CN106047808A - 经修饰的自然杀伤t细胞、医药组合物和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供经修饰的自然杀伤T(NKT)细胞，包含所述经修饰的NKT细胞和至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂的医药组合物，和所述经修饰的NKT细胞的用途。本文还公开用于富集NKT细胞且产生所述经修饰的自然杀伤T细胞的方法。本发明提供的经修饰的NKT细胞以及医药组合物具有免疫抑制作用，可用于自体免疫疾病治疗领域。

Description

经修饰的自然杀伤T细胞、医药组合物和其用途
相关申请案的交叉参考
本申请要求2015年4月7日提交的美国申请案第62/144,066号的优先权，所述申请案的全部公开内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种经修饰的自然杀伤T细胞、医药组合物和其用途。
背景技术
自然杀伤T(NKT)细胞和常规T细胞在胸腺中发育自共同前体。然而，不同的胸腺内T细胞受体(TCR)相互作用会激活细胞特异性转录程序，所述程序指示每一细胞类型的独特功能。NKT细胞通过与表达内源性糖脂结合的CD1d分子及表达CD4/CD8双阳性胸腺细胞的TCR相互作用来选择。相比之下，常规T细胞通过其TCR与胸腺上皮细胞的MHC分子及胜肽相互作用来选择(杰夫苏布勒斯基(Jeff Subleski)等人NKT细胞在恶性病、自体免疫和过敏病症中的分裂人格(The split personality of NKT cells in malignancy,autoimmuneand allergic disorders).免疫疗法(Immunotherapy).2011年10月；3(10):1167-1184)。
识别自身和非自身的确保机制崩溃为自体免疫疾病的标志特征。靶向自身组织的持久免疫反应引起延长的炎症和后续的组织破坏。NKT细胞在患有自体免疫疾病的患者的外周血液中的异常出现率和/或活性，说明NKT细胞涉及疾病病理学。
这些发现提高发展NKT细胞疗法用于自体免疫疾病的可能性和为临床应用产生更多可胜任于治疗的NKT细胞的培养方法的可能性，因为仍存在对于有效治疗和/或预防自体免疫疾病的未满足的需求。
本发明提供具有独特表型以满足这些和其它需求的经修饰的NKT细胞。经修饰的NKT细胞可用于自体疗法或非自体疗法。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供一种经修饰的自然杀伤T(NKT)细胞，其包含CD3+CD56+CD8+NKT细胞表型；至少一种选自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP的调节性T(Treg)细胞表面标记物；以及选自PD-1的T辅助细胞表面标记物。
在另一实施例中，本发明提供一种经修饰的NKT细胞，其包含CD3+CD56+CD8+NKT细胞表型；至少一种选自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP的Treg细胞表面标记物；选自PD-1的T辅助细胞表面标记物，其中所述NKT细胞表型实质上不含至少一种选自CD1d-四聚体或TCR Vα24_Jα18的恒定型自然杀伤T(iNKT)细胞表面标记物，其中所述NKT细胞表型实质上不含至少一种选自GITR、PI-16或IL-15Rα的细胞标记物。
在另一实施例中，本发明提供一种经修饰的NKT细胞，其包含CD3+CD56+CD8+NKT细胞表型；至少一种选自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP的Treg细胞表面标记物；选自PD-1的T辅助细胞表面标记物，选自IL-15Rα的T细胞生长受体，其中所述NKT细胞表型实质上不含至少一种选自CD1d-四聚体或TCR Vα24_Jα18的iNKT细胞表面标记物，其中所述NKT细胞表型实质上不含至少一种选自GITR或PI-16的细胞标记物。
在其它实施例中，本发明提供医药组合物，其包含一种或多种本文所述的经修饰的NKT细胞和医药学上可接受的载剂或赋形剂。
在其它实施例中，本发明提供本文所述的经修饰的NKT细胞在制备治疗自体免疫疾病的药物中的用途。
一些实施例提供用于治疗自体免疫疾病的方法，其包含向有需要的个体投与有效量的本文所述的经修饰的NKT细胞或医药组合物，从而治疗所述自体免疫疾病。
本发明还提供用于产生本文所述的经修饰的NKT细胞的方法，其包含(a)将富集的单核细胞部分与转化生长因子β(TGF-β)和细胞培养基一起培养，其中所述富集的细胞部分中的单核细胞实质上不含以下细胞标记物中的至少一种：CD14、CD19或CD25(下文为富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分)，以及(b)使来自步骤(a)的经培养的CD14-CD19-CD25-细胞部分与T细胞生长因子接触。
在另一实施例中，用于产生本发明的经修饰的NKT细胞的方法包含以下步骤：(a)将富集的单核细胞部分与转化生长因子β(TGF-β)和细胞培养基一起培养，其中所述富集的细胞部分中的单核细胞实质上不含以下表面标记物中的至少一种：CD4、CD14、CD16、CD19或CD25(下文为富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分)，以及(b)使来自步骤(a)的经培养的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分与T细胞生长因子接触。
本文所述的富集和/或培养方法从固定量的样品(例如10ml肝素化外周血液)产生具有较高免疫抑制活性的更多数目的经修饰的NKT细胞。
用于此专利的术语“本发明(invention)”、“本发明(the invention)”、“本发明(this invention)”和“本发明(the present invention)”意欲广泛地指此专利和随附专利权利要求书的所有主题。含有这些术语的陈述应理解为不限制本文所述的主题或不限制随附专利权利要求书的涵义或范围。此专利涵盖的本发明的实施例由随附权利要求书而非此发明内容限定。此发明内容为本发明的各种方面的高阶综述且引入一些进一步描述于以下具体实施方式部分中的概念。本发明内容并不意欲识别所要求的主题的关键特征或基本特征，也并非意图单独用于确定所要求的主题的范围。主题应参照整个说明书的恰当的部分、任一或所有图式和各权利要求来理解。
附图说明
所述专利或专利申请案含有至少一个彩制图式。具有彩色图式的此专利或专利申请案的拷贝将在请求和支付必需费用之后由专利局提供。
下文将参考以下图式详细描述本发明的说明性实施例：
图1A示意性地示出单核细胞富集的两个实施例且图1B和图1C示意性地示出用于产生本发明的经修饰的NKT细胞的培养方法的两个实施例。
图2A-2F为荧光激活细胞分选(FACS)图像，其示出天然NKT细胞上CD4、CD14、CD16、CD19和CD25细胞表面标记物的表达(图2A-2B)，富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分(图2C和图2D)以及富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分(图2E和图2F)。
图3A-3M为直方图，其示出富集的CD14-CD19-CD25细胞部分的Foxp3(图3A)、CD25(图3B)、PD-1(图3C)、GITR(图3D)、PI-16(图3E)、CD1d四聚体(图3F)、TCR Vα24_Jα18(图3G)、CTLA-4(图3H)、LAP(图3I)、IL-15Rα(图3J)、CD14和CD19(图3K)、CD4(图3L)以及CD3(图3M)的表达。
图4A-4L为直方图，其示出富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分的Foxp3(图4A)、CD25(图4B)、PD-1(图4C)、GITR(图4D)、PI-16(图4E)、CD1d四聚体(图4F)、TCR Vα24_Jα18(图4G)、CTLA-4(图4H)、LAP(图4I)、IL-15Rα(图4J)、CD4、CD14、CD16和CD19(图4K)以及CD3(图4L)的表达。
图5A-5M为直方图，其示出实例2中的经修饰的NKT细胞的CD25(图5A)、PD-1(图5B)、GITR(图5C)、PI-16(图5D)、CD1d四聚体(图5E)、TCR Vα24_Jα18(图5F)、CTLA-4(图5G)、LAP(图5H)、IL-15Rα(图5I)、Foxp3(图5J)、CD14和CD19(图5K)、CD4(图5L)以及CD3(图5M)的表达。
图6A-6L为直方图，其示出实例3中的经修饰的NKT细胞的CD25(图6A)、PD-1(图6B)、GITR(图6C)、PI-16(图6D)、CD1d四聚体(图6E)、TCR Vα24_Jα18(图6F)、CTLA-4(图6G)、LAP(图6H)、IL-15Rα(图6I)、Foxp3(图6J)、CD4、CD14、CD16和CD19(图6K)和CD3(图6L)的表达。
图7A-7C为T淋巴细胞的CFSE荧光的直方图，其示出实例2中的经修饰的NKT细胞(培养自富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分)对T淋巴细胞增殖的抑制作用。图7A展示T淋巴细胞在无任何刺激下的体外增殖，图7B展示T淋巴细胞应答细胞在抗CD3和抗CD28抗体刺激下的体外增殖，且图7C展示经修饰的NKT细胞在抗CD3和抗CD28抗体刺激下对T淋巴细胞应答细胞增殖的抑制作用。。
图8A-8C为T淋巴细胞的CFSE荧光的直方图，其示出实例3中的经修饰的NKT细胞(培养自富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分)对T淋巴细胞增殖的抑制作用。图8A展示T淋巴细胞在无任何刺激下的体外增殖，图8B展示T淋巴细胞应答细胞在抗CD3和抗CD28抗体刺激下的体外增殖，且图8C展示经修饰的NKT细胞在抗CD3和抗CD28抗体刺激下对T淋巴细胞应答细胞增殖的抑制作用。
具体实施方式
如本文所用，冠词“一个(a)”和“一个(an)”是指一个或一个以上(即，至少一个)所述冠词的语法对象。作为举例，“一个经修饰的NKT细胞”意指一个经修饰的NKT细胞或一个以上经修饰的NKT细胞。
如本文所用的“有效量”是指足以减少IL-10含量或自体免疫疾病的症状和征象(其包括(但不限于)体重减轻、皮疹、腹痛、眼睛发痒、关节疼痛或肿胀)的经修饰的NKT细胞或医药组合物的剂量。
术语“个体”可指具有自体免疫疾病的脊椎动物或认为需要自体免疫疾病治疗或需要增加IL-10含量的脊椎动物。个体包括温血动物，如哺乳动物、如灵长类动物且更优选地为人类。非人类灵长类动物同样为个体。术语个体包括经驯养动物(如猫、狗等)、家畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验动物(例如小鼠、家兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠等)。由此，在本文中涵盖兽医用途和医用调配物。
NKT细胞表面上的细胞表面标记物(如CD25、Foxp3、PD-1)的表达含量或表面密度只要所述表达相对于阴性对照群体(表示为“-”)为阳性就为“+”。在一个例示性实施例中，“+”意指细胞表面标记物相对于同型对照可检测地存在于荧光激活细胞分选术或磁珠中；或在定量或半定量RT-PCR中在背景之上可检测到。在另一例示性实施例中，“-”意指细胞标记物相对于同型对照不可检测地存在于荧光激活细胞分选术或磁珠中；或在定量或半定量RT-PCR中在背景之上不可检测到。在一个实例中，表面标记物的“+”表达意指表面标记物的净平均荧光强度(MFI)大于或等于约0、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、或约5。在另一实例中，表面标记物的“-”表达意指表面标记物的净MFI小于或等于约5、约4.5、约4、约3.5、约3、约2.5、约2、约1.5、约1、约0.5、约0。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在整个此专利中可互换地使用。
如本文所用的术语“实质上不含”包括细胞标记物的“-”表达或细胞标记物的含量通过所述领域中所用的常规分析方法不可检测到或最低限度地检测到。举例来说，熟练的业内人士已知FACS/流式细胞仪以及其它分析方法。
本文中的所有数字可理解为由“约”修饰。在一个实施例中，除非另外说明，否则当提及可测量值，如量、时间的持续时间等时，术语“约”意欲涵盖偏离指定值±10％、优选地±5％、更优选地±1％、且甚至更优选地±0.1％的变化，照此变化适于治疗剂的剂量。如本文所用，除非另外说明，否则当提及范围时，术语“约”意欲涵盖偏离指定值在所述范围的差值中的±10％、优选地±5％、更优选地±1％、且甚至更优选地±0.1％的变化，照此变化适于治疗剂的剂量。
经修饰的NKT细胞
天然存在的或常规NKT细胞具有CD3+CD56+CD8+表型。在一个例示性实施例中，天然存在的或常规NKT细胞具有CD14-CD19-CD3+CD56+CD8+CD4-CD25-Foxp3-PD-1-CTLA-4-GITR-PI-16-CD1d四聚体-LAP-TCR Vα24_Jα18-表型。
在一个实施例中，本发明提供一种经修饰的NKT细胞，其包含CD3+CD56+CD8+NKT细胞表型；至少一种选自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP的调节性T(Treg)细胞表面标记物；以及T辅助细胞表面标记物，如PD-1，如表1、图5A-图5M和图6A-图6L中所示。不受任何具体理论束缚，据相信，本发明的经修饰的NKT具有与Treg细胞和/或T辅助细胞的免疫抑制性质相似的免疫抑制性质，如制造IFN-γ。在另一实施例中，本发明提供一种经修饰的NKT细胞，其包含CD3+CD56+CD8+NKT细胞，其中所述CD3+CD56+CD8+NKT细胞进一步包含至少一种选自CD25、Foxp3、PD-1、CTLA-4或LAP的Treg细胞表面标记物，和T辅助细胞表面标记物，如PD-1，如表1中所示。
在一个例示性实施例中，经修饰的NKT细胞包含CD14-CD19-CD3+CD4-CD16-CD56+CD8+CD25+Foxp3+PD-1+CTLA-4+GITR-PI-16-CD1d四聚体-LAP+TCR Vα24_Jα18-IL-15Rα+表型。在另一例示性实施例中，经修饰的NKT细胞包含CD14-CD19-CD3+CD4-CD16-CD56+CD8+CD25+Foxp3+PD-1+CTLA-4+GITR-PI-16-CD1d四聚体-LAP+TCR Vα24_Jα18-IL-15Rα-表型。
表1.常规NKT细胞和经修饰的NKT细胞的表型
a叉头框P3
b程序性死亡-1
c细胞毒性T淋巴细胞相关分子-4
d糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体
e肽抑制剂16
f潜伏相关肽
gT细胞受体Vα24 Jα18
h白介素-15受体α
在一个实施例中，本发明提供经修饰的NKT细胞，其由富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-单核细胞部分产生，且包含CD3+CD56+CD8+NKT细胞表型；至少一种选自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP的Treg细胞表面标记物；以及选自PD-1的T辅助细胞表面标记物，其中所述NKT表型实质上不含至少一种选自CD1d-四聚体或TCR Vα24_Jα18的iNKT细胞表面标记物，其中所述NKT表型实质上不含至少一种选自GITR、PI-16或IL-15Rα的细胞表面标记物。在另一实施例中，经修饰的NKT细胞由富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞部分产生，且包含CD3+CD56+CD8+NKT细胞表型；至少一种选自CD25、Foxp3、PD-1、CTLA-4或LAP的Treg细胞表面标记物；选自PD-1的T辅助细胞表面标记物；以及选自IL-15Rα的T细胞生长受体，其中所述NKT表型实质上不含至少一种选自CD1d-四聚体或TCR Vα24_Jα18的iNKT细胞表面标记物，其中所述NKT表型实质上不含至少一种选自GITR或PI-16的细胞表面受体。
在一个实施例中，以下细胞标记物的净MFI大于或等于约0、约0.5、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5或约5：CD3、CD56、CD8、CD25、Foxp3、PD-1、CTLA-4、LAP或IL-15Rα。在另一实施例中，以下细胞标记物的净MFI小于或等于约5、约4.5、约4、约3.5、约3、约2.5、约2、约1.5、约1、约0.5、约0：CD14、CD19、CD4、CD16、GITR、PI-16、CD1d四聚体、TCR Vα24_Jα18或IL-15Rα。
在一些实施例中，本发明的经修饰的NKT细胞实质上不含以下细胞表面标记物中的至少一种：CD14、CD19、CD4、CD16、GITR、PI-16、CD1d四聚体、TCR Vα24_Jα18或IL-15Rα。在一个例示性实施例中，经修饰的NKT细胞包含CD3+CD56+CD8+NKT细胞表型，其中所述CD3+CD56+CD8+NKT细胞实质上不含至少一种选自CD1d-四聚体(例如CD1d-四聚体-)或TCR Vα24_Jα18(例如TCR Vα24_Jα18-)的iNKT细胞表面标记物。在另一个例示性实施例中，经修饰的NKT细胞包含CD3+CD56+CD8+NKT细胞表型，其中所述CD3+CD56+CD8+NKT细胞实质上不含GITR(例如GITR-)。在另一例示性实施例中，经修饰的NKT细胞实质上不含PI-16细胞表面标记物(例如PI-16-)。在另一例示性实施例中，经修饰的NKT细胞实质上不含T细胞生长受体，如IL-15Rα(例如IL-15Rα-)。
在一个实施例中，细胞表面标记物的表达含量或表面密度通过以下方式定量：使经修饰的NKT细胞暴露于在表2中列出的一种或多种荧光染料标记的特异性抗人类单克隆抗体，接着使用流式细胞仪(例如Gallios，可购自美国贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter,Inc.,USA))分选经修饰的NKT细胞。用于定量细胞标记物的表达含量的其它方法为所属领域的技术人员已知或将显而易见的。
经修饰的NKT细胞可来自单一个体(即，自体)或汇集自多个个体(非自体的同种异体)。
医药组合物
本发明提供医药组合物，其包含本文所述的经修饰的NKT细胞和医药学上可接受的载剂或赋形剂。
投与本发明医药组合物或经修饰的NKT细胞的途径包括(但不限于)静脉内、肌内、关节内、皮下、经口、局部、皮下、皮内、经皮、真皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮投与。在一个实施例中，经修饰的NKT细胞或医药组合物通过静脉内注射或输注来投与。
本发明的医药组合物可制备为呈液体溶液或悬浮液或在注射之前呈适合于液体媒剂中的溶液或悬浮液的固体形式的可注射剂。医药组合物还可制备为呈固体形式、乳化或其它微粒载剂用于持续传递。举例来说，医药组合物可呈以下形式：油状乳液、油包水乳液、水包油包水乳液、位点特异性乳液、长期滞留乳液、乳化胶、微乳液、纳米乳液、脂质体、微粒、微球体、纳米球、纳米粒子和各种天然或合成聚合物，如非再吸收的不可渗透的聚合物(如乙烯乙酸乙烯酯共聚物和共聚物)、可溶胀聚合物(如水凝胶)、或再吸收的聚合物(如胶原蛋白)和某些聚酸或聚酯(如用于制造再吸收的缝合线的那些)，其允许医药组合物的持续释放。
本发明经修饰的NKT细胞调配到医药组合物中以便传递到哺乳动物个体。医药组合物单独和/或与医药学上可接受的媒剂、赋形剂或载剂混合投与。合适的媒剂例如为盐水、右旋糖、甘油等和其组合。另外，媒剂可含有少量的助剂物质，如润湿或乳化剂、pH缓冲剂或佐剂。医药学上可接受的载剂可含有用于例如稳定或提高或降低本发明的医药组合物的吸收或清除速率的生理学上可接受的化合物。生理学上可接受的化合物可包括例如碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质、清洁剂、脂质体载体或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。其它生理学上可接受的化合物包括湿润剂、乳化剂、分散剂或防腐剂。参见例如第21版雷明顿医药科学(Remington's Pharmaceutical Science),马克出版公司(Mack Publishing Company),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,PA.)(“雷明顿(Remington's)”)。本发明的医药组合物还可包括辅助物质，如药理药剂、细胞因子或其它生物反应调节剂。
制备所述剂型的实际方法为所属领域的技术人员已知或将显而易见的。参见例如雷明顿医药科学，马克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，第21版。
经修饰的NKT细胞或本发明医药组合物可以单剂量治疗形式或以多剂量治疗形式投与，按照一定时程和经一定时间段，其适于个体的年龄、体重和健康状况、所用具体组合物和投与途径、经修饰的NKT细胞或本发明医药组合物是用于预防性还是治愈性目的等。举例来说，在一个实施例中，根据本发明的经修饰的NKT细胞或医药组合物每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天(qod)、每天(qd)、一天两次(qid)或一天三次(tid)投与。
根据本发明的经修饰的NKT细胞或医药组合物的投与持续时间(例如投与经修饰的NKT细胞或医药组合物所经过的时间段)可不同，视多种因素中的任一种(例如个体反应等)而定。举例来说，经修饰的NKT细胞或医药组合物可经在以下范围内的一段时间投与：约一秒或多秒到一分钟或多分钟，一小时或多小时到一天到约一周，约两周到约四周，约一个月到约两个月，约两个月到约四个月，约四个月到约六个月，约六个月到约八个月，约八个月到约1年，约1年到约2年，或约2年到约4年，或更长时间。
有利的是将肠胃外医药组合物或经修饰的NKT细胞调配成单位剂型以实现投与简易性和剂量均一性。如本文中所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗个体的物理分散单位；每个单位含有与所需药物载剂结合的经计算以产生所需治疗作用的预定量的经修饰的NKT细胞。
从细胞培养分析和动物研究获得的数据可以用于调配适用于人类的多种剂量。在一个实施例中，所述NKT细胞的剂量在包括ED50在内的循环浓度范围内，并且具有极低毒性或无毒性。剂量可以视所用剂型和所用投药途径而在此范围内变化。在另一实施例中，治疗有效剂量最初可以从细胞培养分析估计。可以在动物模型中调配剂量以获得如在细胞培养中所测定的包括IC50(即，经修饰的NKT细胞实现症状的半数最大抑制的浓度)的循环血浆浓度范围。桑德斯特普(Sonderstrup),施普林格免疫病理学研讨会(Springer,Sem.Immunopathol.)25:35-45,2003.尼库拉(Nikula)等人,吸入毒理学(Inhal.Toxicol.)4(12):123-53,2000。
将医药组合物调配成含有有效量的经修饰的NKT细胞，其中所述量视待治疗的个体和待治疗的病况而定。任何具体个体的特定剂量水准视多种因素而定，包括特定经修饰的NKT细胞的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、投药时间、投药途径、以及排泄速率、药物组合以及经历疗法的具体疾病的严重度。本发明的经修饰的NKT细胞的治疗或预防有效量的例示性非限制性范围为至少约10个细胞/剂到约1×1010个/每剂。其它剂量也为可能的，包括(但不限于)1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108或1×109。
用于治疗自体免疫疾病的方法
本发明的经修饰的NKT细胞具有与Treg细胞的免疫抑制性质相似的免疫抑制性质。在一个实施例中，本发明提供用于通过以有效治疗自体免疫疾病的量向有需要的个体投与本文所述的经修饰的NKT细胞或医药组合物来治疗自体免疫疾病的方法。不受任何具体理论束缚，据相信，经修饰的NKT细胞通过增加T辅助细胞1反应(IFN-γ分泌)或发挥免疫抑制性质来对自体免疫疾病发挥治疗作用。在一个实施例中，免疫抑制性质为自体反应和激活的T淋巴细胞(其为自体免疫疾病中的关键参与者)的抑制。
如本文所用，“自体免疫疾病”为由个体自身组织产生且针对个体自身组织的疾病或病症。自体免疫疾病包括(但不限于)I型糖尿病、多发性硬化症、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's Thyroiditis)、格雷氏病(Grave's disease)、牛皮癣、全身性红斑狼疮(SLE)、舍格伦综合症(Sjoren's Syndrome)、乳糜泻、扁平苔癣和类风湿性关节炎、狼疮过敏性皮炎、硬皮病、异位性湿疹、鼻窦炎、哮喘、发炎性肠道疾病(如溃疡性结肠炎)。
经修饰的NKT细胞可单独、或在一种或多种免疫抑制剂之前、之后或与一种或多种免疫抑制剂同时投与。免疫抑制剂的非限制性实例包括类固醇、非类固醇消炎药物(NSAID)(如吲哚美辛(indomethacin))、疾病改性抗风湿病药物(DMARD)或前述中的两种或更多种的组合。DMARD包括小分子药剂，如甲氨蝶呤(methotrexate)、来氟米特(leflunomide)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、环孢菌素A(cyclosporin A)、d-青霉胺(d-penicillamine)、抗疟疾药物(例如羟化氯喹(hydroxychloroquine))。DMARD还包括生物物质，如肿瘤坏死因子a(TNF-a)拮抗剂(例如依那西普(Etanercept)，商标名恩利(Enbrel)，可购自美国科利奇维尔的惠氏医药公司(Wyeth Pharmaceuticals,Inc.,Collegeville,USA)；阿达木单抗(Adalimumab)，商标名修美乐(HUMIRA)，可购自美国伊利诺伊州雅培公园的雅培实验室(Abbott Laboratories,Abbott Park,Illinois,USA))、白介素-1受体拮抗剂、白介素-6受体拮抗剂、抗CD20单克隆抗体、CTLA-4-Ig、RGD肽等。
富集NKT细胞的方法和其用于产生经修饰的NKT细胞的用途
如图1A中所示，样品(例如外周血液、脐血、骨髓、来自胸腺或脾的组织样品)获自个体，且样品中的单核细胞通过离心(例如Ficoll-PaqueTMPREMIUM，美国通用电气医疗集团(GE Healthcare USA))分离。分离(isolating)或分离(separating)单核细胞的其它方法为所属领域的技术人员已知或将显而易见的。经分离的单核细胞可进一步富集以获得仅T细胞。
在一个实施例中，具有至少以下表面标记物的单核细胞自经分离的单核细胞部分耗尽或移除：CD4、CD14、CD16、CD19或CD25。视样品来源而定，单核细胞可来源于人类外周单核细胞、单核细胞或骨髓母细胞。在一个实施例中，富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分中的单核细胞实质上不含选自CD14、CD19或CD25的细胞表面标记物。在另一实施例中，富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分中的单核细胞实质上不含选自CD4、CD14、CD16、CD19或CD25的细胞表面标记物。
在一个实施例中，如图1A和图1B中所示，用于产生经修饰的NKT细胞的体外方法包含以下阶段：(i)耗乏或移除具有以下细胞标记物中的至少一种的单核细胞：CD14、CD19或CD25(即，产生富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞部分)；(ii)使来自步骤(i)的CD14-CD19-CD25-细胞部分与包含转化生长因子β(TGF-β)和细胞培养基的组合物接触；以及(iii)使来自步骤(ii)的富集的CD14-CD19-CD25-NKT细胞部分与T细胞生长因子接触。在另一实施例中，用于产生经修饰的NKT细胞的体外方法包含以下阶段：(i)耗乏或移除具有以下细胞标记物中的至少一种的单核细胞：CD4、CD14、CD16、CD19或CD25(即，产生富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-单核细胞部分)；(ii)使来自步骤(i)的富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分与包含TGF-β和细胞培养基的组合物接触；(iii)使来自步骤(ii)的单核细胞部分与T细胞生长因子接触。
在一个实施例中，使富集的NKT细胞与TGF-β、T细胞生长因子和细胞培养基接触增强经修饰的NKT细胞上的Treg细胞表面标记物(如CD25、Foxp3和CTLA-4)的表达。在另一实施例中，培养方法增强T辅助细胞表面标记物(如PD-1)的表达。经修饰的NKT细胞的增殖速率由FACS测定的经修饰CD3+CD56+CD8+NKT细胞的信号强度测定。细胞增殖的其它分析为此项技术中熟知的，例如，克隆源性分析、代谢分析和直接增殖分析。
如本文所用的细胞培养基包括支持细胞生长和/或维持的任何培养基。细胞培养基的非限制性实例包括造血细胞培养基，如X-Vivo 15，或包含哺乳动物细胞培养基和培养基补充剂的混合物，如R-10培养基。
术语哺乳动物细胞培养基包括支持哺乳动物细胞生长和/或维持的任何细胞培养基，如RPMI培养基1640(可购自美国赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,USA))。在一个实施例中，RPMI培养基1640包含100U/mL青霉素；100μg/mL链霉亲和素；2mML-谷氨酰胺；以及20mM HEPES。培养基补充剂为哺乳动物细胞培养物提供如脂质、氨基酸、生长因子、葡萄糖或微量元素的营养物以增加产量。培养基补充剂的非限制性实例为血清，如约5％到约10％胎牛血清(FBS)。在一个实施例中，R-10培养基包含RPMI培养基1640和10％FBS。
T细胞生长因子包括刺激T细胞的产生和发育的任何分子。T细胞生长因子的非限制性实例包括IL-15。在一个实施例中，IL-15的浓度为约20ng/ml到约160ng/ml。在另一实施例中，IL-15的浓度等于或小于约160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30或20或其间增量为1ng/ml的任何值或值范围(例如约155ng/ml、约37ng/ml)。
尽管IL-2可用于产生经修饰的NKT细胞，但由IL-2产生的经修饰的NKT细胞的数目与IL-15的数目相比较少(参见表6)。IL-2和IL-15为具有重叠但不同生物学作用的细胞因子，其受体共有两个为信号转导所必需的亚基。不受任何具体理论束缚，据相信，IL-15对其专用受体α具有较高亲和力，且因此需要较低浓度的IL-15来产生经修饰的NKT细胞。在一个实施例中，T细胞生长因子实质上不含IL-2。在另一实施例中，IL-2以≤2重量％、≤1.5重量％、≤1重量％和≤0.5重量％的量存在于T细胞生长因子中。富集的NKT细胞与转化生长因子β(TGF-β)细胞培养基或T细胞生长因子的接触时间的例示性非限制性范围为约1分钟到约1小时、约1小时到约24小时、约1天到约3天、约1天到约6天、约1天到约9天、约3天到约6天、或至少1天。在一个实施例中，接触时间为约3天。在另一实施例中，接触时间为约6天。
执行本发明的特定方面的以下实例仅出于说明性目的提供，且并不意欲以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1：富集的单核细胞部分
如图1A中所示，40ml外周血液收集自健康志愿者且肝素化。血液样品与等体积的预温热的磷酸盐缓冲盐水(PBS)混合(以色列生物工业公司(Biological Industries,Israel))。将40ml稀释的外周血液等分试样置放到50ml离心管中且下载10ml预温热的Ficoll-PaqueTMPREMIUM。离心管在2000rpm下在室温中离心30分钟。单核细胞自其它类型的血细胞分离，接着收集且在PBS中洗涤一次。细胞集结粒再悬浮到密度为106个/100μl MACS缓冲液。
为了耗乏或移除具有以下细胞标记物中的至少一种的单核细胞：CD4、CD14、CD16、CD19或CD25，来自前述段落的经分离的单核细胞使用“QuadroMACS分离器”(德国贝吉施-格拉德巴赫的美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec Bergisch,Gladbach,Germany))根据制造商的说明书进行免疫磁性珠粒分离。简单来说，单核细胞用生物素-抗CD14抗体、生物素-抗CD19抗体、生物素-抗CD25抗体、生物素-抗CD4抗体和/或生物素-抗CD16抗体(其均可购自博莱德(BioLegend))和20μl链霉亲和素微珠(德国美天旎生物技术公司)染色，且用磁性分离器分离。CD14-CD19-CD25-单核细胞部分或CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-单核细胞部分通过洗涤而自未结合的细胞富集。富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞部分实质上不含具有至少一种选自CD14、CD19或CD25的细胞表面标记物的细胞，而富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-单核细胞部分实质上不含具有至少一种选自CD4、CD14、CD16、CD19或CD25的细胞表面标记物的细胞。
如图2中所示，富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分(图2D)和富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分(图2F)的CD4、CD14、CD16、CD19和CD25的信号水准比非富集的细胞部分(图2B)的信号水准低得多。
实例2：经修饰的NKT细胞的第一实施例的体外培养
如图1B中所示，来自实例1的富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分如下培养：
(a)在第0天，富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分与包含3ml R-10培养基和40ng/mlTGF-β的组合物一起培养在预先涂布有1μg抗人类CD3抗体(美国博莱德(Biolegend,USA))的6孔板中。
(b)在第1天，将40ng/ml IL-15(博莱德)添加到步骤(a)中的培养物中。
(c)在第3天，收集步骤(b)中的一半经培养细胞且下旋，接着用R-10培养基和40ng/ml TGF-β在6孔板中再悬浮细胞集结粒。
(d)在第4天，将40ng/ml IL-15(博莱德)添加到步骤(c)中的培养物中。
(e)在第6天，收集来自步骤(d)的经修饰的NKT细胞。
步骤(e)中的经修饰的NKT细胞使用Gallios流式细胞仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Inc.))、Kazula软件1.2版(贝克曼库尔特公司)和表2中列出的抗体分析其表型。
表2.用于经修饰的NKT细胞表型的抗体
在此实施例中，使用FACS/流式细胞仪分析的细胞表面标记物的表达含量定义在表3中。表3中的表达含量的解释为定义细胞表面标记物的表达含量的一个实例。应注意，流式细胞仪信号水准强度随着以下因素变化：流式细胞仪、软件和所用的不同批次抗体。
表3
结果：如图3A-3M中所示，富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分的单核细胞具有表型CD14-CD19-CD3+CD56+CD8+CD4-CD25-Foxp3-PD-1-CTLA-4-GITR-PI-16-CD1d四聚体-LAP-TCR Vα24_Jα18-IL-15Rα-。
图5A-5M说明实例2中的经修饰的NKT细胞的表型为CD14-CD19-CD3+CD56+CD8+CD4-CD25+Foxp3+PD-1+CTLA-4+GITR-PI-16-CD1d四聚体-LAP+TCR Vα24_Jα18-IL-15Rα+表型。
表4展示富集的CD14-CD19-CD25-细胞部分的单核细胞和由其培养的经修饰的NKT细胞的净MFI。
表4.
以下概述富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞表型和经修饰的NKT细胞表型之间的差异。
●富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞具有表型Foxp3-CD25-PD-1-CTLA-4-LAP-IL-15Rα-，而经修饰的NKT细胞具有表型Foxp3+CD25+PD-1+CTLA-4+LAP+IL-15Rα+。
●与富集的CD14-CD19-CD25-细胞的相比，Foxp3的表达在经修饰的NKT细胞中上调至少62倍。
●与富集的CD14-CD19-CD25-细胞的相比，CD25的表达在经修饰的NKT细胞中上调至少130倍。
●与富集的CD14-CD19-CD25-细胞的相比，PD-1的表达在经修饰的NKT细胞中上调至少8.5倍。
●与富集的CD14-CD19-CD25-细胞的相比，CTLA-4的表达在经修饰的NKT细胞中上调至少73倍。
●与富集的CD14-CD19-CD25-细胞的相比，IL-15Rα的表达在经修饰的NKT细胞中上调至少250倍。
实例3：经修饰的NKT细胞的第二实施例的体外培养
如图1C中所示，来自实例1的富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分如下培养：
(a)在第0天，富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分与包含3ml X-Vivo 15和40ng/ml TGF-β的组合物一起培养在预先涂布有1μg抗人类CD3抗体(博莱德)的6孔板中。
(b)在第1天，将80ng/ml IL-15(博莱德)添加到步骤(a)中的培养物中。
(c)在第3天，收集步骤(b)中的一半经培养细胞且下旋，接着用3ml X-Vivo 15和40ng/ml TGF-β在6孔板中再悬浮细胞集结粒。
(d)在第4天，将80ng/ml IL-15(博莱德)添加到步骤(c)中的培养物中。
(e)在第6天，收集来自步骤(d)的经修饰的NKT细胞。
步骤(e)中的经修饰的NKT细胞根据实例2中的方案分析其表型。
结果：如图4A-4L中所示，富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞部分的单核细胞具有表型CD14-CD19-CD3+CD16-CD56+CD8+CD4-CD25-Foxp3-PD-1-CTLA-4-GITR-PI-16-CD1d四聚体-LAP-TCR Vα24_Jα18-IL-15Rα-。
图6A-6L说明实例3中的经修饰的NKT细胞的表型为CD14-CD19-CD3+CD16-CD56+CD8+CD4-CD25+Foxp3+PD-1+CTLA-4+GIT R-PI-16-CD1d四聚体-LAP+TCR Vα24_Jα18-IL-15Rα-表型。
表5展示富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-单核细胞和由其培养的经修饰的NKT细胞的净MFI。
表5.
以下概述富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-单核细胞表型和经修饰的NKT细胞表型之间的差异。
●富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-单核细胞具有表型Foxp3-CD25-PD-1-CTLA-4-LAP-，而经修饰的NKT细胞具有表型Foxp3+CD25+PD-1+CTLA-4+LAP+。
●与富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞的相比，Foxp3的表达在经修饰的NKT细胞中上调至少53倍。
●与富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞的相比，CD25的表达在经修饰的NKT细胞中上调至少85倍。
●与富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞的相比，PD-1的表达在经修饰的NKT细胞中上调至少15倍。
●与富集的CD4-CD14-CD16-CD19-CD25-细胞的相比，CTLA-4的表达在经修饰的NKT细胞中上调至少90倍。
实例4：IL-15浓度对经修饰的NKT细胞培养物的作用
IL-15的浓度对经修饰的NKT细胞培养物的体外评估使用FACS/流式细胞仪执行。
以下IL-15浓度用于产生实例2的经修饰的NKT细胞：5ng/ml IL-12、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml和160ng/ml。
结果：当IL-15浓度在约20ng/ml到约160ng/ml之间时，Foxp3、CD25、CTLA-4和PD-1的表达含量较高。
实例5：经修饰的NKT细胞对激活的CFSE标记的T淋巴细胞的增殖的抑制能力的功能性评估
“T淋巴细胞应答细胞”分析：羧基荧光素二乙酸酯丁二酰亚胺酯(CFSE)标记的CD25-外周血单核细胞(CD25-PBMC)用3μg/ml抗CD3和1μg/ml抗CD28抗体刺激以激活CFSE标记的T淋巴细胞应答细胞。将实例2和实例3中的经修饰的NKT细胞添加到CFSE标记的T淋巴细胞应答细胞中以评估免疫抑制性质。在共培养4天之后，测量CFSE荧光稀释度。
实例2中的经修饰的NKT细胞的结果：图7A示出了在无任何抗体刺激下CFSE标记的T淋巴细胞应答细胞的CFSE稀释度分析(2.78％)。抗CD3抗体和抗CD28抗体的添加诱导CFSE标记的T淋巴细胞应答细胞的增殖(35.02％)，如图7B中所示。图7C展示将实例2中的经修饰的NKT细胞添加到CFSE标记的T淋巴细胞应答细胞中使CFSE标记的T淋巴细胞应答细胞的增殖减少35.02％到13.24％(62％减少)。
实例3中的经修饰的NKT细胞的结果：图8A示出了在无任何抗体刺激下CFSE标记的T淋巴细胞应答细胞的CFSE稀释度分析(1.18％)。抗CD3抗体和抗CD28抗体的添加诱导CFSE标记的T淋巴细胞应答细胞的增殖(15.21％)，如图8B中所示。图8C展示将实例3中的经修饰的NKT细胞添加到CFSE标记的T淋巴细胞应答细胞中使CFSE标记的T淋巴细胞应答细胞的增殖减少15.21％到3.7％(75.5％减小)。
这些结果展示出本发明的经修饰的NKT细胞有效抑制激活的CFSE标记的T淋巴细胞(其为自体免疫疾病中的关键参与者)的增殖。
实例6：IL-2对经修饰的NKT细胞的产生的作用
IL-2对经修饰的NKT细胞培养物的作用的体外评估使用FACS/流式细胞仪执行。实例1的富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞与(a)抗CD3抗体+TGF-β+IL-2或(b)抗CD3抗体+TGF-β+IL-15一起根据实例2中的步骤培养。
表6.用不同培养基或生长因子产生的经修饰的NKT细胞的％
如表6中所示，用TGF-β和IL-2产生的经修饰的NKT细胞的一个例示性实施例的％为1.26。另一方面，用TGF-β和IL-15产生的经修饰的NKT细胞的％为15.47，此代表与用TGF-β和IL-2产生的经修饰的NKT细胞的％相比增加11倍。
虽然已经描述并说明了本发明的特定方面，但是所述方面应仅视为本发明的说明性实施例并且不应视为限制如根据所附权利要求书所理解的本发明。本说明书中所引用的所有公开案和专利申请案以全文引用的方式并入本文中用于所有目的，其引用的程度如同每篇个别公开案或专利申请案经具体地并且个别地指明以引用的方式并入一般，以用于所有目的。尽管已出于清楚理解的目的通过说明和实例相当详细地描述前述发明，但根据本发明的教示，所属领域的技术人员能容易地显而易见，可在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下对其作出某些改变和修改。

Claims (25)

1.一种经修饰的自然杀伤T(NKT)细胞，其包含：
NKT细胞表型，其特征为CD3+CD56+CD8+；
至少一种T调节性(Treg)细胞表面标记物，其选自CD25、Foxp3、CTLA-4或LAP；以及
T辅助细胞表面标记物，其选自PD-1。
2.根据权利要求1所述的经修饰的NKT细胞，其中所述NKT细胞表型实质上不含至少一种选自CD1d-四聚体或TCR Vα24_Jα18的恒定型自然杀伤T(iNKT)细胞表面标记物。
3.根据权利要求1所述的经修饰的NKT细胞，其中所述NKT细胞表型实质上不含GITR、PI-16或其组合。
4.根据权利要求1所述的经修饰的NKT细胞，其进一步包含IL-15Rα。
5.根据权利要求1所述的经修饰的NKT细胞，其中所述NKT细胞表型实质上不含IL-15Rα。
6.一种医药组合物，其包含：
(a)经修饰的NKT细胞，其包含：
NKT细胞表型，其特征为CD3+CD56+CD8+；
至少一种T调节性(Treg)细胞表面标记物，其选自CD25、Foxp3、CTLA-4和LAP；以及
T辅助细胞表面标记物，其选自PD-1；以及
(b)医药学上可接受的载剂或赋形剂。
7.根据权利要求6所述的医药组合物，其中所述NKT细胞表型实质上不含一种或多种选自CD1d-四聚体或TCR Vα24_Jα18的iNKT细胞表面标记物。
8.根据权利要求6所述的医药组合物，其中所述NKT细胞表型实质上不含GITR、PI-16或其组合。
9.根据权利要求6所述的医药组合物，其中所述经修饰的NKT细胞进一步包含IL-15Rα。
10.根据权利要求6所述的医药组合物，其中所述NKT细胞表型实质上不含IL-15Rα。
11.权利要求1所述的经修饰的NKT细胞在制备治疗自体免疫疾病的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述经修饰的NKT细胞实质上不含一种或多种选自CD1d-四聚体或TCR Vα24_Jα18的iNKT细胞表面标记物。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述经修饰的NKT细胞实质上不含GITR、PI-16或其组合。
14.根据权利要求11所述的用途，其中所述经修饰的NKT细胞进一步包含IL-15Rα。
15.根据权利要求11所述的用途，其中所述经修饰的NKT细胞实质上不含IL-15Rα。
16.根据权利要求11所述的用途，其中所述治疗自体免疫疾病的药物中，进一步包含免疫抑制剂。
17.一种产生根据权利要求1所述的经修饰的NKT细胞的方法，其包含以下步骤：
(a)将富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞部分与包含转化生长因子β(TGF-β)和细胞培养基的组合物一起培养；以及
(b)使来自步骤(a)的所述经培养的细胞部分与T细胞生长因子接触。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞培养基包含哺乳动物细胞培养基和培养基补充剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养基为RPMI培养基1640且所述培养基补充剂为胎牛血清。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞培养基为造血细胞培养基。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述造血细胞培养基为X-Vivo15。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述T细胞生长因子为IL-15。
23.根据权利要求17所述的方法，其中所述富集的CD14-CD19-CD25-单核细胞进一步耗尽具有以下细胞标记物中的至少一种的细胞：CD4或CD16。
24.根据权利要求17所述的方法，其中所述富集的细胞碎片与所述组合物或所述T细胞生长因子的所述接触时间为约1天到约3天。
25.一种经修饰的自然杀伤T(NKT)细胞，其包含表型CD3+CD56+CD8+CD1d-四聚体-TCR Vα24_Jα18-GITR-PI-16-CD25+Foxp3+CTLA-4+LAP+PD-1+IL-15Rα-。
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