CN117701720A - 宫颈癌clip3基因甲基化的检测试剂及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因诊断的技术领域，尤其是涉及一种宫颈癌CLIP3基因甲基化的检测试剂及试剂盒；检测目标基因甲基化的试剂在制备用于宫颈癌检测试剂盒中的应用，所述目标基因为CLIP3基因；本申请通过设计宫颈癌CLIP3基因甲基化的检测引物、探针、检测试剂、试剂盒，用于检测CLIP3基因的甲基化程度、灵敏度高、特异性强，且适合大规模人群筛查和常规分子诊断；采用本申请设计的检测试剂、试剂盒进行检测的敏感度高于现有报道的宫颈癌标志物，其敏感度有了大幅度的提升，对于宫颈癌的诊断有极大应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因诊断的技术领域，尤其是涉及一种宫颈癌CLIP3基因甲基化的检测试剂及试剂盒。
背景技术
宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤之一，近年来大量研究表明，宫颈癌的病死率呈现上升趋势，对妇女健康造成深远影响，因此，通过高效与精确的检测手段，对于早期精准发现高级别宫颈鳞状上皮内病变(high-gradesquamous intraepithelial lesion，HSIL)，并及时给与干预、降低宫颈浸润癌发生率并改善患者生存率具有重要意义。
液基薄层细胞学是宫颈癌筛查的重要手段，其敏感性约为50%-80%，其对意义不明确的非典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undefined significance，ASC-US)的判读易受细胞病理医师主观因素与经验的影响，可能导致转诊阴道镜检查和治疗增加等问题。HPV检测虽然敏感性较高，但是特异性较低，较容易出现误诊现象。甲基化肿瘤标志物作为一种创新的检测技术，是癌症早筛的理想标志物，但是其受限于甲基化肿瘤标志物的检测试剂或者检测手段，导致肿瘤标志物的灵敏度和特异性不能满足需求。
因此，如何提高肿瘤标志物检测的灵敏度和特异性，成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种宫颈癌CLIP3基因甲基化的检测试剂及试剂盒。
本发明首次发现CLIP3基因进行甲基化检测，可以实现高特异性和高灵敏度的对宫颈癌及其癌前病变进行检测。
第一方面，本申请提供一种目标基因甲基化的检测试剂在制备用于宫颈癌检测试剂盒中的应用，采用如下的技术方案：
CLIP3基因甲基化的检测试剂在制备用于宫颈癌检测试剂盒中的应用。
所述检测试剂的检测区域为CLIP3基因基因体或者其启动子区域；
优选的，检测试剂针对CLIP3基因的检测区域为SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示的核酸片段；
更优选的，检测试剂针对CLIP3基因的检测区域为SEQ ID NO：19所示的核酸片段。
检测试剂包括检测CLIP3基因甲基化的引物，所述引物选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示氨基酸序列，或与其具有至少80％以上的同源性的氨基酸序列。
优选的，所述引物选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示的序列或其互补序列中的至少任意一条。
优选的，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的至少一对引物对。
更优选的，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对。
所述检测试剂包括检测CLIP3基因甲基化的探针；所述探针选自SEQ ID NO：3、SEQID NO：6、SEQ ID NO：9所示的序列或其互补序列中的至少任意一条。
优选的，所述探针选自SEQ ID NO：3所示的序列。
第二方面，本申请提供一种引物，采用如下的技术方案：
一种引物，所述引物选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示氨基酸序列，或与其具有至少80％以上的同源性的氨基酸序列。
优选的，所述引物选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示的序列或其互补序列中的至少任意一条。
优选的，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的至少一对引物对。
更优选的，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对。
第三方面，本申请提供一种探针，采用如下的技术方案：
一种探针，所述探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9所示的序列或其互补序列中的至少任意一条；
优选的，所述探针选自SEQ ID NO：3所示的序列；
在探针的3’末端连接有荧光淬灭基团，5’末端连接有荧光报告基团；
优选的，荧光淬灭基团为BHQ、BHQ1、BHQ2、TAMRA或MGB，荧光报告基团为FAM、CY3、CY5、HEX、ROX或TET；
更优选的，荧光淬灭基团为BHQ1，荧光报告基团为FAM。
在一个具体的可实施方案中，本申请提供一种引物探针组合，采用如下的技术方案：
一种引物探针组合，包括针对CLIP3基因检测的引物对和探针；
其中，针对CLIP3基因检测的引物对和探针的序列如下列任意一组所示：
组一：
引物对为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，探针为SEQ ID NO：3；
组二：
引物对为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，探针为SEQ ID NO：6；
组三：
引物对为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，探针为SEQ ID NO：9。
更优选的，针对CLIP3基因检测的引物对和探针的序列如下所示：
组一：引物对为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，探针为SEQ ID NO：3。
第四方面，本申请提供一种宫颈癌检测试剂，采用如下的技术方案：
一种宫颈癌检测试剂，所述检测试剂包括上述引物和/或上述探针。
优选的，所述检测试剂还包括dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液、无核酸酶水中的一种或几种。
优选的，所述检测试剂还包括内参基因的检测试剂；内参基因为β-actin或COL2A1；进一步的，内参基因也可以采用现有技术的其他的甲基化检测的内参基因。
优选的，内参基因为β-actin。
更优选的，内参基因β-actin检测试剂含有针对内参基因检测的引物对和探针；引物对为SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，探针为SEQ ID NO：23。
第五方面，本申请提供一种用于宫颈癌检测试剂盒，采用如下的技术方案：
一种用于宫颈癌检测试剂盒，所述试剂盒包括上述引物、或上述探针、或上述检测试剂。
优选的，所述试剂盒用于检测CLIP3基因经转化试剂修饰后的序列。
第六方面，本申请提供一种非疾病诊断目的的CLIP3基因甲基化检测方法，采用如下的技术方案：
一种非疾病诊断目的的CLIP3基因甲基化检测方法，所述检测方法的步骤如下：
S1、将待测样品提取DNA后，用转化试剂进行处理，获得经修饰的待测样品；
S2、利用上述所述检测试剂或试剂盒，对转化试剂修饰后的待测样品进行CLIP3甲基化情况检测；
优选的，对步骤S2获取的检测△Ct值与临界值进行比较分析，当△Ct值小于临界值时为阳性，表明收集的待测样品中含有甲基化的CLIP3基因。
优选的，所述转化试剂为重亚硫酸盐、肼盐或亚硫酸氢盐中的一种或几种。所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种的试剂。
更优选的，所述转化试剂为重亚硫酸盐。
第七方面，本申请提供一种宫颈癌的诊断系统，采用如下的技术方案：
一种宫颈癌的诊断系统，所述诊断系统含有：
a.检测构件：用以定量检测CLIP3基因的DNA甲基化程度的检测构件；
b.结果判断构件：用于根据检测构件检测的定量检测CLIP3基因的DNA甲基化程度结果，输出宫颈癌的患病的可能性或者风险值；
其中，所述的定量检测CLIP3基因的DNA甲基化程度的检测构件含有上述检测试剂或试剂盒。
优选的，所述的患病风险是根据通过结果比较待测样本与正常样本的甲基化结果，当待测样本与正常样本的甲基化具有显著差异或极显著差异时，结果判断待测样本患病风险高。
本申请提供了一种宫颈癌CLIP3基因甲基化的检测试剂及试剂盒，所述的甲基化DNA位于CLIP3基因及其启动子区域。本发明人不仅在组织样本中验证了CLIP3基因的检出率，同时验证了CLIP3基因在TCT样本中具有同样高的特异性和灵敏性。本发明人还通过对CLIP3基因进行引探的优化，进一步提高了检测性能，在此基础上完成了本发明。
发明人经过检索和查阅大量文献以及对The Cancer Genome Atlas（TCGA）平台的数据分析，并且基于Reduced representation bisulfite sequencing（RRBS）高通量二代测序的甲基化DNA检测技术，对宫颈石蜡样本进行检测及深入分析，获取宫颈癌及癌前病变具有临床诊断意义的标志物，同时采用qPCR方法先后经过宫颈石蜡样本以及TCT宫颈脱落细胞样本进行验证，最终发现CLIP3基因能够实现高特异性和高灵敏度的对宫颈癌及癌前病变患者进行识别。在石蜡样本中，特异性高达100%，HSIL检测灵敏度为80%，宫颈癌检测灵敏度为100%；在TCT宫颈脱落细胞样本中，特异性高达97%，HSIL检测灵敏度为72.9%，宫颈癌检测灵敏度为97.6%。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
本申请公开了一种宫颈癌CLIP3基因甲基化的检测试剂及试剂盒，本申请不仅在组织样本中验证了CLIP3基因的检出率，同时验证了CLIP3基因在TCT样本中具有同样高的特异性和灵敏性；尤其是针对鳞状上皮内病变（HSIL）的高灵敏度检出对宫颈癌的早诊早发现有重要的意义。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制；其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1：引物探针组合的设计
各种研究资料表明，同一个基因的甲基化状态和分布并不均匀，因此对于同一个基因来说，选择不同的区域设计的甲基化引物、探针检测体系对同一样本，同一肿瘤的诊断检测效能并不一样，甚至有时候选择的区域不合适造成对肿瘤完全没有诊断效果，本发明人经过反复的研究和比较后，确定了CLIP3优选区域，具体如下：
针对CLIP3基因的检测区域为SEQ ID NO：19所示的核酸片段。
为了完成本发明，发明人筛选了大量基因，最终确认CLIP3基因为优选待测基因，β-actin基因作为内参基因，研究各个基因甲基化位点分布情况，设计检测的引物探针分别用于检测。
各基因检测引物探针如下：
表1 引物对和探针序列表
实施例2：CLIP3基因在石蜡样本中的检测
为了完成本发明，发明人筛选了大量基因，最终确认CLIP3基因为优选待测基因，β-actin基因作为内参基因，研究各个基因甲基化位点分布情况，设计检测的引物探针分别用于检测。
本实施例中各基因检测引物探针如下：
CLIP3的检测引物和探针为：
CLIP3-MF5：SEQ ID NO：1所示的序列；
CLIP3-MR5：SEQ ID NO：2所示的序列；
CLIP3-P5：SEQ ID NO：3所示的序列；
β-actin的检测引物和探针为：
ACTB-MF:SEQ ID NO：21所示的序列；
ACTB-MR:SEQ ID NO：22所示的序列；
ACTB-P:SEQ ID NO：23所示的序列。
样本检测：
样本信息：测试宫颈石蜡样本共计50例，其中对照组样本20例；阳性样本（病理≥CIN2，后续简写为CIN2+）30例，阳性样本中包含10例HSIL样本，20例鳞癌样本（包含14例Ⅰ/Ⅱ期宫颈癌样本和6例Ⅲ/Ⅳ期宫颈癌样本）。
试验过程：
1、提取DNA
收集确诊宫颈癌及高级别鳞状上皮内病变（HSIL）患者的标本和非肿瘤患者石蜡组织标本，按美基生物公司试剂盒HiPureFFPE DNA Kit(D3126-03)说明书进行DNA提取。
2、DNA修饰
以ZYMO RESEARCH生物公司试剂盒EZ DNA MethylationTM KIT(D5002)说明书进行重亚硫酸盐修饰。
3、扩增与检测
配液体系：
表2 配液体系
扩增程序：
表3 扩增程序
4、检测结果
以△Ct值（△Ct=标志物Ct值-ACTB Ct值）作为样本阳性判断标准，CLIP3的阳性判断值△Ct为9，当检测结果△Ct值小于相应阳性判断值时，则判断该标志物对样本检测结果为阳性，否则为阴性，50例宫颈石蜡样本检测结果如下：
表4 检测结果
注意：当无扩增曲线时，Ct值统一赋值为45进行△Ct值计算。
对检测结果进行分析，分析结果如下：
表5 分析结果
从以上结果可以看出，在宫颈石蜡样本中，无论将CIN2+作为一个整体还是分别按照HSIL和宫颈癌组进行分析，在特异性为100%的情况下，均具有较高的灵敏度。特别是对HSIL组，单基因检测灵敏度高达80%，对宫颈癌可实现100%检出，由于宫颈癌的发展历程是由鳞状上皮内病变（HSIL）向宫颈癌发展，对HSIL的高灵敏度检出对宫颈癌的早诊早发现有重要的意义。
实施例3：CLIP3基因在宫颈脱落细胞样本中的检测
通过在宫颈石蜡样本中进行甲基化检测，确认CLIP3有很高的特异性和灵敏度，为验证这个基因在实际临床样本—宫颈脱落细胞样本（以下简称TCT样本）中的检测性能，本发明人收集了200例不同疾病类型含病理信息的TCT样本，以β-actin基因作为内参基因，研究CLIP3基因在上述TCT样本中的检测情况。
各基因检测引物探针如下：
CLIP3的检测引物和探针为：
CLIP3-MF5：SEQ ID NO：1所示的序列；
CLIP3-MR5：SEQ ID NO：2所示的序列；
CLIP3-P5：SEQ ID NO：3所示的序列；
β-actin的检测引物和探针为：
ACTB-MF:SEQ ID NO：21所示的序列；
ACTB-MR:SEQ ID NO：22所示的序列；
ACTB-P:SEQ ID NO：23所示的序列；
样本检测：
样本信息：测试200例不同疾病类型含病理信息的TCT样本，其中包括99例阴性对照样本（≤CIN1）和101例阳性对照样本（≥CIN2），阴性对照样本包括59例非宫颈癌及其癌前病变的患其他宫颈疾病的样本，40例低级别鳞状上皮内病变（LSIL）；阳性对照样本包括59例高级别鳞状上皮内病变（HSIL），42例宫颈癌样本，其中宫颈癌样本包括34例鳞癌、4例腺癌、2例腺鳞癌、1例小细胞癌、1例未明确类型宫颈癌样本。
试验过程：
1、提取DNA
取一定量的TCT临床样本离心分离细胞取沉淀，按美基生物公司试剂盒HiPureFFPE DNA Kit(D3126-03)说明书进行DNA提取。
2、DNA修饰
以ZYMO RESEARCH生物公司试剂盒EZ DNA MethylationTMKIT(D5002)说明书进行重亚硫酸盐修饰。
3、扩增与检测
配液体系：
表6 配液体系：
扩增程序：
表7 扩增程序
4、检测结果
以△Ct值（△Ct=标志物Ct值-ACTB Ct值）作为样本阳性判断标准，CLIP3的阳性判断值△Ct为9，当检测结果△Ct值小于相应阳性判断值时，则判断该标志物对样本检测结果为阳性，否则为阴性，200例TCT样本检测结果如下：
表8 200例TCT样本检测结果
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注意：当无扩增曲线时，Ct值统一赋值为45进行△Ct值计算。
对检测结果进行分析，分析结果如下：
表9 分析结果
从以上结果可以看出，在TCT样本中，在特异性为97%的情况下，CLIP3基因整体性能为83.2%，在宫颈癌中灵敏度高达97.6%，对于HSIL组，灵敏度也高达72.9%。由于宫颈癌的发展历程是由鳞状上皮内病变（HSIL）向宫颈癌发展，对HSIL的高灵敏度检出对宫颈癌的早诊早发现有重要的意义。
实施例4：CLIP3的引物设计与优化
引物和探针也对肿瘤标志物的检测效果有极大的影响，发明人在研究过程中，设计了多对引物及其对应的探针，以寻找到尽可能提高检测灵敏度和特异性的探针和引物，以使本发明的检测试剂能够实际应用到临床检测中。
表10 引物探针组合
以上引物对和探针组合在50例宫颈石蜡样本中进行筛选检测，其中对照组样本20例；阳性样本（病理≥CIN2，后续简写为CIN2+）30例，阳性样本中包含10例HSIL样本，20例鳞癌样本（包含14例Ⅰ/Ⅱ期宫颈癌样本和6例Ⅲ/Ⅳ期宫颈癌样本）。
试验过程、扩增程序与实施例2相同。
检测结果如下：
表11 CLIP3 不同引物探针对检测结果
在CLIP3多对引物探针检测结果中，结果显示，组合5检测性能最优，组合4和组合6次之，组合1、组合2和组合3性能较差。
结合表11可知，针对同一区域的不同引物对，对检测结果会产生影响。
Claims (10)
1.CLIP3基因甲基化的检测试剂在制备用于宫颈癌检测试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：检测试剂针对CLIP3基因的检测区域为SEQID NO：19所示的核酸片段。
3.一种引物，其特征在于：所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的至少一对引物对。
4.根据权利要求3所述的一种引物，其特征在于：所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的引物对。
5.一种探针，其特征在于：所述探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9所示的序列或其互补序列中的至少任意一条；
在探针的3’末端连接有荧光淬灭基团，5’末端连接有荧光报告基团；
荧光淬灭基团为BHQ、BHQ1、BHQ2、TAMRA或MGB，荧光报告基团为FAM、CY3、CY5、HEX、ROX或TET。
6.一种宫颈癌检测试剂，其特征在于：所述检测试剂包括权利要求3所述的引物或权利要求5所述的探针。
7.根据权利要求6所述的一种宫颈癌检测试剂，其特征在于：所述检测试剂还包括dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液、无核酸酶水、内参基因中的一种或几种；
其中，内参基因为β-actin；
内参基因β-actin检测试剂含有针对内参基因检测的引物对和探针；引物对为SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：22，探针为SEQ ID NO：23。
8.一种用于宫颈癌检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求6或7所述的检测试剂。
9.一种非疾病诊断目的的CLIP3基因甲基化检测方法，其特征在于，所述检测方法的步骤如下：
S1、将待测样品提取DNA后，用转化试剂进行处理，获得经修饰的待测样品；
S2、利用权利要求6或7所述的检测试剂或权利要求8所述试剂盒，对转化试剂修饰后的待测样品进行CLIP3甲基化情况检测；
其中，对步骤S2获取的检测△Ct值与临界值进行比较分析，当△Ct值小于临界值时为阳性，表明收集的待测样品中含有甲基化的CLIP3基因；
所述转化试剂为重亚硫酸盐、肼盐或亚硫酸氢盐中的一种或几种。
10.一种宫颈癌的诊断系统，其特征在于，所述诊断系统含有：
a.检测构件：用以定量检测CLIP3基因的DNA甲基化程度的检测构件；
b.结果判断构件：用于根据检测构件检测的定量检测CLIP3基因的DNA甲基化程度结果，输出宫颈癌的患病的可能性或者风险值；
其中，所述的定量检测CLIP3基因的DNA甲基化程度的检测构件含有权利要求6或7所述的检测试剂或权利要求8所述试剂盒。
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