CN112870245B - 一种抗幽门螺杆菌青果提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于提取物及提取技术领域，具体涉及一种抗幽门螺杆菌青果提取物的制备方法，本发明先通过水提取方法得到青果水提物，然后以乙酸乙酯为溶剂进行萃取得到青果提取物，该方法够富集青果抗幽门螺杆菌的主要活性物质，从而提高青果提取物的抗菌活性，与传统的青果水提物相比，本发明提取得到的青果提取物抗幽门螺杆菌的MIC大幅度变小，体外抗菌活性明显增强。

Description

一种抗幽门螺杆菌青果提取物的制备方法

技术领域

本发明属于提取物及提取技术领域，具体涉及一种抗幽门螺杆菌青果提取物的制备方法。

背景技术

全球约有一半的人感染幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)，在发展中国家感染率甚至更高。幽门螺杆菌感染可导致慢性胃炎、消化性胃溃疡、胃癌等疾病，因此，幽门螺杆菌被世卫组织列为一类致癌原。流行病学、分子研究、动物研究和临床荟萃分析等的众多证据都证实了根除Hp能降低患者的胃癌发病率。目前，针对Hp感染的常规治疗是抗生素三联或四联疗法，但随着抗生素耐药率的不断升高，这些疗法的根除率逐步下降，因此，开发新的抗Hp感染药物具有重要的意义。

青果即橄榄的成熟果实，因其呈青绿色而得名，主产于福建、四川、广东、广西、云南等地，具有清热解毒、利咽生津等功效，用于治疗咽喉肿痛，咳嗽，烦渴，鱼蟹中毒等。青果富含蛋白质、多糖、多酚类、黄酮类、萜类等成分，具有解酒护肝、抗癌抑癌、抗炎抑菌等多种药理活性。有研究发现，青果对猪源Hp的最小抑菌浓度(MIC)为3.12mg/mL，在25味清热解毒药中属于强度抑菌药(荣茜,代鹏飞,邓林,等.25味常用清热解毒药提取物对猪源幽门螺杆菌的体外抑菌活性[J].浙江农业学报,2016,28(01):38-43)。与药品类产品相比，青果被列入卫计委发布的既是食品又是中药材的传统物质目录，具有更加安全便捷的优势，正常食用几无不良反应，应用前景更加广阔。

传统用法通常采用水煎煮法得到青果水提物，但水提物的Hp抗菌活性不强，往往需要采用较大剂量才能有一定的抑菌效果。因此，开发抗菌活性更强、用量更少的青果提取物具有重要的价值。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种抗幽门螺杆菌青果提取物的制备方法，该方法够富集青果抗Hp的主要活性物质，从而提高青果提取物的抗菌活性。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供了一种抗幽门螺杆菌青果提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、药材的处理：对青果进行清洗、干燥，并粉粹成药材粗粉；

S2、水提取：采用水提取方法对步骤S1的药材粗粉进行提取，得到青果水提物；

S3、乙酸乙酯萃取：以乙酸乙酯为溶剂，对步骤S2的青果水提物进行萃取即可得到青果提取物。

本发明通过研究发现，采用本发明方法提取得到的青果提取物，其抗Hp的MIC大幅度降低，体外抗菌活性明显增强(与传统用的青果水提取相比)，说明本发明方法够富集青果抗Hp的主要活性物质，从而提高青果提取物的抗菌活性。同时发现，本发明的青果提取物对Hp的抑制效果呈浓度依赖性，青果提取物浓度越大，抑制效果越明显，当青果提取物的浓度为156μg/mL时，基本抑制了Hp的增长。此外还发现，本发明的青果提取物与临床治疗Hp感染常用的抗生素联用时，具有减少临床应用抗生素用量的效果，对于改善抗生素的耐药现状具有潜在的应用价值。

优选地，步骤S3所述的乙酸乙酯萃取方法为：步骤S3所述的乙酸乙酯萃取方法为：往青果水提物中加入乙酸乙酯，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止，合并萃取液，即得青果提取物。

进一步地，所述乙酸乙酯与青果水提物的体积比(v:v＝mL:mL)为(2～4):1。具体地，乙酸乙酯与青果水提物的体积比为3:1。

优选地，S3还包括浓缩和冷冻干燥步骤，即所制备得到的青果提取物为青果提取物冻干粉。

优选地，步骤S2的水提取方法为：按1:(10～14)的料液比往药材粗粉中加水，然后置于(80～100)℃下热回流提取(1～3)h，收集滤液经浓缩后得到青果水提物。

进一步地，热回流提取后的滤渣再进行二次提取，合并两次滤液后再进行下一步的浓缩工作。

进一步地，步骤S2的水提取方法为：按1:12的料液比往药材粗粉中加水，然后置于90℃下热回流提取2h，收集滤液经浓缩后得到青果水提物。

具体地，步骤S2所述的浓缩为浓缩至药材粗粉与滤液的料液比为1:5。

优选地，所述青果选择无虫口、不褐变的青果。

优选地，步骤S1中，粉粹后的青果过1～3号筛得到药材粗粉。具体地，粉粹后的青果过2号筛得到药材粗粉。

本发明还提供了采用上述的制备方法制备得到的抗幽门螺杆菌青果提取物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提出了一种抗幽门螺杆菌青果提取物的制备方法，即先通过水提取方法提取得到青果水提物，然后以乙酸乙酯为溶剂，对青果水提物进行萃取即可得到青果提取物，采用本发明方法够富集青果抗Hp的主要活性物质，从而提高青果提取物的抗菌活性，与常用的青果水提取相比，本发明提取得到的青果提取物，抗Hp的MIC大幅度降低，体外抗菌活性明显增强。

附图说明

图1为本发明的青果提取物抗Hp的时间-抑菌曲线。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。

实施例1一种青果提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)药材的处理：选择无虫口、不褐变的青果，清水洗净后置于60℃烘箱中烘至干燥，烘干时长为24h，捶碎后放入粉碎机中进行粉碎，过2号筛成药材粗粉；

(2)水提取：称取10g药材粗粉于250mL圆底烧瓶内，加入12倍量(料液比w:v＝g:mL)二级水，置于90℃水浴中热回流提取2h，过滤，收集滤液；残渣继续加入12倍量二级水进行提取，合并两次滤液；滤液用旋转蒸发仪浓缩至50mL，得到青果水提物；

(3)乙酸乙酯萃取：上述青果提取物转移至500mL分液漏斗中，加入3倍量(体积比v:v＝mL:mL)乙酸乙酯，然后进行萃取，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止(通常萃取4-5次)，合并萃取液，在50℃水浴下用旋转蒸发仪挥干溶剂，残渣加15mL水复溶，溶液转移至玻璃平皿，用保鲜膜封口并扎孔，置于-80℃预冻过夜后，于冷冻干燥机中干燥24h，即得青果乙酸乙酯萃取物冻干粉，即青果提取物冻干粉。

实施例2一种青果提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)药材的处理：选择无虫口、不褐变的青果，清水洗净后置于60℃烘箱中烘至干燥，烘干时长为24h，捶碎后放入粉碎机中进行粉碎，过1号筛成药材粗粉；

(2)水提取：称取10g药材粗粉于250mL圆底烧瓶内，加入10倍量(料液比w:v＝g:mL)二级水，置于80℃水浴中热回流提取3h，过滤，收集滤液；残渣继续加入10倍量二级水进行提取，合并两次滤液；滤液用旋转蒸发仪浓缩至50mL，得到青果水提物；

(3)乙酸乙酯萃取：上述青果水提物转移至500mL分液漏斗中，加入2倍量(体积比v:v＝mL:mL)乙酸乙酯，然后进行萃取，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止(通常萃取4-5次)，合并萃取液，在50℃水浴下用旋转蒸发仪挥干溶剂，残渣加15mL水复溶，溶液转移至玻璃平皿，用保鲜膜封口并扎孔，置于-80℃预冻过夜后，于冷冻干燥机中干燥24h，即得青果乙酸乙酯萃取物冻干粉，即青果提取物冻干粉。

实施例3一种青果提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)药材的处理：选择无虫口、不褐变的青果，清水洗净后置于60℃烘箱中烘至干燥，烘干时长为24h，捶碎后放入粉碎机中进行粉碎，过3号筛成药材粗粉；

(2)水提取：称取10g药材粗粉于250mL圆底烧瓶内，加入14倍量(料液比w:v＝g:mL)二级水，置于100℃水浴中热回流提取1h，过滤，收集滤液；残渣继续加入14倍量二级水进行提取，合并两次滤液；滤液用旋转蒸发仪浓缩至50mL，得到青果水提物；

(3)乙酸乙酯萃取：上述青果水提物转移至500mL分液漏斗中，加入4倍量(体积比v:v＝mL:mL)乙酸乙酯，然后进行萃取，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止(通常萃取4-5次)，合并萃取液，在50℃水浴下用旋转蒸发仪挥干溶剂，残渣加15mL水复溶，溶液转移至玻璃平皿，用保鲜膜封口并扎孔，置于-80℃预冻过夜后，于冷冻干燥机中干燥24h，即得青果乙酸乙酯萃取物冻干粉，即青果提取物冻干粉。

实验例1用微量肉汤法测定青果提取物对不同Hp标准菌株和临床菌株的MIC

(1)Hp标准菌株及临床耐药菌株：Hp标准菌株：ATCC43504购自美国模式培养物集存库(American type culture collection)，ATCC700392由南京医科大学毕洪凯教授赠予，鼠源菌株SS1由上海理工大学刘菁教授赠予；临床分离株：CS01由上海理工大学刘菁教授赠予，LQ2#由深圳伯劳特公司赠予，QYZ-001、003、004由清远中医院赠予。以上菌株均保存于-80℃冰箱。

(2)测试样品：实施例1的青果提取物(即乙酸乙酯萃取物)、青果水提物(对照样品)。

(3)测定方法：按二倍稀释法配制多个浓度梯度的青果提取物药液(625μg/mL、312μg/mL、156μg/mL、78μg/mL、39μg/mL等)，分别吸取50μL上述药液加入到96孔板中，每个药物浓度设置3个复孔，并设置阴性对照孔(只含有药物、不接种菌株)、生长对照孔(不含任何药物、只接种菌株)。从培养箱中取出菌株，用润湿的灭菌棉签刮取菌苔至脑心浸出液中制成菌悬液，用含20％胎牛血清的脑心浸出液调节菌悬液的浊度为1McF，稀释10倍后，于上述含药96孔板中每孔接种50μL，立即将96孔板置于三气培养箱中，37℃、微需氧条件、150rpm的条件下振荡培养72h后取出观察结果。以生长对照呈现纽扣状或明显浑浊时的结果为标准，可观察到澄清孔的最小药物浓度即为MIC。

由表1可知，青果提取物与水提物相比，MIC大幅度降低、体外抗菌活性明显增强，说明采用乙酸乙酯萃取能够富集青果抗Hp的主要活性物质，提高Hp的抗菌活性。

表1青果提取物对不同Hp菌株的MIC

此外，实施例2和实施例3的青果提取物的MIC与实施例1无显著差异(P<0.05)。实验例2通过时间-抑菌曲线动态监测青果提取物对ATCC 43504的抑菌效果

(1)Hp标准菌株：ATCC 43504，保存于-80℃冰箱。

(2)测试样品：本发明的青果提取物(即乙酸乙酯萃取物)。

(3)测定方法：按二倍稀释法配制多个浓度梯度的青果提取物药液(312μg/mL、156μg/mL、78μg/mL、39μg/mL等)，以不含药液的肉汤(无药肉汤)作为生长对照组。从培养箱中取出菌株ATCC 43504，用湿润的灭菌棉签刮下细菌至脑心浸出液中制成菌悬液，用含20％胎牛血清的脑心浸出液调节将菌悬液的浊度调节至1McF后稀释10倍，按照菌悬液：药液/无药肉汤＝1：1的比例于6孔板中每孔接种2mL菌悬液—药液/无药肉汤的混合液，然后放置于三气培养箱中，在37℃、微需氧环境、150rpm的条件下进行振荡培养，在0h、8h、12h、24h、28h、36h、48h、60h、72h吸取100μL培养液测量OD_600nm，吸光度值越大则代表细菌数量越多。

由图1可知，青果提取物对Hp的抑制效果呈浓度依赖性，青果提取物浓度越大，抑制效果越明显，当青果提取物的浓度为156μg/mL时，基本抑制了Hp的增长。

此外，实施例2和实施例3的青果提取物的抑菌效果与实施例1一致。

实验例3通过棋盘稀释法测定青果提取物与抗生素联用对Hp SS1的效果

(1)Hp标准菌株：SS1，保存于-80℃冰箱。

(2)测试样品：本发明的青果提取物(即乙酸乙酯萃取物)、阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星。

(3)测定方法：按二倍稀释法配制多个浓度梯度的青果提取物药液(1250μg/mL、625μg/mL、312μg/mL、156μg/mL、78μg/mL、39μg/mL等)，并以相同的方法配制不同浓度的抗生素药液(阿莫西林0.1～3.2μg/mL、克拉霉素0.004～0.125μg/mL、甲硝唑0.2～6.4μg/mL、左氧氟沙星0.4～12.8μg/mL)。从培养箱中取出菌株SS1，用湿润的灭菌棉签刮下细菌至肉汤中，用脑心浸出液将菌悬液的浊度调节至1McF后稀释10倍，根据微量肉汤棋盘稀释法按照菌悬液：青果提取物药液：抗生素药液＝2：1：1的比例于96孔板中每孔接种120μL菌悬液—青果提取物药液—抗生素药液的混合液，然后放置于三气培养箱中，37℃、微需氧环境、150rpm的条件下振荡培养72h，以可观察到明显澄清孔时的浓度为最小联合抑菌浓度，联合抑菌指数FICI＝MIC_{(联合给药的青果提取物MIC)}/MIC_{(单独给药的青果提取物MIC)}+MIC_{(联合给药的抗生素MIC)}/MIC_{(单独给药的抗生素MIC)}，当FICI≤0.5时，为协同效应；当0.5<FICI<1时，为部分协同效应；当FICI＝1时，为相加效应；当1<FICI<4时，为无关效应；当FICI≥4时，为拮抗效应。

由表2可知，本发明的青果提取物与临床治疗Hp感染常用的抗生素联用时，呈相加或无关效应，但联用可以降低抗生素的MIC，具有减少临床应用抗生素用量的效果，对于改善抗生素的耐药现状具有潜在的应用价值。

此外，实施例2和实施例3的青果提取物的联用效果与实施例1一致。

表2青果提取物与抗生素联用抗Hp的效果

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.青果提取物在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用，其特征在于，所述青果提取物的制备方法包括以下步骤：

S1、药材的处理：对青果进行清洗、干燥，并粉碎成药材粗粉；

S2、水提取：采用水提取方法对步骤S1的药材粗粉进行提取，即按1:(10～14)的料液比往药材粗粉中加水，然后置于(80～100)℃下热回流提取(1～3)h，收集滤液经浓缩后得到青果水提物；

S3、乙酸乙酯萃取：以乙酸乙酯为溶剂，对步骤S2的青果水提物进行萃取即可得到青果提取物，所述乙酸乙酯与青果水提物的体积比为(2～4):1。

2.青果提取物和治疗幽门螺杆菌的抗生素在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用，其特征在于，所述青果提取物的制备方法与权利要求1相同，所述抗生素为克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、阿莫西林中的一种。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤S3所述的乙酸乙酯萃取方法为：往青果水提物中加入乙酸乙酯，萃取至水层与有机层无明显颜色变化为止，合并萃取液，即得青果提取物。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤S2的水提取方法为：按1:12的料液比往药材粗粉中加水，然后置于90℃下热回流提取2h，收集滤液经浓缩后得到青果水提物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述浓缩为浓缩至药材粗粉与滤液的料液比为1:5。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述青果选择无虫口、不褐变的青果。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，步骤S1中，粉粹后的青果过1～3号筛得到药材粗粉。

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