CN108949881A

CN108949881A - 一种鹿肽及其制备方法和应用

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Publication number: CN108949881A
Application number: CN201810896209.9A
Authority: CN
Inventors: 季海滨
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2018-12-07

Abstract

本发明涉及生物活性肽领域，具体而言，涉及一种鹿肽及其制备方法和应用。一种鹿肽的制备方法，包括以下步骤：鹿肉粉碎后进行酶解，所述酶解依次采用以下蛋白酶进行：酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、脂肪酶、碱性蛋白酶；酶解得到的产物经酶灭活后离心，得到的上清液经超滤膜分离得到所述鹿肽。本发明经多次试验筛选，将原料鹿肉以特定的工艺进行酶解，分离纯化，步骤简便，收率高，得到的鹿肽具有增强人体免疫力，延缓衰老、增强体质等功效。

Description

一种鹿肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物活性肽领域，具体而言，涉及一种鹿肽及其制备方法和应用。

背景技术

生物活性肽具有多种多样的生理功能,如激素作用、免疫调节、抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抑菌、抗病毒、抗癌作用等，因此而受到较为广泛的应用。

生物活性肽分布广泛,多来源于动植物体。自1975年Hug hes首先报道从动物组织中发现了具有类吗啡活性的小肽以来,学者们已经从动物、植物和微生物中分离出多种生物活性肽。目前，生物活性肽具有不同的分类方法,如按其原料来源按其原料来源可分为海洋生物活性肽和陆地生物活性肽；按其分泌部位可分为内源性(即人机体内存在的天然生物活性肽)和外源性生物活性肽(包括存在于动、植物和微生物体内的天然生物活性肽和蛋白质降解后产生的生物活性肽成分)；按其功能可分为生理活性肽(包括抗菌肽、神经活性肽、激素肽和激素调节肽、酶调节剂和抑制剂、免疫活性肽、抗氧化肽、矿物元素结合肽等)和食品感官肽(呈味肽、表面活性肽、营养肽等)。对于按其功能分类,由于一些活性肽同时具有多种生理活性。

但生物活性肽还存在诸多问题：大多数生物活性肽构效关系不清楚；原料蛋白利用率低，生产成本偏高；生物活性肽有效成分低、功效不突出；蛋白酶对肽键的专一性不强，难以靶向酶解；小分子肽的分离纯化技术大多数难适应于工业化生产；生物活性肽与食品其他成分在加工、储藏过程中反应复杂，难以控制；生物活性肽在体内进行消化吸收后作用机理缺乏研究。

鹿茸，是指梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化而带茸毛的幼角，是名贵药材。鹿茸中含有磷脂、糖脂、胶脂、激素、脂肪酸、氨基酸、蛋白质及钙、磷、镁、钠等成分，其中氨基酸成分占总成分的一半以上。从鹿茸中提取胰岛素样生长因子、神经生长因子、促生长释放因子、表皮生长因子等等，使得鹿茸得到更深入的应用。

但由于鹿茸的原料有限，限制了其应用。申请号为200310115964.2公开了复合蛋白酶催化制备生理活性鹿肽及鹿肽产品的应用，该鹿肽产品是以处理过的过80目标准筛的肉浆为原料，在恒温反应罐中加热至48～52℃，用NaOH溶液调节pH值到6.8～7.2，搅拌下加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，待蛋白质水解度达28～33％后再加入风味蛋白酶，继续用标准的2M NaOH溶液控制反应进程，使蛋白质水解度达34～42％；然后将酶解液升温至114～116℃，维持10～15分钟后迅速将温度降低到室温，经固液分离、浓缩及干燥后得淡黄色到黄色的粉末或者颗粒鹿肽产品。但是该方法较为复杂，并且得到的鹿肽的产量以及活性还有待进一步提升。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鹿肽的制备方法，该方法通过特定的酶进行酶解，提升蛋白的水解度，得到的鹿肽活性更强，整个方法不含有化学制剂的处理，得到的产品更安全可靠。

本发明的目的还在于提供所述的鹿肽在提升免疫力以及延缓衰老方面中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种鹿肽的制备方法，包括以下步骤：鹿肉粉碎后进行酶解，所述酶解依次采用以下蛋白酶进行：酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、脂肪酶、碱性蛋白酶；

酶解得到的产物经酶灭活后离心，得到的上清液经超滤膜分离得到所述鹿肽。

其中，鹿肉粉碎一般采用新鲜鹿肉，粉碎成肉糜，并去除筋膜和脂肪。

生物活性肽是对生物机体的生命活动有益或是具有生理作用的肽类化合物,是一类相对分子质量小于6000Da,具有多种生物学功能的多肽。其分子结构复杂程度不一,是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物,小至由两个氨基酸组成,大至由数十个氨基酸通过肽键连接而成,而且这些多肽可通过磷酸化、糖基化或酰基化而被修饰。多数生物活性肽是以非活性状态存在于蛋白质的长链中,当用适当的蛋白酶水解时,其分子片段与活性被释放出来。

本发明人经大量实验发现，采用特定的酶依次对鹿肉进行酶解，能提高对鹿肉蛋白的酶解效果，得到更多有效的生物活性肽，该生物活性肽在提升免疫力以及延缓衰老中具有显著的作用。

进一步地，所述酸性蛋白酶的酶解pH为4～4.5；所述菠萝蛋白酶的酶解pH优选为6.8～7.2；所述脂肪酶和所述碱性蛋白酶的酶解pH均优选为7.2～7.5。

研究发现，不同的酶在不同的水解条件下水解，各种酶依次酶解，得到的酶解产物中，有效活性肽得率高。

另外，经本发明提供的方法酶解后，最终产物为弱碱性，不需要再调整产品的pH。

进一步地，以所述鹿肉的重量计，各酶的添加量为：酸性蛋白酶1％～5‰、菠萝蛋白酶1‰～5‰、脂肪酶1‰～1％、碱性蛋白酶1‰～1％。

进一步地，各酶在进行酶解前，先加水混合，得到酶解液，所述酶解液加入所述鹿肉粉碎物中混匀，进行酶解。

研究发现，酶先加温水(38～40℃)混合，能有效激发酶的活性，大幅提高酶解效率。如酶室温(15-25℃)水溶解，则酶解效率降低1倍以上。

进一步地，所述酶解液的质量浓度均为15％～30％。

进一步地，所述酸性蛋白酶的酶解时间为2～3小时，所述菠萝蛋白酶的酶解时间为1～2小时，所述脂肪酶的酶解时间为1～2小时，所述碱性蛋白酶的酶解时间为1～2小时。

进一步地，所述酶解的总时间为5～8小时。

酶解时间并非是越长越好，酶解时间过长容易造成蛋白链的非特异性切割，影响酶切效果。

进一步地，所述酶解的温度为40～65℃。

进一步地，所述酸性蛋白酶酶解的时候还加入双歧杆菌，所述酶解的温度为40～45℃。

发明人意外发现，在进行酸性蛋白酶酶解的时候加入双歧杆菌，能增加酶解效率，并且产生更多的有益活性肽。

本发明中，加入双歧杆菌后的酶解温度为40～45℃，该温度兼顾酶解和菌体的发酵功效。

进一步地，加入的所述双歧杆菌为对数生长期的双歧杆菌菌液，所述双歧杆菌菌液的添加量为所述鹿肉粉碎物体积的8％～15％。

进一步地，所述酶灭活为：95～100℃，20～30分钟。

优选地，所述离心的转速为3500～4000转/分钟。即通过该速度进行离心，能有效的将目标肽与非目标物分离开，提高分离效率，并且操作简便。

进一步地，所述超滤膜分离为通过截留700～10000道尔顿多肽的超滤膜。

进一步地，所述超滤膜分离为分别通过截留700～2000道尔顿多肽的超滤膜以及截留5000～10000道尔顿多肽的超滤膜。

本发明人意外发现，完全由某特定大小的多肽进行服用，效果并不好，而分子量不同的多肽以一定的比例混合，得到的鹿肽产品具有更好的效果。

进一步地，获得的分子量范围为700～2000道尔顿的多肽和5000～10000道尔顿的多肽按重量比为3～5:1进行混合，得到所述鹿肽。

本发明还提供了上述的鹿肽的制备方法制得的鹿肽以及含有所述鹿肽的产品。

本发明提供的鹿肽具有提升免疫力以及延缓衰老中均有较好的效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明通过不同的酶进行酶解，得到生物活性肽，该方法操作简便，收率较高，整个过程无有机溶剂的添加，更安全。

(2)本发明通过不同的酶进行酶解，得到的生物活性肽具有明显的提高免疫力、延缓衰老、补肾益气、增强体质等功效。

(3)本发明还意外发现不同大小的多肽配合使用，功效更优。

(3)本发明还意外发现加入双歧杆菌，在酶解的同时进行发酵，得到的多肽不仅收率高，活性还增强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例2中制得的多肽产物的质谱图；

图2为本发明实施例2中制得的多肽产物的质谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种鹿肽，采用以下方法制备：

以鹿肉的重量计，各酶的添加量为：酸性蛋白酶8‰、菠萝蛋白酶8‰、脂肪酶5‰、碱性蛋白酶5‰，取上述酶备用；

新鲜鹿肉，粉碎成肉糜，并去除筋膜和脂肪，调整肉糜的pH为4～4.5；

酸性蛋白酶加入到室温的水中混合，制得的酶解液的质量浓度为30％，然后加入鹿肉肉糜中，混合，于40-50℃酶解3小时；

调整肉糜的pH为6.8～7.2，菠萝蛋白酶加入室温的水中混合，制得的酶解液的质量浓度为25％，然后加入鹿肉肉糜中，混合，于45-50℃酶解2小时；

脂肪酶加入到室温的水中混合，制得的酶解液的质量浓度为25％，然后加入鹿肉肉糜中，混合，于40-50℃酶解2小时；

碱性蛋白酶加入到室温的水中混合，制得的酶解液的质量浓度为15％，然后加入鹿肉肉糜中，混合，于50-65℃酶解2小时；

酶解产物于100℃处理20分钟进行酶灭活，3500转/分钟离心，得到的上清液经超滤膜分离得到700～10000道尔顿多肽则为鹿肽。

以鹿肉的重量计，得到的多肽的收率为10％。

实施例2

一种鹿肽，采用以下方法制备：

酸性蛋白酶加入到38～40℃的温水中混合，制得的酶解液的质量浓度为30％，然后加入鹿肉肉糜中，混合，于40-50℃酶解2小时；

调整肉糜的pH为6.8～7.2，菠萝蛋白酶加入到38～40℃的温水中混合，制得的酶解液的质量浓度为25％，然后加入鹿肉肉糜中，混合，于40-50℃酶解1小时；

脂肪酶加入到38～40℃的温水中混合，制得的酶解液的质量浓度为25％，然后加入鹿肉肉糜中，混合，于40-50℃酶解1小时；

碱性蛋白酶加入到38～40℃的温水中混合，制得的酶解液的质量浓度为15％，然后加入鹿肉肉糜中，混合，于40-50℃酶解1小时；

得到的鹿肽进行质谱鉴定，结果如图1和图2所示。

以鹿肉的重量计，得到的多肽的收率为15％。

实施例3

一种鹿肽，采用以下方法制备：

以鹿肉的重量计，各酶的添加量为：酸性蛋白酶1％、菠萝蛋白酶1‰、脂肪酶1％、碱性蛋白酶1％，取上述酶备用；

酶解产物于95℃处理30分钟进行酶灭活，4000转/分钟离心，得到的上清液经超滤膜分离得到700～10000道尔顿多肽则为鹿肽。

以鹿肉的重量计，得到的多肽的收率为16％。

实施例4

一种鹿肽，采用以下方法制备：

以鹿肉的重量计，各酶的添加量为：酸性蛋白酶1‰、菠萝蛋白酶5‰、脂肪酶1‰、碱性蛋白酶1‰，取上述酶备用；

调整肉糜的pH为6.8～7.2，菠萝蛋白酶加入到38～40℃的温水中混合，制得的酶解液的质量浓度为25％，然后加入鹿肉肉糜中，混合，于40-50℃酶解2小时；

碱性蛋白酶加入到38～40℃的温水中混合，制得的酶解液的质量浓度为15％，然后加入鹿肉肉糜中，混合，于40-50℃酶解2小时；

以鹿肉的重量计，得到的多肽的收率为14％。

实施例5

一种鹿肽，采用以下方法制备：

脂肪酶加入到38～40℃的温水中混合，制得的酶解液的质量浓度为25％，然后加入鹿肉肉糜中，混合，于40-50℃酶解2小时；

酶解产物于100℃处理20分钟进行酶灭活，3500转/分钟离心，得到的上清液经超滤膜分离分别得到700～2000道尔顿的多肽和5000～10000道尔顿的多肽，两者按重量比为3-5:1混合，得到鹿肽。

以鹿肉的重量计，得到的700～2000道尔顿的多肽的收率为8％，5000～10000道尔顿的多肽的收率为5％。

实施例6

一种鹿肽，采用以下方法制备：

双歧杆菌活化，培养至对数生长期，得到双歧杆菌菌液；

酸性蛋白酶加入到38～40℃的温水中混合，制得的酶解液的质量浓度为30％；

酸性蛋白酶的酶液和双歧杆菌菌液加入鹿肉肉糜中，混合，于40-50℃酶解2小时；

以鹿肉的重量计，得到的700～2000道尔顿的多肽的收率为15％，5000～10000道尔顿的多肽的收率为10％。

对比例1

按照申请号为200310115964.2实例1制得的鹿肽。

实验例1

不同实施例以及对比例制得的鹿肽进行动物实验。

实验动物：昆明小鼠，每组10只，雌雄各5只，小鼠体重在18-22g；饲养条件按常规饲养条件进行。

服用剂量分为低和高剂量组，分别为0.5g/(kg.bw)和1.5g/(kg.bw)，进行灌胃服用，对照组给予等体积蒸馏水，每天一次，连续20天后测定以下指标：细胞免疫功能指标、体液免疫功能指标、单核-巨噬细胞指标和NK细胞活性测定。测定方法按照相关标准进行。

结果如表1-表4所示。

表1 细胞免疫功能指标检测结果

表2 体液免疫功能指标的检测结果

表3 单核-巨噬细胞碳粒廓清实验

表4 NK细胞活性测定

从表1-4可以看出，本发明实施例提供的鹿肽具有明显的提升免疫力的功效。

从表1-4可以看出，本发明实施例提供的鹿肽具有显著提升免疫力的功效，特别是不同大小的多肽以一定关系配比的制得的鹿肽效果更佳，而添加双歧杆菌进行发酵水解，也可进一步增强产物的活性。

实验例2

不同实施例以及对比例制得的鹿肽进行动物实验。

衰老实验按照“冬虫夏草提取物延缓衰老实验研究”的方法进行。

服用剂量分为低和高剂量组，分别为0.5g/(kg.bw)和1.5g/(kg.bw)，进行灌胃服用，对照组给予等体积蒸馏水，每天一次，连续30天后测定以下指标。

结果如表5-表7所示。

表5 对学习记忆能力的影响

表6 对衰老小鼠全血CAT、GSH-Px活性的影响

表7 对衰老小鼠全血SOD活性的影响

从表5-7可以看出，本发明实施例提供的鹿肽具有良好的防衰老的效果，特别是不同大小的多肽以一定关系配比的制得的鹿肽效果更佳，而添加双歧杆菌进行发酵水解，也可增强产物的活性。

实验例3

本发明实施例提供的鹿肽还药理毒理实验，均符合相关产品要求。

本发明提供的鹿肽进行低温保存，保存温度为0～-20℃，不加防腐剂，至少保持1年有效期。

本发明实施例5和6制得的鹿肽还进行了食用效果验证，每天早晚食用一次，每次食用10g。具体典型效果实例如表8所示。其中，序号1-10食用实施例6制得的鹿肽，序号11-16食用实施例5制得的鹿肽。

表8 典型效果例

综上可知，本发明提供的鹿肽具有明显的提升免疫力以及延缓衰老的功效，可明显改善相关问题导致的疾病的症状。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种鹿肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：鹿肉粉碎后进行酶解，所述酶解依次采用以下蛋白酶进行：酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、脂肪酶、碱性蛋白酶；

2.根据权利要求1所述的鹿肽的制备方法，其特征在于，所述酸性蛋白酶的酶解pH为4～4.5；所述菠萝蛋白酶的酶解pH优选为6.8～7.2；所述脂肪酶和所述碱性蛋白酶的酶解pH均优选为7.2～7.5。

3.根据权利要求1所述的鹿肽的制备方法，其特征在于，以所述鹿肉的重量计，各酶的添加量为：酸性蛋白酶1％～5‰、菠萝蛋白酶1‰～5‰、脂肪酶1‰～1％、碱性蛋白酶1‰～1％。

4.根据权利要求1所述的鹿肽的制备方法，其特征在于，各酶在进行酶解前，先加水混合，得到酶解液，所述酶解液加入鹿肉粉碎物中混匀，进行酶解；

进一步地，所述酶解液的质量浓度均为15％～30％。

5.根据权利要求3所述的鹿肽的制备方法，其特征在于，所述酸性蛋白酶的酶解时间为2～3小时，所述菠萝蛋白酶的酶解时间为1～2小时，所述脂肪酶的酶解时间为1～2小时，所述碱性蛋白酶的酶解时间为1～2小时；

进一步地，所述酶解的总时间为5～8小时；

进一步地，所述酶解的温度为40～65℃。

6.根据权利要求1所述的鹿肽的制备方法，其特征在于，所述酸性蛋白酶酶解的时候还加入双歧杆菌，所述酶解的温度为40～45℃；

7.根据权利要求1～6任一项所述的鹿肽的制备方法，其特征在于，所述酶灭活为：95～100℃，20～30分钟；

优选地，所述离心的转速为3500～4000转/分钟。

8.根据权利要求7所述的鹿肽的制备方法，其特征在于，所述超滤膜分离为通过截留700～10000道尔顿多肽的超滤膜；

进一步地，所述超滤膜分离为分别通过截留700～2000道尔顿多肽的超滤膜以及截留5000～10000道尔顿多肽的超滤膜；

9.权利要求1～8任一项所述的鹿肽的制备方法制得的鹿肽以及含有所述鹿肽的产品。

10.权利要求9所述的鹿肽在提升免疫力以及延缓衰老方面中的应用。