JPS60104020A - Ａ型肝炎‐タンパク質サブユニツト抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ型肝炎は一般的には致命的ではないが、長期間の衰弱
する病気を引き起す肝臓の病気である。この病気は感染
個体に直接接触するか、飲別水及び／又は食物に混在し
たＡ型肝炎ビールス（ＨＡＶ）により、まん延する。

従来より、本ビールスに対する中和抗体を含むＨＡ　Ｖ
　（Ａ型肝炎ビールス）のタンパク質について同定され
なかった。ＨＡ　Ｖタンパク質の防飢抗原性を研究する
上での主なる弱点の１つは、十分な量のＨＡ　Ｖ及びそ
のポリペプチド成分が得られない事であった。本ビール
スは、細胞培養中では非常に少量しか得られず、動物宿
主の範囲が限定され、感染細胞培養物及び動物組織から
単雛する事は困難である。

ＨＡＶのサブユニットワクチンを製造するためには、防
御又は中和ビールス抗体を誘発及び／又は結合する事の
できる全ビールスタンパク質又はポリペプチドを同定す
る必要がある。

１−Ｉ　Ａ　Ｖにおける４紳のボリペブ′チドの４在は
、Ｔｒａｔｓｃｈｅｎ等、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　並、１
５１−１５６　（１９８１）　；　Ｃｏｕ］ｅｐｉｓ等
、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ。

１８．１０７−１２７　（１９８２）　Ｋ　ｊす、分ｌ
ｌ１ｊｌ　、、放射ヨウ素化Ｉ−Ｉ　Ａ　Ｖの電気泳動
を用いたイυ（究で報告された。

しだがって、当発明の目的は、）Ｉ　Ａ　Ｖに対する中
和抗（４）に結合する主要ビールス抗原として働＜、Ｈ
ＡＶの構造タンパク質（以後ＶＰ−１と称する）を同定
する事である。当発明の他の目的は、本構造タンパク質
の単腑法を提供する事にある。更に、Ｉ−ＩＡＶに対し
て感受性を持つ宿主を免疫化する／Ｃめに本＋１１７ｉ
造タンパク質を用いる方法を提供する事が当発明の目的
でありＨＡ　Ｖ感染性を中和する単一クローン抗体を産
生ずるハイフリドーマ細胞（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｃｅ
ｌｌ　）　を提供する事も、当発明の目的である。更に
又、本年−クローン抗体を含む診断薬を提供する事も、
当発明の目的である。これらの当発明の目的及び他の目
的は、以下の記述により明らかとなろう。

当発明において、ＨＡＶの構造タンパク質（ｖｐ−１）
を単離した。本タンパク質は分子量３３．　ＯＯＯダル
トンを有し、ビールスの表面に局在化している。ＶＰ−
１はヒトを含む感染宿主からのＨＡＶ免疫血清と非常に
反応する。ＨＡＶに対する単一クローン抗体抗体の結合
部位はｖｐ−１上に存在する。ＶＰ−１のアミノ酸分析
及びＶＰ−１のブロムシアン分解ペプチドの部分アミノ
酸配列を決定した。ＨＡＶのＶＰ−１はＨＡ　Ｖ抗体に
対する血清学的検定に用いる事ができ、ＨＡＶのポリペ
プチドサブユニットワクチンの製造に用いる事ができる
。

ハイブリドーマ細胞は、ＨＡＶ又はｖＰ−１で死傷化し
た肺臓細胞と骨髄腫細胞株を融合して得る。これらハイ
ブリドーマ細胞はクローン化して均一となり、生産され
る単一クローン抗体は、ビールスに結合し、ｖｐ−ｉに
直接結合して、感染性を中和する（上述）。

単一クローン抗体のいくつかは、ＨＡＶ感染したヒトの
血清由来の多クローン抗体と競争反応する。これら単一
クローン杭木は）−Ｉ　Ａ　Ｖに対する抗体の存在を知
るだめの迅速な検査に用いる事ができ、中和抗体の存在
を測定する事もできる。

サルの腎又は肝細胞の如き、感受性のある細胞の培養系
中イノビトロでＨＡ　Ｖは増殖する。細胞を分解し、低
速遠心の如き方法で、細胞残層を除き、上清からビール
スを単離する。ビールス含有画分を取り精製す−る。

ビールス感染細胞は、非イオン性界面活性剤及び低張緩
衝液中溶解及び超音波処理により分解する。好適な非イ
オン性界面活性剤は約４〜約３０のオキシエチレン単位
を有し、炭素数約６〜約１５のアルキル基を有するポリ
オキシエチル化したアルキルフェノールである。この例
としては、ポリオキシエチレン（９）オクタフェノール
；約４〜３０のオキシエチレン単位及び炭素数約１２〜
約２０の脂肪酸から成るポリオキシエチレンソルビタン
脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレン（４）ソ
ルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（４）ソ
ルビタンモノステア（２０）ソルビタンモノパルミテー
ト、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエ
ート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレ
エート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリス
テアレート；炭素数約１２〜約２０の脂肪酸のポリオキ
シエチレンソルビトールエステル、混合脂肪酸及びＭＡ
　脂酸のポリオキシエチレンソルビトールエステル、ラ
オリン、ハチろう又は獣脂エステルのポリオキシエチレ
ンソルビトールエステル、例えば、ポリオキシエチレン
ソルビトールオレエート、ポリオキシエチレンアルコ−
ル獣脂、ポリオキシエチレンソルビトールラウレート、
ポリオキシエチレンソルビトールヘキサオレエート、ポ
リオキシエチレンソルビトールラノリン誘導体；約８〜
約５０オキシエチレン単位及び炭素数約１２に約２０の
脂肪酸から成るポリオキシエチレン酸例えば、ポリオキ
シエチレン（８）ラウレート、ポリオキシエチレン（８
）ステアレート、ポリオキシエチレン（２０）パルミテ
ート、ポリオキシエチレン（４０）ステアレート、ポリ
オキシエチレン（５，０）ステアレート；約２〜約２５
のオキシエチレン単位及び炭素数約１２〜約２０のアル
コールから成るポリオキシエチレンアルコール、例えは
、ポリオキキシエチレン（４）ラウリルエーテル、ポリ
オキシエチレン（６）ｔ−リゾシルエーテル、ポリオキ
シエチレン（１０）セチルエーテル、ポリオキシエチレ
ン（１０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１
０）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン（１２）
トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（１２）トリ
デシルエーテル尿素複合体、ポリオキシエチレン（１５
）トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セ
チルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエ
ーテル、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテ
ル、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル；又
はデオキシコリンである。ポリオキシエチレン（９）オ
クタフェノールが好適な界面活性剤である。

超音波処理した細胞の細胞残層は例えば低速遠心により
除去する。ビールスは上清から種々の方法で単離精製す
る。例えば、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、免
疫親和クロマトグラフィーを用いて行なう。

精製ビールスを処理して主タンパク質の単離、分離を行
なう。単離はケルからの電気溶出、カラムクロマトグラ
フィー、免疫ＸＱ　ｆｆｌクロマトクラフィーで行なう
。

３利■の主Ｉ−Ｉ　Ｖ　Ａタンパク質はアニオン（佳界
面活性剤（還元剤の存在下が望ましい）で可溶化した後
、ゲル電気泳動により、容易に分離できる。アニオン性
界（ｎｉ活性剤は例えは、デシル硫酸ナトリウム、ドデ
シル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸ナトリウムの如
き、炭素数約１０〜約２０のアルキル硫酸アルキル金属
である。還元剤は２−メルカプトエタノール又はジチオ
スレイトールである。

主要タンパク質の１つ、３３，０００タルトンのタンパ
ク質であるＶＰ−１は外表面タンパク質である他の２つ
のタンパク質よりも、１２５■が良く標識される。ＶＰ
−１のフロムシアン分解により、約２０．０００及び約
１４，０００ダルトノの２つの大きなポリペプチド断片
になる。さらにブロムシアンで分解をくり返ずと、少な
くとも４つの小断片が得られる。

ＶＰ−１を単離し、酸加水分解後アミノ酸濃度を分析す
る。以下に示すアミノ酸が含まれ、ここに記した順序で
、重量パーセントで含量が減少している。グリシン、セ
リン、グルタミン酸及び／又はグルタミン、アスパラギ
ン酸及び／又はアスパラギン、アラニン、スレオニン、
ロイシン、バリン、リジン、フロリン、フェニルアラニ
ン、アルギニン、イソロイシン、チロシン、ヒスチジン
、メチオニン。

次に示す重量パーセントでアミノ酸が存在する。

グリシン、約２０チ〜約３０％、 セリン　約９％〜約１１係、 グルタミン酸及び／又はグルタミン、 約８係〜約１０５係、 アスパラギン酸及び／又はアスパラギン、約７．２％〜
約１０％、 アラニン、　約６％〜約７，３％、 スレオニン、約４．９％〜約８．２％、ロイシン、　約
４．９％〜約７．２係、バリン、　約４チ〜約５４％、 リジン、　約３．７％〜約４．３係、 プロリン、約３．２チ〜約５．３％、 フェニルアラニン、 約３−〜約４．５％、 アルギニン、約２ｑｂ〜約４．１％、 イソロイシン、　約２チ〜約３．６％、チロシン、　約
２０チ〜約３，０％、 ヒスチジン、約１．３φ〜約１．９　％及びメチオニン
、約０．３％〜約０．９チ。

タンパク質のゲル電気泳動を用いた単離及び、分析にお
いて用いた加水分解条件に、１：り上に示すグリシンの
値は高く、メチオニンは低い値を示しポリペプチド中に
存在するシスナイン及びトリプトファンは、゛その１直
が１ＩＬＡ　Ｋイされなかった事が注目される。

ＶＰ−１のブロムシアン分）ｒｆにより、前述の如く、
少なくとも６つの断片が得られる。

これらの断片は、ＨＰＬＣ分析にエリアミノ末端からカ
ルボキシ末端の方向に、次に示す配列を含有する事が判
明した。カッコ内のアミノ残基はヌクレオチド配列より
推定した。

ＶＰ−１タンパク質において、これらの配列は、上の順
序で存在しているものと考えられる。

ＶＰ−１は例えは生理食塩水の如き生理学的に適轟な担
体中に含有せしめ、ラットの如き感受性のあるホニュウ
類に、投与肖り約５〜約１５０７ｚｆ　、好ましくは約
５〜約５０μ７を投与して中和杭木を誘発せしめ、ワク
チンとして用いる事ができる。効果的なＩ−Ｉ　Ａ　Ｖ
病の防菌には１回以上の投与が必要である。

ＨＡ　Ｖに対する単一クローン抗体を１４するために、
例えばマウス、ラットから得た、ホニュウ類肺臓細胞を
精製ＨＡＶ又はＶＰ−１でインビトロ又はインビボで免
疫化シ、ホニュウ内骨髄腫細胞株と融合する。この場合
、必ずしも肺臓細胞を得た、同種の動物のものを用いる
必要がない。得られるハイブリドーマ細胞は、ＨＡＶと
結合し、インヒドロにおける検定で示されるようなＨＡ
Ｖ感染性を中和する抗体を作り出すために、その効力で
、これを選別する。選別した混成細胞を継代培養でクロ
ーン化し、ＨＡＶに対する中和抗ｌ＼を産生ずる単一ク
ローン細胞株を得る。Ｆａｂ断片は、精製単一クローン
抗体から常法により（パパイン消化）製造し、全Ｊ−Ｉ
　Ａ　Ｖ　ＶＣ化学的に架橋する。中和午−クローン抗
（本は、架橋に続きケルで分析するとＨＡ　ＶのＶ　Ｉ
）　−Ｊにほとんど特異的に結合する。これらの単一ク
ローン抗体はＨＡ　Ｖに対する抗体の存在を測定するだ
めの迅速な検定系として月１いる・」“トができ、中和
杭内の存在を測定する小もてきる。

感染した動物又はヒトの免疫血清は変性Ｖ　Ｉ）−１と
反応せしめ、基本的なウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ　）
法又は免疫法（すなわち、ＨＡ　Ｖタンパク質のゲル分
離後、ニトロセルロース紙に移す。）で分セ１する。

以下の実施例は誘発１夕」を例／Ｊ＜シたものであり、
その記述に限定するものではない。

実施例１ 米国特許第４．１６４．５６６号中に記載の方法に基す
き、次の方法を用いてＡ型肝炎ビールスを連続、サル腎
臓細胞株中で増殖ぜしめる。

連続、サル腎臓細胞株、Ｌ　Ｌ　Ｃ−Ｍ　Ｋ　２の感染
培養物を培養２１〜２８日後２８日後培養器表面からは
がし取り遠心して細胞を集める（ｓｏｏｘｙ、４℃で１
０分間）。集めた細胞の塊りを分解緩衝液（１０ｍＭ　
トリス−１１Ｃ１、ｐＨ７，５；　１０　ｍＭ　Ｎａ（
ＩＪ　；　１．５　ｍＭ　Ｍｇα２；１％ポリオキシエ
チレン（９）オクタノーノり中に懸濁させる。８５０　
ｃｃ　のローラー容器２個の細胞塊あたり５ｄの緩衝液
を用いる。

細胞分解物を、超音波処理装置を高度（ｈｌｇｈ）にセ
ットして２０秒間超高波処理する。水浴上で、これを１
０分間インキュベートする。

再び同じセットで２０秒間超高波処理する。

次にこれをさらに２０分間水浴上でインキュベートする
。細胞破片を１０℃で２０分間１０、０００　Ｘ　ｒで
遠心して集める。上清を取す、サルコシルナトリウム（
ＳＬＳ）の２０係保存溶液を加えて、最終濃度０，５係
とする。

ビールス含有上清を３７℃で３０分間インキュベートし
、次に」−述の如く、１０秒間超音波処理する。ポリカ
ーホネート遠心管中、蔗糖液層は０．１チＳＬＳ及び１
０ｍＭ　トリス−ＩＱ！、ｐＨ７，４；　１５０　ｍＭ
Ｎａα；　１．　ＯｍＭＥＤＴＡ（ＴＮＥ）の混液中２
０％蔗糖（ＲＮａｓｅ　、無）を含有する。典型的には
、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｔ−４５ローター用の７０ｄポリカ
ーホネート管を１１」い３０　ｍｌの蔗糖液層上４０　
ｍｅのヒールス含准上清を乗せて層にする。次に４℃で
２３．０００ｒｐｍで２０時間遠ノＬ・する。

遠心後、上清を除き、ビールス塊をｉ’　Ｎ　Ｅ中０．
５％ＳＬＳ液中に懸濁する。次に上述の如＜１０秒間超
音波処理する。

ビールスを３７℃で３０分間イ：、’　キ、：Ｌ　ヘ−
トし、上述の如＜１０秒間超音波処理する。

塩化セシウム２５％〜４５％の直線勾配上にビールスを
乗せ、８℃で４０，０００　ｒｐｍにて６０時間遠心す
る。（Ｂｅｃｋｍａｎ型４５　ローター中、１０ローラ
ー容器から得たビールスに対し直線勾配液１００ｄを用
いる。塩化セシウム溶液は、ＴＮＥ及び０１％ＳＬＳ中
で製する）。

直線勾配の底か４ら２．５ｄずつ分画し、Ｒ■Ａ検定に
よりＡ型肝炎ビールス抗原の検定を行なう。１．３４ｆ
／ゴにて、感染ＨＶＡピークの局在を屈折計で決定する
。ピークの部分を合併しく　１．３３〜１．３５９　／
　ｍｌ　）、ＴＮＥ中０．１％ＳＬＳ＠液で２０倍希釈
する。Ｂｅｃ−ｋｍａｎＴ−４５０−ターで４℃、１０
時間４０、　ＯＯＯｒｐｍにて遠心する。最終ビールス
塊をＴＮＥ中０．１　％　Ｓ　Ｌ　Ｓ溶液中に溶かし、
ビールス抗原のＲＩＡ検定により濃度を決定する。

実施例２ Ａ型肝炎ビールスの放射活性標識 クロラミンＴあるいはラクトペロキシダーゼ系を用いて
、精製ＨＡＶをヨウ素化する。

このどちらの方法によっても、ＨＡ■のＶＰ−１は、Ｖ
Ｐ−２又はＶＰ−３よりも良く標識される。

実施例１に記載のＣｓα　勾配により単離したＨ　Ａ　
Ｖ　５〜２０ミクログラムを、クロラミンＴ反応におい
て、リン酸ナトリウム緩衝液（０，５Ｍ　）、１．ｏｍ
ｃｉの１２５■−ヨウ素を月］い全反応容量０．１　ｄ
中でクロラミνＴ（２５ミクログラム）と６０秒間反応
ぜしめて標識する。反応を中止するため、重”−ＩＮＩ
酸ナトリウム（４０ミクログラム／　０．１　ｍｅ　）
を加える。

架橋型デキストラン（セファデックスＧ−１００）カラ
ム（１４ｍ７！；　１．３　Ｘ　ｌ　５　ａｎ　：直径
×高さ）を用いたクロマトグラフィーにより１２５工標
識ＨＡＶを未反応１２５丁−ヨウ素から分離する。標識
ビールス粒子を含む間隙容積画分を、Ｌａｅｍｍｌｉ等
による不連続ゲル系（Ｎａｔｕｒｅ；ロンドン、２７７
：６８０−６８５．１９７０　）を用い、次の変法を用
いてドテシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電
気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ　）　を行ない分析する。す
なわち１５チアクリルアミド−３，５Ｍ尿素の分離層及
び５チアクリルアミド−３，５Ｍ尿素の重ね層を用いＨ
ＡＶ主構造タンパク質を解像する。

クーマシーブルー又は硝酸銀染色により解像した主バン
ドは分子量３３．０００　ｄ　（Ｖ　Ｐ−１）、２９，
０００　ｄ　（ＶＰ−２Ｌ　２７，０００　ｄ（ｖｐ−
３）で、はソ等量存在する。他の副バンドが時により２
８ｋｄ〜３０ｋｄ及び２４〜２６ｋｄの部位に移動して
見られさらに高分子量（６０ｋｄ　）にも発現する。Ｈ
ＡＶ主構造タンパク質はタンパク質濃度としてはソ等量
存在するが、ＶＰ−１はＶＰ−２又はＶＰ−３に比べて
、１２Ｊが良く標識される。

ＶＰ−３はＶＰ−２，１：りも標識される）。

ＨＡＶをその′＝！ま１２Ｊ−ヨウ素で放射標識するの
に用いる他の標識法は、ラクトペロキシダーゼ酵素法で
ある。本酵素は、ビールス粒子に直接侵入しないため、
表面のタンパク質のみが標識されやすい。本方法を行な
うには、１０μ２　の純ＨＡＶを凍結乾燥し、０．２Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，６）中に溶かして１０
μ７７７５μｌとする。６〜８単位の酵素活性を有する
１　００　ｔｔｆ／　のラクトペロキシダーゼを酢酸ナ
トリウム緩衝ｉ　（ｐＨ５，６）に溶かし、これを１ｍ
Ｃ４の１２５１と共にＨＡＶ溶液中に加え入れる。５０
　％　Ｈ２Ｏ２の１：３６００希釈液（水で希釈）を加
えて、反応を開始する。混合物を５分間インキュベート
し、５分間かくで更に３回Ｈ２Ｏ２（１０μｔ）を加え
る。反応を中止するため、３００μＬの、ＮａＩ　（１
０Ｔｎｇ／　ｍｌ　）を加え、標識物を架橋型アガロー
ス（セファローズＣＬ６Ｂ）カラムを用いてクロマトグ
ラフィーを行ない、放射標識ラクトペロキシダーゼ及び
遊離のヨウ素から、”ＪＩＩＡＶを分離する。標識ＨＡ
　ＶｔｓＤｓ−ｐＡａｇで分析するとこの場合でも３３
　ｋｄ　タンパク質（ＶＰ、−１）は２９又は２７　ｋ
ｄ　タンパク質よりも非常（ｌこ良＜　・漂！＋哉され
ることが明らかとなった。

これら２種の標識法は、両者共、ＶＰ、−’Ｌがビール
ス表面から得られる最も標識されやすいタンパク質であ
る事を示している。

実施例３ ビールスタンパク質の単離と定性 ３３　ｋｄ　タンパク質、ＶＰ−１はＨＡ、Ｖから以下
の如き方法により単離する。すなわち、試料用緩衝液中
（実施例２におけるＬａｅｍｍｌｉの方法による）に、
ビールスを溶かす。次に、実施例２の如く、ポリアクリ
ルアミドゲルでビールスタンパク質を個々に分離する。

電気泳動後、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等の方法（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、９１巻、２２
７〜２３６．１９８３年、アカデミツクブレス社、ニュ
ーヨーク）に従い、ゲルからＶＰ−１を単離する。

ＶＰ−１は　＋２Ｊ標識ＨＡＶを非標識ＨＡ　Ｖと共に
電気泳動し、各タンパク質の部位を決定するため、Ｘ線
フィルムにゲルを暴露する事に工り非固定ゲル中に局在
化する。

ＶＰ−１含有のゲルバンドを、かみそりの刀で切り取る
。これを１０　ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡＢ）、２．
０％ＳＤＳ、１．５ｍＭジチオスレイトール中、室温で
２時間、又は４℃で１晩インキユベートする。次に、■
５Ｃ０１７５０型濃縮（幾を用い、３ワット／試才」で
試料管中、ゲル切片及びインキュベーション緩衝液を４
〜５時間荷電してＶＰ−１を電気溶出させる。電極及び
内部チャンバー中で、５０ｍＭ　ＡＲ，０，１％ＳＤＳ
を用いる。試別の荷電、電気泳動、非荷電は、本機器の
案内書に記載の方法で行なう。電気泳動後、ｖｐ−１を
、各２４時毎に４回ｃｌＨ２０を変えて透析を行なう（
５００＄のｄＨ２０あたりｖｐ−１溶１１ｄ）。ＶＰ−
１を乾燥し、純度（ＳＤＳケル、実施例２に記載の方法
）及びアミノ酸濃度分析又はアミノ酸配列を調べる。

アミノ酸羨度はＶＰ−１を６ＭＭＣ／！で加水分解し、
Ｐｏｅ等（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８．２
２０９〜２２１６．１９８３　）　の方法、５ｐｊｅｓ
ｓ　等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ、７６．２９７４〜２９７Ｂ、１９７９　）の方法に
よりＢｅｃｋｍａｎ１２１型分析機で分析する。アミノ
酸濃度は衣■に示す。

表　１ グリシン　２８．８０　２２．３２ セリン　１０．２５　９．５８ グルタミン酸及び／又は グルタミン　９．７３　８．７３ アスパラギン酸 及び／又はアスパラギン　７．９７　９．２３アラニン
　６．３６　６．９０ スレオニン　５．２２　７．８７ ０イシン　５．２８　６．８５ バリン　４．３２　５．１７ リジン　４，１３　３．９６ プロリン　３，５４　５．０９ フエニルアラニン　３，２９　４．１６フルギニン　３
．９３　２．２６ イソロイシン　２，２５　３．３４ チロシン　２．７２　２．４１ ヒスチジン　１．４７　１．６８ メチオニン　０．７４　０．４８ アミノ酸配列の分析の場合、前実験の結果、本ビールス
タンパク質のアミン末端が保獲されている事がわかった
ので、ブロムシアンでＶＰ−１を分解する。ＶＰ−１，
１０〜４０μ７を７０係蟻酸約１ｍｅＫ溶かし、４０倍
過剰の（重量）ブロムシアンを加える。これを室７晶で
１６時間インキュベートする。分解タンパク質を、Ｈｅ
ｗｉｃｋ　等（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６．７９
９０−７９９７．１９８１　）　の方法に基すき、気−
液固相アミノ酸配列分析機で配列を分析する。次のアミ
ノ酸配列テータをそれぞれ１．ｔ）る。

この場合カッコ内に示すアミノ酸残基はヌクレオチド配
列から推定したものである。

上に示し／こ配列における、ず在わちＶｌ）−１タンパ
ク質における配列では、配列１のＶａｌで始するものと
思われる。

配列データは、ＨＡｖゲノムのＤＮＡコピーをＤＮＡ配
列分析して得られたヌクレオチド配列に対し、丸ごとの
配列分析機を用いて得たデータと比較して得る。本方法
は、当Ｃ−Ｉ−Ｐと同時に提出された、係属中のＵ。

ｓ、Ｓ、Ｎ。　、（代理人ドケット （ｄｏｃｋｅｔ　）　１７０１．１、発明者Ｌｉｎｅｍ
ｅｙｅｒ　。

Ｍｅｎｋｅ　、、　Ｍｉ　ｔｒａ　、、Ｒｅｕｂｅｎ　
、同−譲受人に譲渡、その明細書を文献として導入する
。）に記載され、特許請求の範囲中に含捷れている。

ＶＰ−１ゲノムのヌクレオチド配列を含む１−Ｉ　Ａ　
Ｖの部分的ヌクレオチド配列及び、対応する、そのアミ
ノ酸配列を以下に示す。

Ｌｃｕ　Ｌｃｕ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　八ｓｎ　ｌｌｃ　八
ｓｎ　Ａｓｎ　Ｖａｔ　Ｖａｌ　八ｒｇ　ｌｉｅ　Ｌｙ
Ｓ　ｉｔ　ｌ’Ｔｏ　ｌ’ｌｕ：　ｌｌｅ　Ｂ１Ｍ口　
Ｔｈｒ　八ｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　八ｓｐ　Ｇ
ｉｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　ｌｌｅ　ｉ’ｌ＋ｒ　Ａｌａ　
ＬｅＬＩ　ＡＩａ　ｂｃｒ　１１ＣしｙＳ１９７２　１
９９９ ＣＡＡ　ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＡＴＡ　ＡＣＡ　八ＣＴ　八
ＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡＡ
　ＧＣＣＡＡＴ　ＡＧＧ　ＧＧ八　八ＡＧＧｉｎ　Ｖａ
ｌ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＭＩｉＴ　Ｌｙ
ｓ　Ａｓ　Ｌｅｕ　Ｌ　ｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　八ｌａ　
八ｓｎ　八ｒｇ　Ｇｌｙ　１．ｙｓ１ Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｈａ　ｌ、ｙｓ　Ｌｙｓ　
Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｔ＋ｅ　Ｐｒｏ　
Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＴｈ
ｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔ１１ｒ　Ｓｅｒ　八ｓ
ｎ　Ｐｒｏ　ｌ’ｒｏ　１ｌｉｓ　Ｇｌｙ　１．ｅｕ　
Ｉ’ｒｏ　Ｓｃｒ　Ｔｈｒ　Ｌｃｕ　Ａｒｇ　ＴｒｐＰ
ｈｅ　Ｉ’ｈｅ　八ｓｎ　Ｌｅｕ　Ｉ’ｈｅ　Ｇｌｎ　
しｃｕ　Ｔｙｒ　八ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａ
ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｉｌｅ　ｌ１ｅＶａｔ
　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｉ
ｌｅ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ２４５８　２４
８５ ＧＣＣＣＴＴ　ＧＧ八　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＡＧＡ　ＴＴ
Ｔ　ＡＡＴ　ＡＣＡ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　八ＣＡ　ＧＧＧ
　ＡＡＣＡＴＴ　［：ＡＧ　ＡＴＴ　八ＧＡＡｌａ　Ｌ
ｅａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｓ
ｎ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　八ｒ１；　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓ
ｎ　ｌｌｅ　Ｇｉｎ　ｌｌｅ　Ａ＋３Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　
Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌｃｕ　Ｔｙｒ　Ａ
ｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　八ｌａ　Ｌｃｕ　八ｓ
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ｒ　八ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ
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Ａｓｎ　Ｔｙｒ　八５ｎ１１ｉｓ　Ｓｅｒ　八ｓｐ　Ｇ
ｌｕ　ｌ’ｙｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ’　ｌ’ｈｅ　Ｓｅｒ
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山＋ｆｉｕＬｅｕ　Ｓｅｒ　八ｓｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　
Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　１．ｙｓ　
ＭｌｉＴ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｃｕ　ｌ’ｌ＋ｅ　Ｓｃ
ｒ　＋ｉｌｎＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ ＨＡ　ＶはＲＮ　Ａビールスであるため、上の配列中、
デオキシチミジンホスフェートｔ　−ＲわすｒＴＪで示
したヌクレオチドは、実際には従来から「Ｕ」で示すウ
リジンホスフェートである事は理解されたい。下線及Ｏ
一番シＪ゛を付けた配列は、第３３　頁における配列番
号のアミノ酸配列にそれぞれ対応する。

実施例４ 精製、Ａ型肝炎ビールスによるマウスの免疫化実施例１
に示って得た、精製ＨＡ　Ｖを成熟Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ
マウスに腹腔内投与する。各マウスには０．５　ｍｌの
完全フロイントのアジュバントに溶かした５７１′？　
の精製ＨＡ　Ｖを投与する。ビールス感染１８日後、各
マウスの一力の眼から血清を採取する。基本的競ＨＪｐ
　Ｉ　Ａ試験（ＨＡＶＡ　Ｂ、　Ａｂｂｏｔ　）、及び
中和試験（下達）でＨＡ　Ｖに対する、抗体を検定する
。

ヒールス投与前に採取した血清を、これらの分析用基準
とする。

Ｐ　Ｉ　Ａ、　（実施例７に記載）及び中和（実施例８
に記載）の両方法で抗ＨＡＶ抗木が陽性のマウスを、細
胞融合３日前に３．５μ７　の精製ＨＡＶを尾静脈から
注入する（水性液、０．２ｄ／マウス）。細胞融合に用
いた２匹のマウスから採取した血清をＨＡＶに対する抗
１ｔ＝（ＨＡｖＡＢ、　Ａｂｂｏｔ　）及び中和活性を
検定したところ陽性を示した。

実施例５ 免疫化マウス胛臓細胞とマウス骨髄腫細胞とＨＴ培地中
凍結保存したマウス骨髄腫細胞（ＳＰ２１０）を増殖さ
せる。ＨＴ培地１００ゴ中には、６６ゴのＤｕｌｂｅｃ
ｃｏ　改良Ｅａｇｌｅ　培地：２０ｍ１の牛胎児血清（
Ｆ　ＣＳ　）　；　１０　ａｒｅのＥａｇｌｅバランス
塩を含むＮＣＴＣ１０９；２ゴの２ｍＭＬ−グルタミン
；　４０８　ｍｇのヒポキサンチン及び１１４　ｍｇの
チミジンを３００−の蒸留水に溶かした溶液１ｍ；ＯＰ
Ｉ保存液（１，ｓｙのシスオキザル酢酸、０．４Ｍ’の
ピルビン酸、２０００単位の牛イジシュリンを１００　
ｍｌ　Ｉ（２０に溶かした溶液）　１　ｍ７！；　０．
２−ｍｌのペニシリン（１０，ＯＯＯ単位／　ｍｌ　）
及びストレプトマイシン（１０，０００ｔｔ９／ｍｌ　
）混合物を含有する。Ｈ’Ａ　Ｖ　（実施例４）で免疫
化したマウス胛臓を断頭後に取り、室温で無血清ＨＴ培
地中に入れる。胛臓をプラスチック製ペトリ皿に入れ、
プラスチック製スクラツパーで、胛臓をけずり落してば
らばらの細胞にする。皿を５ゴの無血清ＨＴ培地で洗浄
し、１５ｍ７！のプラスチック製コニカル管中に入れる
。大粒子を沈ませ、上清を１５ｍ１．のプラスチック製
丸底管に移す。１０分間、室温で３５０Ｘｆにて遠心し
、細胞を集める。上清を除き、無血ＷＴ　ＩＩＴ　Ｊｐ
地（］−’　Ｏｍｅ　／　２個の貯庫）中に懸濁させる
。トリパンブルー処理により、全細胞が生育し得るかど
うかを決定する。

生育可能な５Ｐ２１０骨髄腫細胞を決定し、この細胞数
よりもｌ　ｌｏｇ多い肺臓細胞を用いて混合する（すな
わち、２×１０８個の肺臓細胞に対し、２×ｌＯ７個の
５Ｐ２１０細胞を用いる。）。細胞混合物を３５０Ｘｉ
ｉ’で１０分間遠心して細胞を集め、１０ｍ１の無血清
１１Ｔ培地中に懸濁させる。これら遠心による細胞収集
−懸濁−洗浄の操作を更に２回くり返す二最終的に１０
ｍ７！の無血清ＨＴ培地に懸濁した後、１５ｍの丸底管
に入れ、３５０×７で１０分間遠心して細胞を集める。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：平均分子量＝１００
０ｄ）を４５℃で液化し、無血清ＨＴ培地と混合し３５
％ＰＥＧ濃度にする（　Ｖ／Ｖ　）。ＰＥＧ／ＨＴ培地
混合物を３ｍｌシリンジの先端に付けた０、２２ミクロ
ンの膜フィルターを通して滅菌する。次にＰＥＧを３７
℃に保つ。ＰＥＧ／培地混合物中にジメチルスルホキサ
イド（ＤＭＳＯ）を加え、最終濃度５％にする。ＰＦＪ
Ｇ／ＤＭＳＯ／ＨＴ培地混合物を牌細胞ペレットに２Ｘ
１０８細胞あたり０．８−になるよう滴下し、培養管壁
をかるくたたき、ゆすって細胞を懸濁させる。

細胞の接触時間を６分間となるようにして、２５０×２
にて室温で遠心する。・ＰＥＧ上清を吸引して取り除き
、１０ｍｅのＩ−Ｉ　Ｔ培地中に懸濁する。３５０Ｘｌ
、１０分間遠心して細胞を採取し、■■Ｔ培地中にて、
ゆっくり懸濁させ、最終濃度を３．５ＸｌＯ’骨髄腫細
胞／蔵とする。細胞を、ピペットをハ］いて９６個の井
戸型ミクロ力価板中に０．１　ｍ７！／板濃度で入れ、
水−包被ＣＯ２インキュベーター中、５％ＣＯ２，９６
％湿度にて、インキュベートする。

２４時間後、各井戸型板に、０．１　ｍｌのＪ−Ｉ　Ａ
　Ｔ培地（Ｈ’］’培地ＶＣ０，３５２ｍｆ／リットｊ
Ｌ　ｄＡ度でアミノプテリンを加えたもの）を加える。

井戸型力価板に、０１ゴの新しいＨＡ　Ｔ培地を４〜５
日４Ｕ入れる。

１５条以」−（一般には４０〜８０％）の細胞接合度の
細胞を用いて、ＨＡＶに対する抗体産生を、単一クロー
ンＲＩＡ及び中和検定により調べる。（実施例７及び８
に記載）。

上述検定法により高い活性を示す細胞を、２期期の限定
希釈で継代クローン化する。強いＨＡ　Ｖ結合性及び中
和活性を持つ４継代クローンを得る。これら継代クロー
ンから得られた精製単一クローン抗体について常法によ
り、亜型イムノグロブリン及び分子量を調べ、以下の結
果を得た。

Ａ　ＩｇＧ−２ａ　４９，０００　２７，０００Ｂ　Ｉ
ｇＧ−１４９，０００２７，０００ＣＩｇＧ−２ａ　４
９，０００　２７，０００Ｄ　ＩｇＧ−２ａ　４９，０
００　２７，０００実施例６ 組織培養培地から得られる単一クローン抗体の不肖製 架橋実験、標識ＨＡＶの免疫沈殿及びビールス上の中和
部位を決定するための他の実験に用いられる単一クロー
ン杭木は個々の抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞の増
殖培養液で精製する。用いた方法は以下に示すとうりで
あるが、本質的には、Ｅｍｉｎｉ等の方法（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、４３−１９９７−１００５．１９８２　）
に従った。

特定のハイブリドーマ細胞株の培養液２す′ノトルをｗ
ｈａｔｍａｎｎ　４Ｍｆ−１紙、グラスウールカラム、
アカロース（セファロース６Ｂ）カラムをそれぞれ通過
してΔコ過する。組織培養液を１００ｍＭ１−リス−Ｈ
α、ｐ１１８を加えテｐＨ８，０にする。次にタンパク
質入−セファローズカラム（２リツトルの培養液に対し
４〜６ゴの層容量）を通過させる。１０層容量の１００
ｍＭ　トリス−■］α（ｐＨ８，０）でカラムを洗浄す
る。次にグリシン（１００ｍＭ　）ｐＨ３，０を加えて
結合イムノグロブリンをカラムから流出させる。抗体を
安定化さぜるため、グリシンの酸性側ｐＨを高いｐＨに
変えるように容管の中に１００　ｍＭのトリス−ｆＩｃ
Ｊ！　（＋）ＩＩ８．０）を入れて分画する。カラムか
ら流出するタンパク質ピーク画分を集め、蒸留水で透析
する。これを全抗体として用いるか、Ｆａｂ断片を得る
ために更に処理する。

各単一クローン抗体のＦａｂ断片を得るため上述の如く
タンパク質Ａカラムを用いて精製した１０〜１５■の抗
体を、凍結乾燥し、１００　ｍＭ　リン酸ナトリウム、
１０ｍＭシスティン、ｐＨ７，２（２ｍｌ／　２　Ｑｍ
ｇ抗体）中に溶かす。パパイン（１０〜１５単位／ｍｇ
）を抗体に対して重量で１：１００の比で加える。

これを３７℃で１晩（１６時間）インキュベートスる。

ヨウドアセトアミドを加え最終濃度３０　ｍＭにして反
応を中止する。消化杭木を架橋デキストラン（セファデ
ックスＧ−７５）カラム（２，５Ｘ　２０ｃｍ、直径×
高さ）を用い４℃でクロマトグラフィーを行なう。

両分は存在するタンパク質の測定として２８０ｎｍにお
ける吸光度でチェックする。大多数のＦａｂ　断片を含
む第２ピークの両分を集める。タンパク質入−セファロ
ーズカラムを通過させ、タンパク質Ａカラムに結合する
Ｆｃ断片又は、未消化抗体を除く。タンパク質Ａカラム
から得られるＦａｂ断片のピーク画分を集め、蒸留水で
透析する。これを凍結乾燥し２００μ２ずつ一８０℃で
保存する。

実施例７ Ａ型肝炎ビールスに対する抗体検定のためのラジオイム
ノアッセイ この検定のため、ヤキ抗−マウスイムノグロブリン（’
ＩｇＧ）又はヤキ抗−ラットＬｇＧを用いてＨＡＶに対
するマウス又はラット抗体を検定するため、直径０．６
爺のポリスチレンピースを抗血清でコーチングする。コ
ーチングは次の如く行なう。すなわち抗血清を生理的食
塩水中、少なくとも１：４００（１：１０００−＊で）
に希釈する。室温で１晩ヒーズをインキュベートし蒸留
水で４回洗浄し、風乾した後−２０℃に保存する。

検定のため、１０〜２０ｔｔｌの各血清（実施例４にお
けるＨ　Ａ　Ｖで免疫化したマウスから得る）又は単一
クローン組織培養液（実施例５より得る）を、１％ＢＳ
Ａ（牛Ｊｆ＋＋清アルブミン）及び０．０２　％のナト
リウムアジドを含むＰＢＳ　（リン酸緩衝化生理食塩水
）で０、２　ｍｌに希釈する。これを、プラスチック製
反応皿中の井戸型力価板中に入れる。ヤギ抗−マウスＩ
ｇ　でコーチングしたピースを、各力価板中に１つずつ
入れ検定血清と３７℃で２時間インキュベートする。

３〜５ゴの水で３回洗浄し、０２ゴのＨＡＶ（実施例１
の方法で得る）をＰ　Ｂ　Ｓ　（１％ＢＳＡ及び０．０
２　％ナトリウムアンドを含む）で５０ナノグラム／ｄ
に希釈し、各力価板に入れ室温で１晩インキユベートす
る。ヒースを再び、５ゴの水で３回洗浄する。ＨＡＶに
対する１２５１抗本（ＨＡ　Ｖ　Ａ　Ｂ、　Ａｂｂｏｔ
ｔ　）（０，２ｄ）を加え、３７℃で２時間インキュベ
ートする。上述の如くピースを洗浄し、カンマカウンタ
ーで１分／試料で測定する。

陽性の基準は中和検定及びＩ−Ｉ　Ａ　Ｖ　Ａ　Ｂ検定
でＨＡＶに対する抗体が陽性を示したＨ　Ａ　Ｖ−免疫
化ラット又はマウス血清である。陽性の基準は、ＰＢＳ
のみ又は陽性血清に利用した動物の、あらかじめ免疫化
した血清である。

各検定血清又は単一クローン抗体は、、ｅｐｍの値が陽
性基準の平均よりも標準偏差が５以上の場合は陽性とす
る。

必要ならば、ヒースは、ＨＡＶに加える前に抗−ＨＡ　
Ｖ単一クローン抗体で直接コーチングする事ができ、ヤ
キ抗−マウス又はラット抗体層をイマ１けるのを除く事
ができる。

実施例８ Ａ型肝炎ヒールスの中和検定 Ｅ　Ｍ　Ｆ２Ｍ　（Ｉｉ：ａｇｌｃ最少必須培地）に１
．０　％ＦＣ８を加えた培地を用い、９６個の井戸型力
価板中に、凍結保存した新生サル腎臓（ＮＢＣｍＫ　）
細胞を１×１０４細胞／力価板濃度で、ＣＯ２−水包被
インキュベーター中３５℃、湿気下５％Ｃ０２にて５〜
７日間培養して８０〜９０％細胞接合度にする。Ｌ　Ｌ
　Ｃ−ＭＫ−２（サル腎臓連続細胞株）もＨＡ　Ｖ増殖
、中和検定に用いるが、ビールス増殖を決定するインキ
ュベート時間は長い（ＮＢＣｍｋ細胞が６〜８日である
のに対して１０〜１４日である）。

検定に用いる保存ビールスは、検定に用いる細胞（ずな
わちＮＢＣｍｋ細胞中の保存ＮＢＣｍｋヒールスのみ）
中で、あらかじめ増殖させる。前述の方法（米国特許４
，１６４，５６６）で製造した未処理保存ＨＡＶを、こ
れらの検定に用いる事ができるが、中和抗体活性の、よ
り高い力価が界面活性剤ＳＬＳで処理しだＨＡＶで決定
できる。この方法を行なうには２０％Ｓ　Ｌ　Ｓ保存溶
液を保存ＨＡＶに加え１最終濃度０．１％とし、ビール
スを中力混合して３７℃で６０分インキュベートする。

ビールスを４リツトルのＰＢＳで３回換えて、３６時間
かけて透析し４ｄとする。次にビールス溶液を、透析膜
中から取り出しｆ過滅菌して、少量ずつ（０，３〜０．
５−）−２０℃で保存する。

中和検定を行なう日、保存ビールスを希釈して、数個の
５又は１０倍希釈物とする（希釈にはＥＭＥＭ培地を用
いる尤単−クローン抗体を含む血清又は組織培養液を小
プラスチック管又はミクロ力価板中の１１八■希釈物中
に入れる。一般に各ビールス０．１　ｍｅずつ入れた中
に、血清を１：４〜１：２００の割合で加える。（超免
疫性動物血清では、更に希釈の割合を多くする）。ビー
ルスと抗血清を混合し、室温で６０分インキュベートす
る。

培養液を吸引して除き、検定細胞にあらかじめインキュ
ベートしたビールス−１九本混合物を、各希釈物に対し
、別々のミクロピペットチップを用いて加え、汚染を防
ぐ。細胞の入った力価板を台の上で、室温で３０分間ゆ
すり、３５℃で３０分静置培養する。培養液を吸引して
除き、０５％ＦＣ８，２ｍＭクルタミン、５０単位／　
ｍｌのペニシリン、５０ミクログラム／　ｍｌのストレ
プトマイシンを含イイするＥＭＥＭを加える（０２５ゴ
／力価板、９６個）。

次に細胞をＣＯ２水包被イラインキュベーター中℃でイ
ンキュベートする。ＨＡＶで感染後５日日に吸引して培
養液を除き、上述の牛胎児血清、グルタミン、ペニシリ
ン、ストレプトマイシン含有の新しいＥＭＥＭに換える
。

ＮＢＣｍｋ細胞感染後７日染抜び日日Ｌ’Ｃ−ＭＫ−２
細胞１０〜１４日目に細胞を固定する。この方法は以下
の如く行なう。すなわち培養液を吸引して除き、細胞を
０．２ｍｌ＋７）ＰＢＳ／洗浄／力価板力価っくり洗浄
する。アセトンを２ＱＯμｔ／力価板、加えて細胞を固
定する。アセトンと細胞の接触時間が６０秒以下となる
よう、すばやく吸引して除く。板を風乾し全アセトンを
除く。

ＨＡ　Ｖに対する１２５ニー標識抗咋（ＨＡＶＡＢ。

Ａｂｂｏｔｔ　）　を０．０４０　ｍ１２’／力価板（
約０．１５マイクロキユ一リー／力価板）ずっ各力価板
に加える。板を振動台上６０分、室温でインキュベート
し、次に３５℃で３時間静置する。

＋２Ｊ抗血清を吸引して取り、０．３ゴのＰＥＳ　／力
価板／洗浄で３回力価板を洗浄する。次に板を、ゆるや
かな流動水で１０回洗浄する。

板を風乾又はオーフン中ですばやく乾燥抜根を増感Ｘ−
線フイルムに感光させる。感光は一７０℃で１０時間〜
３日間行なう。

゛基準は１）　１２Ｊ抗体によりハックグラウンド標識
した非感染細胞、２）ビールスの力価を決定するだめ抗
血清又は単一クローン組織培養液を加えないビールス希
釈物、３）前述のＨＡＶに対する中和抗血清に対しそれ
ぞれ陰性及び陽性で示した、マウス、ラット、キヌサル
、又はチンパンジーの感染前及び後の血清である。

血清又は単一クローン抗体の中和力価を決定するため、
非感染細胞の標識に対するビールス希釈物の放射標識（
Ｘ−線フィルムの黒化度）を比較して非処理ビールスの
力価を最初に決定する。次にＡ型肝炎ビールスを増殖阻
害する最高抗体希釈物（又は、より少ない生産抗原／力
価板）はＡ型肝炎ビールスに検定血清を加えた力価板を
ビールスのみで増殖゛させたものと比べて決定する。増
殖阻害の正確な割合を決定するため、可視又はデンシト
メーターを用いて放射活性フィルムを測定する。

Ｉ−Ｉ　Ａ　Ｖ免疫化宿主の単一クローン抗体及び血清
は、前述の検定法によりビールス中和活性がある事を示
した。

実施例９ ＨＡ　Ｖに対する単一クローン抗体の架橋ＨＡＶに対す
る中和単一クローン抗体は、Ｅｍｉｎｉ等の方法（Ｊ、
　Ｖｉｒｏｌ、旦、９９７−１００５゜１９８２　）　
を多少変更し、異種−１基作用性架橋剤、トルエン−２
，４−ジイソシアネート（ＴＤＩ）を用いてビールスに
架橋する。単一クローン抗体の乾燥断片にリン酸ナトリ
ウム緩衝液を加え、一般には、最終濃度０５μｆ　／Ｉ
ｔｌにする。ＴＤＩを加工、１．１　ｔｔｌ　／　２０
０　μｉの抗１；ｌ、：を加える。次に抗体−Ｆ”ａｂ
断片をＴＤＩと４℃又は室温でインキュベートする。棹
々の時間、（一般に１０分以下）に一部を取り反応を中
止し、これを０℃で１０分間インキュベートするとＴＤ
Ｉが固形化する。

２、０００　Ｘ　ｆで０℃にて遠心し固形化ＴＤＩヲ除
く。０℃でのインキュベートと遠心をくり返す。最終の
上清を取りＨＡ　Ｖを加える。

ＨＡ　Ｖは非標識ビールス（３〜５μ７／反応）として
、又は１２５■標識ＨＡ　Ｖ　（反応あたり、５０．０
００〜７０，０００ｃｐｍ）として、あるいは３５Ｓ標
識ＨＡ　Ｖ　（３，０００〜７．０００ｃｐｍ）として
加える。ビールスを抗（Ａ、と室？ｉ’ｌｌ！て３０分
間インキュベートする。

室温、１０分間で、飽和第：３リン酸塩緩Ｉｉｉ液を加
え、ｐＨ９，６にする。次に飽和第１リン酸塩緩衝液を
加えて、ｐｌ＋　７．　Ｑにする。次に試別をｄｌ−１
２０で透析（氷を３回換える）する。

各試別を凍結乾燥し、実施例２の如くポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動する。電気泳動後、クーマシーフルー
（ｆ（−２５０，５０％メタノール溶液中０．２　％　
’）でゲルを；−３０分間染・色する。次に１５％メタ
ノール、５％酢酸にて脱色する。ゲルを乾燥させＸ−線
フイルムに、種々の時間で感光させる。個々のタンパク
質に対する架橋度を調べるため、Ｘ−線フイルムのデン
シトメーターによる追跡（トレース）を行ない種々のビ
ールスピークを定量する。非放射活性ＨＡＶの場合は、
ゲル自体を走査し、乾燥する。単一クローン抗体を１２
Ｊ標識ＨＡＶに、４℃又は室温で架橋させる。両温度で
抗体は、２８〜２９　ｋｄ　のｖｐ−２，２７ｋｄ　の
ＶＰ−３Ｊ：りも、３３　ｋｄのＶＰ−１に多く架橋す
る。

実施例１０ Ａ型肝炎ビールスタンパク質に対する抗体の免疫検定 ＨＡＶに対する抗体の免疫検定は、ウサギ又はマウス血
清を決定するだめの、それぞれヤギ抗−ウサギ：ワサビ
ペロキシダーゼ（Ｇ　Ａ　Ｒ−ＨＲＰ　）又はヤギ抗−
マウス：ワサとペロキシダーゼ（ｃＡＭ、−ＨＲＰ）を
用いた、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ社の
免疫検定キットに伺いでいる使用説明書に従いこれを行
なう。本質的にはＩＩ　Ａ　Ｖを実施例２における如く
ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。

次に１．Ｉ（ｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　ＴＥ４２転移機を用い、ニトロセ
ルロース膜（キット）に転移させる。転移緩衝液は］　
ＯＯｍＭヒトス、１６ｍＭ　クリシン、２０％メタノー
ルを含有し、この場合平均６０ホルトで４時間かけて転
移させる。次にニトロセルロース膜を、トリス緩衝化生
理食塩水（ＴＢＳ）（２０ｍＭ　トリス−ＨＬＪ　、　
ｐＨ７，５；　５００　ｍＭＮａα）中３％ゼラチンで
Ｂｉｏ−Ｒａｄ使用説明書の如く被覆する。ニトロセル
ロース膜を、犀−クローン組織培養液に］：５〜１：２
５及びヒト、チンパンジー、キヌサル、マウス、ウサギ
、ラット、モルモットのＨＡ　Ｖによる感染前及び後の
血清１：１００〜１：’＋００の範囲の希釈液中１晩イ
ンキュベートする。

インキュベート後、膜をｄｉ−１，０で洗浄し、次にＴ
　Ｔ　Ｂ　Ｓ　（０，０５％のポリオキシエチレン（２
０）ソルビタンモノラウレートを含ムＴＢｓ）でそれぞ
れ１０分間、２回洗浄する。

チンパンジー、キヌザル、ヒトの血清試料を１：２００
０〜１：３０００に希釈したウサギ抗−ヒト血清と１時
間インキュベートする。

上述の如く、洗浄後、全試料を最終指標抗体：ウサギ血
清を含む第２抗体中で洗浄したものに対するＧ　Ａ　Ｒ
−Ｊ−Ｉ　ＲＰ又は、マウス血清を含むものに対するＣ
ＡＭ−ＨＲＰ、にてインキュベートする。室温で２時間
インキュベート後、ニトロセルローズ膜を洗浄し、着色
剤を１３ｉｏ−Ｒａｄ説明書の如く加えて、特異的ＨＡ
Ｖタンパク質に対する反応抗体を現像する。

感染後のチンパンジー抗血清は主としてＶＰ−１と反応
し、ＶＰ−２、ＶＰ−３との反応性は低い。感染前チン
パンジー血清の非特異的応答性は第２抗体（ウサギ抗−
ヒト）の低希釈物を用いた場合に顕著であり、等量で存
在する全てのタンパク質で検知されるが、高希釈物（１
：３０００）では検知できない。

キヌザル感染後血清はＶＰ−１及びＶＰ−２と強く反応
するが、ＶＰ−３とは反応性が弱い。感染前血清は、ど
のタンパク質とも反応しない。ヒトの感染前及び後の血
７１１゛はキヌサルの場合と似ている。ＨＡＶ投与マウ
ス又はウサギ血清は主としてＶＰ−１と反応しｖｐ−２
、ＶＰ−３との反応性は低い。

実施例１１ Ａ型肝炎ビールスに対する抗体の改良型競＜工＋検定 ＨＡＶに対する抗体測定用の市販キット（ＨＡ　ＶＡ　
Ｂ、　Ａｂｂｏｔｔ　）を用いた方法及び試薬を使用し
て、以下の如く改良して本検定を行なう。組織培養液（
混成腫瘍細胞より得る）又は検定を行なう血清、１００
マイクロリツトルを２０個の井戸型ミクロ力価板に加え
る。１００マイクロリツトルより少なく用いる場合、１
　ｙｎｇ　／　ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ含有ＰＢＳを加えて全
量１００マイクロリツトルにする。各力側板に、ＨＡ　
Ｖに対する１２！ｌ　ｌヒト抗体（１−Ｉ　ＡＶ　Ａ　
Ｂ、、Ａｂｂｏｔｔ　）又は実施例１３に記載の方法で
製造した１２５Ｉ単一クロ一ン抗体を加える。）（ＡＶ
に結合するポリスチレンビーズを各力価板に加える。ミ
クロ力価板を振とう台上、３０分間インキュベートし、
室温で１晩静置する。検定血清又は培養液、競争標識抗
体を吸引して取り、ビーズを２ゴの蒸留水で３回洗浄す
る。これをガンマカウンター（１分測定／試料）で測定
する。基準は、陽性及び陰性ヒト血清（ｉＩＡ　Ｖ　ｐ
、　Ｂ、　Ａｂｂｏｔｔ　）及び検定血清又は単一クロ
ーン杭木が陽性かどうかを決定するための試料であり、
陰性及び陽性血清のｃｐｍ　を合計し２で割る。

改良競争検定を、動物（マウス、キヌザル、チンパンジ
ー）の感染前及び後の血清で行なう場合、感染前を陰性
、感染後を陽性として区別するのが容易である。単一ク
ローン組織培養液を検定に用いる場合、単一クローン抗
体のいくつかは、全てではないが、ＨＡｖに対する１２
５■標識ヒト抗日・と競トｉ１する。実施例５のＡ、Ｃ
，Ｄを含む陽性Ｊ、ｌ’ｌ−クローン抗体はＨＡＶに対
する１２５■抗本と競争する。これらの単一クローン抗
体を２種混合する場合（全検定量１００マイクロリット
ルを用いる）、併用した単一クローン杭木のあるものは
互いに補体となり結果として、競争反応が大きくなるが
、他の併用の場合、同じ程度の競９１が起きるのみであ
る。２種を混合して増強した単一クローン杭木は明らか
にＩ−Ｉ　Ａ　Ｖの２種の異なる部位に結合するが、増
強されないものは、ビールス上の同−又は類似部位に結
合する。

単一クローン抗体の１つを１２′■で標識し、競争検定
に競ｑ１抗木として用いる場合、このような検定系によ
り、ＨＡＶに対する陽性及び陰性血清への異なった結合
量を容易に決定できる。このような分析において、ＨＡ
Ｖに対する、種々の量のヒト陽性及び陰性ヒト血清（Ｈ
ＡＶＡ’ＢＸＡｂｂｏｔｔ　）及びマウス、チンパンジ
ー、キヌザルの感染前及び後の血清を上述の如くミクロ
力価板に加え、１００マイクロリツトルの１２５Ｉ標識
単一クロ一ン抗体を加えて、ＨＡｖコーチングしたポリ
スチレンビーズへの結合を競争させる。本検定は陽性及
び陰性血清の結合における差異を決定する事ができ　＋
２Ｊ標識抗体が中和抗体である事実は、競争する検定血
清中の抗体が、同じ中和部位又は単一クローン抗体が結
合する部位にも結合する事を示している。このようにＨ
ＡＶにおける少なくとも１個の中和部位に対する単一ク
ローン抗体である　＋２Ｊ標識中和単一クロ一ン抗体を
用いた競争検定は検定血清中の防御抗体又は中和抗体の
存在を決定する迅速な検定法である。これに対して多ク
ローン抗−ＨＡ　Ｖ抗体を用いる市販の抗ＨＡ■抗体決
定法においてはＨＡ　Ｖの中和部位と反応するという証
拠は無い。

実施例１２ Ａ型肝炎ビールスに対するハイブリドーマ産生、単一ク
ローン抗体を投１ｊシだ動物から得る腹水 若い成熟ＦだＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスに、ハイブリド
ーマ細胞を腹腔内に０．５　ｍｌ！注入する前に２〜５
週間飼育する。ハイフリドーマ細胞をＥＭＥＭ中希釈し
、約１ｍ７！容昂で１０６〜１０７細胞数／マウス、投
与する。ハイブリドーマ細胞の増殖は、腹水としての増
殖に対して、かなり変化さぜる事ができるが、典型的に
は腹腔に針を入れて、１０〜１４日後に腹水を取る。腹
水は、使用時１で４℃で保存する。

実施例１３ 単一クローン抗体の放射活性標識 実施例１２で得られた腹水から以下のようにして単一ク
ローン抗体を鞘製する。すなわチ、硫酸アンモニウムを
４℃で加えて、２０２ミリグラム／−濃度にし、抗体を
沈殿させる。

これを１０．０００　Ｘ　ｆで１５分遠心して集めＰＢ
Ｓ中に溶かす。Ａ−２５カラムを通ノ尚させてＱ　Ｉｇ
Ｍ及びＩｇＡ　を除く。間隙容積には１〜２のタンパク
質画分のピークを示す。

ＰＭ−１０フイルターを有するＡｍ１ｃｏｎ　濃縮系を
用い、４℃で濃縮してタンパク質濃度１〜２　”？　／
　ｍｌとする。あるいは単一クローン抗体は、実施例６
の如く組織培養液から精製する。

精製抗体物をヨウ素化するために、０．５Ｍりん酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７，２５）中に１０〜１５１ｔｆ　
のタンパク質をガラス管中で溶かず。１ミリキユーリー
の１２Ｊ−ヨウ素を１０μを中に加える。クロラミンＴ
を０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２５）　
１　ｍｌ中２、５　ｍｇの保存溶液から２５１ｔＶ　を
取って加え、ヨウ素化を開始する。２０秒後、４０マイ
クログラムの重亜硫酸ナトリウムを加えて反応を中止す
る。３００マイクロリツトルのＮａ■を１０マイクログ
ラム／　ｍｅ濃度で反応管に加える。全反応物を１４ｍ
１のセファデックスＧ１００カラム（１，３Ｘ　１５　
ｃｍ　：直径×高さ）の上に乗せる。０．０２％ナトリ
ウムアジドを含むＰＢＳを用いてクロマトグラフィーを
行なう。＋２５　（（聖職タンパクＴ１を含む両分を取
り、１ｍｇ／ｍ１ＢｓＡ、０．０２％ナトリウムアジド
を含むＰＢＳで、５０．０００　ｃｐｍ／　１０　ｔｈ
ｌに希釈する。

実施例１４ ＶＰ−１から得られるサブユニットワクチンによる動物
の免疫化 実施例３で得られる単離ｖｐ−１を成熟し６ｗ１ｓラツ
トに３回に分けて投与する。第１の動物群には０．７３
．８３日に投１５．　ｌ、第２の群には０．１６．７０
日に投与する。第１回目の投＋−７ｉｌ′ｉ（ｏ日）、
０．　”、）　１ｎ７！の１１２０．０．５Ｈの完全フ
ロイントのアジュバント中に約ｌＯ〜１５μ７　のＶＰ
−１を含イ］ぜしめ、１、０　ｍｌを皮下注入する。第
２回目の投１ｊ（７３、又は１６日）及び第３回目の投
与（８９又は７０日）は０．５　ｒｄ　Ｊ（２０、Ｏ，
’　５　ｒｒｄ完全フロイントのアジュバント巾約１５
μ７　のＶＰ−１／投Ｌ５．　／動物を腹腔内投与する
。

ＶＰ−１の最終投与後、１０〜１４日、２１日、２８日
、数週間に血清を採取する。

これを実施例８の方法でＨＡＶ感染の中和度を検定する
。これらの１ｎ冒１〒ば、ＩＩＡＶの中和抗体の存在が
陽性であった。

出願人　メルク　エンド　カムパニー インコーボレーテツド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ａ型肝炎ビールスに対する中和抗体とタンパク質と
   が反応し、そのタンパク質が、酸加水分解及びゲル電気
   泳動後、グリシン、セリン、グルタミン酸及び／又はグ
   ルタミン、アスパラキン酸及び／又はアスパラギン、ア
   ラニン、スレオニン、ロイシン、バリン、リジン、プロ
   リン、フェニルアラニン、アルギニン、イソロイシン、
   チロシン、ヒスチジン及びメチオニンを上に示す順にそ
   の含有重量パーセントが少なくなるような割合で含有す
   る、分子量約３３．０００ダルトンのＡ型肝炎ビールス
   表面タンパク質。 ２、　酸加水分解及び電気泳動後、アミノ酸が、はソ次
   の割合（重量）； グリシン、約２１チ〜約３０チ、 セリン　、約　９％〜約１１％ グルタミン酸及び／又はグルタミン、 約８チ〜約１０５チ、 アスパラギン酸及び／又はアスパラキン、約７．２％〜
   約ＪＯ係、 アラニン、約６係〜約７３％、 スレオニン、約４９チ〜約８２係、 ロイシン、約４．９％〜約７．２係、 バリン、　約４％〜約５．４係、 リジン、　約３７チ〜約４．３チ、 プロリン、約３．２係〜約５．３係、 フェニルアラニン、 約３係〜約４５係、 アルギニン、　約２チ〜約４１係、 イソロイシン、約２チ〜約３．６係、 チロシン、約２０係〜約３０係、 ヒスチジン、　約１．３係〜約１９係及びメチオニン、
   　約０．３チ〜約０９係 で存在する特許請求の範囲第１項のＡ型、′１１炎ビー
   ルス表面タンパク質。 、　ペプチドのアミノ末端からカルボキシ未端の方向に
   アミノ酸配列が、以下に示す群、すなわち、 Ｉ　Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｇｌｙ
   −Ｇｌｙ−Ｐｈｅ　−，５ｅ？−Ｔｈｒ−Ｔｈγ ｕ　Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ
   −Ｌｙｓ−Ａｌａ　−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌ！Ｉ
   ’５ １１Ｊ　Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖ
   ａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａ
   ｌａ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ７１１ｅ　−Ｇｌｕ−Ａ
   ｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
   ｓ　−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−ＰｈｅＩＶ　
   Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−８ｅｒ−Ｈｉ３−Ｐｈｅ−Ｌ
   ｅｕ−Ｃｙｓ　−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａ
   ｓｎ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｑｌｕ−Ｔｙ
   ｒ Ｖ　Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
   −Ｖａｌ−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｔ−ＡＳｐ
   −Ｔｈｒ−Ｐｒ。 のうちの１個以上を含む特許請求の範囲第１項の：Ａ型
   肝炎ビールスの表面タンパク質。 ４、ａ）アニオン性界面活性剤及び還元剤を含有する溶
   液中にＡ型肝炎ビールスを溶かす； ｂ）ビールスタンパク質を分離する； Ｃ）分子量約３３．０００ダルトン２のビールスタンパ
   ク質を取る； 以上の操作を特徴とする特許請求の範囲第１項の野面タ
   ンパク質の単離法。 ５、アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムで
   ある特許請求の範囲第４項の方法。 ６、　還元剤が２−メルカプトエタノールである特許請
   求の範囲第４項の方法。 ７、　ビールスタンパク質の分離をケル電気泳動で行な
   う、特許請求の範囲第４項の方法。 ８　ホニュウ類骨髄腫細胞に、Ａ型肝炎ビールスで免疫
   化したホニュウ類肺臓細胞を融合して製造したハイブリ
   ドーマ細胞。 ９　免疫化肺臓細胞が、Ａ型肝炎ビールス又は、そのタ
   ンパク質サブユニットをインヒポで、ホニュウ類に注入
   して得る、特許請求の範囲第８項のハイフリドーマ細胞
   。 １０、ホニュウ類肺臓細胞を、Ａ型肝炎ビールス又はそ
   のタンパク質サブユニットでインビトロにて、感作せし
   めて、免疫肺臓細胞を得る特許請求の範囲第８項のハイ
   ブリドーマ細胞。 １１、ホニュウ類細胞がマウス由来である特許請求の範
   囲第８項のハイフリドーマ細胞。 １２、分子量約１５０．０００ダルトンを有し、亜型Ｉ
   ｇＧ−１又はＩｇＱ−２ａ　である、Ａ型肝炎ヒールス
   に対する実質的に純粋な単一クローン抗体。 １３、　特許請求の範囲第８項のハイブリドーマ細胞に
   より製造される、Ａ型肝炎ビールスに対する、単一クロ
   ーン抗体。 １４、　９面が、Ａ型肝炎ビールスに対する単一クロー
   ン抗体の内層に合着し、内層が、Ａ型肝炎ビールスの外
   層に合着している事を特徴とする検査薬。 １５、単一クローン抗体の内層がヤギの抗マウス抗体の
   最内部層に合着している特許請求の範囲第１４項の検査
   薬。 １６　特許請求の範囲第１２項の１２５１標識［１，。 クローン抗体。 １７、”Ｊ標識単一／７　ローンＨＡ　Ｖ又はｖｐ−１
   抗体を、特許請求の範囲第１４項の検査薬に加える事を
   特徴とする試料の、、ＨＡＶ中和抗体力価を決定するだ
   めの競ゴｊ検定法。 １８１２’Ｉ標識ルークローンＨＡ　Ｖ又はｖｐ−１抗
   咋を特許請求の範囲第１５項の検査薬に加える事を特徴
   とする試着のＨＡ　Ｖ中第１１抗（２１辺力価を決定す
   るための競争検定法。 １９、ホニュウ類に、効果的な量の、特＊ｌ’　請求の
   範囲第３項のタンパク質を投与し、Ａ型肝炎ヒールス又
   はそのタンパク質すフユニットに対する中和抗体を産生
   せしめる方法。 ２０　特許請求の範囲第３項のタンパク質を、効果的な
   量、含有する薬剤担体をｌｊ徴とする治療組成物。 ２１、以下に示す配列；すなわち、 Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ １ 八ｒｙ、Ｇｌｙ　Ｖａｔ （上記配列中、Ｘは未知、ＡはＧｔｎ又はＧＡｕ　）を
   有する特許請求の範囲第１項のＡ型肝炎ビールス表面タ
   ンパク質。