CN113116968B - 地榆非药用部位的提取及在抗幽门螺旋杆菌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于地榆资源化利用技术领域，具体涉及地榆非药用部位的提取及在抗幽门螺旋杆菌中的应用，本发明提供的地榆非药用部位的提取方法，使用的是地榆的非药用部位，能够充分利用地榆药材资源、弥补市场空白、传承中药文化、合理开发药用资源、提高地榆的经济价值，为扩大地榆在抗幽门螺杆菌中的应用提供了科学依据，具有广阔的应用前景。

Description

地榆非药用部位的提取及在抗幽门螺旋杆菌中的应用
技术领域
本发明属于地榆资源化利用技术领域，具体涉及地榆非药用部位的提取及在抗幽门螺旋杆菌中的应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，Hp)是一种螺旋状的，微需氧的革兰氏阴性杆菌，是唯一能在人体胃酸中生存的细菌，全球有一半以上人口感染，早在1994年世界卫生组织下属的国际肿瘤研究机构就将Hp列为胃癌的第一类致癌原。研究表明Hp感染与慢性活动性胃炎，消化性胃溃疡，胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤及胃癌均有关系。此外，还有研究发现Hp感染与不明原因的缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜和维生素B12缺乏等胃肠道外的疾病也有关。目前，针对Hp的清除治疗主要为标准三联疗法和铋剂四联疗法，其他治疗方案还包括伴同疗法、序贯疗法、混合疗法和微生态制剂疗法等。但是上述方法大多涉及抗生素的使用，而抗生素的滥用以及大剂量、长时间使用，都会导致Hp对抗生素的耐药率大幅增加。因此，研发新一代安全有效的抗幽门螺杆菌药物，具有十分重大的意义。
地榆(Sanguisorba officinalis L.)为地榆属蔷薇科植物，广泛分布于亚洲、西欧、北美等地区，全球有30个种及9个变种，其中的7个种主要分布在我国的东北、东南和北部地区。地榆作为一种中药材，在我国始载于汉代的《神农本草经》，距今已有2000多年的应用历史。地榆可外用也可内服，具有凉血止血，解毒敛疮的功效，用于便血，痔血，血痛，崩漏，水火烫伤，痈肿疮毒等。现代研究表明地榆有多种药理学作用，主要包括抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌、止血、抗肿瘤以及促进造血、增强免疫功能、神经保护、降血糖作用等。
地榆作为传统的中药材，主要是以根为入药部位，在中国、韩国、日本都深受欢迎，因此地榆的需求量很大，导致地榆被大量采挖，除其根部留作药用外，其余的地上部分均被遗弃掉，造成了地榆药材资源的严重浪费。因此，开发地榆非药用部位的资源化利用方法对于提高地榆的经济价值具有重要的意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了地榆非药用部位的提取方法，既避免了地榆药材的浪费，又拓展了地榆在抗幽门螺杆菌中的应用价值。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种地榆非药用部位提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1、选择生长状态良好的地榆，分别摘取地榆非药用部位，冲洗干净后烘干，粉碎并过30-50目筛使成药材细粉；
S2、按1：(8-12)的料液比往地榆非药用部位细粉中加水浸泡20-40min，然后置于80-90℃的水浴中提取1-3h，冷却至室温，离心抽滤后保留滤液，残渣加水进行二次提取，共提取三次，得到地榆非药用部位提取物。
优选地，所述地榆非药用部位包括地榆花、地榆茎和地榆叶。以往的地榆除地榆根部外，地榆花、地榆茎和地榆叶等非药用部位一般都被遗弃掉，造成了地榆药材资源的严重浪费，本发明通过对地榆花、地榆茎和地榆叶进行提取，使它们具有可利用的价值，从而促进了地榆的资源化利用。
优选地，地榆非药用部位细粉与水的料液比为1：10。
优选地，水浴提取的温度为85℃，时间为1h，水浴提取先浸泡30min。在此提取条件下，可以使地榆非药用部位的有效活性成分得到充分的提取，从而提升了地榆非药用部位的利用价值。
优选地，药材细粉为经过40目筛后制备得到。该种尺寸的药材细粉有利于地榆非药用部位有效成分的浸出，从而达到最大化的利用地榆的目的。
本发明还提供了采用上述的方法提取得到的地榆非药用部位提取物。
本发明还提供了上述的地榆非药用部位提取物在抗幽门螺旋杆菌中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了地榆非药用部位的提取方法，使用的是地榆的非药用部位，能够充分利用地榆药材资源、弥补市场空白、传承中药文化、合理开发药用资源、提高地榆的经济价值，为扩大地榆在抗幽门螺杆菌中的应用提供了科学依据，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为地榆花水提物对Hp ATCC 43504的时间-抑菌曲线；
图2为地榆茎水提物对Hp ATCC 43504的时间-抑菌曲线；
图3为地榆叶水提物对Hp ATCC 43504的时间-抑菌曲线；
图4为地榆花水提物对Hp ATCC 43504的时间-杀菌曲线；
图5为地榆茎水提物对Hp ATCC 43504的时间-杀菌曲线。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1地榆非药用部位的提取
(1)药材的处理
选择生长状态良好的地榆，分别摘取地榆花、地榆茎和地榆叶，用水冲洗干净后置于60℃烘箱中过夜烘干，用粉碎机分别将地榆花、地榆茎和地榆叶粉碎，过40目筛使成药材细粉，分别得到地榆花细粉、地榆茎细粉和地榆叶细粉。
(2)水提物的制备
分别称取10g地榆花细粉、地榆茎细粉和地榆叶细粉于圆底烧瓶中，加入10倍量(料液比：w:v＝1：10)去离子水浸泡30min，然后置于85℃的水浴中提取1h，冷却至室温，4000rpm离心10min，经抽滤后保留滤液，残渣倒回圆底烧瓶中，继续加入10倍量(料液比：w:v＝1：10)的去离子水进行二次提取，共提取三次；合并三次提取所得滤液，用旋转蒸发仪于60-70℃下浓缩至7mL后，转移至玻璃平皿、用保鲜膜封口、扎孔，放置于-80℃冰箱预冻过夜，冷冻干燥24h后即得地榆非药用部位水提物，即地榆花、地榆茎和地榆叶水提物，放置于-20℃冰箱中干燥保存备用。
实施例2微量肉汤法测定地榆非药用部位水提物对Hp标准菌株及临床菌株的MIC、MBC
(1)菌株
标准菌株：ATCC43504【购自美国模式培养物集存库(American type culturecollection)】、ATCC700392(由南京医科大学毕洪凯教授赠予)、鼠源菌株SS1(由上海理工大学刘菁教授赠予)；
临床菌株：CS01(由上海理工大学刘菁教授赠予)、LQ2#(由深圳伯劳特生物制品有限公司赠予)、QYZ-001、QYZ-003、QYZ-004(均由清远市中医院赠予)。
以上菌株均保存于-80℃冰箱。
(2)测定方法
地榆花、地榆茎和地榆叶水提物分别用脑心浸出液肉汤(BHI)超声溶解、涡旋混匀，12000rpm离心5min，用0.22μm水系滤膜过滤，按二倍稀释法分别配制成2560μg/mL、1280μg/mL、640μg/mL、320μg/mL、160μg/mL、80μg/mL等多个浓度梯度的药物溶液。将上述配制好的药液吸取50μL加入到96孔板中，每个药物浓度至少设置3个复孔，并设置阴性对照孔(只含有药物、不接种菌株)、生长对照孔(不含任何药物、只接种菌株)。从培养箱中取出标准菌株及临床菌株(于-80℃冰箱取出的冻存菌株，待自然融化，吸取100μL均匀涂布于哥伦比亚血平板，置于三气培养箱，37℃、微需氧条件倒置培养48-72h)，用润湿的灭菌棉签刮取菌苔至BHI肉汤中，并用含20％FBS的BHI调节菌悬液浊度为1McF，稀释10倍后每孔接种50μL于上述含药液的96孔板中(最终在96孔板中的菌悬液浊度约为1×106CFU/mL)，立即将96孔板置于培养箱中，在37℃、微需氧条件以及150rpm下振荡培养72h，取出观察结果。当生长对照呈现明显浑浊时结果才可用，肉眼从下往上观察，细菌浑浊度明显降低时的药物浓度即为MIC。
取出上述培养72h的96孔板，吸取100μLMIC、2MIC、4MIC、8MIC药物浓度孔中的液体均匀涂布于新鲜血平板上，培养72h后取出观察结果，以降低初始接种浓度(103CFU/mL)时的药物浓度为MBC。
(3)测定结果
由表1可知，地榆花水提物抗幽门螺旋杆菌SS1、QYZ-003、QYZ-004的最小抑菌浓度(MIC)为80μg/mL，抗ATCC 43504、ATCC700392、LQ2 #的最小抑菌浓度为160μg/mL，抗CS01、QYZ-001的最小抑菌浓度为320μg/mL。地榆花水提物抗幽门螺旋杆菌QYZ-003的最小杀菌浓度(MBC)为80μg/mL，抗ATCC 43504、SS1、QYZ-004的最小杀菌浓度为160μg/mL，抗ATCC700392、CS01、LQ2 #、QYZ-001的最小杀菌浓度为320μg/mL。
由表2可知，地榆茎水提物抗幽门螺旋杆菌ATCC 43504、SS1、LQ2 #、QYZ-003、QYZ-004的最小抑菌浓度为160μg/mL，抗幽门螺旋杆菌ATCC700392、CS01、QYZ-001的最小抑菌浓度为320μg/mL。地榆茎水提物抗幽门螺旋杆菌QYZ-003的最小杀菌浓度为160μg/mL，抗幽门螺旋杆菌ATCC 43504、SS1、LQ2 #、QYZ-001、QYZ-004的最小杀菌浓度为320μg/mL，抗幽门螺旋杆菌ATCC700392、CS01的最小杀菌浓度为640μg/mL。
由表3可知，地榆叶水提物抗幽门螺旋杆菌SS1、QYZ-003、QYZ-004的最小抑菌浓度为320μg/mL，抗ATCC 43504、LQ2 #的最小抑菌浓度为640μg/mL，抗ATCC700392、CS01、QYZ-001的最小抑菌浓度为1280μg/mL。地榆叶水提物抗幽门螺旋杆菌QYZ-003的最小杀菌浓度为320μg/mL，抗ATCC 43504、SS1、QYZ-004的最小杀菌浓度为640μg/mL，抗LQ2 #、QYZ-001的最小杀菌浓度为1280μg/mL，抗ATCC700392、CS01的最小杀菌浓度为2560μg/mL。
综上所述可见，地榆花水提物、地榆茎水提物和地榆叶水提物对Hp标准菌和临床菌均具有较强的抑菌和杀菌作用，是优良、天然来源的抑制和杀灭幽门螺杆菌的中药资源。
表1地榆花水提物对Hp标准及临床菌株的MIC、MBC
Figure BDA0003057405160000051
表2地榆茎水提物对Hp标准及临床菌株的MIC、MBC
Figure BDA0003057405160000052
表3地榆叶水提物对Hp标准及临床菌株的MIC、MBC
Figure BDA0003057405160000053
实施例3根据时间-抑菌曲线动态监测地榆非药用部位水提物对HpATCC 43504的抑菌效果
(1)测定方法
以HpATCC 43504为代表，按二倍稀释法分别配制浓度为1/4MIC、1/2MIC、MIC的地榆花水提物、地榆茎水提物和地榆叶水提物的含药BHI肉汤，并以不含药肉汤作为生长对照组。从培养箱取出ATCC 43504菌株，用湿润的灭菌棉签刮下细菌至BHI肉汤中，用含20％FBS的BHI调节菌悬液浊度为1McF后稀释10倍，按照菌悬液：含药肉汤/不含药肉汤＝1：1的剂量每孔接种2mL于6孔板中，然后置于三气培养箱中，在37℃、微需氧环境以及150rpm的条件下进行振荡培养，分别在0h、8h、12h、24h、28h、32h、36h、48h、60h、72h吸取100μL测量OD600nm处的吸光度值，吸光度值越大则代表细菌数量越多。
(2)测定结果
由图1可知，地榆花水提物对ATCC43504菌株的抑制活性呈现剂量依赖性，在40μg/mL时就能抑制菌株生长，当浓度为160μg/mL时，基本抑制了Hp的增长。
由图2可知，地榆茎水提物对ATCC43504菌株的抑制活性也呈现剂量依赖性，在40μg/mL时就能抑制菌株生长，当浓度为160μg/mL时，基本抑制了Hp的增长。
由图3可知，地榆叶水提物对ATCC43504菌株的抑制活性同样呈现剂量依赖性，在160μg/mL时就能抑制菌株生长，当浓度为640μg/mL时，基本抑制了Hp的增长。
综上所述可见，地榆花水提物、地榆茎水提物和地榆叶水提物对HpATCC43504均呈现剂量依赖性，均具有较好的Hp抑制活性。
实施例4根据时间-杀菌曲线动态监测地榆非药用部位水提物对HpATCC 43504的杀菌效果
(1)测定方法
以HpATCC 43504为代表，按二倍稀释法分别配制浓度为2MIC、4MIC、8MIC的地榆花水提物和地榆茎水提物的含药BHI肉汤，并以不含药肉汤作为生长对照组。从培养箱取出ATCC 43504菌株，用湿润的灭菌棉签刮下细菌至BHI肉汤中，用含20％FBS的BHI调节菌悬液浊度为1McF后稀释10倍，按照菌悬液：含药肉汤/不含药肉汤＝1：1的剂量每孔接种2mL于6孔板中，然后放置于三气培养箱中，在37℃、微需氧环境以及150rpm的条件下进行振荡培养。分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h吸取50μL培养基，经10倍梯度稀释(1:10-1:100000)后接种于血平板中，培养4-5天后对细菌进行菌落计数，作图后得到不同药物浓度下的杀菌曲线。
(2)测定结果
如图4所示，地榆花水提物在60h、320μg/mL药物浓度时可杀死全部菌株，表现出较强的杀菌能力。
如图5所示，地榆茎水提物在60h、320μg/mL药物浓度时也可杀死全部菌株，表现出较强的杀菌能力。
综上所述可见，地榆花水提物和地榆茎水提物对HpATCC43504均较好的杀菌能力。
实施例5通过棋盘稀释法测定地榆非药用部位水提物与抗生素联用对HpATCC700392的抑制作用
(1)测定方法
以HPATCC700392为代表，用湿润的灭菌棉签刮下细菌至BHI肉汤中，用含20％FBS的BHI调节菌悬液浊度为1McF后稀释10倍，然后按二倍稀释法配制40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL、640μg/mL、1280μg/mL药物浓度的地榆花水提物、地榆茎水提物和地榆叶水提物，并按照相同的方法配制不同浓度的抗生素(阿莫西林0.0125～0.4μg/mL、克拉霉素0.001～0.031μg/mL、甲硝唑0.8～25.6μg/mL、左氧氟沙星0.1～3.2μg/mL)。最后按照微量肉汤棋盘稀释法按菌悬液：地榆花水提物/地榆茎水提物/地榆叶水提物：抗生素＝2：1：1的剂量每孔接种120μL于96孔板中，放置于三气培养箱中，在37℃、微需氧环境以及150rpm的条件下振荡培养72h，以肉眼观察明显澄清时的孔为最小联合抑菌浓度，联合抑菌指数FICI＝MIC(联合给药的地榆花/地榆茎/地榆叶水提物MIC)/MIC(单独给药的地榆花/地榆茎/地榆叶水提物MIC)+MIC(联合给药的抗生素MIC)/MIC(单独给药的抗生素MIC)，当FICI≤0.5时，为协同效应；当0.5<FICI≤1时，为部分协同效应；当FICI＝1时，为相加效应；当1<FICI<4时，为无关效应；当FICI≥4时，为拮抗效应。
(2)测定结果
由表4-6可知，地榆非药用部位水提物(地榆花水提物、地榆茎水提物和地榆叶水提物)与临床治疗Hp感染常用的抗生素联用，呈无关效应，但联用可以降低抗生素的MIC，能够减少临床抗生素用量，减少不良反应，改善抗生素耐药状况。
表4地榆花水提物与抗生素联用对HpATCC700392的抑制作用
Figure BDA0003057405160000071
表5地榆茎水提物与抗生素联用对HpATCC700392的抑制作用
Figure BDA0003057405160000081
表6地榆叶水提物与抗生素联用对HpATCC700392的抑制作用
Figure BDA0003057405160000082
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.地榆非药用部位提取物在制备抗幽门螺旋杆菌药物中的应用，其特征在于，所述地榆非药用部位为地榆花和地榆茎，所述地榆非药用部位提取物的制备方法包括以下步骤：
S1、选择生长状态良好的地榆，分别摘取地榆非药用部位，冲洗干净后烘干，粉碎并过30-50目筛使成药材细粉；
S2、按1：(8-12)的料液比往地榆非药用部位细粉中加水浸泡20-40min，然后置于80-90℃的水浴中提取1-3h，冷却至室温，离心抽滤后保留滤液，残渣加水进行二次提取，共提取三次，得到地榆非药用部位提取物。
2.根据权利要求1所述的地榆非药用部位提取物在制备抗幽门螺旋杆菌药物中的应用，其特征在于，地榆非药用部位细粉与水的料液比为1：10。
3.根据权利要求1所述的地榆非药用部位提取物在制备抗幽门螺旋杆菌药物中的应用，其特征在于，水浴提取的温度为85℃，时间为1h，水浴提取先浸泡30min。
4.根据权利要求1所述的地榆非药用部位提取物在制备抗幽门螺旋杆菌药物中的应用，其特征在于，药材细粉为经过40目筛后制备得到。
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In vitro anti-bacterial activity and network pharmacology analysis of Sanguisorba officinalisL. against Helicobacter pylori infection;Xue Shen et al.;《Chinese Medicine》;20210417;第16卷(第33期);第1-19页，尤其是第3页左栏第1段 *
地榆不同部位没食子酸的含量测定;史国伟等;《黑龙江医药科学》;20110228;第34卷(第1期);第14-15页，尤其是第14页左栏第1段、右栏第4段 *

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