하기 위해 구성된 검정과 교차-반응하지 않는 DNA가 혈장 샘플에 가해진다. 예를 들면, 바람직한 구현예에서, 혈장은 사람 혈장이고 거대한 어류 DNA, 예컨대, 연어로부터의 게놈 DNA가 샘플에 가해진다.
본원에 제공된 방법의 구현예는 비교적 큰 혈장 샘플, 예컨대, 1 mL 이상의 가공에 있어서 특수한 용도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 혈장 샘플은 적어도 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 또는 적어도 10 mL, 또는 이들 사이의 어떠한 분획 용적을 갖는다. 일부 구현예에서 혈장 샘플은 용적이 10 mL 초과이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 특수한 표적 핵산에 대해 분리된 DNA 샘플을 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 다수의 메틸화된 표적 핵산에 대해 분리된 DNA를 분석하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 분리된 DNA 샘플을 바이설파이트로 처리하여 바이설파이트-처리된 DNA 샘플을 생산하고, 바이설파이트-처리된 DNA 샘플을 다음의 조건 하에서 증폭 반응에 대해 처리함을 포함한다. 다수의 상이한 표적 영역(예컨대, 2, 3, 4, 5개 등의 표적 영역)은, 샘플 속에 존재하는 경우, 증폭되어 증폭된 혼합물을 형성한다.
특정의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 증폭된 혼합물을 다수의 상이한 검출 분석 반응 혼합물로 분배하는 단계 및 다수의 상이한 검출 분석을 검출 분석 반응 혼합물로 수행하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 다수의 상이한 표적 영역은, 샘플 속에 존재하는 경우, 다수의 상이한 검출 분석 반응 혼합물 중 하나 이상에서 검출된다. 바람직한 구현예에서, 다수의 상이한 표적 영역은 적어도 5개의 상이한 표적 영역을 포함한다.
본원에 기술된 방법을 수행하기 위한 키트 및 시스템이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서 상기 기술은 혈장으로부터 DNA를 분리하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는, 예컨대, 다음을 포함한다:
a) 구아니딘 티오시아네이트 및 비-이온성 세제 또는 제1 분해 시약을 제조하기 위한 성분을 포함하는 제1 분해 시약;
b) 구아니딘 티오시아네이트, 비-이온성 세제, 및 이소프로판올, 또는 제2 분해 시약을 제조하기 위한 성분을 포함하는 제2 분해 시약;
c) 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트 및 에틸 알코올, 또는 제1 세척 용액을 제조하기 위한 성분을 포함하는 제1 세척 용액;
d) 트리스 완충액 및 에틸 알코올, 또는 제2 세척 용액을 제조하기 위한 성분을 포함하는 제2 세척 용액; 및
e) 실리카 입자.
바람직한 구현예에서, 비-이온성 세제는 IGEPAL CA-630을 포함한다. 일부 구현예에서, 실리카 입자는 자기 입자를 포함하고, 특히 바람직한 구현예에서, 키트는 예컨대, 과정의 단계 동안 입자를 분리하기 위한 자석을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 용출 완충액 또는 용출 완충액을 제조하기 위한 성분을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 DNA 공정 대조군, 예컨대, 제브라피쉬 RASSF1 서열을 포함하는 DNA 공정 대조군을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 거대한 어류 DNA의 제제를 추가로 포함하고, 특히 바람직한 구현예에서, DNA 공정 대조군은 거대한 어류 DNA의 제제 속에 존재한다.
일부 구현예에서, 상기 기술은 혈장 샘플을 가공하기 위한 시스템을 제공하며, 당해 시스템은 다음을 포함한다:
a) 구아니딘 티오시아네이트 및 비-이온성 세제 또는 제1 분해 시약을 제조하기 위한 성분을 포함하는 제1 분해 시약;
b) 구아니딘 티오시아네이트, 비-이온성 세제, 및 이소프로판올, 또는 제2 분해 시약을 제조하기 위한 성분을 포함하는 제2 분해 시약;
c) 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트 및 에틸 알코올, 또는 제1 세척 용액을 제조하기 위한 성분을 포함하는 제1 세척 용액;
d) 트리스 완충액 및 에틸 알코올, 또는 제2 세척 용액을 제조하기 위한 성분을 포함하는 제2 세척 용액; 및
e) 실리카 입자.
바람직한 구현예에서, 비-이온성 세제는 IGEPAL CA-630을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 시스템은 용출 완충액 또는 당해 용출 완충액을 제조하기 위한 성분을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 시스템은 DNA 공정 대조군, 예컨대, 제브라피쉬 RASSF1 서열을 포함하는 DNA 공정 대조군을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시스템은 거대한 어류 DNA의 제제를 추가로 포함하며, 특히 바람직한 구현예에서, DNA 공정 대조군은 거대한 어류 DNA의 제제 속에 존재한다.
일부 구현예에서, 상기 시스템은 다음 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 자석, 혈장 가공용 용기, 및/또는 정제된 DNA를 수용하기 위한 용기 또는 플레이트. 일부 구현예에서, 상기 시스템은 단계들 모두 또는 일부를 수행하기 위한 장치, 예컨대, STARlet 자동화된 플랫폼과 같은 장치를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 시스템은 혈장으로부터 분리된 DNA의 분석을 위한 시약을 추가로 포함한다. 예를 들면, 특정의 구현예에서, 상기 시스템은 다음을 포함한다. DNA를 바이설파이트로 처리하여 바이설파이트-처리된 DNA를 생산하기 위한 시약, 예컨대, 바이설파이트 시약, 데설폰화 시약, 및 바이설파이트-처리된 DNA를 정제하기 위한 물질(예컨대, 실리카 비드, 결합 완충액, 소 혈청 알부민 및/또는 카제인을 포함하는 용액, 예컨대, 다음에 기술된 바와 같음: 미국 특허 제9,315,853호, 이는 본원에 참고로 포함됨).
바람직한 구현예에서, 상기 시스템은 다음을 추가로 포함한다. DNA 분석 시약, 예컨대, PCR 증폭 시약 및/또는 플랩 분석 시약. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 시스템은 다음을 포함하는 PCR 증폭 시약을 포함한다:
i) 상기 혈장 속에 존재하는 경우, 다수의 상이한 표적 영역을 증폭시키기 위한 다수의 상이한 프라이머 쌍;
ii) 열안정성 DNA 폴리머라제;
iii) dNTP; 및
iv) Mg++를 포함하는 완충액
일부 구현예에서, 상기 시스템은 PCR-플랩 분석 시약을 추가로 포함한다. 특정의 바람직한 구현예에서, 상기 PCR 플랩 분석 시약은 다음을 포함한다:
i) 상기 혈장 속에 존재하는 경우, 다수의 상이한 표적 영역을 증폭시키기 위한 다수의 상이한 프라이머 쌍;
ii) 열안정성 DNA 폴리머라제;
iii) dNTP;
iv) Mg++를 포함하는 완충액
v) 플랩 엔도뉴클레아제;
vi) 플랩 올리고뉴클레오타이드, 및
vi) 상기 플랩 올리고뉴클레오타이드의 일부에 대해 상보성인 영역을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오타이드).
여전히 추가의 구현예에서, 상기 시스템은 PCR 증폭 및/또는 PCR 플랩 분석 반응을 수행하기 위한 열 사이클러(thermal cycler)를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 열 사이클러는 분석 시약을 사용하여 수행된 증폭 반응의 과정 동안에 시그날, 예컨대, 형광성을 검출하도록 구성된다.
추가의 구현예는 본원에 포함된 교시내용을 바탕으로 하여 관련 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
본 기술의 이들 및 다른 특징, 국면, 및 장점은 다음의 도면과 관련하여 보다 잘이해될 것이다:
도 1은 조합된 PCR-침입성 절단 분석(“PCR-플랩 분석”), 예컨대, QuARTS분석의 개략도를 제공한다.
도 2는 외부 프라이머를 사용한 제1 증폭(또는 예비-증폭)을 나타내는 PCR-플랩분석에 이어, 외부 프라이머의 부위 내에 결합 부위를 갖는 제2 프라이머 쌍을 사용한 PCR-플랩 분석과 조합된 네스티드(nested) PCR의 개략도를 제공한다. 제2 증폭에서 생산된 보다 작은 앰플리콘(amplicon)은 하단에 나타나 있다. 반응물의 FRET-카세트 부위는 나타나 있지 않다.
도 3은 PCR 예비-증폭에 이어 PCR-플랩 분석의 개략도를 제공하며, 여기서 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석은 동일한 프라이머 쌍을 사용하여, 동일한 앰플리콘의 카피를 생산한다. 반응물의 FRET-카세트 부위는 나타나 있지 않다.
도 4는 복합 예비-증폭(여기서 샘플 속의 다수의 상이한 표적 영역은 상이한 표적 영역 각각에 대한 프라이머 쌍을 함유하는 단일의 복합화된 PCR 반응에서 증폭된다)에 이어서, 개개의 PCR-플랩 분석(여기서 각각의 PCR 플랩 분석은 최종 PCR-플랩 분석 반응에서 검출될 표적 유전자 자리에 대해 특이적인 프라이머 쌍 만을 사용한다)의 개략도를 제공한다.
도 5a 내지 도 5f는 바이설파이트 전환, 예비-증폭, 및 PCR-플랩 분석 검출의 조합을 사용한 메틸화의 분석용 핵산 서열을 나타낸다. 각각의 패널은 바이설파이트 처리 전 DNA 표적 영역의 하나의 쇄 및 ‘T’로 나타낸전환된 메틸화되지 않은 C 잔기와 함께, 바이설파이드 시약을 사용한 전환시 상기 영역의 예측된 서열을 나타낸다. 외부 프라이머 및 PCR-플랩 분석 내부 프라이머(네스티드 분석 설계에 사용될 수 있는 것으로서)에 대한 프라이머 결합 부위는 박스로 표시하여 나타낸다. 각각의 도는 또한 전환된 서열의 분절에 있어서, PCR-플랩 분석 프라이머 및 플랩 프로브의 정렬을 나타낸다. 도 5a 내지 5f는 마커 SFMBT2, VAV3, BMP3, NDRG4, 및 참고 DNA β-액틴, 및 ZDHHC1 각각의 표적 영역을 나타낸다. PCR-플랩 분석에 사용된 플랩 올리고뉴클레오타이드에서 ‘아암’은 다음과 같다: Arm 1은 5'-CGCCGAGG-3'이고; 아암 3은 5'-GACGCGGAG-3'이며; 아암 5는 5'-CCACGGACG-3'이다.
도 6은 상이한 수의 사이클을 위한 외부 프라이머를 사용하여 예비-증폭된 나타낸바이설파이트-처리된 표적 DNA의 검출에 이은, PCR-플랩 분석 증폭 및 네스티드(내부) 프라이머를 사용한 검출을 비교하는 표를 나타낸다. 비교 검정을 예비-증폭없이, 바이설파이트-처리된 DNA에서 직접 QuARTS PCR-플랩 분석을 사용하였다.
도 7은 도 5a 내지 5f에 나타낸 바와 같은 네스티드 또는 비-네스티드 증폭 프라이머 구성을 사용한 결과를 비교하고, 실시예 3에 기술된 것으로서, PCR 예비-증폭 단계에서 상이한 프라이머 농도 및 상이한 완충액을 비교한다.
도 8a 내지 8c는 분석의 예비-증폭 상에서 상이한 수의 사이클을 사용한 결과를 나타낸다. 도 8a는 정상의 혈장 샘플 또는 공지된 양의 표적 DNA로 스파이크된 혈장 샘플에서 표적 유형 각각에 대해, 예비-증폭을 사용하지 않거나, 5, 10, 20 또는 25 사이클의 증폭을 사용하여 표적 유형 각각에 대해 예측된 쇄의 수를 나타낸다. 도 8b는 실시예 4에서 기술된 것으로서, 나타낸 조건 하에서 각각의 반응에 있어서 쇄 검출의 수를 비교한다.
도 9는 실시예 5에 기술된 것으로서, 대변으로부터 분리된 DNA에서 네스티드되지 않은 복합 예비-증폭을 사용한 결과를 나타낸다.
도 10a 내지 도 10i는 실시예 6에 기술된 것으로서, 혈장으로부터 분리된 DNA에서 네스티드되지 않은 복합 예비-증폭을 사용한 결과를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11c는 실시예 8에 기술된 것으로서, β-액틴 DNA(처리되지 않은 및 추출 후 바이설파이트 전환됨) 및 B3GALT6 유전자(추출 후 바이설파이트 전환됨)의 수율에 있어서 상이한 혈장 분리 조건을 비교한 그래프를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12c는 실시예 10에 기술된 것으로서, β-액틴 DNA(처리되지 않은 및 추출 후 바이설파이트 전환됨) 및 B3GALT6 유전자(추출 후 바이설파이트 전환됨)의 수율에 있어서 상이한 혈장 분리 조건을 비교한 그래프를 나타낸다.
도 13은 본원의 구현예에 관한 핵산 서열의 표를 나타낸다.
도는 필수적으로 축척을 나타내지 않을 뿐 아니라 도에서 대상물은 다른 것과 관련하여 축척을 필수적으로 도시하지 않음이 이해되어야 한다. 도는 본원에 개시된 장치, 시스템, 및 방법의 다양한 구현예에 대한 명확성 및 이해를 가져오기 위해 의도된 묘사이다. 가능하게는 어디에서나, 동일한 참고 번호가 동일한 또는 유사한 부분을 나타내기 위해 도면 전체에서 사용될 것이다. 더욱이, 도면은 본 발명의 영역을 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지않음이 인식되어야 한다.
정의
본 발명의 기술의 이해를 촉진시키기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기 정의되어 있다. 추가의 정의는 상세한 설명 전체에 설정되어 있다.
명세서 및 청구범위 전체에서, 다음의 용어는 내용이 달리 명확하게 지적하지 않는 한, 본원에 명쾌하게 관련된 의미를 취한다. 본원에 사용된 것으로서 어구 “일 구현예에서”는 비록 의미할 수는 있으나, 동일한 구현예를 필수적으로 나타내는 것은 아니다. 또한, 본원에 사용된 것으로서 “다른 구현예에서”는 이것이 언급할 수는 있으나 상이한 구현예를 필수적으로 나타내는 것은 아니다. 따라서, 하기 나타낸 것으로서, 상기 기술의 다양한 구현예는 상기 기술의 영역 또는 취지로부터 벗어남이 없이, 용이하게 합해질 수 있다.
또한, 본원에 사용된 것으로서, 용어 “또는”은 포괄적인 “또는” 기호이며, 내용에서 달리 명확하게 나타내지 않는 한 용어 “및/또는”과 동일하다. 용어 “를 기준으로”는 배타적인 것이 아니며 내용이 달리 명확하게 지적하지 않는 한, 기술되지 않은 추가의 요인을 기준으로 하는 것을 허용한다. 또한, 명세서 전체에서, 단수(“a”, “an”, 및 “the”)의 의미는 복수 참고물을 포함한다. “에 있어서(in)”의 의미는 “에 있어서(in)” 및 “에서(on)”를 포함한다.
본원의 청구범위에 사용된 것으로서 해석 어구 “로 필수적으로 이루어진”은 청구범위의 영역을 규정된 물질 또는 단계, 및 In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976)에 논의된 바와 같이, 청구된 발명의 “기본 및 신규 특정(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 것들”로 제한한다. 예를 들면, 인용된 요소”로 필수적으로 이루어진” 조성물은 비록 존재하지만, 오염물이 순수한 조성물, 즉, 인용된 성분”으로 이루어진” 조성물과 비교하여 인용된 조성물의 기능을 변경시키지 않는 수준으로 인용되지 않은 오염물을 함유할 수 있다.
비-표적 DNA를 참고하여 본원에 사용된 것으로서, 용어 “외인성”은 표적 DNA를함유하는 공급원 또는 샘플 이외의 공급원으로부터 분리되어 정제된 비-표적 DNA를 말한다. 예를 들면, 정제된 어류 DNA는 예컨대, 다음에 기술된 바와 같이, 사람 표적 DNA를 포함하는 샘플과 관련하여 외인성 DNA이다. 미국 특허 제9,212,392호, 이는 본원에 참고로 포함된다. 외인성 DNA는 표적 DNA 이외의 상이한 유기체로부터 기원할 필요가 없다. 예를 들면, 상업적으로 수득된 정제된 어류 DNA는 특수한 어류로부터 샘플 속의 표적 핵산을 검출하도록 구성된 반응물에 가해지는 경우 외인성일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 외인성 DNA는 외인성 DNA가 가해진 반응물 속에서 표적 핵산을 검출하고/하거나 정량화하도록 구성된 분석에 의해서는 검출되지 않도록 선택된다.
본원에 사용된 것으로서, “DNA 단편” 또는 “소 DNA” 또는 “짧은 DNA”는 대략 200개 염기쌍 또는 뉴클레오타이드 이하의 길이로 이루어진 DNA를 의미한다.
용어 “프라이머”는 프라이머 연장이 개시되는 조건 하에 위치하는 경우 합성 개시 시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 말한다. 올리고뉴클레오타이드 “프라이머”는 정제된 제한 분해에서와 같이 천연적으로 존재할 수 있거나 합성적으로 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 주형 핵산과 함께 사용되며프라이머의 연장은 주형 의존성이어서, 주형의 상보체가 형성된다.
핵산과 관련하여 용어 “증폭하는” 또는 “증폭”은 소량의 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 단일 폴리뉴클레오타이드 분자)로부터 전형적으로 출발하는, 폴리뉴클레오타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드의 부위의 다중 카피의 생산을 말하며, 여기서 증폭 생성물 또는 앰플리콘은 일반적으로 검출가능하다. 폴리뉴클레오타이드의 증폭은 다양한 화학적 및 효소적 공정을 포함한다. 다음의 반응 동안 표적 또는 주형 DNA 분자 중 하나 또는 소수의 카피로부터의 다중 DNA 카피의 생성: 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 또는 리가제 쇄 반응(LCR; 참고: 예컨대, 미국 특허 제5,494,810호; 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨)은 증폭의 형태이다. 추가 유형의 증폭은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대립형질-특이적인 PCR (참고: 예컨대, 미국 특허 제5,639,611호; 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨), 조립체 PCR(참고: 예컨대, 미국 특허 제5,965,408호; 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨), 헬리카제-의존성 증폭(참고: 예컨대, 미국 특허 제7,662,594호; 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨), 더운-출발 PCR(참고: 예컨대, 미국 특허 제5,773,258호 및 제5,338,671호; 이들 전문은 각각 본원에 참고로 포함됨), 서열간-특이적인 PCR, 역 PCR(참고: 예컨대, Triglia, 등, (1988) Nucleic Acids Res.,16:8186; 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨), 연결-매개된 PCR(참고: 예컨대, Guilfoyle, R. 등, Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997); 미국 특허 제5,508,169호; 이들 각각은 이의 전문이 본원에 참고로 포함됨), 메틸화-특이적인 PCR(참고: 예컨대, Herman, 등, (1996) PNAS 93(13) 9821-9826; 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨), 미니프라이머 PCR, 복합 연결-의존성 프로브 증폭(참고: 예컨대, Schouten, 등, (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57; 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨), 복합 PCR(참고: 예컨대, Chamberlain, 등, (1988) Nucleic Acids Research 16(23) 11141-11156; Ballabio, 등, (1990) HumanGenetics 84(6) 571-573; Hayden, 등, (2008) BMC Genetics 9:80; 이들 각각은 이의 전문이 본원에 참고로 포함됨), 네스티드 PCR, 오버랩-연장 PCR(참고: 예컨대, Higuchi, 등, (1988) Nucleic Acids Research 16(15) 7351-7367; 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨), 실시간 PCR(참고: 예컨대, Higuchi, 등, (1992) Biotechnology 10:413-417; Higuchi, 등, (1993) Biotechnology 11:1026-1030; 이들 각각은 이의 전문이 본원에 참고로 포함됨), 역 전사 PCR(참고: 예컨대, Bustin, S.A.(2000) J.Molecular Endocrinology 25:169-193; 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨), 고체 상 PCR, 열 비대칭 인터레이스드(thermal asymmetric interlaced) PCR, 및 터치다운(Touchdown) PCR(참고: 예컨대, Don, 등.,Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008; Roux, K.(1994) Biotechniques 16(5) 812-814; Hecker, 등, (1996) Biotechniques 20(3) 478-485; 이들 각각은 이의 전문이 본원에 참고로 포함됨). 폴리뉴클레아제 증폭은 또한 다음을 사용하여 달성할 수 있다. 디지탈 PCR(참고: 예컨대, Kalinina, 등, Nucleic Acids Research.25; 1999-2004, (1997); Vogelstein and Kinzler, Proc Natl Acad Sci USA.96; 9236-41, (1999); 국제 특허 공보 제WO05023091A2호; 미국 특허원 공보 제20070202525호; 이들 각각은 이의 전문이 본원에 참고로 포함됨).
용어 “폴리머라제 쇄 반응”(“PCR”)은 다음의 방법을 말한다. K.B.Mullis의 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 및 제4,965,188호, 이들은 클로닝 또는 정제없이, 게놈성 또는 다른 DNA 또는 RNA의 혼합물 속에서 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키는 방법을 기술한다. 표적 서열을 증폭시키기 위한 당해 공정은 과다한 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 목적한 표적 서열을 포함하는 DNA 혼합물에 도입시킨 후, DNA 폴리머라제의 존재하에서 열 사이클링의 정밀한 서열을 도입하는 것으로 이루어진다. 2개의 프라이머가 이본쇄 표적 서열의 이들 각각의 쇄에 대해 상보성이다. 증폭을 수행하기 위하여, 혼합물을 변성시키고 이후에 프라이머를 표적 분자내에서 이들의 상보성 서열로 어닐링한다. 어닐링에 이어서, 프라이머를 폴리머라제로 연장시켜 상보성 쇄의 새로운 쌍을 형성시킨다. 변성, 프라이머 어닐링, 및 폴리머라제 연장의 단계들을 수회 반복(즉, 변성, 어닐링 및 연장은 하나의 “사이클”을 구성한다; 다수의 “사이클”이 존재할 수 있다)하여 목적한 표적 서열의 증폭된 분절의 고 농도를 수득한다. 목적한 표적 서열의 증폭된 분절의 길이는 서로에 대하여 프라이머의 상대적 위치에 의해 측정되므로, 당해 길이는 조절가능한 매개변수이다. 공정의 반복 국면 덕분에, 상기 방법은 “폴리머라제 쇄 반응”(“PCR”)으로 언급된다. 표적 서열의 목적한 증폭된 분절은 혼합물 속에서 우세한 서열(농도의 측면에서)이 되므로, 이들은 “PCR 증폭된”으로 일컬어지며 “PCR 생성물” 또는 “앰플리콘”이다. 당해 분야의 숙련가는 용어 “PCR”이 예컨대, 실시간 PCR, 네스티드 PCR, 역 전사 PCR(RT-PCR), 단일 프라이머 및 임의적으로 프라이밍된 PCR, 등을 사용한 원래 기술된 방법의 많은 변형을 포함함을 이해할 것이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “핵산 검출 분석”은 목적한 핵산의 뉴클레오타이드조성물을 측정하는 특정 방법을 말한다. 핵산 검출 분석은 다음에 기술된, DNA 서열 분석 방법, 프로브 하이브리드화 방법, 구조 특이적인 절단 분석(예컨대, “INVADER” 플랩 분석, 또는 침입성 절단 분석, (Hologic, Inc.)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 미국 특허 제5,846,717호, 제5,985,557호, 제5,994,069호, 제6,001,567호, 제6,090,543호, 및 제6,872,816호; Lyamichev 등, Nat.Biotech.,17:292 (1999), Hall 등, PNAS, USA, 97:8272 (2000), 및 조합 PCR/침입성 절단 분석(Hologic, Inc., 예컨대, 미국 특허 공보 제2006/0147955호 및 제2009/0253142호), 이들 각각은 모든 목적을 위해 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다); 효소 미스매치 절단 방법(enzyme mismatch cleavage method) (예컨대, Variagenics, 미국 특허 제6,110,684호, 제5,958,692호, 제5,851,770호, 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨); 상기 기술된 폴리머라제 쇄 반응(PCR); 측쇄 하이브리드화 방법(예컨대, Chiron, 미국 특허 제5,849,481호, 제5,710,264호, 제5,124,246호, 및 제5,624,802호, 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨); 롤링 서클 복제(rolling circle replication)(예컨대, 미국 특허 제6,210,884호, 제6,183,960호 및 제6,235,502호, 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨); NASBA (예컨대, 미국 특허 제5,409,818호, 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨); 분자 비콘 기술(molecular beacon technology)(예컨대, 미국 특허 제6,150,097, 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨); E-센서 기술(미국 특허 제6,248,229호, 제6,221,583호, 제6,013,170호, 및 제6,063,573호, 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨); 사이클링 프로브 기술(cycling probe technology)(예컨대, 미국 특허 제5,403,711호, 제5,011,769호, 및 제5,660,988호, 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨); 데이드 베링(Dade Behring) 시그날 증폭 방법(예컨대, 미국 특허 제6,121,001호, 제6,110,677호, 제5,914,230호, 제5,882,867호, 및 제5,792,614호, 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨); 리가제 쇄 반응(예컨대, Barany Proc.Natl.Acad.Sci USA 88, 189-93 (1991)); 및 샌드위치 하이브리드화 방법(예컨대, 미국 특허 제5,288,609호, 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨).
일부 구현예에서, 표적 핵산이 증폭되고(예컨대, PCR에 의해) 증폭된 핵산은 침입성 절단 분석을 사용하여 동시 검출된다. 증폭 분석과 함께 검출 분석(예컨대, 침입성 절단 분석)을 수행하기 위해 구성된 검정은 다음에 기술되어 있다. 미국 특허 공보 제 20090253142 Al호(출원일련번호제제12/404,240호), 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 참고로 포함되고, 도 1에 기술되어 있다. FRET 카세트의 많은 카피가 생산된 표적 앰플리콘의 각각의 카피에 대해 절단되므로, 상기 분석은 표적 증폭 외에도 “시그날 증폭”을 생산하는 것으로 일컬어진다. 추가의 증폭 및 침입성 절단 검출 구성(QuARTS방법으로 명명됨)은 다음에 기술되어 있다. 미국 특허 제8,361,720호, 제8,715,937호, 및 제8,916,344호, 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 참고로 포함됨.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “PCR-플랩 분석”은 용어 “PCR-침입성 절단분석”과상호교환적으로 사용되며 증폭된 표적 DNA를 포함하는 제1의 오버랩 절단 구조, 및 제1의 오버랩 절단 구조로부터 절단된 5’ 플랩 및 “FRET 카세트”로 불리는 표지된 헤어핀 검출 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제2의 오버랩 절단 구조의 형성에 의한 PCR 표적 증폭과 증폭된 DNA의 검출을 조합한 분석 구성을 말한다. 본원에 사용된 바와 같은 PCR-플랩 분석에서, 분석 시약은 DNA 폴리머라제, FEN-1 엔도뉴클레아제, 표적 핵산에 대해 상보성인 부위를 포함하는 1차 프로브, 및 헤어핀 FRET 카세트를 함유하는 혼합물을 포함하고, 표적 핵산은 PCR에 의해 증폭되며 증폭된 핵산은 동시 검출된다 (즉, 검출이 표적 증폭 과정 동안 발생한다). PCR-플랩 분석은 다음에 기술된 분석을 포함한다. QuARTS분석(미국 특허 제8,361,720호; 제8,715,937호; 및 제8,916,344호), 및 증폭 분석(미국 특허제9,096,893호(예를 들면, 당해 특허의 도 1에 도시된 바와 같음), 이들 각각은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다).
본원에 사용된 것으로서, 용어 “PCR-플랩 분석 시약”은 PCR-플랩 분석에서 표적 서열을 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 말하며, 당해 시약은 DNA 폴리머라제, FEN-1 엔도뉴클레아제 및 FRET 카세트를 함유하는 혼합물 속에서, 표적 서열의 존재하에 표적 핵산의 증폭 및 플랩 절단 구조의 형성에 관여할 수 있는 핵산 분자를 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “플랩 분석 시약” 또는 “침입성 절단 분석 시약”은기질에서 플랩 분석 또는 침입성 절단 분석을 수행하는데 필요한 모든 시약을 말한다. 당해 분야에 공지된 것으로서, 플랩 분석은 일반적으로 위에서 기술한 바와 같은,침입성 올리고뉴클레오타이드, 플랩 올리고뉴클레오타이드, 플랩 엔도뉴클레아제 및, 임의로, FRET 카세트를 포함한다. 플랩 분석 시약은 침입성 올리고뉴클레오타이드 및 플랩 올리고뉴클레오타이드가 결합하는 표적을 임의로 함유할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “플랩 올리고뉴클레오타이드”는 플랩 엔도뉴클레아제에 의해, 침입성 절단 분석과 같은 검출 검정에서 절단가능한 올리고뉴클레오타이드를 말한다. 바람직한 구현예에서, 플랩 올리고뉴클레오타이드는 다른 핵산, 예컨대, 표적 핵산 및 침입성 올리고뉴클레오타이드와 함께 침입성 절단 구조를 형성한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “FRET 카세트”는 형광단 잔사 및 형광단을 퀀칭(quenching)하는 근처의 퀀처 잔사를 함유하는 헤어핀 올리고뉴클레오타이드를 말한다. 절단된 플랩(예컨대, PCR-플랩 분석에서 표적-특이적인 프로브의 절단으로부터)과 FRET 카세트의 하이브리드화는 플랩 엔도뉴클레아제, 예컨대, FEN-1 효소에 대한 제2 기질을 생산한다. 일단 상기 기질이 형성되면, 5' 형광단-함유 염기를 카세트로부터 절단함으로써, 형광성 시그날을 생성한다. 바람직한 구현예에서, FRET 카세트는 절단 생성물, 예컨대, 절단된 플랩 올리고뉴클레오타이드의 부위가 가수분해되어 FEN-1 엔도뉴클레아제에 의해 절단가능한 침입성 절단 구조를 형성할 수 있는 쌍을 이루지 않은 3’ 부위를 포함한다.
본원에 사용된 것으로서 핵산 “헤어핀”은, 핵산이 서로 충분히 상보성이어서 다수의 연속성 염기쌍을 형성하는 2개 부위를 포함하는 경우 형성된, 이본쇄(duplex) (즉, 염기-쌍을 이룬) 줄기 및 루프를 함유하는 일본쇄 핵산의 영역을 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “FRET”는 잔사(예컨대, 형광단)가 에너지를 예컨대, 다른 것들 중에서, 또는 형광단으로부터 비-형광단(예컨대, 퀀처 분자)로 전달하는 공정인, 형광성 공명 에너지 전달을 말한다. 일부 상황에서, FRET는 단-범위(예컨대, 약 10 nm 미만)의 쌍극자-쌍극자 상호작용을 통해 보다 낮은-에너지 수용체 형광단에 에너지를 전달하는 여기된 공여체 형광단을 포함한다. 다른 상황에서, FRET는 공여체로부터 형광성 에너지의 손실 및 수용체 형광단에서 형광성에 있어서의 증가를 포함한다. 여전히 다른 형태의 FRET에서, 에너지는 여기된 공여체 형광단으로부터 비-형광성 분자(예컨대, 퀀칭 분자)로 교환될 수 있다. FRET는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 기술되어 이다(참고: 예컨대, Stryer 등, 1978, Ann.Rev.Biochem.,47:819; Selvin, 1995, Methods Enzymol.,246:300; Orpana, 2004 Biomol Eng 21, 45-50; Olivier, 2005 Mutant Res 573, 103-110, 이들 각각은 이의 전문이 본원에 참고로 포함됨).
본원에 사용된 것으로서, 효소를 참고로 용어 “FEN-1”은 FEN-1 유전자에 의해 암호화된 것으로서, 진핵세포 또는 고세균 유기체로부터의 비-폴리머라제 플랩 엔도뉴클레아제를 말한다. 다음을 참고한다. 예컨대, 제WO 02/070755호, 및 Kaiser M.W., et al.(1999) J.Biol.Chem.,274:21387, 이는 모은 목적을 위해 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “FEN-1 활성”은 FEN-1 효소의 효소 활성을 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “프라이머 어닐링”은 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 주형 핵산 쇄에 하이브리드화하도록 하는 조건을 말한다. 프라이머 어닐링을 위한 조건은 프라이머의 길이 및 서열에 따라 변하며 일반적으로 프라이머에 대해 측정되거나 계산된 Tm을 기본으로 한다. 예를 들면, 열사이클링을 포함하는 증폭 방법에서 어닐링 단계는 열 변성 단계 후 온도를 이러한 어닐링을 허용하기에 충분한 시간 동안 프라이머 서열의 Tm을 기준으로 한 온도로 강하시킴을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “증폭가능한 핵산”은 어떠한 증폭 방법에 의해서도증폭될 수 있는 핵산에 대해 참고하여 사용된다. “증폭가능한 핵산”은 일반적으로 “샘플 주형”을 포함할 것으로 고려된다.
핵산 증폭 또는 시그날 증폭의 검출을 참고하여 본원에 사용된 것으로서 용어 “실시간”은 반응이 진행되는 동안, 예컨대, 항온처리 또는 열 사이클링 동안 반응물 속에 생성물 또는 시그날의 축적의 검출 또는 측정을 말한다. 이러한 검출 또는 측정은 연속적으로 일어날 수 있거나, 이는 증폭 반응의 진행동안 다수의 별개의 지점에서 일어날 수 있거나, 이는 조합될 수 있다. 예를 들면, 폴리머라제 쇄 반응에서, 검출(예컨대, 형광성의)은 열 사이클링의 모두 또는 일부 동안에 연속적으로 일어날 수 있거나, 이는 하나 이상의 사이클 동안 하나 이상의 시점에서, 일시적으로 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, PCR의 실시간 검출은 형광성의 수준을 다수의 사이클 각각에서, 또는 매 마이클에서 동시에(예컨대, 사이클내 시점에서, 또는 사이클내 온도 단계에서) 측정함으로써 달성된다. 증폭의 실시간 검출은 또한 증폭 반응 “동안” 검출로서 언급될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “핵산의 풍부성”은 샘플 또는 분취량 속에 존재하는 표적 핵산 서열의 양을 말한다. 상기 양은 일반적으로 질량의 측면에서(예컨대, μg), 다음을 말한다. 용적 단위당 질량(예컨대, μg/μL); 카피 수(예컨대, 1000개 카피, 1 attomole), 또는 용적 단위 당 카피 수(예컨대, mL당 1000개 카피, μL당 1 attomole). 핵산의 풍부성은 또한 공지된 농도 또는 카피 수의 표준 양에 대해 상대적인 양으로 표현될 수 있다. 핵산의 풍부성의 측정은 물리적 밀도 또는 샘플, 광학 밀도, 굴절 특성, 염색 특성을 포함하는 핵산 풍부성의 적합한 정량적 표시인 것으로 당해 분야의 숙련가가 이해하는 어떠한 기준, 또는 검출가능한 표지, 예컨대 형광성 표지의 강도의 기준일 수 있다.
용어 “앰플리콘” 또는 “증폭된 생성물”은 PCR 공정과 같은 증폭 공정에 의해 생성된, 핵산, 일반적으로 DNA의 분절을 말한다. 상기 용어는 또한 RNA 폴리머라제, 예를 들면, NASBA, TMA, 등을 사용하는 증폭 방법에 의해 생산된 RNA 분절을 참고로 사용된다.
열 사이클링 증폭 반응을 참고로 사용된 바와 같은 용어 “증폭 플롯”은 증폭의 지표, 예컨대, 사이클 수에 대한 형광성 시그날인 시그날의 플롯을 말한다. 비-열 사이클링 증폭 방법을 참고하여 사용된 경우, 증폭 플롯은 일반적으로 시간의 함수로서 시그날의 축적의 플롯을 말한다.
증폭 플롯을 참고로 사용된 바와 같은 용어 “기본선”은 항온처리 전 또는, PCR의경우에, 시그날에 있어서 변화가 거의 없는 초기 사이클에서 조립된 증폭 반응으로부터 오는 검출된 시그날을 말한다.
열 사이클링되는 증폭 반응 동안 실시간 검출을 참고로 본원에 사용된 바와 같은 용어 “Ct” 또는 “역치 주기(threshold cycle)”는 검출된 시그날(예컨대, 형광성)이 고정된 역치를 통과하는 분획 사이클 수를 말한다.
대조군 반응을 참고로 본원에 사용된 바와 같은 용어 “주형 대조군이 없음” 및 “표적 대조군이 없음”(또는 “NTC”) 은 주형 또는 표적 핵산을 함유하지 않는 반응물 또는 샘플을 말한다. 이는 증폭 품질을 입증하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “샘플 주형”은 “표적”의 존재에 대해 분석되는 샘플로부터 기원하는 핵산을 말한다. 대조적으로, “배경 주형”은 샘플 속에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 샘플 주형 이외의 핵산에 대해 참고하여 사용된다. 배경 주형의 존재가 가장 흔하게 의도치 않은 것이다. 이는 캐리오버(carryover)의 결과일 수 있거나, 이는 샘플로부터 정제 제거되는 것으로 고려된 핵산 오염물의 존재에 기인할 수 있다. 예를 들면, 검출될 것들 이외의 다른 유기체로부터의 핵산은 시험 샘플 속에서 배경으로서 존재할 수 있다.
핵산”을 함유하는 것으로 추측되는” 샘플은 표적 핵산 분자를 함유하거나 함유하지않을 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “샘플”은 이의 최대의 광의로서 사용된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 이는 표본 또는 배양물(예컨대, 미생물 배양물)을 포함함을 의미하는 반면, 다른 구현예에서, 이는 생물학적 및 환경적 샘플(예컨대, 표적 서열, 유전자 또는 주형을 포함하는 것으로 추측됨) 둘 다를 포함함을 의미한다. 일부 구현예에서, 샘플은 합성 기원의 표본을 포함할 수 있다. 샘플은 정제되지 않거나 부분적으로 또는 완전히 정제될 수 있거나 또는 달리는가공될 수 있다.
본 기술은 사용되거나 분석된 생물학적 샘플의 유형에 의해 제한되지 않는다. 본 기술은 사람 (예컨대, 성인, 유아, 또는 배아) 또는 동물(예컨대, 소, 가축, 마우스, 랫트, 개, 돼지, 고양이, 말 등)으로부터 수득된 조직(예컨대, 기관(예컨대, 심장, 간, 뇌, 폐, 위장, 장, 비장, 신장, 췌장, 및 재생 기관), 선(glandular), 피부, 및 근육), 세포(예컨대, 혈액 세포(예컨대, 림프구 또는 적혈구), 근육 세포, 종양 세포, 및 피부 세포), 가스, 체액(예컨대, 혈액 또는 이의 일부, 혈청, 혈장, 뇨, 정액, 타액, 등.), 또는 고체(예컨대, 대변) 샘플을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 생물학적 샘플과 함께 유용하다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 고체 음식 및/또는 사료 생성물 및/또는 낙농 제품, 야채, 고기 및 고기 부산물, 및 폐기물과 같은 성분일 수 있다. 생물학적 샘플은 유제류, 곰, 어류, 토끼목 포유동물, 설치류, 기각류 등과 같은 동물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 가축 동물, 및 농장 또는 야생 동물의 다양한 계열 모두로부터 수득될 수 있다.
생물학적 샘플은 또한 생검 및 조직 단면(예컨대, 종양, 성장, 발진, 감염, 또는 파라핀-매립된 단면), 의학적 또는 병원 샘플(예컨대, 혈액 샘플, 타액, 볼내 면봉 표본, 뇌척수액, 흉수, 젖, 초유, 림프, 가래, 구토물, 담즘, 정액, 난모세포, 경부 세포, 양수액, 대변, 모발, 및 땀), 실험실 샘플(예컨대, 준세포 분획(subcellular fractions)), 및 법의학 샘플(예컨대, 혈액 또는 조직(예컨대, 스패터(spatter) 또는 잔사), 핵산을 함유하는 모발 및 피부 세포), 및 고고학적 샘플(예컨대, 화석화된 기관, 조직, 또는 세포)을 포함한다.
환경 샘플은 표면 물질, 토양, 물(예컨대, 담수 또는 해수), 조류, 이끼, 지질 샘플, 핵산, 결정, 및 산업적 샘플을 함유하는 공기 함유 물질, 및 또한 식품 및 유제품 가공 기구, 장치, 장비, 기구, 일회용 및 비-일회용 항목으로부터 수득된 샘플과 같은 환경 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
샘플은 어떠한 바람직하거나 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 다음에 기술된 방법을 사용하여 체액, 대변, 또는 다른샘플로부터 직접 분석된다. 미국 특허 제9,000,146호, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
그러나, 상기 기술된 실시예는 본 기술에 적용가능한 샘플(예컨대, 표적 서열, 유전자 또는 주형을 포함하는 것으로 의심됨)(예컨대, 본 기술의 조성물 및 방법을 사용하여 측정될 수 있는 것의 존재 또는 부재))을 제한하는 것으로 고려되지 않는다.
본원에 사용된 것으로서 용어 “핵산 서열” 및 “핵산 분자”는 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 및 이의 단편 또는 부위를 말한다. 상기 용어는 상기 나열된 것들을 포함하고, 또한 4-아세틸사이토신, 8-하이드록시 -N6-메틸아데노신, 아지리딘사이토신, 슈도이소사이토신, 5-(카복시하이드록실-메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카복시메틸-아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도-우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸-사이토신, 5-메틸사이토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시 -아미노-메틸-2-티오우라실, 베타 -D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오사이토신, 2,6-디아미노푸린, 및 피라졸로[3,4-d]피리미딘, 예를 들면, 구아닌 유사체 6 아미노 1H-피라졸로[3,4d]피리미딘 4(5H) 온(ppG 또는 PPG, 또한 Super G) 및 아데닌 유사체 4 아미노 1H-피라졸로[3,4d]피리미딘(ppA 또는 PPA)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 DNA 및 RNA 뉴클레오타이드의 유사체를 포함하는 서열을 포함한다. 크산틴 유사체 1H-피라졸로[5,4d]피리미딘 4(5H)-6(7H)-디온(ppX)을 또한 사용할 수 있다. 이들 염기 유사체는 올리고뉴클레오타이드 속에 존재하는 경우, 하이브리드화를강화시키고 미스매치 식별을 개선시킨다. 천연적으로-발생하는 염기, 개질된 염기 및 염기 유사체의 모든 토우토머 형태는상기 기술의 올리고뉴클레오타이드 접합체 속에 포함될 수 있다. 본 기술에 유용한 다른 개질된 염기는 6-아미노-3-프로프-1-이닐-5-하이드로피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-온, PPPG; 6-아미노-3-(3-하이드록시프로프-1-이닐)-5-하이드로피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-온, HOPPPG; 6-아미노-3-(3-아미노프로프-1-이닐)-5-하이드로피라졸로[3,4-d]피리미딘-4- -온, NH2PPPG; 4-아미노-3-(프로프-1-이닐)피라졸로[3,4-d]피리미딘, PPPA; 4-아미노-3-(3-하이드록시프로프-1-이닐)피라졸로[3,4-d]피리미딘, HOPPPA; 4-아미노-3-(3-아미노프로프-1-이닐)피라졸로[3,4-d]피리미딘, NH2 PPPA; 3-프로프-1-이닐피라졸로[3,4-d]피리미딘-4,6-디아미노, (NH2)2 PPPA; 2-(4,6-디아미노피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)에틴-1-올, (NH2)2 PPPAOH; 3-(2-아미노에티닐)피라졸로[3,4-d]피리미딘-4,6-디아민, (NH2)2 PPPANH2; 5-프로프-1-이닐-1,3-디하이드로피리미딘-2,4-디온, PU; 5-(3-하이드록시프로프-1-이닐)-1,3-디하이드로피리미딘-2,4-디온, HOPU; 6-아미노-5-프로프-1-이닐-3-디하이드로피리미딘-2-온, PC; 6-아미노-5-(3-하이드록시프로프-1-이니)-1,3-디하이드로피리미딘-2-온, HOPC; 및 6-아미노-5-(3-아미노프로프-1-이니)-1,3-디하이드로피리미딘-2-온, NH2PC; 5-[4-아미노-3-(3-메톡시프로프-1-이닐)피라졸[3,4-d]피리미디닐]-2-(하이드록시메틸)옥솔란-3-올, CH3 OPPPA; 6-아미노-1-[4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)옥솔란-2-일]-3-(3-메톡시프로프-1-이닐)-5-하이드로피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-온, CH3 OPPPG; 4, (4,6-디아미노-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-3-일)-부트-3-인-1-올, SuperA; 6-아미노-3-(4-하이드록시-부트-1-이닐)-1,5-디하이드로-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-온; 5-(4-하이드록시-부트-1-이닐)-1H-피리미딘-2,4-디온, 슈퍼(Super) T; 3-요오도-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4,6-디아민 ((NH2)2PPAI); 3-브로모 -1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4,6-디아민((NH2)2 PPABr); 3-클로로-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4,6-디아민((NH2)2PPACl); 3-요오도-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일아민(PPAI); 3-브로모-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일아민 (PPABr); 및 3-클로로-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일아민(PPACl)을 포함한다.
핵산 서열 또는 분자는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고, 센스 또는 안티센스 쇄를나타내는, 게놈성 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 따라서, 핵산 서열은 ssDNA(예컨대, 용융, 변성, 헬라카제, 등)로 제조된 dsDNA, ssDNA, 혼합된 ssDNA, 혼합된 dsDNA, dsDNA일 수 있다. ssRNA(예컨대, 용융, 변성, 헬리카제등을 통해), 전령 RNA (mRNA), 리보소옴 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 촉매 RNA, snRNA, microRNA, 또는 단백질 핵산(PNA)으로 제조된 A-, B-, 또는 Z-DNA, 삼-본쇄 DNA, RNA, ssRNA, dsRNA, 혼합된 ss 및 dsRNA, dsRNA일 수 있다.
본 기술은 이용된 핵산(예컨대, 서열 또는 분자(예컨대 표적서열 및/또는 올리고뉴클레오타이드))의 유형 또는 공급원에 의해 제한되지 않는다. 예를 들면, 핵산 서열은 증폭되거나 창조된 서열일 수 있다(예컨대, 다음을 통한 핵산 서열의 증폭 또는 창조(예컨대, 중합(예컨대, 프라이머 연장(예컨대, RNA-DNA 하이브리드 프라이머 기술)) 및 역 전사(예컨대, RNA의 DNA내로)) 및/또는 증폭(예컨대, 폴리머라제 쇄 반응(PCR), 롤링 서클 증폭(RCA), 핵산 서열 계 증폭(NASBA), 전사 매개된 증폭(TMA), 리가제 쇄 반응(LCR), 사이클링 프로브 기술, Q-베타 레플리카제, 쇄 교체 증폭(strand displacement amplification: SDA), 측쇄된-DNA 시그날 증폭(bDNA), 하이브리드 포획, 및 헬리카제 의존성 증폭).
용어 “뉴클레오타이드” 및 “염기”는 본원에 달리 나타내지 않는 한, 핵산 서열을 참고로 사용되는 경우 상호교환적으로 사용된다. “뉴클레오염기”는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 우라실, 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 또는 헤테로사이클릭 유도체, 유사체, 또는 이의 토우토머와 같은 헤테로사이클릭 염기이다. 뉴클레오염기는 천연적으로 존재하거나 합성일 수 있다. 뉴클레오염기의 비-제한적 예는 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신, 우라실, 크산틴, 하이포크산틴, 8-아자푸린, 8번 위치에서 메틸 또는 브롬으로 치환된 푸린, 9-옥소 -N6-메틸아데닌, 2-아미노아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, 7-데아자-아데닌, N4-에타노사이토신, 2,6-디아미노푸린, N6-에타노-2,6-디아미노푸린, 5-메틸사이토신, 5-(C3-C6)-알키닐사이토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 티오우라실, 슈도이소사이토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소사이토신, 이소구아닌, 이노신, 7,8-디메틸알록사진, 6-디하이드로티민, 5,6-디하이드로우라실, 4-메틸-인돌, 에테노아데닌 및 비-천연적으로 존재하는 뉴클레오염기이며 이들은 미국 특허 제5,432,272호 및 제6,150,510호 및 PCT 출원 제WO 92/002258호, 제WO 93/10820호, 제WO 94/22892호, 및 제WO 94/24144호, 및 Fasman (“Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology”, pp.385-394, 1989, CRC Press, Boca Raton, LO), 이의 전문은 모두 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 것으로서 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 2개 이상의 뉴클레오타이드(예컨대, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드), 바람직하게는 적어도 5개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 적어도 약 10 내지 15개의 뉴클레오타이드 및 보다 바람직하게는 적어도 약 15 내지 30개의 뉴클레오타이드, 또는 보다 긴(예컨대, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 전형적으로 200개 미만의 잔기(예컨대, 15 내지 100개의 뉴클레오타이드)를 포함하는 분자로서 정의되지만, 본원에 사용된 것으로서, 상기 용어는 또한 보다 긴 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 것으로 의도된다)를 포함하는 분자로서 정의된다. 정확한 크기는 많은 인자에 의존할 것이며, 이는 최종적으로는 올리고뉴클레오타이드의 최종적인 기능 또는 용도에 의존한다. 올리고뉴클레오타이드는 흔히 이들의 길이에 의해 언급된다. 예를 들면, 24개의 잔기 올리고뉴클레오타이드는 “24-머”로서 언급된다. 올리고뉴클레오타이드는 자가-하이브리드화에 의해서 또는 다른 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화함으로써 2차 및 3차 구조를 형성할 수 있다. 이러한 구조는 이본체, 헤어핀(hairpin), 십자형, 벤드(bend), 및 삼원체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 올리고뉴클레오타이드는 화학적 합성, DNA 복제, 역 전사, PCR, 또는 이의 조합을 포함하는 어떠한 방식으로도 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 침입성 절단 구조를 형성하는 올리고뉴클레오타이드가 반응물 속에 생성된다(예컨대, 효소적 연장 반응에서 프라이머의 연장에 의함).
모노뉴클레오타이드는 하나의 모노뉴클레오타이드 펜토즈 환의 5’ 포스페이트가포스포디에스테르 연결을 통해 하나의 방향으로 이의 이웃의 3’ 산소에 부착하도록 하는 방식으로 반응하여 올리고뉴클레오타이드를 제조하므로, 올리고뉴클레오타이드의 말단은 이의 5’ 포스페이트가 모노뉴클레아제 펜토즈 환의 3’ 산소에 연결되지 않는 경우 “5’ 말단”으로서 및 이의 3’ 산소가 후속적인 모노뉴클레오타이드 펜토즈 환의 5’ 포스페이트에 연결되지 않는 경우 “3’ 말단”으로서 언급된다. 본원에 사용된 것으로서, 핵산 서열은 보다 큰 올리고뉴클레오타이드에 대해 내적인 경우에도 핵산 서열이 또한 5’ 및 3’ 말단을 갖는 것으로 일컬어질 수 있다. 핵산 쇄에 따른 제1 영역은 5’ 내지 3’ 방향으로 핵산의 쇄를 따라 이동하는 경우 제1 영역의 3’ 말단이 제2 영역의 5’ 말단 앞에 있는 경우 다른 영역의 하부에 있는 것으로 일컬어진다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “상보적인” 또는 “상보성”은 염기-쌍화 규칙에 의해관련된 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 2개 이상의 뉴클레오타이드(예컨대, 올리고뉴클레오타이드 또는 표적 핵산)의 서열)를 참고로 사용된다. 예를 들면, 서열 “5'-A-G-T-3'”는 서열 “3'-T-C-A-5'”에 대해 상보적이다. 상보성은 “부분적”일 수 있으며, 여기서 핵산 염기 중 일부만이 염기 쌍화 규칙에 따라 매치된다. 또는, 핵산 염기들 사이에 “완전한” 또는 “총” 상보성일 수 있다. 핵산 쇄들 사이에서 상보성 정도는 핵산 쇄들 사이에 하이브리드화의 효능 및 강도에 있어서 유의적인 효과를 갖는다. 이는 증폭 반응, 및 또한 2개 이상의 핵산 쇄의 연합에 의존하는 검출 방법에 있어 특히 중요하다. 어느 용어도 또한 특히 폴리뉴클레오타이드의 내용내에서, 개개 뉴클레오타이드를 참고로 사용될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드내 특수한 뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드의 나머지와 핵산 서열 사이의 상보성과 대조적으로 또는 이와 비교하여, 다른 핵산 서열(예컨대, 표적 서열)내에서 뉴클레오타이드에 대해 이의 상보성, 또는 이의 결여에 대해 주목될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 핵산 서열의 상보성은 하나의 서열의 5’ 말단이 다른 것의 3’ 말단과 쌍을 이루도록 핵산 서열과 정렬되는 경우, “역평행 관계”에 있는 올리고뉴클레오타이드를 말한다. 상기 논의된 바와 같은, 뉴클레오타이드 유사체는 본 기술의 핵산내에 포함될 수 있으며 포함한다. 상보성은 완전할 필요가 없으며; 안정한 이본체는 미스매치된 염기쌍 또는 매치되지 않은 쌍을 함유할 수 있다. 핵산 기술의 분야의 숙련가는 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드의 길이, 올리고뉴클레오타이드의 염기 조성 및 서열, 이온 강도 및 미스매치된 염기 쌍의 발생 정도를 포함하는 다수의 변수를 실험적으로 고려하여 이본쇄 안정성을 측정할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “표지”는 검출될 수 있거나 검출가능한 반응을 가져올 수 있는 어떠한 잔사(예컨대, 화학 종)을 말한다. 일부 바람직한 구현예에서, 표지의 검출은 정량가능한 정보를 제공한다. 표지는 예를 들면, 방사활성 표지(예컨대, 방사핵종), 리간드(예컨대, 바이오틴 또는 아비딘), 화학단(예컨대, 검출가능한 색상을 부여하는 염료 또는 입자), 합텐(예컨대, 디곡시게닌), 질량 표지, 라텍스 비드, 금속 입자, 상자성 표지, 발광성 화합물(예컨대, 생물발광성, 인광성또는 화학발광성 표지) 또는 형광성 화합물과 같은, 어떠한 공지된 검출가능한 잔사일 수 있다.
표지는 올리고뉴클레오타이드 또는 다른 생물학적 분자에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 직접적인 표지화는 공유 결합 또는 수소 결합, 소수성 및 이온성 상호작용과 같은 비-공유결합성 상호작용을 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 표지를 연결하는 결합 또는 상호작용을 통해, 또는 킬레이트 또는 배위 착체의 형성을 통해 일어날 수 있다. 간접적인 표지화는 직접 또는 간접적으로 표지되는 항체 또는 추가의 올리고뉴클레오타이드(들)과 같은, 브릿징 잔사(bridging moiety) 또는 “링커”를 통해 일어날 수 있다.
표지는 단독으로 또는 지지(예컨대, 퀀치), 여기, 또는 전달(예컨대, 쉬프트(shift)) 방사 스펙트럼(예컨대, 표지(예컨대, 발광성 표지)의 형광성 공명 에너지 전달(FRET))할 수 있는 잔사와 함께 사용될 수 있다.
“폴리머라제”는 일반적으로 3'-OH 5'-트리포스페이트 뉴클레오타이드, 올리고머, 및 이들의 유사체를 결합시키기 위한 효소이다. 폴리머라제는 주형-의존성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제, DNA-의존성 RNA 폴리머라제, RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리머라제는 T7 DNA 폴리머라제, T3 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 1, 클레노우 단편(Klenow fragment), 써모필루스 아쿠아티쿠스(Thermophilus aquaticus) DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제 (New England Biolabs), Deep Vent DNA 폴리머라제 (New England Biolabs), Bst DNA 폴리머라제 거대 단편, 스토에펠 단편(Stoeffel Fragment), 9°N DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, Tfl DNA 폴리머라제, RepliPHI Phi29 폴리머라제, Tli DNA 폴리머라제, 진핵세포 DNA 폴리머라제 베타, 텔로머라제, 터미네이터 폴리머라제 (New England Biolabs), KOD HiFi DNA 폴리머라제(Novagen), KOD1 DNA 폴리머라제, Q-베타 레플리카제, 말단 트랜스퍼라제, AMV 역 전사효소, M-MLV 역 전사효소,, Phi6 역 전사효소, HIV-1 역 전사효소, 바이오프로스펙팅(bioprospecting)에 의해 발견된 신규 폴리머라제, 및 다음에서 인용된 폴리머라제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 제US 2007/0048748호, 미국 특허 제6,329,178호; 제6,602,695호; 및 제6,395,524호(참고로 포함됨). 이들 폴리머라제는 야생형, 돌연변이 동형, 및 유전적으로 가공된 변이체를 포함한다.
“DNA 폴리머라제”는 데옥시뉴클레오타이드 단량체(dNTP)로부터 DNA를 생산하는 폴리머라제이다. 본원에 사용된 것으로서 “진핵세포 DNA 폴리머라제”는 이. 콜라이(E. coli)로부터의 DNA 폴리머라제 I, 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터의 Taq DNA 폴리머라제 및 써무스 속의 다른 구성원, 및 다른 진핵세포 종 등으로부터의 DNA Pol I 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 유박테리아(Eubacteria)로부터의 Pol A 형 DNA 폴리머라제(복구 폴리머라제)를 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “표적”은 검출되거나 특성화될 핵산 종 또는 핵산서열 또는 구조를 말한다.
따라서, 본원에 사용된 것으로서, “비-표적”은, 예컨대, DNA와 같은 핵산을 기술하는데 사용되므로, 반응물 속에 존재할 수 있지만, 반응에 의한 검출 또는 특성화의 대상이 아닌 핵산을 말한다. 일부 구현예에서, 비-표적 핵산은 예컨대, 표적 서열을 함유하지 않는 샘플 속에 존재하는 핵산을 말할 수 있는 반면, 일부 구현예에서, 비-표적은 외인성 핵산, 즉, 표적 핵산을 함유하거나 함유하는 것으로 추측되는 샘플로부터 기원하지 않고, 반응물에 가해져서, 예컨대, 효소(예컨대, 폴리머라제)의 활성을 정상화시켜 반응물 속의 효소의 수행능에 있어서 가변성을 감소시키는 핵산을 말할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “증폭 시약”은 프라이머, 핵산 주형, 및 증폭 효소를 제외하고 증폭에 필요한, 시약(데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, 완충액, 등)을 말한다. 전형적으로, 다른 반응 성분과 함께 증폭 시약은 반응 용기에 위치하거나 이 속에 함유된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “대조군”은 핵산 검출 또는 분석에 대한 참고로 사용되는 경우 실험 표적(예컨대, 공지되지 않은 농도의 핵산)과 비교하여 사용하기 위한, 공지된 특징(예컨대, 공지된 서열, 세포당 공지된 카피-수)를 갖는 핵산을 말한다. 대조군은 내인성, 바람직하게는 검정에서 시험 또는 표적 핵산을 정상화시킬 수있는 불변 유전자일 수 있다. 이러한 정상화는 예를 들면, 샘플 가공, 검정 효능, 등에서 일어날 수 있고, 샘플-대-샘플 데이터 비교를 정밀하게 할 수 있는 샘플-대-샘플 변이체에 대해 조절한다. 사람 샘플에서 핵산 검출 분석을 정상화하기 위한 용도를 지닌 유전자는, 예컨대, β-액틴, ZDHHC1, 및 B3GALT6를 포함한다(참고: 예컨대, 미국 특허 출원일련번호제14/966,617호 및 제62/364,082호, 각각은 본원에 참고로 포함된다.
대조군은 또한 외부적일 수 있다. 예를 들면, qPCR, QuARTS,등과 같은 정량적 분석에서, “캘리브레이터 (calibrator)” 또는 “캘리브레이션 대조군(calibration control)”은 예컨대, 실험적 표적 핵산의 일부와 동일한 서열, 및 공지된 농도 또는 일련의 농도(예컨대, 정량적 PCR에서 커브된 캘리브레이션의 생성을 위한 일련 희석된 대조군 표적)를 갖는 공지된 서열의 핵산이다. 전형적으로, 캘리브레이션 대조군은 실험 DNA에서 사용된 바와 동일한 시약 및반응 조건을 사용하여 분석된다. 특정 구현예에서, 캘리브레이터의 측정은 동시에, 예컨대, 실험 분석에서와 같은 동일한 열 사이클러 속에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, 다중 캘리브레이터는 상이한 캘리브레이터 서열은 등몰량으로 용이하게 제공되도록, 단일 플라스미드 속에 포함될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 플라스미드 캘리브레이터는 예컨대, 하나 이상의 제한 효소로 분해되어, 플라스미드 벡터로부터 캘리브레이터 일부를 방출한다. 다음을 참고한다. 예컨대, 제WO 2015/066695호, 이는 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, “ZDHHC1”은 Chr 16 (16q22.1) 상의 사람 DNA 속에 위치하는 1을 함유하고 DHHC 팔미토일트랜스퍼라제 계열에 속하는 DHHC-형의 아연 핑거(zinc finger)로서 특성화된 단백질을 암호화하는 유전자를 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “공정 조절”은 추출 후 측정되어 공정의 효능을 평가할 수 있고 성공 또는 실패 방식을 측정할 수 있는 표적 DNA의 추출 전에 샘플에 가해진 외인성 분자, 예컨대, 외인성 핵산을 말한다. 사용된 공정 조절 핵산의 특성은 일반적으로 검정 유형 및 측정되는 물질에 의존한다. 예를 들면, 사용되는 검정이 이본쇄 DNA 또는 이 속의 돌연변이의 검출 및/또는 정량화를 위한 것인 경우, 이본쇄 DNA 공정 조절은 전형적으로 추출 전 샘플내로 스파이크된다. 유사하게, mRNA 또는 마이크로RNA를 모니터하는 분석의 경우, 사용된 공정 조절은 전형적으로 RNA 전사체 또는 합성 RNA이다. 다음을 참고한다. 예컨대, 미국 특허 출원일련번호제62/364,049호(2016년 7월 19일자로 출원됨), 이는 본원에 참고로 포함되고, 사람 샘플용 공정 대조군으로서 제브라피쉬 DNA의 사용을 기술한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “제브라피쉬 DNA”는 거대한 “어류 DNA” ) 예컨대, 정제된 연어 DNA)와는 구별되며 다니오 레리오(Danio rerio)로부터 분리되거나 시험관내(in vitro)에서 창조(예컨대, 효소적으로, 합성적으로)되어 다니오 레리오로부터의 DNA 속에서 발견된 뉴클레오타이드의 서열을 갖는 DNA를 말한다. 바람직한 구현예에서, 제브라피쉬 DNA는 검출가능한 대조군 DNA, 예컨대, 샘플 프로세싱 단계를 통해 DNA 회수를 입증하기 위한 공정 대조군으로서 가해진 메틸화된 DNA이다. 특히, RASSF1 유전자의 적어도 일부를 포함하는 제브라피쉬 DNA는 다음에 기술된 바와 같이, 예컨대, 사람 샘플용의 공정 대조군으로서의 용도를 갖는다. 미국 특허 출원일련번호제62/364,049호.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “어류 DNA”는 제브라피쉬 DNA와는 구별되며 예컨대, 다음에 기술된 바와 같이, 어류로부터 분리된 거대한 (예컨대, 게놈성) DNA를 말한다. 미국 특허 제 9,212,392호.거대한 정제된 어류 DNA는 상업적으로 이용가능한데, 예컨대, 대구및/또는 청어 정자 DNA(Roche Applied Science, 독일 만하임 소재) 또는 연어 DNA (USB/Affymetrix)의 형태로 제공된다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “입자” 및 “비드”는 상호교환적으로 사용되며, 용어”자기 입자” 및 “자기 비드”는 상호교환적으로 사용되고 자기장에 대해 반응하는 입자 또는 비드를 말한다. 전형적으로, 자기 입자는 자기장이 없지만 자기장에 노출되는 경우 자기 쌍극자를 형성하는 물질, 예컨대, 자기장의 존재 하에서 자기화될 수 있지만 이러한 장의 부재 하에서 자체가 자기성(magnetic)이 아닌 물질을 포함한다. 본 내용에서 사용된 것으로서 용어 “자성”은 상자성 또는 초상자성 물질인 물질을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 “자성”은 또한 상자성 또는 큐리 온도(Curie temperature)가 낮은 상자성 물질과 같은 일시적인 자성 물질을 포함하지만, 단 이러한 일시적인 자성 물질은 이러한 물질을 함유하는 실리카 자기 입자가 생물학적 물질을 분리하기 위해 본 방법에 따라 사용되는 온도 범위에서 상자성이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 “키트”는 물질을 전달하기 위한 특정 전달 시스템을 말한다. 핵산 정제 시스템 및 반응 분석과 관련하여, 이러한 전달 시스템은 시약 및 장치 (예컨대, 적절한 용기 속의 카오트로픽(chaotropic) 염, 입자, 완충액, 변성제, 올리고뉴클레오타이드, 여과기등)의 저장, 수송, 또는 전달을 허용하고/하거나 하나의 위치로부터 다른 위치로 물질을 지지하는(예컨대, 샘플 가공 또는 샘플 저장 용기, 과정을 수행하기 위한 지시사항 등 ) 시스템을 포함한다. 예를 들면, 키트는 관련된 반응 시약 및/또는 지지 물질을 함유하는 하나 이상의 봉입물(예컨대, 박스)를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 “단편화된 키트”는 총 키트 성분 중 소부분을 각각 함유하는 2개 이상의 별도의 용기를 포함하는 전달 시스템을 말한다. 용기는 함께 또는 별도로 의도된 수취인에게 전달될 수 있다. 예를 들면, 제1 용기는 샘플 수집용 물질 및 완충액을 함유할 수 있지만, 제2 용기는 포획 올리고뉴클레오타이드 및 변성제를 함유한다. 용어 “단편화된 키트”는 연방 식품, 약물, 및 화장품 법률 520(e)조 하에 규정된 분석물 특이적인 시약(ASR)을 함유하는 키트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 것으로 의도된다. 실제로, 총 키트 성분의 소부위를 각각 함유하는 2개 이상의 별도의 용기를 포함하는 어떠한 전달 시스템도 용어 “단편화된 키트” 속에 포함된다. 대조적으로, “조합된 키트”는 단일 용기(예컨대, 목적한 성분 각각을 수용하는 단일 박스) 속에 반응 분석의 성분들 모두를 함유하는 전달 시스템을 말한다. 용어 “키트”는 단편화된 및 조합된 키트 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 “시스템”은 특수한 목적을 위해 사용하기 위한 물품의 수집을 말한다. 일부 구현예에서, 물품은 예컨대, 종이, 기록가능한 매체(예컨대, 디스켓, CD, 플래쉬 드라이브, 등)에 공급된 정보로서, 사용을 위한 지시사항을 포함한다. 일부 구현예에서, 지시사항은 사용자를 온라인 위치, 예컨대, 지시사항을 보고/보거나, 듣고/듣거나 다운로드하기 위한 웹사이트로 안내한다. 일부 구현예에서, 지시사항 또는 다른 정보는 이동 장치용 애플리케이션(“앱”)으로 제공된다.
발명의 상세한 설명
핵산의 증폭-계 검출 및 특히, 그러나 전적이지는 않지만, 저-DNA, 바이설파이트-전환된 분석용 샘플을 농축시키는 방법에 관한 기술이 본원에 제공된다.
목적한 생물학적 샘플은 이들 속에 매우 상이한 양의 DNA를 가질 수 있으며, 거대한 DNA 속에 농축된 경우에도, 매우 적은 양의 목적한 DNA, 예컨대, 정상 DNA의 배경내의 비-정상인 DNA, 또는 미생물 DNA의 배경의 사람 DNA(또는 이의 역)를 가질 수 있다. 저 농도의 표적 DNA 를 보충하기 위해, 큰 샘플을 때때로 가공하여 특수한 분석을 위해 충분한 DNA를 수집한다. 그러나, 저 농도의 표적 DNA를 지닌 샘플을 다수의 상이한 분석에 나란히 적용하는 것이 바람직한 경우, 필수적인 샘플 크기는 엄청나게 커질 수 있게 된다. 예를 들면, 대상체의 혈장 속의 순환하는 유리 DNA는, 이것이 혈류로부터, 주로 간에 의해 연속적으로 청소되므로, 전형적으로 매우 적으며, 반감기는 단지 10 내지 15분이다. 따라서, 순환하는 DNA의 대표적인 수준은 매우 적은데, 예컨대, 건강한 개인의 경우, 예컨대, 목적한 유전자로부터 DNA의 특수 분획은 약 1,500 내지 2000개 카피/mL로 존재할 수 있는 반면, 종양과 관련된 DNA의 분절은 말기 단계의 암을 지닌 대상체에서 약 5000개 카피/mL로 존재할 수 있다. 또한, 혈장 속의, 종양-기원한 cfDNA는 예컨대, 200개 이하의 염기 쌍의 단 쇄로 전형적으로 단편화된다(참고: 예컨대.,P.Jiang, 등, Proc.Natl Acad Sci.112(11):E1317-E1325 (2015), 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨). 이러한 작은 DNA는 대표적인 정제 단계, 예컨대, 침전 및/또는 DNA 결합 정제 단계에서의 비효율성을 통해 손실될 수 있기 때문에 정제하기가 특히 어렵다.
이러한 혈액 분획 샘플로부터의 DNA의 회수는 75%를 포획할 수 있지만, 흔히 훨씬 더 적게 회수된다. 따라서, 이들 표적을 위한 특수한 검정의 민감성에 따라서, 혈장으로부터의 다수의 DNA의 분석은 대상체로부터 다량의 혈장을 필요로 할 수 있다. 특이적인 표적 영역의 표적화된 예비-증폭에 의한 농축은 동일한 출발 물질을사용하여, 즉, 대상체로부터 상응하게 보다 큰 샘플(예컨대, 혈장 또는 혈액)을 수집할 필요없이 분석될 수 있는 마커의 수를 증가시킬 수 있다.
DNA, 예컨대, 세포-유리된 순환하는 DNA를 혈장 샘플로부터 추출하기 위한 기술의 구현예가 본원에 제공된다. 바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 유기 추출(예컨대, 페놀-클로로포름 추출), 알코올 침전, 또는 컬럼의 사용을 포함하지 않으므로, 당해 방법을 용이하게 확장할 수 있고 자동화할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 필수적으로 전체 분리 과정-혈장 샘플로부터 용출을 위해 준비된 비드-결합된 정제된 DNA까지-은 실온에서 수행된다.
양이 적고/적거나 이들이 발견되는 샘플 속에서 단편화되어 있고, 예컨대, 다음에 기술된 바와 같이, 바이설파이트 시약으로 처리된 표적 DNA의 분석에 특히 적합한 복합화된 예비-증폭을 위한 기술의 구현예가 본원에 제공된다. Leontiou, 등, PLoS ONE 10(8): e0135058. doi:10.1371/journal.pone.0135058 (2015). 특정의 바람직한 구현예에서, 바이설파이트 처리는 바람직하게는 다음에 기술된 바와 같이, 지지체-결합된 DNA에서 수행된 데설폰화와 함께, 아황산수소암모늄의 사용을 포함한다. 미국 특허제US 9,315,853호.
기술의 구현예:
1. 혈장으로부터 세포-유리된 DNA의 분리
샘플, 예컨대, 혈액 또는 혈장 샘플로부터 단편화된 DNA의 분리에 관한 기술이 본원에 제공된다. 특히, 혈장 샘플로부터 혼합가능한 입자, 예컨대, DNA에 결합하기 위한 실리카 입자를 사용한, 예컨대, 길이가 약 200개 미만의 염기쌍인, 저-카피의, 작은 DNA의 추출과 관련된 기술이 본원에 제공된다. 혈장 샘플의 분해 처리 동안에 상이한 횟수로 가해진, 2개의 상이한 분해 시약을사용하고, 입자에 결합된 DNA의 가공시 2개의 상이한 세척 완충액의 조합을 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 거대한 외인성 비-표적 DNA, 예컨대, 거대한 어류 DNA를 추가의 분석을 위해 분리될, 바람직하게는 제1의 입자-결합 단계 전에 또는 당해 단계에 혈장에 가해질 DNA에 첨가하는 것을 포함한다.
2. PCR-플랩 분석 검정을 위한 표적 영역의 예비-증폭
PCR-플랩 분석, 예컨대, 도 1에 묘사된 바와 같은 QuARTS분석에서 분석용 DNA의 증가된 양을 제공하는 것과 관련된 기술이 본원에 제공된다. 특히, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 구현예는 예컨대, 저-표적 샘플로부터, 복합화된 예비-증폭 단계를 사용함에 이어, 표적-특이적인 검출에 의해 목적한 DNA 표적의 양을 증가시켜 목적한 표적 유전자자리를 추가로 증폭시키고 검출하기 위해 제공한다.
표적화된 방식으로 이미 증폭된 DNA 분절의 재-증폭, 예컨대, 표적-특이적인 PCR의 앰플리콘 생성물의 희석 또는 분취량의 증폭은 바람직하지 않은 인공물, 예컨대, 바람직하지 않은 DNA 생성물의 고 배경이 되는 경향이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 특이적인 PCR의 순차적인 라운드를 사용한 표적 핵산의 분석은 특수한조건 하에서, 예컨대, 순차적인 반응에서 상이한 프라이머 쌍을 사용하여 전형적으로 수행된다. 예를 들면, “네스티드 PCR”에서, 증폭의 제1 라운드는 제1 앰플리콘을 생산하기 위해 수행되고, 증폭의 제2 라운드는 프라이머 쌍을 사용하여 수행되며, 여기서 초기 프라이머 쌍에 의해 정의된 영역내 부위에 어닐링하는 프라이머, 즉, 제2 프라이머 중 하나 또는 둘 다는 제1 프라이머 쌍내에서 “네스티드”되는 것으로 고려된다. 이러한 방식으로, 정확한 내부 서열을 함유하지 않는 제1 PCR로부터의 배경 증폭 생성물은 제2 반응에서 추가로 증폭되지 않는다. 바람직하지 않은 효과를 감소시키는 다른 전략은 제1 증폭에서 매우 낮은 농도의프라이머를 사용함을 포함한다.
다수의 상이한 특이적인 표적 서열의 복합 증폭은 전형적으로 비교적 표준 PCR 시약 혼합물, 예컨대, Amplitaq DNA 폴리머라제의 경우, 50 mM KCl, 1.5 내지 2.5 Mm의 MgCl2, 및 트리스-HCl 완충액(약 pH 8.5)를 포함하는 혼합물을 사용하여 수행한다. 상기 논의한 바와 같이, 제2 증폭이 수행되어야 하는 경우, 프라이머는 전형적으로 제한된 양으로 존재한다(Andersson, 상기 참고). 후속적인 분석을 위해, 증폭된 DNA는 희석되거나 정제되며, 이후에 소량의 분취량이 검출 분석, 예컨대, PCR-플랩 분석에 가해지며, 당해 분석은 낮은 일가 염 및 비교적 높은 농도의 Mg++로 인하여 PCR용으로 불량한 것으로 대표적으로 고려되는 조건인, 표준 PCR과는 상이한 완충액 및 염 조건(예컨대, MOPS, 트리스-HCl pH 8.0, 및 7.5 mM MgCl2, 및 거의 가해지지 않거나 전혀 가해지지 않은 KCl 또는 다른 일가 염)을 사용한다(참고: 예컨대, “Guidelines for PCR Optimization with Taq DNA Polymerase” https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with-taq-dna-polymerase, 이는 마그네슘 농도를 0.5 증분으로 4 mM까지 보충함으로써 수행될 최적화를 사용하여, Taq DNA 폴리머라제에 대한 최적의 Mg++ 범위로서 1.5 mM 내지 2.0 Mm를 개시한다). 또한 다음을 참고한다. “Multiplex PCR:Critical Parameters and Step-by-Step Protocol” O.Henegariu, 등, BioTechniques 23:504-511 (September 1997). 제1 증폭과 제2 증폭(또는 다른 결실 분석) 사이의 반응 조건에 있어서의 변화는제1 증폭 반응으로부터의 DNA를 정제하거나 후속적인 반응으로 수행된 반응 성분의 양이 무시할만하도록 하기에 충분한 희석을 사용함으로써 흔히 실시된다.
본 기술의 구현예는 바이설파이트 개질, 복합 PCR 증폭, 및 저-카피 수의 DNA의검출을 위한 PCR-플랩 분석 검출을 조합하는 것에 관한 것이다. 본원에 제공된 기술의 구현예의 개발 동안, 다음 사실이 발견되었다. PCR-플랩 분석 완충액(이는 매우 낮은 KCl을 지니고 다음을 포함한다. 상승된 Mg++ (예컨대, >6 mM, 바람직하게는 > 7mM, 보다 바람직하게는 7.5mM))이, 플랩 분석 시약의 부재(예컨대, 헤어핀 올리고뉴클레오타이드 및 FEN-1 엔도뉴클레아제의 부재) 하에서의 복합 예비-증폭 및 후속적인 PCR-플랩 분석 둘 다가 실질적으로 보다 우수한 시그날을 생산하였다. 또한, 예비-증폭 및 후속적인 PCR-플랩 분석 반응 둘 다에서 표적 영역을 증폭시키기 위한 동일한 프라이머 쌍의 사용이 프라이머의 네스티드 배열을 사용하는 것보다 더 우수한 결과를 생산하였음이 예상치않게도 측정되었다. 초기 증폭 및 PCR-플랩 분석에서 PCR-플랩 분석 프라이머 쌍의 사용은 먼 DNA 샘플에서 예상될 수 있는 것과 같은, 표적 DNA의 매우 작은 단편으로부터 시그날을 생산하는 장점을 갖는다. 예를 들면, 약 50 내지 85개 염기쌍의 앰플리콘이 생산되어 하기 실시예에서 검출된다).
일부 구현예에서, 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석 중 하나 또는 둘 다는 다음에 기술된 바와 같이, 반응 혼합물 속에 외인성의 비-표적 DNA를 포함한다. 예컨대, 미국 특허원일련번호제14/036,649호(2013년 9월 25일자로 출원됨, 이는 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다). 특정의 바람직한 구현예에서, 외인성의 비-표적 DNA는 어류 DNA를 포함한다. 어떠한 특수한 작용 메커니즘으로 본 발명을 제한하지 않지만, 헤어핀 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 침입성 절단 검출 분석의 일부 구현예에서 사용된 것으로서, 예컨대, 헤어핀 FRET 카세트)는 샘플 및 시그날 증폭에 의해 평가된 것으로서, 동일한 용기 속에 존재하는 DNA 폴리머라제에 있어서의 억제 효과를 가질 수 있다. 다음을 참고한다. 예컨대, 미국 특허 공보 제2006/0147955호(Allawi에게 허여됨, 이는 모든 목적을 위해 본원에참고로 포함된다). Allawi 등은 PCR 및 침입성 절단 분석 성분을 합하는 경우, 헤어핀 FRET 올리고뉴클레오타이드가 폴리머라제 성능에 영향을 미쳤으며 정제된 외인성 비-표적 DNA, 특히 게놈성 DNA의 사용이 이러한 분석에서 생산된 시그날의 일관성을 개선시킴을 발견하였다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 정제된 외인성 비-표적 DNA는 샘플이 폴리머라제와 같은 효소와 접촉하기 전 및/또는 접촉 동안에 샘플에 가해진다. 비-표적 DNA는 전형적으로 샘플 또는 반응 혼합물에, 예를 들면, 대략 2 내지 20 ng / μl의 반응 혼합물, 바람직하게는 대략 6 내지 대략 7 ng / μl의 반응 혼합물의 농도에서 가해지며, 이때 대략 0.01 내지 1.0 U/μL의 효소, 예컨대, 0.05 U/μL의 효소(예컨대, 다음과 같은 폴리머라제: 예컨대, Taq 폴리머라제)가 당해 분석에 사용된다.
본원에 개시된 것으로서 복합 예비-증폭의 구현예는 QuARTS 분석과 같은 PCR-플랩 분석을 사용하는 용도를 갖는다. 도 1에 묘사된 바와 같이, QuARTS기술은 폴리머라제-계 표적 DNA 증폭 공정과 침입성 절단-계 시그날 증폭 공정을 결합한다. QuARTS반응에 의해 생성된 형광성 시그날은 실시간 PCR과 유사한 방식으로 모니터링된다. 각각의 증폭 주기 동안에, 3개의 순차적인 화학 반응이 각각의 분석 웰(well) 속에서 일어나는데, 제1 및 제2 반응은 표적 DNA 주형에서 일어나고 제3 반응은 형광단 및 퀀처 염료로 표지된 합성 DNA 표적에서 일어나므로, 형광성 공명 에너지 전달(FRET) 공여체 및 수용체 쌍이 형성된다. 제1 반응은 폴리머라제 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머로 증폭된 표적을 생산하며, 제2 반응은 고도로 구조-특이적인 5′-플랩 엔도뉴클레아제-1(FEN-1) 효소 반응을 사용하여 폴리머라제 반응의 생성물에 결합하는 표적-특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브로부터 5’-플랩 서열을 방출하여, 오버랩 플랩 기질을 형성한다. 제3 반응에서, 절단된 플랩은 FRET 쌍 내에서 밀접하게 연결된 형광단 및 퀀처를 함유하는 구체적으로 설계된 올리고뉴클레오타이드에 어닐링됨으로써 형광성이 퀀치된다(FRET 카세트). 방출된 프로브 플랩은 FEN-1 효소가 형광단을 함유하는 5’-플랩을 절단하도록 하는 방식으로 하이브리드화함으로써, 이를 근접한 곳으로부터 퀀처 분자로 방출한다. 방출된 형광단은 검출될 형광성 시그날을 생성한다. 제2 및 제3 반응 동안에, FEN-1 엔도뉴클레아제는 표적당 다수의 프로브를 절단하여, 표적당 다수의 절단된 5′플랩을 생성하며, 각각의 절단된 5’ 플랩은 많은 FRET 카세트의 절단에 관여하여 전체 반응에서 추가의 형광성 시그날 증폭을 유발한다.
일부 구성에서, 각각의 분석은 예컨대, 다음의 다수의 유전자를 검출하도록 설계된다: 3개의 명백한 형광성 염료를 보고하는 3개 유전자. 다음을 참고한다. 예컨대, Zou, 등, (2012) “Quantificationof Methylated Markers with a Multiplex Methylation-Specific Technology”, Clinical Chemistry 58:2, 이는 모든 목적을 위해 참고로 본원에 포함된다.
이들 구현예는 하기 제공된 설명적 실시예에 의해 추가로 이해된다.
실험 실시예
실시예 1
세포 및 혈장으로부터 DNA 분리 및 바이설파이트 전환
DNA 분리
세포주에 대해, 게놈성 DNA를 다음을 사용하여 세포-조건화된 배지로부터 분리하였다. “Maxwell® RSC ccfDNA 혈장 키트(Promega Corp.,위스콘신주 매디슨 소재). 키트 프로토콜에 따라서, 1 mL의 세포-조건화된 배지(CCM)를 혈장 대신에 사용하고, 키트 과정에 따라 진행시킨다. 용출 용적은 100 μL이고, 이중 70 μL는 바이설파이트 전환에 사용한다.
● 4 mL의 혈장 샘플로부터 DNA를 분리하기 위한 예시적인 과정은 다음과 같이 수행할 수 있다:
● 4 mL의 혈장 샘플에, 300 μL의 프로테이나제 K(20mg/mL)를 가하고 혼합한다.
● 3 μL의 1 μg/μL의 어류 DNA를 혈장-프로테이나제 K 혼합물에 가한다.
● 2 mL의 혈장 분해 완충액을 혈장에 가한다.
혈장 분해 완충액은:
- 4.3M 구아니딘 티오시아네이트
- 10% IGEPAL CA-630(옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올, 측쇄됨)
(45 mL의 4.8 M 구아니딘 티오시아네이트와 결합된 IGEPAL CA-630 5.3g)
● 혼합물을 55 ℃에서 1시간 동안 500 rpm에서 교반하면서 항온처리한다.
● 3 mL의 혈장 분해 완충액을 가하고 혼합한다.
● 200 μL의 자기 실리카 결합 비드[16 μg의 비드/μL]를 가하고 다시 혼합한다.
● 2 mL의 100% 이소프로판올을 가하고 혼합한다.
● 30 ℃에서 30분 동안 500 rpm에서 교반하면서 항온처리한다.
● 튜브(들)를 자석 위에 두고 비드를 수집한다. 흡인시키고 상층액을 버린다.
● 750μL의 구아니딘 하이드로클로라이드-에틸 알코올(GuHCl-EtOH) 세척 용액을 결합 비드를 함유하는 용기에 가하고 혼합한다.
GuHCl-EtOH세척 용액은 다음과 같다;
- 3M GuHCl
- 57% EtOH.
● 400 rpm에서 1분 동안 진탕한다.
● 샘플을 깊은 웰 플레이트 또는 2 mL의 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)로 이전한다.
● 튜브를 자석 위에 두고 비드를 10분 동안 수집한다. 흡인시키고 상층액을 버린다.
● 1000 μL의 세척 완충액(10 mM의 트리스 HCl, 80% EtOH)을 비드에 가하고, 30 ℃에서 3분 동안 진탕하면서 항온처리한다.
● 튜브를 자석 위에 두고 비드를 수집한다. 흡인시키고 상층액을 버린다.
● 500 μL의 세척 완충액을 비드에 가하고 30 ℃에서 3분 동안 진탕하면서 항온처리한다.
● 튜브를 자석 위에 두고 비드를 수집한다. 흡인시키고 상층액을 버린다.
● 250 μL의 세척 완충액을 가하고 30 ℃에서 3분 동안 진탕하면서 항온처리한다.
● 튜브를 자석 위에 두고 비드를 수집한다. 흡인시키고 나머지 완충액을 버린다.
● 250 μL의 세척 완충액을 가하고 30 ℃에서 3분 동안 진탕하면서 항온처리한다.
● 튜브를 자석 위에 두고 비드를 수집한다. 흡인시키고 나머지 완충액을 버린다.
● 비드를 70 ℃에서 15분 동안 진탕하면서 항온처리한다.
● 125 μL의 용출 완충액(10 mM 트리스 HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)을 비드에 가하고 65 ℃에서 25분 동안 진탕하면서 항온처리한다.
● 튜브를 자석 위에 두고 비드를 10분 동안 수집한다.
● 흡인하고 DNA를 함유하는 상층액을 새로운 용기 또는 튜브로 이전한다.
바이설파이트 전환
I. 아황산수소암모늄을 사용한 DNA의 설폰화
1. 각각의 튜브 속에서, 64 μL의 DNA, 7 μL의 1N NaOH, 및 0.2 mg/mL BSA 및 0.25 mg/mL의 어류 DNA를 함유하는 9 μL의 담체 용액을 합한다.
2. 42 ℃에서 20분 동안 항온처리한다.
3. 120 μL의 45% 아황산수소암모늄을 가하고 66°에서 75분 동안 항온처리한다.
4. 4 ℃에서 10분 동안 항온처리한다.
II. 자기 비드를 사용한 탈설폰화
물질
자기 비드(Promega MagneSil Paramagnetic Particles, Promega 제품 번호 AS1050, 16 μg/μL).
결합 완충액6.5-7 M 구아니딘 하이드로클로라이드.
전환 후 세척 완충액:10 mM 트리스 HCl (pH 8.0)이 들어있는 80% 에탄올.
탈설폰화 완충액:70% 이소프로필 알코올, 0.1 N NaOH를 탈설폰화 완충액을 위해 선택하였다.
샘플을 어떠한 적절한 장치 또는 기술을 사용하여 혼합함으로써 샘플을 필수적으로 하기 기술한 바와 같은 온도 및 혼합 속도에서 혼합하거나 항온처리한다. 예를 들면, 써모믹서(Thermomixer)(Eppendorf)를 샘플의 혼합 또는 항온처리에 사용할 수 있다. 예시적인 탈설폰화는 다음과 같다:
1. 비드 스톡을 용기를 1분 동안 와동시켜 완전히 혼합한다.
2. 50 μL의 비드를 2.0 mL의 튜브(예컨대, USA Scientific으로 부터)에 분취한다.
3. 750 μL의 결합 완충액을 비드에 가한다.
4. 단계 I로부터의 150 μL의 설폰화된 DNA를 가한다.
5. 혼합한다(예컨대, 30 ℃에서 30분 동안 1000 RPM으로).
6. 튜브를 자석 스탠드에 두고 5분 동안 둔다. 튜브를 스탠드에 둔 상태에서, 상층액을 제거하고 경사분리한다.
7. 1,000 μL의 세척 완충액을 가한다. 혼합한다(예컨대, 30 ℃에서 3분 동안 1000 RPM으로).
8. 튜브를 자석 스탠드에 두고 5분 동안 둔다. 튜브를 스탠드에 둔 상태에서, 상층액을 제거하고 경사분리한다.
9. 250 μL의 세척 완충액을 가한다. 혼합한다(예컨대, 30 ℃에서 3분 동안 1000 RPM으로).
10. 튜브를 자기 랙에 두고; 1분 후 상층액을 제거하고 경사분리한다.
11. 200 μL의 탈설폰화 완충액을 가한다. 혼합한다(예컨대, 30 ℃에서 5분 동안 1000 RPM으로).
12. 튜브를 자기 랙에 두고; 1분 후 상층액을 제거하고 경사분리한다.
13. 250 μL의 세척 완충액을 가한다. 혼합한다(예컨대, 30 ℃에서 3분 동안 1000 RPM으로).
14. 튜브를 자기 랙에 두고; 1분 후 상층액을 제거하고 경사분리한다.
15. 250 μL의 세척 완충액을 튜브에 가한다. 혼합한다(예컨대, 30 ℃에서 3분 동안 1000 RPM으로).
16. 튜브를 자기 랙에 두고; 1분 후 상층액을 제거하고 경사분리한다.
17. 모든 튜브를 30 ℃에서 15분 동안 뚜껑을 개방한 상태에서 항온처리한다.
18. 튜브를 자기 랙으로부터 제거하고 70 μL의 용출 완충액을 비드에 직접 가한다.
19. 비드를 용출 완충액과 함께 항온처리한다(예컨대, 40 ℃에서 45분 동안 1000 RPM으로).
20. 튜브를 자기 랙 위에 약 1분 동안 두고; 상층액을 제거하여 저장한다.
이후에 전환된 DNA를 하기 기술한 바와 같은 예비-증폭 및/또는 플랩 엔도뉴클레아제 분석에 사용한다.
실시예 2
복합 예비-증폭 - 예비-증폭의 주기
네스티드 시도를 사용하여, PCR 주기의 수의 효과를 각각의 표적 샘플에 대해 외부 프라이머 쌍을 사용하여 5, 7 또는 10회 주기를 수행함으로서 시험하였다. 내부 프라이머를 사용한 PCR-플랩 분석을 사용하여 예비-증폭된 생성물을 추가로 증폭시키고 분석하였다.
● 실험 조건:
1. 샘플 공급원: DNA를 HCT116 세포주로부터 추출하고 하기 기술한 바와 같이 바이설파이트 처리하였다;
2. 50 μL의 예비-증폭 PCR 반응.
3. 시험한 표적 영역: NDRG4, BMP3, SFMBT2, VAV3, ZDHHC1, 및 β-액틴(도 5 참고)
4. 예비-증폭 PCR 및 PCR-플랩 분석 둘 다에 사용된 반응 조건:
7.5 mM MgCl2,
10 mM MOPS,
0.3 mM 트리스-HCl, pH 8.0,
0.8 mM KCl,
0.1 μg/μl BSA,
0.0001% 트윈-20,
0.0001% IGEPAL CA-630,
250 μM dNTP)
0.025 U/μl에서 GoTaq 폴리머라제 (Promega Corp.,위스콘신주 매디슨 소재)
도 5a 내지 도 5f에 나타낸 바와 같이, 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석 둘 다에서 500nM 각각의 프라이머에서 바이설파이트-전환된 NDRG4, BMP3, SFMBT2, VAV3, ZDHHC1, 및 β-액틴에 대한 프라이머 쌍.
10 μL의 제조된 바이설파이트-처리된 표적 DNA를 각각의 50 μL의 PCR 반응에 사용한다. 예비-증폭 사이클링은 하기 나타낸 바와 같았다:
Figure pct00001
PCR 후, 10 μL의 증폭 반응물을 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA 속에서 100 μL로 희석하고, 10 μL의 희석된 증폭 생성물을 하기 나타낸 바와 같이, 표준 PCR-플랩 분석에 사용하였다. 비교 검정을 예비-증폭없이, 바이설파이트-처리된 DNA에서 직접 QuARTS PCR-플랩 분석을 사용하였다.
예시적인 QuARTS 반응물은 전형적으로 다음을 포함한다. 대략 400 내지 600 nM(예컨대, 500 nM)의 각각의 프라이머 및 검출 프로브, 대략 100 nM의 침입성 올리고뉴클레오타이드, 대략 600 내지 700 nM의 각각의 FAM (예컨대, Hologic에 의해 상업적으로 공급됨), HEX(예컨대, BioSearch Technologies, IDT에 의해 상업적으로 공급됨), 및 Quasar 670(예컨대, BioSearch Technologies에 의해 상업적으로 공급됨) FRET 카세트, 6.675 ng/μL의 FEN-1 엔도뉴클레아제(예컨대, Cleavase® 2.0, Hologic, Inc.), 30 μl의 반응 용적 중 1 단위의 Taq DNA 폴리머라제(예컨대, GoTaq® DNA 폴리머라제, Promega Corp., 위스콘신주 매디슨 소재), 10 mM의 3-(n-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS), 7.5 mM MgCl2, 및 250 μM의 각각의 dNTP.
예시적인 QuARTS 사이클링 조건은 하기 나타낸 바와 같다:
Figure pct00002
데이터를 도 6에 나타내며, 예비-증폭의 10회 주기는 예비-증폭이 없는 PCR-플랩분석과 비교한 것으로서, 메틸화 퍼센트의 가장 일관적인 측정을 제공하였다.
실시예 3
네스티드 프라이머 대 비-네스티드 프라이머; PCR 완충액 대PCR-플랩 분석 완충액
분석을 수행하여 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석 단계 둘 다에서 네스티드 프라이머 정렬을 사용하여 동일한 PCR 플랩 분석 프라이머의 사용에 대해 비교하고, 예비-증폭 단계 동안 대표적인 PCR 완충액 대 PCR-플랩 분석 완충액의 사용을 비교하였다. PCR-플랩 분석 완충액을 사용하였다. 대표적인 PCR 완충액은 1.5 mM MgCl2, 20 mM 트리스-HCl, pH 8, 50 mM KCl, 250 μM의 각각의 dNTP이었고; PCR-플랩 분석 완충액은 7.5 mM MgCl2, 10 mM MOPS, 0.3 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.8 mM KCl, 0.1 μg/μL BSA, 0.0001% 트윈 -20, 0.0001% IGEPAL CA-630, 250 μM의 각각의 dNTP이었다. 20 nM, 100 nM 및 500 nM의 각각의 프라이머의 프라이머 농도를 또한 비교하였다.
● 실험 조건:
1. 샘플 공급원: DNA를 HCT116 세포주로부터 추출하고 바이설파이트 처리하였다;
2. 50 μL PCR 반응.
3. 시험한 표적 영역: NDRG4, BMP3, SFMBT2, VAV3, ZDHHC1, 및 β-액틴
4. 0.025 U/μL에서 GoTaq 폴리머라제.
5. 상기 기술한 바와 같은, PCR 또는 PCR-플랩 분석 완충액.
6. 도 5a 내지 5f에 나타낸 바와 같이, 20 nM, 100 nM 및 500 nM의 각각의 프라이머에서 바이설파이트-전환된 NDRG4, BMP3, SFMBT2, VAV3, ZDHHC1, 및 β-액틴에 대한 프라이머 쌍.
예비-증폭 사이클링은 하기 나타낸 바와 같았다:
Figure pct00003
10 μL의 제조된 바이설파이트-처리된 표적 DNA를 각각의 50 μL의 PCR 반응에 사용하였다. PCR 후, 10 μL의 예비-증폭 반응물을 10 mM 트리스 속에서 100 μL로 희석시키고, 0.1 mM EDTA, 및 10 μL의 희석된 증폭 생성물을 실시예 2에 기술한 바와 같이, 표준 PCR-플랩 분석에서 사용하였다.
데이터는 도 7에 나타낸다. 상부 패널은 출발하는 DNA 양으로부터 계산된 예측된 수율을 나타내고 제2 패널은 프라이머 및 나타낸 완충액 조건을 사용하여 검출된 양을 나타낸다. 이들 데이터는 프라이머의 최대 nM 농도가 최대 증폭 효율을 제공하였음을 나타낸다. 놀랍게도, 비교적 높은 Mg++ 및 낮은 KCl(각각 7.5 mM 0.8 mM)을 갖는 PCR-플랩 분석 완충액이, PCR 예비-증폭에 사용되는 경우, 보다 낮은 Mg++ 및 훨씬 더 높은 KCl 농도(각각 1.5mM 및 50 Mm)를 갖는 전통적인 PCR 완충액의 사용시보다 더 우수한 결과를 제공하였다. 또한, 예비-증폭 PCR에서 PCR-플랩 분석 프라이머(“내부” 프라이머 및 도 5a 내지 5f에 나타냄)는 네스티드 PCR 정렬에서 외부 및 내부 프라이머 쌍을 사용하는 것보다 양호하게 또는 보다 더 양호하게 작용하였다.
실시예 4
플랩 분석 완충액 속에서 예비-증폭의 사이클 시험
분석을 수행하여 표적이 없는 대조군 샘플 및 표적 DNA를 함유하는 샘플 둘 다에서의 배경에 있어서 예비-증폭 PCR 사이클의 수를 증가시키는 효과를 측정하였다.
실험 조건:
1. 샘플 공급원:
i) 표적이 없는 대조군 = 20 ng/μL의 어류 DNA 및/또는 10 mM 트리스, 0.1 mM EDTA;
ii) 정상 환자로부터의 혈장으로부터 분리된 바이설파이트-전환된 DNA
iii) HCT116 세포주로부터 추출되고 바이설파이드 처리된 DNA와 조합된 정상 환자로부터의 혈장으로부터 분리된 바이설파이트-전환된 DNA
2. 50 μL의 PCR 반응물,
3. 시험한 표적 영역: NDRG4, BMP3, SFMBT2, VAV3, ZDHHC1, 및 β-액틴,
4. 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석 둘 다에 사용된 반응 조건:
7.5 mM MgCl2,
10 mM MOPS,
0.3 mM 트리스-HCl, pH 8.0,
0.8 mM KCl,
0.1 μg/μL BSA,
0.0001% 트윈-20,
0.0001% IGEPAL CA-630,
250 μM dNTP)
0.025 U/μl에서 GoTaq 폴리머라제,
500nM 각각의 프라이머에서, 도 5a 내지 5f에 나타낸 바와 같이, 바이설파이트-전환된 NDRG4, BMP3, SFMBT2, VAV3, ZDHHC1, 및 β-액틴에 대한 프라이머 쌍.
예비-증폭 사이클링은 하기 나타낸 바와 같았다:
Figure pct00004
PCR 후, 10 μL의 증폭 반응물을 10 mM 트리스 속에 100 μL로 희석하고, 0.1 mM EDTA, 및 10 μL의 희석된 증폭 생성물을 실시예 1에 기술된 바와 같이, 표준 PCR-플랩 분석에서 사용하였다.
데이터는 도 8a 내지 8c에 나타내며, 최대 사이클 수에서조차, 표적이 없는 대조군 반응물 속에서 배경이 생산되지 않았음을 나타낸다. 그러나, 20 또는 25회 주기 동안 예비-증폭된 샘플은 PCR-플랩 분석에 있어서의 시그날에서 인식할만한 감소를 나타내었다.
실시예 5
거대-용적 바이설파이트-전환된 DNA의 복합 표적화된 예비-증폭
투입된 샘플로부터 바이설파이트 처리된 DNA 중 대부분 또는 모두를 예비-증폭시키기 위하여, 거대 용적의 처리된 DNA를 단일의, 거대 용적의 복합 증폭 반응에서 사용할 수 있다. 예를 들면, DNA는 다음으로부터 추출된다. 세포주(예컨대, DFCI032 세포주(선암종); H1755 세포주(신경내분비), 상술한 바와 같이, 예를 들면, Maxwell Promega blood kit # AS1400를 사용함. DNA는 예컨대, 실시에 1에 기술된 바와 같이, 바이설파이트 전환된다.
예비-증폭은 다음을 함유하는 반응 혼합물 속에서 수행된다. 7.5 mM MgCl2, 10 mM MOPS, 0.3 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.8 mM KCl, 0.1 μg/μL BSA, 0.0001% 트윈-20, 0.0001% IGEPAL CA-630, 250 μM dNTP, (예컨대, 12개 프라이머 쌍/24개 프라이머, 등몰량으로, 또는 상이한 표적 영역의 증폭 효율을 균형맞추도록 조절된 개개 프라이머 농도를 사용함), 0.025 단위 /μL HotStart GoTaq 농도, 및 20 내지 50용적%의 바이설파이트-처리된 표적 DNA (예컨대, 50 μL의 반응 혼합물 내로 10 μL의 표적 DNA, 또는 125 μL의 반응 혼합물 내로 50 μL의 표적 DNA). 열 사이클링 횟수 및 온도를 반응 및 증폭 용기의 용적에 적절하도록 선택한다. 예를 들면, 반응은 다음과 같이 사이클링될 수 있다.
Figure pct00005
열 사이클링 후, 다음의 분취량: 예비-증폭 반응물(예컨대, 10 μL)을 10 mM 트리스, 0.1 mM EDTA 속에서 500 μL로 희석한다. 희석된 예비-증폭된 DNA의 분취량 (예컨대, 10 μL)을 예컨대, 실시예 2에 기술된 바와 같이 QuARTS PCR-플랩 분석에서 사용한다.
실시예 6
대변 샘플로부터 바이설파이트-전환된 DNA의 복합 표적화된 예비-증폭
상기 기술된 복합 예비-증폭 방법을 사람 대변 샘플로부터 분리된 DNA에서 시험하였다.
샘플 공급원:
i) 4개의 DNA 샘플을 다음으로부터 포획하고: 대변 샘플(참고: 예컨대, 미국 특허 제9,000,146호) 및 상기 실시예 1에 따라 바이설파이트-처리하였으며, 샘플은 다음 병리학을 갖는다:
500237 선종(AA)
500621 선암종(ACA)
780116 정상
780687 정상
ii) 표적이 없는 대조군 = 20 ng/μL의 거대한 어류 DNA 및/또는 10 mM 트리스, 0.1 mM EDTA;
2. 50 μL의 PCR 반응물,
3. 시험한 표적 영역: NDRG4, BMP3, SFMBT2, VAV3, ZDHHC1, 및 β-액틴,
4. 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석 둘 다에 사용된 반응 조건:
7.5 mM MgCl2,
10 mM MOPS,
0.3 mM 트리스-HCl, pH 8.0,
0.8 mM KCl,
0.1 μg/μL BSA,
0.0001% 트윈-20,
0.0001% IGEPAL CA-630,
250 μM dNTP)
0.025 U/μl에서 GoTaq 폴리머라제,
500nM 각각의 프라이머에서, 도 5a 내지 5f에 나타낸 바와 같이, 바이설파이트-전환된 NDRG4, BMP3, SFMBT2, VAV3, ZDHHC1, 및 β-액틴에 대한 프라이머 쌍.
예비-증폭 사이클링은 하기 나타낸 바와 같았다:
Figure pct00006
PCR 후에, 10 μL의 증폭 반응물을 10 mM 트리스 속에서 100 μL로 희석시키고, 0.1 mM EDTA, 및 10 μL의 희석된 증폭 생성물을 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표준 PCR-플랩 분석에서 사용한다.
데이터는 도 9에 나타내며, 표적이 없는 대조군 반응에서는 배경이 생산되지 않았음을 나타낸다. 예를 들면, 표적 마커가 메틸화되지 않은 것으로 예측된 샘플(정상 샘플)의 경우, 메틸화된 마커에 대한 시그날이 검출되지 않았으나, 선종 또는 선암종을 가진 대상체로부터의 샘플에서 검출된 메틸화 퍼센트는 표준 비-복합된 QuARTS PCR-플랩 분석을 사용하여, 즉, 별도의 예비-증폭 단계없이 수득된 결과와 일치하였다.
실시예 6
혈장 샘플로부터 바이설파이트-전환된 DNA의 복합 표적화된 예비-증폭
상기 기술된 복합 예비-증폭 방법을 사람 혈장 샘플로부터 분리하고 실시예1에 기술된 바와 같이 바이설파이트로 처리한 DNA에서 시험하였다.
실험 조건:
1. 샘플 공급원:
■ 결장직장 암 또는 위 암을 지닌 환자, 또는 정상 환자로부터 각각 2mL의 75개의 혈장 샘플을 추출하고 바이설파이트-처리하였다.
2. 50 μL의 PCR 반응물,
3. 시험한 표적 영역: NDRG4, BMP3, SFMBT2, VAV3, ZDHHC1, 및 β-액틴,
4. 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석 둘 다에 사용된 반응 조건:
7.5 mM MgCl2,
10 mM MOPS,
0.3 mM 트리스-HCl, pH 8.0,
0.8 mM KCl,
0.1 μg/μL BSA,
0.0001% 트윈-20,
0.0001% IGEPAL CA-630,
250 μM dNTP)
0.025 U/μl에서 GoTaq 폴리머라제,
500nM 각각의 프라이머에서, 도 5a 내지 5f에 나타낸 바와 같이, 바이설파이트-전환된 NDRG4, BMP3, SFMBT2, VAV3, ZDHHC1, 및 β-액틴에 대한 프라이머 쌍.
예비-증폭 사이클링은 하기 나타낸 바와 같았다:
Figure pct00007
PCR 후에, 10 μL의 증폭 반응물을 10 mM 트리스 속에서 100 μL로 희석시키고, 0.1 mM EDTA, 및 10 μL의 희석된 증폭 생성물을 실시예 2에 기술된 바와 같이, 표준 PCR-플랩 분석에서 사용한다.
데이터는 도 10a 내지 10i에 나타낸다. 도 10a 내지 10c는 복합 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석을 사용한 결과를 예비-증폭이 수행되지 않은 동일한 샘플로부터의 결과와 비교한다. 도 10d 내지 10f는 복합 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석을 사용한 각각의 샘플에 대해 계산된 메틸화 퍼센트를 나타내고, 도 10g 내지 10i는 예비-증폭 단계가 없는 PCR-플랩 분석을 사용하여 동일한 샘플로부터의 결과에 대해 비교한 것으로서, 복합 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석에서 투입 쇄의 회수 퍼센트를 나타낸다. 결장직장암에 대한 3개의 마커(VAV3, SFMBT2, ZDHHC1)를 사용하여, 이들 데이타는 100% 특이성에서, 92% 민감성(23/25)을 나타내었다. 본원에 개시된 기술의 구현예는 다음을 제공한다. 혈액으로부터 DNA를 검출하기 위한 적어도 100배 이상의 민감성, 예컨대, 예비-증폭이 없는 QuARTS PCR 플랩 분석을 사용한 250개 카피와 비교하여, 4 mL의 혈장으로부터의 2.5개의 카피.
실시예 7
혈장 DNA의 완전한 혈액-대-결과에 대한 예시적인 프로토콜
예컨대, 검출 분석에서 사용하기 위한 혈액 샘플로부터 DNA를 분리하기 위한 완전한 공정의 예가 당해 실시예에 제공된다. 임의의 바이설파이트 전환 및 검출 방법이 또한 기술되어 있다.
I. 혈액 가공
전혈을 항응고제 EDTA 또는 Streck 세포-유리된(Cell-Free) DNA BCT 튜브 속에 수집한다. 예시적인 과정은 다음과 같다:
1. 10mL의 전혈을 진공 채혈기 튜브(항응고제 EDTA 또는 Streck BCT)내로 채혈하고, 완전한 용적을 수집하여 정확한 혈액 대 항응고제 비가 되도록 한다.
2. 수집 후, 튜브를 8 내지 10회 역전시킴으로써 혈액을 온화하게 혼합하여 혈액과항응고제를 혼합하고 실온에서 원심분리때까지 유지시키며, 이는 혈책 수집 시간의 4시간 내에 일어나야 한다.
3. 혈액 샘플을 수평 회전자(스윙-아웃 헤드(swing-out head) 속에서 10분 동안 1500 g (±100 g)에서 실온으로 원심분리한다. 원심분리를 중지하기 위한 브레이크는 사용하지 않는다.
4. 상층액(혈장)을 실온에서 조심스럽게 흡인시키고 원심분리 튜브 속에서 혼주(pooling)한다. 세포 층이 파괴되지 않도록 하거나 어떠한 세포도 이전되지 않도록 한다.
5. 상층액의 4mL의 분취량을 저온유리병 튜브내로 조심스럽게 이전한다.
6. 뚜껑을 단단히 밀봉하고 각각의 분취량이 제조되자 마자 빙상에 둔다. 당해 공정은 1시간의 원심분리 내에 완료되어야 한다.
7. 저온 유리병이 혈액 속에 존재하는 첨가제의 세부사항을 포함하는, 관련 정보로적절히 표지되도록 보장한다.
8. 표본을 -80 ℃ 동결기로 이전시키기 전에, -20 ℃에서 최대 48시간 동안 동결하여 유지시킬 수 있다.
II. 합성 공정 대조군 DNA의 제조
메틸화된 제브라피쉬 DNA의 상보성 쇄를 나타낸 위치에서 포스포르아미디트 첨가, 5-메틸 C 염기 혼입과 같은 표준 DNA 합성 방법을 사용하여 하기 나타낸 바와 같은 서열을 가지도록 합성한다. 합성 쇄를 어닐링하여 공정 대조군으로서 사용하기 위한 이본쇄 DNA 단편을 창조한다.
A. 농축된 제브라피쉬 (ZF-RASS F1 180mer) 합성 공정 대조군의 어닐링및 제조
Figure pct00008
1. 동결건조된, 일본쇄 올리고뉴클레오타이드를 10 mM 트리스, pH 8.0, 0.1 mM EDTA 속에, 1μM의 농도에서 재구성시킨다.
2. 500mM NaCl, 200mM 트리스-HCl pH 8.0, 및 20mM MgCl2의 10X의 어닐링 완충액을 제조한다.
3. 합성 쇄를 어닐링한다.
총 100 μL의 용적으로, 등몰량의 각각의 일본쇄 올리고뉴클레오타이드를 예컨대, 하기 표에 나타낸 바와 같이, 1X 어닐링 완충액 속에서 결합시킨다:
Figure pct00009
4. 어닐링 혼합물을 98°C로 11 내지 15분 동안 가열한다.
5. 반응 튜브를 열로부터 제거하고 약간 약하게 회전시켜 튜브의 바닥에 농축물을수집한다.
6. 반응 튜브를 실온에서 10 내지 25분 동안 항온처리한다.
7. 0.9mL의 어류 DNA 희석물(Te (10 mM 트리스-HCl pH8.0, 0.1 mM EDTA 중 20ng/mL 거대 어류 DNA))을 가하여 제브라피쉬 RASSF1 DNA 단편의 농도 내지 1.0x 1010 카피/μl의 어닐링된, 이본쇄 합성 제브라피쉬 RASSF1 DNA로 게놈성 어류 DNA의 담체 속에서 조절한다.
8. 공정 대조군을 예컨대, 하기 표에 기술한 바와 같이, 10 mM 트리스, pH 8.0, 0.1 mM EDTA를 사용하여 목적하는 농도로 희석시키고, -20˚C 또는 -80˚C에서 저장한다.
Figure pct00010
B. 100x 스톡 공정 대조군(12,000개의 카피/200 ng/μL의 거대 어류 DNA중 μL의 제브라 피쉬 RASSF1 DNA)의 제조
1. 시약을 해동한다
2. 해동된 시약을 와동시키고 회전시킨다
3. 다음의 시약을 50mL의 원뿔형 튜브에 가한다
Figure pct00011
4. 표지된 0.5 mL의 튜브로 분취하고 @ -20 ℃에서 저장한다
C. 공정 대조군의 1x 스톡(120개 카피/ 2 ng/μL의 어류 DNA 중 μL의 제브라 피쉬 RASSF1 DNA)의 제조
1. 시약을 해동한다
2. 해동된 시약을 와동시키고 회전시킨다
3. 다음의 시약을 50 mL의 원뿔형 튜브에 가한다:
Figure pct00012
4. 0.3 mL를 표지된 0.5 mL 튜브내로 분취하고 @ -20 ℃에서 저장한다
III. 혈장으로부터 DNA 추출
1. 혈장을 해동하고, 시약을 제조하고, 튜브를 표지하며, 추출을 위해 생물 안전성 캐비넷을 세정하고 설정한다
2. 300 μL의 프로테이나제 K(20 mg/mL)을 각각의 샘플에 대해 하나의 50 mL 원뿔형 튜브에 가한다.
3. 2 내지 4 mL의 혈장 샘플을 각각 50 mL의 원뿔형 튜브에 가한다(와동시키지 않음).
4. 혼합물에 소용돌이시키거나 피펫팅하고 실온에서 5분 동안 둔다.
5. 4 내지 6 mL의 분해 완충액 1(LB1) 용액을 가하여 용적이 대략 8 mL가 되도록 한다.
LB1 제형:
■ 위에서 기술한 바와 같은, 0.1 mL의 120개 카피/μL의 제브라피쉬 RASSF1 DNA 공정 대조군;
■ 0.9 내지 2.9 mL의 10 mM 트리스, pH 8.0, 0.1 mM EDTA (예컨대, 2 mL의 혈장 샘플에 대해 2.9 mL를 사용함)
■ 10% IGEPAL(45 mL의 4.8 M 구아니딘 티오시아네이트와 합해진 5.3g의 IGEPAL CA-630의 스톡으로부터)가 들어있는 3 mL의 4.3 M 구아니딘 티오시아네이트
6. 튜브를 3회 역전시킨다.
7. 튜브를 벤치 탑 진탕기(bench top shaker)(실온) 위에 500 rpm에서 30분 동안 실온으로 둔다.
8. 200 μL의 실리카 결합 비드[16 μg의 입자/μL]를 가하고 소용돌이쳐서 혼합한다.
9. 7 mL의 분해 완충액 2 (LB2) 용액을 가하고 소용돌이쳐서 혼합한다.
LB2 제형:
■ 다음과 혼합된 4 mL의 4.3 M 구아니딘 티오시아네이트: 10% IGEPAL
■ 3 mL 100% 이소프로판올
(분해 완충액 2는 실리카 결합 비드 전, 후, 또는 동시에 가할 수 있다)
10. 튜브를 3회 역전시킨다.
11. 튜브를 벤치 탑 진탕기 위에 500 rpm에서 30분 동안 실온에서 둔다.
12. 튜브를 포획 흡인기 위에 두고 10분 동안 비드의 자기 수집을 사용한 프로그램을 수행한 후, 흡인한다. 이는 10분 동안 비드를 수집할 것이며 이후 모든 액체를 튜브로부터 제거할 것이다.
13. 0.9 mL의 세척 용액 1(3 M 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트, 56.8% EtOH)를 가하여 결합 비드를 재현탁시키고 소용돌이에 의해 혼합한다.
14. 튜브를 벤치 탑 진탕기 위에 400 rpm에서 2분 동안 실온으로 둔다.
(모든 후속적인 단계는 STARlet 자동화 플랫폼에서 수행할 수 있다. )
15. 반복된 피펫팅으로 혼합한 후 비드를 함유하는 96 깊은 웰 플레이트로 이전한다.
16. 플레이트를 자기 랙 위에 10분 동안 둔다.
17. 상층액을 흡인하여 폐기한다.
18. 1 mL의 세척 용액 2 (80% 에탄올, 10 mM 트리스 pH 8.0)를 가한다.
19. 3분 동안 혼합한다.
20. 튜브를 자기 랙 위에 10분 동안 둔다.
21. 상층액을 흡인하여 폐기한다.
22. 0.5 mL의 세척 용액 2를 가한다.
23. 3분 동안 혼합한다.
24. 튜브를 자기 랙 위에 5분 동안 둔다.
25. 상층액을 흡인하여 폐기한다.
26. 0.25 mL의 세척 용액 2를 가한다.
27. 3분 동안 혼합한다.
28. 튜브를 자기 랙 위에 5분 동안 둔다.
29. 상층액을 흡인하여 폐기한다.
30. 0.25 mL의 세척 용액 2를 가한다.
31. 3분 동안 혼합한다.
32. 튜브를 자기 랙 위에 5분 동안 둔다.
33. 상층액을 흡인하여 폐기한다.
34. 플레이트를 가열 블록에 70 ℃에서, 15분 동안, 진탕시키면서 둔다.
35. 125 μL의 용출 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)을 가한다.
36. 65 ℃에서 25분 동안 진탕하면서 항온처리한다.
37. 플레이트를 자석 위에 두고 비드를 수집하여 8분 동안 냉각시킨다.
38. 용출액을 96-웰 플레이트로 이전시키고 -80 ℃에서 저장한다. 회수가능한/이전가능한 용적은 약 100 μL이다.
IV. 예비-바이설파이트 DNA 정량화
샘플 속에서 DNA를 ACTB 유전자를 사용하여 측정하고 제브라피쉬 공정 대조군회수를 평가하기 위하여, DNA를 추가의 처리 전에 측정할 수 있다. QuARTS PCR-플랩 분석을 10 μL의 추출된 DNA를 사용하여 다음의 프로토콜을사용하여 설정한다:
1. 2 μM에서 각각 전방 및 역방 프라이머, 5μM에서 프로브 및 FRET 카세트 및 250μM에서 dNTP를 각각 함유하는 10X 올리고 혼합물를 제조한다. (프라이머, 프로브 및 FRET 서열에 대해서는 하기를 참고한다)
Figure pct00013
2. 마스터 혼합물을 다음과 같이 제조한다:
Figure pct00014
3. 10 μL의 각각의 샘플을 96 웰 플레이트의 웰내로 피펫팅한다.
4. 20 μL의 마스터 혼합물을 플레이트의 각각의 웰에 가한다.
5. 플레이트를 밀봉하고 3000 rpm에서 1분 동안 원심분리한다.
6. 플레이트를 다음 반응 조건을 사용하여 ABI7500 또는 광 사이클러 480 실시간 열사이클러를 사용하여 작동시킨다
Figure pct00015
V. DNA의 바이설파이트 전환 및 정제
1. 혈장 단계로부터의 DNA 추출로부터 모든 추출된 DNA 샘플을 해동하고 DNA를 회전시킨다.
2. 시약 제조:
Figure pct00016
3. 5 μL의 100 ng/μL BSA DNA 담체 용액을 깊은 웰 플레이트(DWP) 중 각각의 웰에 가한다.
4. 80 μL의 각각의 샘플을 DWP내로 가한다.
5. 5 μL의 새로이 제조된 1.6N NaOH를 DWP(들)중 각각의 웰에 가한다.
6. 30 내지 40 μL로 설정된 피펫으로 피펫팅하여 조심스럽게 혼합함으로써 거품을 피한다.
7. 42 ℃에서 20분 동안 항온처리한다.
8. 120 μL의 BIS SLN을 각각의 웰에 가한다.
9. 처음 3분 동안 혼합하면서 66 ℃에서 75분 동안 항온처리한다.
10. 750 μL의 BND SLN을 가한다.
11. 실리카 비드(BND BDS)를 예비 혼합하고 50 μL의 실리카 비드(BND BDS)를 DWP의 웰에 가한다.
12. 30 ℃에서 가열기 진탕기 위에서 1,200 rpm에서 30분 동안 혼합한다.
13. 비드를 플레이트 자석 위에서 5분 동안 수집한 후 용액을 흡인하여 폐기한다.
14. 1 mL의 세척 완충액(CNV WSH)을 가한 후 플레이트를 가열기 진탕기로 이동시키고 1,200 rpm에서 3분 동안 혼합한다.
15. 비드를 플레이트 자석 위에서 5분 동안 수집한 후 용액을 흡인하여 폐기한다.
16. 0.25 mL의 세척 완충액(CNV WSH)을 가한 다음 플레이트를 가열기 진탕기로 이전하고 1,200 rpm에서 3분 동안 혼합한다.
17. 비드를 플레이트 자석 위에 수집한 후 용액을 흡인하여 폐기한다.
18. 0.2 mL의 탈설폰화 완충액(DES SLN)을 가하고 1,200 rpm에서 7분 동안 30 ℃에서 혼합한다.
19. 비드를 2분 동안 자석 위에 수집한 후 용액을 흡인하여 폐기한다.
20. 0.25 mL의 세척 완충액(CNV WSH)을 가한 후 플레이트를 가열기 진탕기에 이동시키고 1,200 rpm에서 3분 동안 혼합한다.
21. 비드를 2분 동안 자석 위에 수집한 후 용액을 흡인하여 폐기한다.
22. 0.25 mL의 세척 완충액(CNV WSH)을 가한 후 플레이트를 가열기 진탕기에 이동시키고 1,200 rpm에서 3분 동안 혼합한다.
23. 비드를 2분 동안 자석 위에 수집한 후 용액을 흡인하여 폐기한다.
24. 플레이트를 가열기 진탕기로 이동시키고 1,200rpm에서 혼합하면서 70 ℃에서 15분 동안 항온처리하여 건조시킨다.
25. 80 μL의 용출 완충액(ELU BFR)을 DWP중 모든 샘플에 걸쳐 가한다.
26. 1,200rpm에서 혼합하면서 65 ℃에서 25분 동안 항온처리한다.
27. 용출물을 96 웰 플레이트로 수동 이전시키고 -80 ℃에서 저장한다.
28. 회수가능한/전달가능한 용적은 약 65 μL이다.
VI. 메틸화된 DNA 검출 및 정량화를 위한 QuARTS-X
A. 복합 PCR (mPCR) 설정:
1. 각각의 목적한 메틸화된 마커에 대해 전방 및 역방 프라이머를 각각 750nM의 최종 농도로 함유하는 10X 프라이머 혼합물을 제조한다. 상기 실시예에 기술된 바와 같이, 희석물로서 10 mM 트리스-HCl, pH 8, 0.1 mM EDTA를 사용한다.
2. 100 mM MOPS, pH 7.5, 75 mM MgCl2, 0.08% 트윈 20, 0.08% IGEPAL CA-630, 2.5 mM dNTP를 함유하는 10X 복합 PCR 완충액을 제조한다.
3. 복합 PCR 마스터 혼합물을 다음과 같이 제조한다:
Figure pct00017
4. DNA를 해동시키고 플레이트를 회전시킨다.
5. 25 μL의 마스터 혼합물을 96 웰 플레이트에 가한다.
6. 50 μL의 각각의 샘플을 각각의 웰로 이전시킨다.
7. 플레이트를 알루미늄 호일 밀봉으로 밀봉한다(스트립 뚜껑을 사용하지 않는다)
8. 가열된-마개 열 사이클러 속에 두고 다음 프로파일을 사용하여 약 5 내지 20 사이클, 바람직하게는 약 10 내지 13회 사이클을 사용하여 사이클로 진행시킨다:
Figure pct00018
9. 열 사이클링의 완료 후, 앰플리콘의 1:10 희석을 다음과 같이 수행한다:
a. 180 μL의 10 mM 트리스-HCl, pH 8, 0.1 mM EDTA를 깊은 웰 플레이트의 각각의 웰에 이전시킨다.
b. 20 μL의 증폭된 샘플을 각각의 예비-충전된 웰에 가한다.
c. 희석된 샘플을 새로운 팁 및 200 μL의 피펫터를 사용한 피펫팅을 반복함으로써 혼합한다(에어로졸을 생성하지 않도록 주의한다).
d. 희석된 플레이트를 플라스틱 밀봉으로 밀봉한다.
e. 희석된 플레이트를 1000 rpm에서 1분 동안 원심분리한다.
f. 희석되지 않은 어떠한 나머지 복합 PCR 생성물도 새로운 알루미늄 포일 밀봉으로 밀봉한다. -80 ℃에 둔다.
B. 복합-증폭된 DNA의 QuARTS 분석:
1. 어류 DNA 희석액(20 ng/μL)을 해동시키고 다음에 필요한 플라스미드 캘리브레이터를 희석시키는데 사용한다(참고: 예컨대, 미국 특허 출원일련번호제15/033,803호, 이는 참고로 본원에 포함된다): 분석. 다음의 표를 희석 안내로서 사용한다:
Figure pct00019
2. 10X 삼본체 QuARTS올리고 혼합물을 다음에 대해 다음 표를 사용하여 제조한다. 마커 A, B, 및 C(예컨대, 목적한 마커, 및 β-액틴 또는 B3GALT6와 같은 수행 대조군 및 내부 대조군(참고: 예컨대.,미국 특허 출원일련번호제62/364,082호, 본원에 참고로 포함됨).
Figure pct00020
예를 들면, 다음을 사용하여 바이설파이트-처리된 β-actin, B3GALT6, 및 제브라피쉬 RASSF1 마커를 검출할 수 있다:
Figure pct00021
3. QuARTS플랩 분석 마스터 혼합물을 다음 표를 사용하여 제조한다:
Figure pct00022
4. 96 웰 ABI 플레이트를 사용하여, 20 μL의 QuARTS 마스터 혼합물을 각각의 웰 내로 피펫팅한다.
5. 10 μL의 적절한 캘리브레이터 및 희석된 mPCR 샘플을 가한다.
6. 플레이트를 ABI 투명 플라스틱 밀봉으로 밀봉한다.
7. 플레이트를 3000rpm을 사용하여 1분 동안 원심분리한다.
8. 플레이트를 다음의 열 프로토콜을 작동하도록 프로그램된 ABI 열 사이클러에두고 장치를 개시한다.
Figure pct00023
실시예 8
제1 세척 용액 속에서 카오트로픽 염의 비교
기술의 개발 동안에, 제1 세척 용액 속에서 상이한 카오트로픽 염, 예컨대, 구아니딘 티오시아네이트 대 구아니딘 하이드로클로라이드의 효과를 비교하였다.
DNA를 실시예 7에 기술된 바와 같이 혈장 샘플로부터, 다음으로서 사용된 구아니딘 티오시아네이트-에틸 알코올 또는 구아니딘 하이드로클로라이드-에틸 알코올을 사용하여 추출하였다. 제1 세척 용액(즉, 57% 에틸 알코올과 3 M 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 3 M 구아니딘 티오시아네이트). 샘플을 실시에 7에 기술된 바와 같이 달리 가공하고, DNA의 일부를 바이설파이트-전환시켰다. 수득된 전환되지 않은 DNA의 양을 상기 기술된 바와 같이, QuARTS PCR 플랩 분석을 사용한 공정 대조군 및 β-액틴(ACTB)의 검출에 의해 측정하고, 바이설파이트-전환된 DNA를 상기 기술된 바와 같이 복합 예비-증폭 및 QuARTS PCR-플랩 분석을 사용하여 공정 대조군, B3GALT6, 및 β-액틴 (BTACT)의 검출에 의해 측정하였다. 결과는 도 11a 내지 11c에 나타낸다(공정 대조군 데이터는 나타내지 않음). 이들 데이터는 용액 둘 다가 허용가능한 DNA 수율을 생산하였으며, 구아니딘 티오시아네이트-에탄올이 보다 높은 수율을 생산함을 나타낸다.
실시예 9
제1 세척 단계에서 에틸 알코올과 구아니딘 티오시아네이트 또는 구아니딘 하이드로클로라이드 대 에틸 알코올과 완충액의 비교
기술의 개발 동안에, 실시예 7, III 부분에 기술된 혈장 DNA 추출의 제1 세척 단계에서 에틸 알코올(에탄올)과 카오트로픽 염 용액, 예컨대, 구아니딘 티오시아네이트 (GTC) 또는 구아니딘 하이드로클로라이드 (GuHCl)의 혼합물을 사용한, 즉, 57% 에틸 알코올과 3 M 구아니딘 하이드로클로라이드(실시예 7, III 부분에서의 세척 용액 1) 또는 50% 에틸 알코올과 2.4 M 구아니딘 티오시아네이트를 사용한 효과를 제1 세척 단계에서 80% 에틸 알코올과 10 mM 트리스 HCl, pH 8.0(실시예 7, III 부분에서 세척 용액 2)를 사용하여 비교하였다. 80% 에탄올-트리스 완충액 용액을 후속적인 세척 단계에서, 실시예 7에 기술된 바와 같이 사용하였다.
8회의 반복을 세척 조건의 각각의 세트에 대해 수행하였다. 샘플을 달리 실시예 7에 기술된 바와 같이 가공하고 DNA는 바이설파이트로 처리하지 않았다. 수득되는 DNA의 양은 상기 기술된 바와 같이 QuARTS PCR 플랩 분석을 사용하여, β-액틴(ACTB)의 검출에 의해 측정하였다. 결과(검출된 DNA 쇄의 평균)은 하기 표에 나타낸다. 이들 데이터는 제1 세척 단계에서 에틸 알코올과 구아니딘 티오시아네이트 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 사용에 이은, 에탄올-완충액 세척을 사용한 추가의 세척이 모든 세척 단계에 대해 에탄올-완충액 세척을 사용한 것보다 더 높은 수율을 생산하였음을 나타낸다.
Figure pct00024
실시예 10
1회의 단계 또는 2회의 단계에서 분해 시약의 첨가의 시험
기술의 개발 동안, 분리 과정에서 1회 또는 2회 단계에서 분해 시약의 첨가 효과를 비교하였다. 6개의 상이한 혈장 샘플로부터 2 mL 또는 4 mL의 분취량을 사용하여, 제1 과정은 4.3 M 구아니딘 티오시아네이트와 10% IGEPAL과 프로테이나제 K의 7 mL의 분해 시약 및 실시예 1에 기술된 바와 같은 공정 대조군의 첨가, 혈장/프로테아제/공정 대조군 혼합물의 55 ℃에서 60분 동안의 항온처리에 이은, 이소프로판올의 첨가를 포함하였다. 제2의 과정은 3 mL의 4.3 M 구아니딘 티오시아네이트와 10% IGEPAL과 프로테아제의 1개 분취량 및 공정 대조군의 첨가를 포함하였으며, 4mL의 추가의 분취량은 이소프로판올의 첨가와 함께, 55 ℃ 항온처리 후 가하였다. 이후에 샘플을 30 ℃에서 30분 동안 추가로 항온처리한 후, 실시예 1에 기술된 바와 같이 가공하였다. 수득되는 DNA의 일부를 기술한 바와 같이 바이설파이트-전환시켰다.
수득되는 전환되지 않은 DNA의 양은 상기 기술된 바와 같이, QuARTS분석을 사용한, 공정 대조군 및 β-액틴 (ACTB)의 검출에 의해 측정하고, 바이설파이트-전환된 DNA는 상기 기술된 바와 같이, 복합 예비-증폭 및 QuARTS PCR-플랩 분석을 사용하여 공정 대조군, B3GALT6, 및 β-액틴(BTACT)의 검출에 의해 측정하였다. 결과는 도 12a 내지 12c에 나타낸다(공정 대조군 데이터는 나타내지 않음). 각각의 시험된 마커 및 공정 대조군(PC)에 대해 평균 배 차이는 하기 나타낸다:
Figure pct00025
이들 데이터는 제1 단계에서는 이소프로판올의 부재하에 및 제2 단계에서는 이소프로판올과 함께 첨가한, 2회의 단계에서 분해 시약의 첨가가 보다 높은 수율의 검출가능한 DNA를 생산함을 나타낸다.
상기 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허는 모든 목적에서 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원에 기술된 다양한 구현예가 속하는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 포함된 참고문헌에서 용어의 정의가 본 교시내용에서 제공된 정의와 상이한 것으로 여겨지는 경우, 본 교시내용에 제공된 정의가 제어할 것이다.
기술된 조성물, 방법, 및 기술의 용도의 다양한 변형 및 변화는 설명된 바와 같은 기술의 영역 및 취지로부터 벗어남이 없이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 비록 기술이 구체적인 예시적 구현예와 관련해서 기술되었지만, 청구된 기술은 이러한 구체적인 구현예로 과도하게 한정되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로, 약학, 생화학, 의과학, 또는 관련 분야의 숙련가에게 명백한 기술을 수행하기 위한 설명된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 영역 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> EXACT SCIENCES CORPORATION <120> MULTIPLEX AMPLIFICATION DETECTION ASSAY AND ISOLATION AND DETECTION OF DNA FROM PLASMA <130> EXCT-34562/WO-1/ORD <150> US 62/249,097 <151> 2015-10-30 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 224 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 aagggctgct ctccggccag cctgggcgcc ggggacagca gccggcgcgg cgtcctacct 60 ggtgaagttc gtcctgccct cggcgtggac ccaggccccg gtcgccgccc gggagggcac 120 cggcctcgct cgcttgctcg ctcgcccgcc cttgcccgct cgctccccgc ccgccgcctc 180 cctcgcgcgc ccgctccggt cctccggctc ccactacagc tcat 224 <210> 2 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 tgccctcggc gtggacccag gccccggtcg ccgcccggga gggcaccggc ctcgctcgct 60 tgctcgctcg cccgcccttg cccgctcgct ccccgcccgc cgcctccctc gcgcgcccgc 120 tccggtcctc cg 132 <210> 3 <211> 224 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 aagggttgtt tttcggttag tttgggcgtc ggggatagta gtcggcgcgg cgttttattt 60 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sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 24 cgggtttcgt gcgttttcgt tttagttggt ttggagttta attttcggtt tcgtcgtcgg 60 ttttttgcgt tttcggagtg tttcgtagcg acgtcgggag tcgacgcgtc gcgcgggtat 120 ttagttatgg ttggggcga 139 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 25 ggtttcgtgc gttttcgttt tagt 24 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 26 ccaaccataa ctaaataccc gcg 23 <210> 27 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 27 gtttaatttt cggtttcgtc gtcggttttt tgcgttttcg gagtgtttcg tagcg 55 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 28 gtttaatttt cggtttcgtc gtc 23 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 29 cgctacgaaa cactccga 18 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 30 cgccgaggcg gttttttgcg 20 <210> 31 <211> 224 <212> DNA <213> Artificial sequence 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gtgtgacctg tgtggagagt tcatctgggg cctgtacaga cagagcctcc 420 <210> 63 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 63 attagaacga gacgttaaat ttattagttt gttttggagt aaatagcgtt gttttaaaat 60 attttatagt tataaattat ttttagtttt aattatggtt tattgagtta tgtcgtttat 120 ttttttacga ttttaaaatg gtaaaatgtg agtttatcga gttgtaggat ttgatttcga 180 atgatcgtat tgagttggta ttttttagtg tttttttatt tatcgtggtg tttattttgg 240 ataggtggag tagagggaag gtggtgcgta tggtgggcga gcgcgtgcgt ttggaggatt 300 tcgattggtt gacgtgtaaa ttaggacgag gatatgattt ttagttttgt agttagatat 360 agttgagttg gtgtgatttg tgtggagagt ttatttgggg tttgtataga tagagttttc 420 <210> 64 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 64 cgcatggtgg gcgag 15 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 65 acacgtcagc caatcggg 18 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 66 gacgcggagg cgcgtgcgcc 20 <210> 67 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 67 tgcgtatggt gggcgag 17 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 68 cctaatttac acgtcaacca atcgaa 26 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 69 gacgcggagg cgcgtgcgtt t 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 70 ccacggacgg cgcgtgcgtt t 21 <210> 71 <211> 171 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 71 tccacgtggt gcccactctg gacaggtgga gcagagggaa ggtggtggca tggtggggag 60 ggtggcctgg aggacccgat tggctgagtg taaaccagga gaggacatga ctttcagccc 120 tgcagccaga cacagctgag ctggtgtgac ctgtgtggag agttcatctg g 171 <210> 72 <211> 171 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 72 ccagatgaac tctccacaca ggtcacacca gctcagctgt gtctggctgc agggctgaaa 60 gtcatgtcct gtcctggttt acagtcagcc aatggggtcc tccagggcag gctgcccacc 120 atggcaccac cttccctctg ctccacctgt ccagagtggg caccaggtgg a 171 <210> 73 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 73 ggtttatttt ggttttttga gttttcgg 28 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 74 tccaacctac tatatttacg cgaa 24 <210> 75 <211> 0 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 75 000 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 76 cgccgagggc ggatttaggg 20 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 77 gtgtttgttt ttttgattag gtgtttaaga 30 <210> 78 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 78 ctttacacca acctcataac cttatc 26 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 79 gacgcggaga tagtgttgtg g 21 <210> 80 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 80 agccggtttt ccggctgaga cctcggcg 28 <210> 81 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 81 agccggtttt ccggctgaga cgtccgtgg 29 <210> 82 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 82 agccggtttt ccggctgaga ctccgcgtc 29 <210> 83 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 83 tgccctcggc gtggacccag gccccggtcg ccgcccggga gggcaccggc ctcgctcgct 60 tgctcgctcg cccgcccttg cccgctcgct ccccgcccgc cgcctccctc gcgcgcccgc 120 tccggtcctc cg 132 <210> 84 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 84 tgttttcggc gtggatttag gtttcggtcg tcgttcggga gggtatcggt ttcgttcgtt 60 tgttcgttcg ttcgtttttg ttcgttcgtt tttcgttcgt cgtttttttc gcgcgttcgt 120 ttcggttttt cg 132 <210> 85 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 85 atcggtttcg tt 12 <210> 86 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 86 gtcgtcgttc gggagggtat cggtttcgtt cgtttgttcg ttcgttcgtt tttgttcg 58 <210> 87 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 87 gcgcgcggga ctcgctgcag cggcggccgg gtcgcggcgc acccgggccg ggaccggagc 60 cgagcctagc gcggcgcccg cgacccgtca gccgcggctc ctgctccctc gatcccgcgc 120 ggggaaaggg ccggcggctg ttggc 145 <210> 88 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 88 gcgcgcggga ttcgttgtag cggcggtcgg gtcgcggcgt attcgggtcg ggatcggagt 60 cgagtttagc gcggcgttcg cgattcgtta gtcgcggttt ttgttttttc gatttcgcgc 120 ggggaaaggg tcggcggttg ttggc 145 <210> 89 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 89 cggcgttcgc ga 12 <210> 90 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 90 cgggctccgt gcgccctcgc cccagctggt ttggagttca accctcggct ccgccgccgg 60 ctccttgcgc cttcggagtg tcccgcagcg acgccgggag ccgacgcgcc gcgcgggtac 120 ctagccatgg ctggggcga 139 <210> 91 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 91 cgggtttcgt gcgttttcgt tttagttggt ttggagttta attttcggtt tcgtcgtcgg 60 ttttttgcgt tttcggagtg tttcgtagcg acgtcgggag tcgacgcgtc gcgcgggtat 120 ttagttatgg ttggggcga 139 <210> 92 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 92 cggttttttg cg 12 <210> 93 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 93 gaccggggtg tcccccaggc tccgcgtcgc ggtccccgct cgccctcccg cccgcccacc 60 gggcacccca gccgcgcaga aggcggaagc cacgcgcgag ggaccgcggt c 111 <210> 94 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 94 gatcggggtg ttttttaggt ttcgcgtcgc ggttttcgtt cgttttttcg ttcgtttatc 60 gggtatttta gtcgcgtaga aggcggaagt tacgcgcgag ggatcgcggt t 111 <210> 95 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 95 gttcgtttat cg 12 <210> 96 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 96 ctctgcaggt tctatttgct ttttcccaga tgagctcttt ttctggtgtt tgtctctctg 60 actaggtgtc taagacagtg ttgtgggtgt aggtactaac actggctcgt gtgacaaggc 120 catgaggctg gtgtaaagcg gccttggagt gtgtattaag taggtg 166 <210> 97 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 97 ttttgtaggt tttatttgtt tttttttaga tgagtttttt ttttggtgtt tgtttttttg 60 attaggtgtt taagatagtg ttgtgggtgt aggtattaat attggtttgt gtgataaggt 120 tatgaggttg gtgtaaagtg gttttggagt gtgtattaag taggtg 166 <210> 98 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 98 atagtgttgt gg 12 <210> 99 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 99 gggcagcgcc gctctggccg ccccgcgggg ccggggccga cagcccacgc tggcgcggca 60 ggcgcgtgcg cccgccgttt tcgtgagccc gagcagcggc gagcccaggg cgccgggcgg 120 ccgggaggct ggtctggctt agctgg 146 <210> 100 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 100 gggtagcgtc gttttggtcg tttcgcgggg tcggggtcga tagtttacgt tggcgcggta 60 ggcgcgtgcg ttcgtcgttt tcgtgagttc gagtagcggc gagtttaggg cgtcgggcgg 120 tcgggaggtt ggtttggttt agttg 145 <210> 101 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 101 gacgaacgca cg 12

Claims (68)

  1. 다음을 포함하는 다수의 표적 핵산에 대해 샘플을 분석하는 방법:
    a) 다수의 n 개의 상이한 표적 영역 중 하나 이상을 함유하는 것으로 추측된 바이설파이트-처리된 DNA를 포함하는 샘플 인, 용적 x를 갖는 샘플을 제공하는 단계(여기서, 상기 표적 영역의 적어도 하나는 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 상기 샘플속에 다음과 같은 카피 수에서 존재하는 저-카피 표적이다:
    i) 용적이 x/n인 상기 샘플 각각의 n개 분획 중에서, 상기 저 카피 표적은 상기 n 개 표적 중 하나 이상으로부터 부재하거나,
    ii) 용적이 x/n인 상기 샘플 각각의 n개 분획 중에서, 상기 n개 분획들 중 하나 이상에서 상기 저 카피 표적은 상기 저 카피 표적에 대한 검출 분석의 민감성의 수준 이하이다);
    b) 상기 용적 x의 상기 샘플을 증폭 반응에 상기 n개의 상이한 표적 영역이 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 증폭하여 용적이 y인 예비-증폭된 혼합물을 형성하도록 하는 조건 하에서 처리하는 단계;
    c) 상기 예비-증폭된 혼합물을 다수의 상이한 검출 분석 반응 혼합물에 분배하는 단계(여기서, 각각의 검출 분석 반응 혼합물은 용적이 y/n 이하인 상기 예비-증폭된 혼합물의 일부를 포함하고, 여기서 상기 저-카피 표적은 단계 a)에서 상기 혼합물 속에 존재하는 경우, 상기 검출 분석 반응 혼합물 각각에 존재한다);
    d) 다수의 검출 분석을 상기 검출 반응 혼합물을 사용하여 수행하는 단계(여기서, 상기 상이한 표적 영역은, 단계 a)에서 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 상기 검출 분석 반응 혼합물 속에서 검출된다).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 바이설파이트 처리된 DNA가 사람 대상체로부터 기원하는 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 샘플이 체액으로부터 제조되는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 체액이 혈장을 포함하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 샘플이 혈장으로부터 분리된 세포-유리된 DNA로부터 제조되는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 세포-유리된 DNA가 길이가 200개 미만의 염기쌍인 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 세포-유리된 DNA가 다음을 포함하는 방법에 의해 상기 혈장으로부터 분리되는 방법:
    a) 혈장 샘플을 다음과 합하여:
    i) 프로테아제; 및
    ii) 제1 분해 시약(당해 제1 분해 시약은 다음을 포함한다:
    - 구아니딘 티오시아네이트; 및
    - 비-이온성 세제);
    단백질이 상기 프로테아제에 의해 분해되는 혼합물을 형성시키는 단계;
    b) 단계 a)의 상기 혼합물에
    iii) 실리카 입자, 및
    iv) 제2 분해 시약(당해 제2 분해 시약은 다음을 포함한다:
    - 구아니딘 티오시아네이트;
    - 비-이온성 세제; 및
    - 이소프로필 알코올);
    을 DNA가 상기 실리카 입자에 결합되는 조건 하에서 가하는 단계;
    c) b)의 상기 혼합물로부터 DNA가 결합된 실리카 입자를 분리하는 단계;
    d) DNA가 결합된 상기 분리된 실리카 입자에 제1 세척 용액(당해 제1 세척 용액은 i) 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트, 및 ii) 에틸 알코올을 포함한다)을 가하는 단계;
    e) 상기 제1 세척 용액으로부터 DNA가 결합된 상기 실리카 입자를 분리하는 단계;
    f) DNA가 결합된 상기 분리된 실리카 입자에 제2 세척 용액(당해 제2 세척 용액은 완충액 및 에틸 알코올을 포함한다)을 가하는 단계;
    g) DNA가 결합된 세척된 실리카 입자를 상기 제2 세척 용액으로부터 분리하는 단계; 및
    h) DNA가 결합된 상기 세척된 실리카 입자로부터 DNA를 용출시키는 단계.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 프로테아제가 프로테이나제 K 프로테아제인 방법.
  9. 청구항 3 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 적어도 1 mL, 바람직하게는 적어도 5 mL, 보다 바람직하게는 적어도 10 mL의 체액으로부터 제조되고/되거나, 여기서 상기 샘플의 상기 용적 x가 적어도 10μl, 바람직하게는 적어도 25 μl, 보다 바람직하게는 적어도 50μl, 보다 바람직하게는 적어도 100 μl이고, 여기서 단계 b의 상기 증폭 반응에서의 상기 샘플의 상기 용적이 상기 증폭 반응물의 상기 총 용적의 적어도 20 내지 50%인 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, n이 적어도 3, 바람직하게는 적어도 5, 보다 바람직하게는 적어도 10, 보다 바람직하게는 적어도 20인 방법.
  11. 다음을 포함하여, PCR 예비-증폭 및 PCR-플랩 분석을 사용하여 샘플 속에서 다수의 표적 핵산을 분석하는 방법:
    a) PCR 증폭 시약을 포함하는 제1 반응 혼합물 속에서 다수의 상이한 표적 영역을 포함하는 바이설파이트-처리된 DNA를 제공하는 단계(여기서, 상기 PCR 증폭 시약은 다음을 포함한다:
    i) 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 상기 바이설파이트-처리된 DNA로부터 상기 다수의 상이한 표적 영역을 증폭시키기 위한 다수의 상이한 프라이머 쌍;
    ii) 열안정성 DNA 폴리머라제;
    iii) dNTP; 및
    iv) Mg++를 포함하는 완충액
    b) 상기 제1 반응 혼합물을 열 사이클링 조건(thermal cycling condition)에 노출시키는 단계(여기서 다수의 상이한 표적 영역은, 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 증폭되어 예비-증폭된 혼합물을 생산하고, 여기서 상기 열 사이클링 조건은 증폭을 기하급수적 범위, 바람직하게는 20회 미만, 보다 바람직하게는 15회 미만, 보다 바람직하게는 10회 이하의 열 사이클로 유지하는 열 사이클의 수로 제한된다);
    c) 상기 예비-증폭된 혼합물을 다수의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물 내로 분배하는 단계(여기서 각각의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물은 다음을 포함한다:
    i) 단계 a) i)의 상기 다수의 상이한 프라이머 쌍으로부터 선택된 추가량의 프라이머 쌍;
    ii) 열안정성 DNA 폴리머라제;
    iii) dNTP;
    iv) Mg++을 포함하는 상기 완충액;
    v) 플랩 엔도뉴클레아제;
    vi) 플랩 올리고뉴클레오타이드, 및
    vi) 상기 플랩 올리고뉴클레오타이드의 일부에 대해 상보성인 영역을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오타이드);
    및
    d) PCR-플랩 분석 반응 동안에 상기 바이설파이트-처리된 DNA로부터 하나 이상의 상이한 표적 영역의 증폭을 검출하는 단계.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예비-증폭된 혼합물 이상기 분배 전에 희석제로 희석되는 방법.
  13. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서, 상기 PCR-플랩 분석 반응 혼합물에 가해진추가량의 프라이머 쌍 속의 프라이머들이 상기 PCR-플랩 분석 속의 상기 가해진 프라이머들의 상기 농도가 상기 PCR 증폭 시약 속의 이러한 프라이머 쌍의 상기 프라이머들의 상기 농도와 필수적으로 동일하도록 하는 농도로 가해지는 방법.
  14. 청구항 11 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤어핀 올리고뉴클레오타이드가 형광단 잔사를 포함하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 헤어핀 올리고뉴클레오타이드가 FRET 카세트 올리고뉴클레오타이드인 방법.
  16. 청구항 11 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, Mg++를 포함하는 상기 완충액이 대략 약 6 내지 10 Mm의 Mg++를 포함하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, Mg++를 포함하는 상기 완충액이 대략 7.5 mM의 Mg++를 포함하는 방법.
  18. 청구항 11 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서, Mg++를 포함하는 상기 완충액이 1mM 미만의 KCl을 포함하는 방법.
  19. 청구항 11 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, Mg++를 포함하는 상기 완충액이 10 mM의 3-(n-모르폴리노)프로판설폰산 (MOPS) 완충액 및 7.5 mM의 MgCl2를 포함하는 방법.
  20. 청구항 11 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 반응 혼합물 및/또는 상기 다수의 PCR-플랩 분석 반응 혼합물이 외인성의 비-표적 DNA를 포함하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 외인성의 비-표적 DNA가 거대한 어류 DNA인 방법.
  22. 청구항 11 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 열안정성 DNA 폴리머라제가 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 기원하는 방법.
  23. 청구항 11 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 열안정성 DNA 폴리머라제가 핫 스타트 (hot start) PCR을 위해 개질되는 방법.
  24. 청구항 11 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랩 엔도뉴클레아제가 FEN-1 엔도뉴클레아제인 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 FEN-1 엔도뉴클레아제가 고세균 유기체(archaeal organism)로부터 기원하는 방법.
  26. 청구항 1 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이설파이트-처리된 DNA가 사람 DNA를 포함하는 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 다수의 상이한 표적 영역이 SFMBT2, VAV3, BMP3, 및 NDRG4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표적 영역을 포함하는 방법.
  28. 청구항 26에 있어서, 상기 다수의 상이한 표적 영역이 참고 표적 영역을 포함하는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 참고 표적 영역이 β-액틴 및/또는 ZDHHC1 및/또는 B3GALT6을 포함하는 방법.
  30. 청구항 11 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 상이한 프라이머 쌍들 중 적어도 하나가 길이가 약 100개 미만의 염기쌍인 표적 영역으로부터의 앰플리콘(amplicon)을 생산하도록 선택되는 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 다수의 상이한 프라이머 쌍 각각이 길이가 약 100개 미만의 염기 쌍, 바람직하게는 길이가 약 85개 미만의 염기 쌍인 표적 영역으로부터 앰플리콘을 생산하도록 선택되는 방법.
  32. 청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예비-증폭된 혼합물 또는 상기 제1 반응 혼합물 속에 바이설파이트-처리된 DNA를 포함하는 상기 샘플의 상기 용적이 상기 예비-증폭된 혼합물 또는 상기 제1 반응 혼합물의 상기 총 용적의 20 내지 50%인 방법.
  33. 다음을 포함하여, 혈장 샘플을 가공하는 방법:
    a) 혈장 샘플을 다음과 합하여:
    i) 프로테아제;
    ii) 제1 분해 시약(당해 제1 분해 시약은 다음을 포함한다:
    - 구아니딘 티오시아네이트,
    - 비-이온성 세제);
    단백질이 상기 프로테아제에 의해 분해되는 혼합물을 형성시키는 단계;
    b) 단계 a)의 상기 혼합물에
    iii) 실리카 입자, 및
    iv) 제2 분해 시약(당해 제2 분해 시약은 다음을 포함한다:
    - 구아니딘 티오시아네이트;
    - 비-이온성 세제; 및
    - 이소프로필 알코올),
    을 DNA가 상기 실리카 입자에 결합되는 조건 하에서 가하는 단계;
    c) b)의 상기 혼합물로부터 DNA가 결합된 실리카 입자를 분리하는 단계;
    d) DNA가 결합된 상기 분리된 실리카 입자에 제1 세척 용액(당해 제1 세척 용액은 i) 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트, 및 ii) 에틸 알코올을 포함한다)을 가하는 단계;
    e) 상기 제1 세척 용액으로부터 DNA가 결합된 상기 실리카 입자를 분리하는 단계;
    f) DNA가 결합된 상기 분리된 실리카 입자에 제2 세척 용액(당해 제2 세척 용액은 완충액 및 에틸 알코올을 포함한다)을 가하는 단계;
    g) DNA가 결합된 상기 세척된 실리카 입자를 상기 제2 세척 용액으로부터 분리하는 단계;
    h) DNA가 결합된 상기 세척된 실리카 입자로부터 DNA를 용출하여 분리된 DNA 샘플을 생산하는 단계.
  34. 청구항 1에 있어서, 단계 f) 내지 g)를 단계 h) 전에 1 내지 3회의 추가 횟수로 반복하는 단계.
  35. 청구항 33 또는 청구항 34에 있어서, 상기 제1 분해 시약 및 제2 분해 시약 속의 상기 비-이온성 세제들이 동일하거나 상이하고, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트 (트윈-20), 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올에탄올(Nonidet P-40), 및 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시) 에탄올, 측쇄된(IGEPAL CA-630)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  36. 청구항 33 내지 청구항 35 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제가 프로테이나제 K 프로테아제인 방법.
  37. 청구항 33 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 있어서, 단계 g) 후 및 단계 h) 전에DNA가 결합된 상기 세척된 실리카 입자를 건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  38. 청구항 33 내지 청구항 37 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 상기 혼합물이 DNA 공정 대조군을 추가로 포함하는 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 DNA 공정 대조군이 제브라피쉬 RASSF1 서열을 포함하는 방법.
  40. 청구항 8 또는 청구항 39에 있어서, 상기 DNA 공정 대조군이 합성 DNA인 방법.
  41. 청구항 33 내지 청구항 40 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 상기 혼합물이 거대한 어류 DNA를 추가로 포함하는 방법.
  42. 청구항 33 내지 청구항 41 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 실리카 입자가 자기입자인 방법.
  43. 청구항 33 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 샘플이 적어도 2 mL의 용적을 갖는 방법.
  44. 청구항 33 내지 청구항 43 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 분해 시약이 약 4.3 M의 구아니딘 티오시아네이트 및 10% w:v의 IGEPAL CA-630을 포함하는 방법.
  45. 청구항 33 내지 청구항 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 분해 시약이 이소프로필 알코올과 배합된 4.3 M의 구아니딘 티오시아네이트 및 10% w:v의 IGEPAL CA-630을 포함하는 방법.
  46. 청구항 33 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세척 용액이 i) 약 3M의 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 3M의 구아니딘 티오시아네이트, 및 ii) 약 57%의 에틸 알코올을 포함하는 방법.
  47. 청구항 33 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 세척 용액이 약 80%의 에틸 알코올 및 약 20%의 10 mM 트리스 pH 8.0 완충액을 포함하는 방법.
  48. 청구항 33 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출 단계가 10 mM의 트리스-HCl, pH 8.0, 0.1 mM의 EDTA를 포함하는 용출 완충액 속에서 상기 DNA를 용출시키는 단계를 포함하는 방법.
  49. 청구항 33 내지 청구항 48 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 상기 프로테아제에의해 분해되는 상기 조건이 상기 혼합물을 실온에서 30 내지 60분 동안 항온처리하는 단계를 포함하는 방법.
  50. 청구항 33 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 내지 g)를 실온에서 수행하는 방법.
  51. 청구항 33 내지 청구항 50 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하여, 다수의 표적 핵산에 대해 상기 분리된 DNA 샘플을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법:
    a) 상기 분리된 DNA 샘플을 바이설파이트로 처리하여 바이설파이트 처리된 DNA 샘플을 생산하는 단계;
    b) 상기 바이설파이트-처리된 DNA 샘플을 적어도 5개의 상이한 표적 영역이 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 증폭되어 예비-증폭된 혼합물을 형성하는 조건 하에서 증폭 반응에 대해 처리하는 단계;
    c) 상기 예비-증폭된 혼합물을 다수의 상이한 검출 분석 반응 혼합물 내로 분배하는 단계; 및
    d) 상기 검출 검정 반응 혼합물을 사용하여 다수의 검출 분석을 수행하는 단계(여기서 상기 적어도 5개의 상이한 표적 영역은 단계 a)에서 상기 샘플 속에 존재하는 경우, 상기 다수의 상이한 검출 분석 반응 혼합물 중 하나 이상에서 검출된다).
  52. 다음을 포함하는, 혈장으로부터 DNA를 분리하기 위한 키트:
    a) 구아니딘 티오시아네이트 및 비-이온성 세제를 포함하는 제1 분해 시약, 또는 상기 제1 분해 시약을 제조하기 위한 성분;
    b) 구아니딘 티오시아네이트, 비-이온성 세제, 및 이소프로판올을 포함하는 제2 분해 시약, 또는 당해 제2 분해 시약을 제조하기 위한 성분;
    c) i) 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트, 및 ii) 에틸 알코올을 포함하는 제1 세척 용액, 또는 당해 제1 세척 용액을 제조하기 위한 성분;
    d) 트리스 완충액 및 에틸 알코올을 포함하는 제2 세척 용액, 또는 당해 제2 세척 용액을 제조하기 위한 성분; 및
    e) 실리카 입자.
  53. 청구항 52에 있어서, 상기 제1 분해 시약 및 제2 분해 시약 중 상기 비-이온성 세제가동일하거나 상이하고 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트 (트윈-20), 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(Nonidet P-40), 및 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올, 측쇄된(IGEPAL CA-630)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 키트.
  54. 청구항 52 또는 청구항 53에 있어서, 상기 실리카 입자가 자기 입자인 키트.
  55. 청구항 54에 있어서, 자석을 추가로 포함하는 키트.
  56. 청구항 52 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 있어서, 용출 완충액 또는 당해 용출 완충액을 제조하기 위한 성분을 추가로 포함하는 키트.
  57. 청구항 52 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 있어서, DNA 공정 대조군, 바람직하게는 합성 DNA 공정 대조군을 추가로 포함하는 키트.
  58. 청구항 57에 있어서, 상기 DNA 공정 대조군이 제브라피쉬 RASSF1 서열을 포함하는 키트.
  59. 청구항 52 내지 청구항 58 중 어느 한 항에 있어서, 거대한 어류 DNA의 제제를 추가로 포함하는 키트.
  60. 청구항 57 또는 청구항 58에 있어서, 상기 DNA 공정 대조군이 거대한 어류 DNA의 제제 속에 존재하는 키트.
  61. 다음을 포함하는, 혈장 샘플을 가공하기 위한 시스템:
    a) 구아니딘 티오시아네이트 및 비-이온성 세제를 포함하는 제1 분해 시약, 또는 상기 제1 분해 시약을 제조하기 위한 성분;
    b) 구아니딘 티오시아네이트, 비-이온성 세제, 및 이소프로판올을 포함하는 제2 분해 시약, 또는 당해 제2 분해 시약을 제조하기 위한 성분;
    c) i) 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구아니딘 티오시아네이트, 및 ii) 에틸 알코올을 포함하는 제1 세척 용액, 또는 당해 제1 세척 용액을 제조하기 위한 성분;
    d) 트리스 완충액 및 에틸 알코올을 포함하는 제2 세척 용액, 또는 당해 제2 세척 용액을 제조하기 위한 성분; 및
    e) 실리카 입자.
  62. 청구항 61에 있어서, 상기 제1 분해 시약 및 제2 분해 시약 중 상기 비-이온성 세제가 동일하거나 상이하고, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트 (트윈-20), 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(Nonidet P-40), 및 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올, 측쇄된(IGEPAL CA-630)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 시스템.
  63. 청구항 61 또는 청구항 62에 있어서, 다음 중 하나 이상을 추가로 포함하는 시스템:
    i) 프로테아제;
    ii) 용출 완충액 또는 당해 용출 완충액을 제조하기 위한 성분;
    iii) DNA 공정 대조군;
    iv) 거대한 어류 DNA의 제제;
    v) DNA를 처리하여 바이설파이트-처리된 DNA를 생산하기 위한 시약;
    vi) 혈장을 가공하기 위한 용기; 및/또는
    vii) 자석.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 DNA 공정 대조군이 제브라피쉬 RASSF1 서열을 포함하는 합성 DNA인 시스템.
  65. 청구항 63 또는 청구항 64에 있어서, 상기 DNA 공정 대조군이 거대한 어류 DNA를 포함하는 용액 속에 존재하는 시스템.
  66. 청구항 61 내지 청구항 65 중 어느 한 항에 있어서, DNA를 바이설파이트로 처리하여 바이설파이트-처리된 DNA를 생산하기 위한 시약을 추가로 포함하는 시스템.
  67. 청구항 61 내지 청구항 66 중 어느 한 항에 있어서, PCR 증폭 시약을 추가로 포함하는 시스템.
  68. 청구항 61 내지 청구항 66 중 어느 한 항에 있어서, PCR 증폭 시약 및/또는 PCR 플랩 분석 시약을 추가로 포함하는 시스템(여기서, 상기 PCR 증폭 시약은 다음을 포함하고:
    i) 상기 혈장 속에 존재하는 경우, 다수의 상이한 표적 영역을 증폭시키기 위한 다수의 상이한 프라이머 쌍;
    ii) 열안정성 DNA 폴리머라제;
    iii) dNTP; 및
    iv) Mg++를 포함하는 완충액;
    여기서 상기 PCR 플랩 분석 시약은 다음을 포함한다;
    i) 상기 혈장 속에 존재하는 경우, 다수의 상이한 표적 영역을 증폭시키기 위한 다수의 상이한 프라이머 쌍;
    ii) 열안정성 DNA 폴리머라제;
    iii) dNTP;
    iv) Mg++를 포함하는 완충액
    v) 플랩 엔도뉴클레아제;
    vi) 플랩 올리고뉴클레오타이드, 및
    vi) 상기 플랩 올리고뉴클레오타이드의 일부에 대해 상보성인 영역을 포함하는 헤어핀 올리고뉴클레오타이드).
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