CN101822711B - 中药复方灌注液的制备方法及用途 - Google Patents
中药复方灌注液的制备方法及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种中药灌注液的制备方法，具体为一种中药复方提取物制备灌注液的制备工艺及其在治疗表浅性膀胱癌上的用途。解决提高苏木类中药提取物在治疗肿瘤方面的应用效果。是由二种中药制成，三七1-5份，苏木5-9份，生产工艺为：水煮提取，石油醚脱脂，乙酸乙脂淬取，减压干燥，水溶过滤，冻干处理。该提取物对膀胱肿瘤细胞有很好的杀伤作用。能够作为制备治疗膀胱癌药物方面的应用。可用于膀胱肿瘤切除术后创面清洗，能起到杀死残留膀胱肿瘤细胞，促进创面愈合，降低术后膀胱肿瘤复发的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药灌注液的制备方法，具体为一种中药复方提取物制备灌注液的制备工艺及其在治疗表浅性膀胱癌上的用途。
背景技术
膀胱癌是较常见的肿瘤之一，约占所有恶性肿瘤的10％左右，是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤。本病男性多发，男女发病率的比例约为4∶1，发病年龄多在40岁以上，且随年龄增大而发病率增加。但近年来30岁以下发病者有所增加，20岁左右的患者也时有所见，总的发病率有上升趋势。初次就诊的患者中70％-80％为表浅性膀胱癌(Superficial Transitional CellCarcinoma，STCC)。表浅性膀胱癌是指包括原位癌(Tis)、Ta及Tl期的所有膀胱肿瘤，不论肿瘤分化程度的高低，都未侵及膀胱肌层。经尿道切除术或者膀胱部分切除术虽然可以切除原发肿瘤，但由于STCC的多中心性和多发性特点，复发率高达30％-85％，且绝大多数术后一年内复发。复发的患者中有30％-40％会进展为浸润性膀胱癌。
为了预防肿瘤的术后复发，目前普遍采用的方式是在手术切除原发病灶后，给予持续的膀胱抗肿瘤药物灌注治疗。膀胱灌注治疗的主要目的如下：1、抗癌药物可以在膀胱内较长时间高浓度直接作用于肿瘤。2、可以杀灭膀胱内术后残余的肿瘤细胞，防止肿瘤细胞种植，降低复发的可能。3、可以减少全身用药的毒副作用。4、可以保留膀胱，不仅生活方便，且可保留性功能。5、阻止肿瘤恶性程度的进展。
常用的术后膀胱灌注治疗的药物分为两大类：化疗药物和免疫调节剂类药物。化疗药主要包括丝裂霉素(MMC)、表阿霉素和吡柔比星等，是目前国内的一线用药，国外多中心前瞻性对照研究证明都能够不同程度降低近期(≤2年)复发率，但对远期复发率(≥5年)及生存率的改善不明显。
分析影响效果的重要原因之一就是肿瘤细胞的耐药性，包括原发性耐药和获得性耐药，降低甚至消除了药物效果。
现国外应用较多的药物为卡介苗(BCG)，是目前治疗和预防表浅性膀胱癌最有效的药物之一。其优势在于能够降低近期复发率，同时阻止肿瘤进展，从而提高了远期疗效。但由于BCG毒副作用大，不能在肿瘤切除后立即使用，从而影响了预防肿瘤细胞种植的作用。
目前还没有发现关于这种中药提取物在治疗膀胱癌方面的研究报道。
发明内容
本发明为了解决提高苏木类中药提取物在治疗肿瘤方面的应用效果而提供了一种中药复方提取物制备灌注液的制备工艺及其在作为治疗膀胱癌药物方面的应用。
本发明是由以下技术方案实现的，一种中药复方提取物制备灌注液，是由二种中药制成，三七1-5质量份，苏木5-9质量份，生产工艺为：水煮提取，石油醚脱脂，乙酸乙脂淬取，减压干燥，水溶过滤，冻干处理。
该提取物对膀胱肿瘤细胞有很好的杀伤作用。能够作为制备治疗膀胱癌药物方面的应用。可用于膀胱肿瘤切除术后创面清洗，能起到杀死残留膀胱肿瘤细胞，促进创面愈合，降低术后膀胱肿瘤复发的作用。
三七为五加科植物三七(Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen)的根，含有多种化学成分，其中三七总皂苷(PNS)为主要有效活性成分之一，其药理作用非常广泛。三七水溶性成分能缩短小鼠的凝血时间，使血小板数量显著增加(中国野生植物资源，2000，19(1)：10)。还能通过改善血管内皮功能，改善血流状态，改善血液成分，达到抑制血小板粘附和聚集，防止血栓形成的目的(三七总皂苷干预血栓形成研究概况，云南中医中药杂志，2003，24(5)：46-47)。
三七皂苷RG3能抑制前列腺癌LNCaP细胞的增生，对lewis肺癌也有明显的抑制作用。此外三七总皂苷还有显著的抗炎镇痛作用，能减轻组织水肿、炎症、变性坏死，加快病灶清除和组织修复，对机体起到保护作用，是一种常用的创伤外用药，适合于术后清创，加速创伤修复。
苏木(Lignum Sappan)为豆科(Leguminosae)云实属植物苏木(Caesalpinia sappan L.)的干燥心材，产于我国广西、云南等地，有行血祛瘀、消肿止痛的功能，其水提物对多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用。我们曾就此申报了名为“具有抗肿瘤作用的灌洗液的制备方法”的专利，申请号：200910074345.0。在之后的研究中我们发现一定比例的三七与苏木的混合提取物具有更为有效的抗肿瘤作用。两者合用能起到减毒增效的作用。膀胱肿瘤术后使用具有消炎止痛，活血止血，促进创伤组织修复，降低术后肿瘤复发率的作用。
制备工艺为：
1、将两种药材粉碎，按比例称取；
2、加入4-5倍重量的纯化水浸泡2-3小时；
3、煮沸提取60分钟后，倾出提取液，再加3-4倍体积量纯化水煮沸保持50分钟，倾出提取液，再加3-4倍体积量纯化水煮沸保持40分钟，倾出提取液；
4、合并三次提取液，减压浓缩(60-80℃)到干药材重量的1.5-1.6倍；
5、将浓缩后的药液置4℃，放置24-36小时，过滤，去掉沉渣；
6、浓缩液中加入等体积量石油醚，充分摇匀，静置，取水相；
7、分5次加入等体积量的乙酸乙脂淬取。
8、减压挥去乙酸乙脂(30-40℃)，加入与药材等重量的纯化水溶解，置4℃放置24小时；
9、过滤除去沉淀，加入1.5倍药材重量的纯化水混匀，灌装，高压灭菌后即可使用(液体型)或过滤除去沉淀后冷冻干燥；无菌分装，封口，即成(干粉型)。使用时用蒸馏水融化即可成为灌注液直接使用。
细胞学研究资料
不同比例混合提取物对膀胱癌细胞株T24的杀伤作用比较：
本实验采用活细胞拒染法检测药物对靶细胞的杀伤作用，其原理是正常活细胞对台盼兰染料有拒染性，细胞死亡后可以被染成兰色。药物与细胞混合培养一定时间后，细胞与染液混合，显微镜下观察，可以根据细胞是否着色来判断细胞的死活。
材料
1、靶细胞人膀胱癌细胞株T24，购于中科院上海生命科学院。
2、染液台盼兰染料(Trypan Blue)，sigma公司产品，以生理盐水配制成含量为0.4％的溶液。
3、药物组方：(1)三七50g、苏木50g。(2)三七40g苏木60g。(3)三七30g、苏木70g。(4)三七20g、苏木80g。(5)三七10g、苏木90g。(6)三七0g、苏木100g。
4、药物提取方法：
药材适当粉碎，加水浸泡2小时，煮沸提取3次，每次加水量分别是药材总量的4倍、3倍、3倍，合并提取液，浓缩成含量为100％的水提取液，加等量石油醚淬取一次，取水相，加等量乙酸乙脂淬取5次，合并乙酸乙脂相，减压干燥，收集干粉，用生理盐水配制成含量为2mg/ml的溶液，用于细胞实验。
5、实验方法：消化收集处于对数生长期的靶细胞，以不含血清的RPMI1640调整细胞密度为1×107/ml。取细胞悬液0.1ml加入24孔细胞培养板中，加入各种待测药液0.9ml，对照组不加药，每组药液均设4个复孔，置37℃，5％CO2饱和温度恒温培养箱中，分别于0、20、40、60、80、100分钟时，取细胞悬液0.1ml，加等量台盼兰染液，轻轻混匀，滴加到细胞计数板上，置100倍光学显微镜下计数4个大格内(约150-200个)的细胞总数，分别计数活细胞(未着色的细胞)和死细胞(染成兰黑色的细胞)数，按公式：(细胞总数-活细胞数)/细胞总数×100，求出细胞杀伤百分率。按不同时间点绘制细胞杀伤率曲线图，进行比较。
6、结果：
对照组细胞活性良好，平均活细胞率大于98％，实验各组按照对靶细胞的杀伤作用由强到弱排列依次为5#、6#、4#、3#、2#、1#，综合比较，以5#、6#、4#、组方对靶细胞的杀伤作用较好(见表1、图1)
表1：各组药物不同时间对靶细胞的杀伤作用(X±S)
动物实验研究资料
复方洗液对荷瘤小鼠的生命延长作用
1、细胞株：小鼠肝癌细胞H22购自河北医科大学实验动物中心，小鼠肉瘤S180购自中国药品生物制品鉴定所，细胞株置液氮中冷冻保存。
2、动物：清洁级KM小鼠，雌雄兼用，体重18-22g，购自山西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(晋)2009-0001。动物实验在山西省肿瘤研究所动物实验室内进行，实验室许可证号：SYXK(晋)2007-0002。
3、实验方法：无菌抽取接种后第7-8天小鼠腹水，以PBS调整细胞密度为5×107/ml，台盼兰检测活细胞率大于98％，每只动物腹腔内接种0.2ml细胞悬液。接种后动物随机分组，每组10只，分别设空白对照组、顺铂组、复方高剂量组(简称复方高)、复方中剂量组(简称复方中)、复方低剂量组(简称复方低)。药物按实验1方法提取，制备成含量为2％的灌注液使用。接种后24小时开始腹腔注射给药，每天给药一次，连续给药6天，给药剂量见表2，观察动物生存时间，每隔3天记录体重，观察时间为60天，生存时间大于60天者按60天统计，分别计算各组动物平均生存时间，进行组间比较。
4、结果：
(1)对荷肝癌H22小鼠的生命延长作用 对照组动物平均生存时间为17.3±5.1天，各给药组动物按生命延长率由高到低依次为复方高→顺铂→复方中→复方低。综合比较复方高剂量组对H22肿瘤细胞有较好的抑制作用(见表2)。
表2 复方灌注液对H22荷瘤小鼠生命延长率作用(X±S)
| 组别 | 动物数开始/结束 | 给药剂量Mg.Kg-1×d | 平均生存天数(d) | 生命延长率(％) | P值 |
| 对照组 | 10/0 | 17.3±5.1 | |||
| 顺铂 | 10/1 | 2×6 | 38.6±9.6** | 123.12 | P＜0.001 |
| 复方高 | 10/2 | 300×6 | 43.1±8.3** | 149.13 | P＜0.001 |
| 复方中 | 10/0 | 200×6 | 39.4±6.7** | 127.75 | P＜0.001 |
| 复方低 | 10/0 | 100×6 | 37.5±8.6** | 116.76 | P＜0.001 |
注：与对照组比较，**P＜0.001
(2)对荷肉瘤S180小鼠的生命延长作用对照组动物平均生存时间为19.2±4.1天，各给药组按照生存时间由长到短依次为复方高→顺铂→复方中→复方低。综合比较复方高效果较好，复方中、低效果较差(见表3)，表明复方洗液在适当剂量下对S180有显著的抑制作用。
表3 复方灌注液对S180荷瘤小鼠生命延长率作用(X±S)
| 组别 | 动物数开始/结束 | 给药剂量Mg.Kg-1×d | 平均生存天数(d) | 生命延长率(％) | P值 |
| 对照组 | 10/0 | 19.3±4.1** | |||
| 顺铂 | 10/0 | 2×6 | 40.7±6.1** | 111.98 | P＜0.001 |
| 复方高 | 10/3 | 300×6 | 44.1±8.7** | 129.69 | P＜0.001 |
| 复方中 | 10/0 | 200×6 | 37.1±6.9** | 93.23 | P＜0.001 |
| 复方低 | 10/0 | 100×6 | 38.5±9.0** | 100.752 | P＜0.001 |
注：与对照组比较，**P＜0.001
临床研究资料
本灌注液在临床使用过程中，采用与传统方疗药物相同的灌注方式，即表浅性膀胱癌术后6-8小时开始灌注，每次40ml，药液在膀胱内保留80-100分钟，然后自行排出。术后连续灌注6-8次，然后改为每周灌注一次，连续灌注8周，然后改为每月灌注一次，连灌8次，即总计一年内灌注22-24次。
灌注期间每隔3月作一次膀胱镜检查，如果发现复发即改用其它药物灌注，同时按复发记录，并记录不良反应发生情况，共观察患者50例，观察时间为12个月，结果如下(见表4)。
表4 复灌注液的初步临床疗效观察
| 初发组 | 36 | 27-79 | 0 | 1(1.7) | 1(1.7) | 2(3.4) |
| 复发组 | 23 | 41-81 | 1(1.7) | 3(5.1) | 2(3.4) | 6(10.17) |
| 合计 | 59 | 27-81 | 1(1.7) | 4(6.8) | 3(5.1) | 8(13.56) |
观察结果表明，复方灌注液对表浅性膀胱癌术后复发有显著的治疗效果，用药后初发组一年的复发率仅为3.4％，复发组为10.7％。两组合计术后1年的复发率仅为13.56％，明显低于传统治疗方法的35-45％年复发率，而且患者的不良反应发生率也较化疗药物组明显降低，是一种有很好临床应用价值的药物。
附图说明
图1为各组药物不同时间对靶细胞的杀伤作用
具体实施方式
实施例1、一种中药复方提取物制备灌注液，是由二种中药制成，三七1份，苏木9份，制备工艺为：
1、将两种药材粉碎，按比例称取；
2、加入5倍重量的纯化水浸泡2小时；
3、煮沸提取60分钟后，倾出提取液，再加4倍体积量纯化水煮沸保持50分钟，倾出提取液，再加3倍体积量纯化水煮沸保持40分钟，倾出提取液；
4、合并三次提取液，减压浓缩(60-80℃)到干药材重量的1.5-1.6倍；
5、将浓缩后的药液置4℃，放置36小时，过滤，去掉沉渣；
6、浓缩液中加入等体积量石油醚，充分摇匀，静置，取水相；
7、分5次加入等体积量的乙酸乙脂淬取。
8、减压挥去乙酸乙脂(30-40℃)，加入与药材等重量的纯化水溶解，置4℃放置24小时；
9、过滤除去沉淀，加入1.5倍药材重量的纯化水混匀，灌装，高压灭菌后即可使用(液体型)或过滤除去沉淀后冷冻干燥；无菌分装，封口，即成(干粉型)。
实施例2、一种中药复方提取物制备灌注液，是由二种中药制成，三七5份，苏木5份，制备工艺为：
1、将两种药材粉碎，按比例称取；
2、加入4倍重量的纯化水浸泡3小时；
3、煮沸提取60分钟后，倾出提取液，再加4倍体积量纯化水煮沸保持50分钟，倾出提取液，再加3-4倍体积量纯化水煮沸保持40分钟，倾出提取液；
4、合并三次提取液，减压浓缩(60-80℃)到干药材重量的1.5-1.6倍；
5、将浓缩后的药液置4℃，放置24小时，过滤，去掉沉渣；
6、浓缩液中加入等体积量石油醚，充分摇匀，静置，取水相；
7、分5次加入等体积量的乙酸乙脂淬取。
8、减压挥去乙酸乙脂(30-40℃)，加入与药材等重量的纯化水溶解，置4℃放置24小时；
9、过滤除去沉淀，加入1.5倍药材重量的纯化水混匀，灌装，高压灭菌后即可使用(液体型)或过滤除去沉淀后冷冻干燥；无菌分装，封口，即成(干粉型)。
实施例3、一种中药复方提取物制备灌注液，是由二种中药制成，三七4份，苏木8份，制备工艺为：
1、将两种药材粉碎，按比例称取；
2、加入5倍重量的纯化水浸泡3小时；
3、煮沸提取60分钟后，倾出提取液，再加3倍体积量纯化水煮沸保持50分钟，倾出提取液，再加3-4倍体积量纯化水煮沸保持40分钟，倾出提取液；
4、合并三次提取液，减压浓缩(60-80℃)到干药材重量的1.5-1.6倍；
5、将浓缩后的药液置4℃，放置24-36小时，过滤，去掉沉渣；
6、浓缩液中加入等体积量石油醚，充分摇匀，静置，取水相；
7、分5次加入等体积量的乙酸乙脂淬取。
8、减压挥去乙酸乙脂(30-40℃)，加入与药材等重量的纯化水溶解，置4℃放置24小时；
9、过滤除去沉淀，加入1.5倍药材重量的纯化水混匀，灌装，高压灭菌后即可使用(液体型)或过滤除去沉淀后冷冻干燥；无菌分装，封口，即成(干粉型)。
Claims (3)
1.一种中药复方提取物制备灌注液，其特征在于：是由二种中药，三七1-5份，苏木5-9份，通过水提取制成。
2.根据权利要求2所述的中药复方提取物制备灌注液，其特征在于：制备工艺为：
(1)、将两种药材粉碎，按比例称取；
(2)、加入4-5倍重量的纯化水浸泡2-3小时；
(3)、煮沸提取60分钟后，倾出提取液，再加3-4倍体积量纯化水煮沸保持50分钟，倾出提取液，再加3-4倍体积量纯化水煮沸保持40分钟，倾出提取液；
(4)、合并三次提取液，减压浓缩到干药材重量的1.5-1.6倍；
(5)、将浓缩后的药液置4℃，放置24-36小时，过滤，去掉沉渣；
(6)、浓缩液中加入等体积量石油醚，充分摇匀，静置，取水相；
(7)、分5次加入等体积量的乙酸乙脂淬取；
(8)、减压挥去乙酸乙脂，加入与药材等重量的纯化水溶解，置4℃放置24小时；
(9)、过滤除去沉淀，加入1.5倍药材重量的纯化水混匀，灌装，高压灭菌后即可使用或过滤除去沉淀后冷冻干燥。
3.一种如权利要求1或2所述的中药复方提取物制备灌注液，作为制备治疗膀胱癌药物方面的应用。
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