CN113101341B - 黄精在制备防治低剂量或/和慢性铀暴露药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄精在制备防治低剂量或/和慢性铀暴露药物中的应用，属于药物技术领域，解决现有技术中没有一种低毒高效的铀解毒药物，可预防性给药且长期服用的技术问题。本发明公开了黄精在制备防治低剂量铀暴露或/和慢性铀暴露药物中的应用。所述药物是对线粒体凋亡通路具有抑制作用、对内源性的抗氧化通路具有激活作用的药物。本发明具有良好的防治低剂量铀暴露及慢性铀暴露的作用。实验表明，黄精多糖和水提取物能显著提高HK‑2细胞活力，降低HK‑2细胞凋亡，改善线粒体功能，黄精多糖和水提取物通过抑制线粒体凋亡通路和激活内源性的抗氧化GSK‑3β/Fyn/Nrf2通路来抑制铀诱导的细胞毒性效应。

Description

黄精在制备防治低剂量或/和慢性铀暴露药物中的应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及黄精在制备防治低剂量或/和慢性铀暴露药物中的应用。

背景技术

铀作为一种重要的锕系元素，具有放射性和化学毒性的双重作用。由于铀的广泛开采以及在军事和民用领域的应用，职业工作人员和普通民众长期接触低水平铀的健康风险显著增加。根据大量的流行病学、临床和实验室研究，铀可以通过吸入、摄入或皮肤接触进入人体，导致长期沉积在肾脏、肝脏和骨骼。沉积的铀可通过氧化应激、代谢紊乱、遗传损伤和炎症引发严重的毒性作用，导致细胞损伤和死亡。肾脏是铀积累和排泄的主要部位。血液中吸收的铀通过肾小球过滤，然后在近端小管被重新吸收。我们之前的结果表明，铀抑制HK-2细胞中线粒体呼吸链复合物IV(细胞色素c氧化酶)和复合物V(ATP合酶)的活性。该结果可以充分解释一些线粒体的改变，包括线粒体膜电位(MMP)的丧失、活性氧(ROS)的产生和ATP产生的减少。其他研究人员证实，铀升高ROS水平，随后破坏GSK-3β/Fyn/Nrf2信号通路，加重氧化应激。铀也被证明可引起线粒体功能障碍，激活线粒体凋亡通路，最终导致细胞凋亡和肾毒性。

目前，针对铀中毒的救治，仍然是国内外研究的重难点。从19世纪40年代开始，人们开始研究铀促排化合物，柠檬酸钠是研究最早的排铀化合物之一。在四五十年代，碳酸氢钠、柠檬酸钠、以及琥珀酸钠等小分子弱酸盐得到了大量关注。此后，又研究了邻苯二酚类、羟基吡啶酮类、DTPA和杯芳烃类等促排试剂。这些促排试剂一般用于大剂量或急性铀暴露时的紧急促排治疗，普遍存在毒性高、效率低、不良反应大、生物利用度低等缺点。而针对以下情况：(1)将要从事低剂量或慢性铀暴露行业的相关从业人员铀中毒；(2)接触低水平铀暴露的一般公众铀中毒；(3)铀紧急促排治疗后，肾脏等器官中残余铀引起的毒性效应。减少机体氧化应激、缓解肾脏损伤是防治铀中毒的重要处理手段。最近，研究发现NaHS、ZnSO₄等化学药物和褪黑素、银杏提取液、鱼油等天然提取物可用于铀中毒损伤治疗。ZnSO₄、NaHS作为化药来源的抗氧化剂，存在需及时给药、心理接受度低、长期给药毒性等问题。天然来源的抗氧化剂褪黑素有头晕、疲劳和呼吸困难恶化等副作用；鱼油有鱼腥味和胃肠道副作用；银杏提取物会增加出血的风险。因此，选用心理接受度高、可预防性给药且长期服用低毒高效的铀解毒药物意义重大。

黄精是我国著名的传统中药和功能食品。古代药典记载黄精健脾、养肺、养肾，入药制用，以增强补益作用，避免咽喉刺激。我们前期的研究表明，黄精最佳蒸制次数为5蒸。植物化学和药理研究表明，黄精具有多种生物活性，如抗氧化、降血糖、抗疲劳、抗炎、抗肿瘤等。其活性成分包括黄精多糖、皂苷、类黄酮、酚类和氨基酸。最近的研究表明，这些活性成分具有强大的抗氧化作用。研究表明黄精多糖对庆大霉素诱导的大鼠急性肾损伤具有较强的保护作用。体内实验发现黄精水提物通过抑制氧化应激和线粒体凋亡通路对CdCl₂诱导的小鼠睾丸损伤具有保护作用。黄精水提物通过促进线粒体功能减轻高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病。因此，黄精多糖或黄精水提物可能通过增强抗氧化能力和保护线粒体功能来有效解毒和预防铀诱导的肾毒性。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供黄精在制备防治低剂量铀暴露或/和慢性铀暴露药物中的应用。

本发明的目的之二在于，提供包括黄精水提取物的药物组合物。

本发明的目的之三在于，提供包括黄精多糖的药物组合物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的黄精在制备防治低剂量铀暴露或/和慢性铀暴露药物中的应用。

本发明的部分实施方案中，所述药物是对线粒体凋亡通路具有抑制作用的药物。

本发明的部分实施方案中，所述药物是对内源性的抗氧化GSK-3β/Fyn/Nrf2通路具有激活作用的药物。

本发明的部分实施方案中，黄精经水提取后得到的黄精水提取物在制备防治低剂量铀暴露或/和慢性铀暴露药物中的应用。

本发明的部分实施方案中，由黄精中提取得到的黄精多糖在制备防治低剂量铀暴露或/和慢性铀暴露药物中的应用。

本发明所述的一种药物组合物，包括上述的黄精水提取物以及一种或多种药学上可接受的载体。

本发明所述的另一种药物组合物，包括上述的黄精多糖以及一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的部分实施方案中，两种药物组合物均为口服制剂或注射制剂。

进一步地，所述口服制剂包括固体口服制剂或液体口服制剂。

进一步地，所述注射制剂包括粉针注射制剂或液体注射制剂。

本发明中所述的黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.etHemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根茎。即符合《中国药典》规定的黄精。

本发明所述的黄精水提取物(Polygonatum kingianum aqueous extract，PKAE)为以水为溶剂，对黄精药材提取后所得的提取物。

本发明所述的黄精多糖(Polygonatum kingianum polysaccharides，PKP)的制备方法为现有技术。本发明的部分实施方案中，采用水提沉法制备黄精多糖，优选地，先采用高浓度乙醇去除黄精药物中的脂溶性成分后，再加水提取黄精多糖。

本发明的部分实施方案中，黄精多糖的制备方法还包括精制步骤；优选地，将水提醇沉制得的黄精粗多糖采用活性炭和Sevage试剂纯化，然后再将纯化产物干燥；更优选地，采用冷冻干燥。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明设计科学，构思巧妙，具有良好的防治低剂量铀暴露及慢性铀暴露的作用。实验表明，黄精多糖和水提取物能显著提高HK-2细胞活力，降低HK-2细胞凋亡，改善线粒体功能，黄精多糖和水提取物通过抑制线粒体凋亡通路和激活内源性的抗氧化GSK-3β/Fyn/Nrf2通路来抑制铀诱导的细胞毒性效应。

附图说明

1.附图1为实验例1的碳酸铀酰与黄精多糖和水提取物对细胞活力的影响结果图；数据以平均值±标准差表示(n＝6)。其中图A表示碳酸铀酰细胞毒性的剂量依赖性；图B表示碳酸铀酰细胞毒性的时间依赖性；图C表示黄精多糖的细胞毒性；图D表示黄精水提取物的细胞毒性。PKP(0)表示0蒸黄精多糖；PKP(5)表示5蒸黄精多糖；PAKE(0)表示0蒸黄精水提物；PAKE(5)表示5蒸黄精水提物。

2.附图2为实验例2的黄精多糖和水提物对铀诱导细胞毒性的影响图。其中图A为黄精多糖对碳酸铀酰诱导细胞毒性的保护作用结果图，图B为黄精水提取物对碳酸铀酰诱导细胞毒性的保护作用结果图；数据以平均值±标准差表示(n＝6)。其中，PKP(0)+Uranium表示0蒸黄精多糖预处理组；PKP(5)+Uranium表示5蒸黄精多糖预处理组；Uranium+PKP(0)表示0蒸黄精多糖后处理组；Uranium+PKP(5)表示5蒸黄精多糖后处理组；PAKE(0)+Uranium表示0蒸黄精水提物预处理组；PAKE(5)+Uranium表示5蒸黄精水提物预处理组；Uranium+PAKE(0)表示0蒸黄精水提物后处理组；Uranium+PAKE(5)表示5蒸黄精水提物后处理组。

3.附图3-1为实验例3的黄精多糖和水提取物预处理对铀染毒HK-2细胞形态学影响图。其中control表示对照组；PKP表示黄精多糖单独处理组；PKAE表示黄精水提物单独处理组；uraniun表示铀处理组；PKP+uraniun表示黄精多糖预处理组；PAKE+uranium表示黄精水提物预处理组。

附图3-2为实验例3的流式细胞仪检测细胞凋亡结果图。Annexin V-FITC/PI双染的方法检测细胞凋亡，早期凋亡的细胞位于图形右下象限，晚期凋亡或坏死的细胞位于图形右上象限。其中A03表示对照组，B03表示黄精多糖单独处理组，A07表示黄精水提物单独处理组，B06表示铀处理组，A04表示黄精多糖预处理组，C08表示黄精水提物预处理组。

附图3-3为细胞总凋亡比率图；数据以平均值±标准差表示(n＝3)，与对照组相比，*p<0.05；与碳酸铀酰组相比，^#p<0.05。

4.附图4为实验例4的黄精多糖和水提物预处理对铀染毒HK-2细胞线粒体功能的影响结果图。其中图A为线粒体膜电位结果图；图B为细胞内ATP含量结果图；图C为细胞内ROS水平结果图。其中control表示对照组；PKP表示黄精多糖单独处理组；PKAE表示黄精水提物单独处理组；uraniun表示铀处理组；PKP+uraniun表示黄精多糖预处理组；PAKE+uranium表示黄精水提物预处理组。

5.附图5为实验例5的黄精多糖和水提物对铀染毒HK-2细胞线粒体凋亡通路的影响结果图。其中图A为细胞浆中Bcl-2的含量结果图，图B为细胞浆中Bax的含量结果图，图C为细胞中Caspase 3的酶活力测定结果图，图D为细胞中Caspase 9的酶活力测定结果图。其中control表示对照组；PKP表示黄精多糖单独处理组；PKAE表示黄精水提物单独处理组；uraniun表示铀处理组；PKP+uraniun表示黄精多糖预处理组；PAKE+uranium表示黄精水提物预处理组。数据以平均值±标准差表示(n＝3)，与对照组相比，*p<0.05；与碳酸铀酰组相比，^#p<0.05。

6.附图6为实验5的黄精多糖和水提物对铀染毒HK-2细胞GSK3β/Fyn/Nrf2通路的影响结果图。其中图A为细胞中GSK3β磷酸化水平结果图，图B为细胞核中Fyn的含量结果图；图C为细胞核中Nrf2的含量结果图。其中control表示对照组；PKP表示黄精多糖单独处理组；PKAE表示黄精水提物单独处理组；uraniun表示铀处理组；PKP+uraniun表示黄精多糖预处理组；PAKE+uranium表示黄精水提物预处理组。数据以平均值±标准差表示(n＝3)，与对照组相比，*p<0.05；与碳酸铀酰组相比，^#p<0.05。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

本发明实施例中所述的0蒸黄精药材为未经炮制的黄精净药材；

本发明中所述的五蒸五制黄精饮片的制备方法为：取净黄精，照酒蒸法(中国药典一部，通则0213)蒸透，干燥，反复操作五次；每100kg黄精用黄酒20kg。

实施例1

本实施例公开了黄精多糖的制备方法，具体为：

取黄精药材，粉碎为细粉，取约15g，精密称定，加入95％乙醇150mL回流提取1h，过滤，残渣加入120mL蒸馏水，回流提取1h，过滤，滤液60℃浓缩至45mL，加入无水乙醇，至乙醇浓度80％，4℃静置24h，过滤，滤渣加入适量活性炭和sevage试剂纯化，冷冻干燥，即得黄精多糖。用超纯水溶解黄精多糖制备0.5mg/mL的多糖溶液，0.22μm滤膜过滤，4℃储存。用DMEM/F12培养基(含3％胎牛血清和1％三抗)稀释至实验所需浓度。

实施例2

本实施例公开了黄精水提取物的制备方法，具体为：

取黄精饮片约100g，精密称定，加入10倍量蒸馏水浸泡1h，加热，微沸后持续加热1h，过滤，残渣再加入8倍量蒸馏水持续加热0.5h，合并滤液，减压浓缩至200mL，即药液浓度为0.5g/mL。0.22μm滤膜过滤，4℃储存。用DMEM/F12培养基(含3％胎牛血清和1％三抗)稀释至实验所需浓度。

实验例1

本实验例公开了黄精多糖和黄精水提取物对HK-2细胞活力的影响实验。

1.材料与方法

1.1 0蒸黄精多糖：以0蒸黄精净药材为原料，按实施例1的方法制备0蒸黄精多糖。

1.2 5蒸黄精多糖：以五蒸五制黄精饮片为原料，按实施例1的方法制备5蒸黄精多糖。

1.3 0蒸黄精水提取物：以0蒸黄精药材为原料，按实施例2的方法制备0蒸黄精水提取物。

1.4 5蒸黄精水提取物：以五蒸五制黄精饮片为原料，按实施例2的方法制备5蒸黄精水提取物。

1.5碳酸铀酰的制备

精密称定适量硝酸铀酰，加超纯水配置成100mmol/L的硝酸铀酰溶液，再配制成10mmol/L碳酸铀酰溶液(1mol/L NaHCO₃:100mmol/L UO₂(NO₃)₂:H₂O＝1:1:8)，0.22μm滤膜过滤，用DMEM/F12培养基(含3％胎牛血清和1％三抗)稀释至实验所需浓度。

1.6细胞培养及分组

人肾脏近曲小管上皮HK-2细胞(中国科学院昆明细胞库)，用含10％胎牛血清和1％三抗的DMEM/F12培养基在5％CO₂，37℃的条件下进行贴壁培养，隔天传代(一传三)，将对数生长期的细胞用于实验。

为了研究黄精多糖和水提取物对铀诱导细胞毒性的保护作用，将HK-2细胞随机分为6组：

(1)对照组：含3％胎牛血清的DMEM/F12培养基100μL处理48h；

(2)0蒸黄精多糖不同浓度组：按0蒸黄精多糖计分为以下5个浓度组：50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：采用100μL0蒸黄精多糖处理24h。

(3)5蒸黄精多糖不同浓度组：按5蒸黄精多糖计分为以下5个浓度组：50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：采用100μL5蒸黄精多糖处理24h。(4)0蒸黄精水提取物不同浓度组：按0蒸黄精水提取物计分为以下5个浓度组：100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、750μg/mL、1000μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：采用100μL0蒸黄精水提物处理24h。

(5)5蒸黄精水提取物不同浓度组：按5蒸黄精水提取物计分为以下5个浓度组：100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、750μg/mL、1000μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：采用100μL 5蒸黄精水提物处理24h。

(6)碳酸铀酰不同浓度组：按碳酸铀酰计分为以下5个浓度组：200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L；每个浓度组n＝6；处理方法为：采用100μL各浓度碳酸铀处理48h。

(7)碳酸铀不同时间组：按处理时间分为5个时间组：6h、12h、24h、36h、42h；每个时间组n＝6；处理方法为：采用600μmol/L碳酸铀处理，加入体积为100μL。

1.7细胞活力测定方法

参照CCK-8试剂盒说明书测定细胞活力。细胞按7×10³个/mL接种于96孔板中，每组6个孔，每孔100μL，贴壁24h后，吸弃培养孔中培养基。按照实验分组，给予相应药物处理细胞后，各孔加入10μL CCK-8继续孵育1h，于酶标仪450nm波长处检测吸光度。

细胞存活率＝A药物组/A对照组×100％。

本实施例先测定了碳酸铀酰(200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L)，0蒸和5蒸黄精多糖(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL)以及0蒸和5蒸黄精水提物(100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、750μg/mL、1000μg/mL)单独给药对细胞活力的影响，并测定了碳酸铀酰(600μmol/L)不同时间段对细胞活力的影响。细胞活力相对水平＝处理组吸光度/对照组吸光度×100％。

2.结果

2.1碳酸铀酰、黄精多糖和黄精水提取物单独给药对细胞活力的影响如附图1所示。由图1可知，分别采用200-1000μmol/L碳酸铀酰处理细胞24h，随着碳酸铀量的增加，细胞存活率降低。

采用600μmol/L碳酸铀酰处理细胞6-42h；随着处理时间的增加，碳酸铀酰细胞毒性增加。

实验例2

本实验例公开了黄精多糖和黄精水提取物对铀染毒HK-2细胞活力的影响实验。

1.材料：

本实验例中所用的黄精多糖、黄精水提取物、碳酸铀酰及HK-2细胞均同实验例1。

2.细胞培养及分组：

为了评估0蒸和5蒸黄精多糖(2-200μg/mL)以及0蒸和5蒸水提物(2.5-250μg/mL)对碳酸铀酰(600μmol/L)诱导的细胞毒性的保护作用，本实验测定了黄精多糖或水提取物预处理24h后，再加铀继续处理24h以及碳酸铀酰处理24h后再加黄精多糖或水提物继续处理24h对细胞活力的影响。

细胞培养同实验例1；

具体分组如下：

(1)对照组：含3％胎牛血清的DMEM/F12培养基100μL处理48h；

(2)0蒸黄精多糖预处理组：按0蒸黄精多糖计分为以下6个浓度组：0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、200μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：先采用100μL 0蒸黄精多糖预处理24h后加100μL浓度为600μM的碳酸铀酰继续处理24h。

(3)5蒸黄精多糖预处理组：按5蒸黄精多糖计分为以下6个浓度组：0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、200μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：先采用100μL 5蒸黄精多糖预处理24h后加100μL浓度为600μM的碳酸铀酰继续处理24h。

(4)0蒸黄精多糖后处理组：按0蒸黄精多糖计分为以下6个浓度组：0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、200μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：先采用100μL浓度为600μM的碳酸铀酰处理24h后加100μL 0蒸黄精多糖继续处理24h。

(5)5蒸黄精多糖后处理组：按5蒸黄精多糖计分为以下6个浓度组：0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、200μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：先采用100μL浓度为600μM的碳酸铀酰处理24h后加100μL 5蒸黄精多糖继续处理24h。

(6)0蒸黄精水提取物预处理组：按0蒸黄精水提取物计分为以下6个浓度组：0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、250μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：先采用100μL0蒸黄精水提取物预处理24h后加100μL浓度为600μM的碳酸铀酰继续处理24h。

(7)5蒸黄精水提取物预处理组：按5蒸黄精水提取物计分为以下6个浓度组：0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、250μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：先采用100μL 5蒸黄精水提取物预处理24h后加100μL浓度为600μM的碳酸铀酰继续处理24h。

(8)0蒸黄精水提取物后处理组：按0蒸黄精水提取物计分为以下6个浓度组：0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、250μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：先采用100μL浓度为600μM碳酸铀酰处理24h后加100μL 0蒸黄精水提取物继续处理24h。

(9)5蒸黄精水提取物后处理组：按5蒸黄精水提取物计分为以下6个浓度组：0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、250μg/mL；每个浓度组n＝6；处理方法为：先采用100μL浓度为600μM碳酸铀酰处理24h后加100μL 5蒸黄精水提取物继续处理24h。

3细胞活力测定

参照CCK-8试剂盒说明书测定细胞活力。细胞按7×10⁴个/mL接种于96孔板中，每组6个孔，每孔100μL，贴壁24h后，吸弃培养孔中培养基。按照实验分组，给予相应药物处理细胞后，各孔加入10μL CCK-8继续孵育1h，于酶标仪450nm波长处检测吸光度。细胞活力相对水平＝处理组吸光度/对照组吸光度×100％。

4.结果

结果如附图2所示。由附图2A可知，5蒸的40μg/mL黄精多糖预处理提高细胞活力效果最佳，因此筛选出多糖的给药方式是40μg/mL黄精多糖预处理24h再加600μM碳酸铀酰处理24h；由附图2B可知，5蒸的5μg/mL黄精水提物预处理提高细胞活力效果最佳，因此筛选出水提物的给药方式是5μg/mL黄精水提物预处理24h再加600μM碳酸铀酰处理24h。

综上，本申请在安全浓度范围内，详细研究了不同浓度的PKP和PKAE对铀致细胞损伤的保护作用。分别考察了黄精给药方式(预处理和后处理)、黄精蒸制次数(0和5次)以及药物浓度对铀致HK-2细胞存活率的影响。首先，对于不同的给药途径，提前预处理给药组(group a b e f)，细胞活力以浓度依赖型显著增加。而对于后处理给药组(group c d gh),黄精处理后细胞活力改善微弱或者没有。因此，黄精预处理给药可以更好地改善铀致细胞的损伤。比较不同蒸制次数的黄精对细胞损伤的缓解效果发现，无论是PKP(group a b)还是PKAE(group e f)，5次蒸制药物对细胞损伤的缓解作用比0次蒸制的更好。其中，5蒸PKP对提高细胞活力效果最佳的浓度是40μg/mL(提高20％)，5蒸PKAE对提高细胞活力效果最佳的浓度是5μg/mL(提高12％)。

实验例3

本实验例公开了黄精多糖和黄精水提取物的细胞形态学观察和凋亡检测实验。

1.材料：

本实验例中所用的黄精多糖、黄精水提取物、碳酸铀酰及HK-2细胞均同实验例1。

2.细胞培养及分组：

细胞培养同实验例1；分组如下：

(1)对照组：含3％胎牛血清的DMEM/F12培养基500μL(或3mL)处理48h；

(2)黄精多糖预处理组：40μg/mL的5蒸黄精多糖500μL(或3mL)预处理HK-2细胞24h后加10mmol/L的碳酸铀酰21μL(或125μL)继续处理24h；

(3)黄精水提取物预处理组：5μg/mL的5蒸黄精水提取物500μL(或3mL)预处理HK-2细胞24h后加10mmol/L的碳酸铀酰21μL(或125μL)继续处理24h；

(4)铀处理组：含3％胎牛血清的DMEM/F12培养基500μL(或3mL)处理24h后加入10mmol/L的碳酸铀酰21μL(或125μL)处理24h；

(5)黄精多糖单独处理组：40μg/mL的5蒸黄精多糖500μL(或3mL)处理HK-2细胞48h；

(6)黄精水提物单独处理组：5μg/mL的5蒸黄精水提取物500μL(或3mL)预处理HK-2细胞48h；

3.细胞形态学观察和凋亡检测

HK-2细胞按1.2×10⁴个/孔接种在玻璃底的24孔培养板内，每孔500μL，贴壁24h后，吸弃培养孔中培养基，碳酸铀酰浓度为400μmol/L。按照实验分组给予相应药物处理细胞后，用PBS清洗2遍，并加200μLPBS覆盖细胞使用光学显微镜在明场下进行观察，放大倍数40×。

参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书测定细胞凋亡。HK-2细胞按2.5×10⁵个/孔接种于6孔板中，每孔3mL，贴壁24h后，吸弃培养孔中培养基。碳酸铀酰浓度为400μmol/L，按照实验分组给予相应药物处理细胞后，胰蛋白酶消化后收集孔中全部细胞，用预冷的PBS洗涤2次。取约3×10⁵个细胞，依次加入390μL Annexin V-FITC结合缓冲液，10μL Annexin V-FITC和20μL PI，室温避光孵育20min，流式细胞仪FITC和PE通道检测Annexin V-FITC和PI染料的平均荧光强度(计2×10⁴个细胞)。Annexin V-FITC染色呈阳性，PI染色呈阴性的计为早凋亡细胞；Annexin V-FITC染色呈阳性，PI染色呈阳性的计为晚凋亡或坏死细胞。

4.结果

我们首先观察了黄精多糖和黄精水提物对铀暴露HK-2细胞形态学特征的影响(图3-1)。用黄精多糖和黄精水提物处理的细胞与对照细胞相似。在400μM铀处理24h后，细胞萎缩、变圆。观察到大量悬浮、撕裂、萎缩的细胞，以及漂浮的细胞内容物。然而，当用黄精多糖或黄精水提物预处理细胞时，细胞损伤的严重程度明显降低。黄精多糖和黄精水提物预处理有效地保留了细胞的形态特征。

为了评估黄精多糖和黄精水提物对铀诱导的凋亡的影响，用Annexin V-FITC/PI双染色HK-2细胞，并用流式细胞术分析(图3-2)。暴露于400μM铀24h后，凋亡细胞的总比率(包括早期和晚期凋亡)增加到20％(图3-3)，与之前报道的16％和20％的凋亡率一致。黄精多糖和黄精水提物预处理明显降低了凋亡细胞的总百分比。用黄精多糖预处理比用黄精水提物预处理更有效。因此，我们证明了黄精多糖和黄精水提物预处理可以显著抑制铀诱导的HK-2细胞凋亡。

实验例4

本实验例公开了黄精多糖和水提取物的铀染毒HK-2细胞线粒体功能的影响实验。

1.材料：

本实验例中所用的黄精多糖、黄精水提取物、碳酸铀酰及HK-2细胞均同实验例1。

2.细胞培养及分组：

细胞培养同实验例1；分组如下：

(1)对照组：含3％胎牛血清的DMEM/F12培养基3mL处理48h；

(2)黄精多糖预处理组：40μg/mL的5蒸黄精多糖3mL预处理HK-2细胞24h后加10mmol/L的碳酸铀酰192μL(或93μL)继续处理24h；

(3)黄精水提取物预处理组：5μg/mL的5蒸黄精水提取物3mL预处理HK-2细胞24h后加10mmol/L的碳酸铀酰192μL(或93μL)继续处理24h；

(4)铀处理组：含3％胎牛血清的DMEM/F12培养基3mL处理24h后加入10mmol/L的碳酸铀酰192μL(或93μL)处理24h；

(5)黄精多糖单独处理组：40μg/mL的5蒸黄精多糖3mL处理HK-2细胞48h；

(6)黄精水提物单独处理组：5μg/mL的5蒸黄精水提取物3mL预处理HK-2细胞48；

3.线粒体膜电位测定

利用TMRE荧光染料特异性标记活性线粒体，检测线粒体膜电位。HK-2细胞按2.5×10⁵个/孔接种于6孔板中，每孔3mL，贴壁24h后，吸弃培养孔中培养基。碳酸铀酰浓度为600μmol/L，按照实验分组给予相应药物处理细胞后。收集各孔全部细胞，用PBS洗涤细胞2次，取200nM TMRE 1mL将细胞均匀悬浮后，37℃细胞培养箱内孵育30min，离心收集细胞，用预冷的无血清培养基洗涤细胞3次，加200μL PBS重悬细胞，流式细胞仪FL2通道进行分析(计2×10⁴个细胞)。MMP相对水平＝处理组MFI_TMRE/对照组MFI_TMRE×100％。

4.ATP检测

利用生物荧光素发光法检测细胞内的ATP含量。HK-2细胞按2.5×10⁵个/孔接种于6孔板中，每孔3mL，贴壁24h后，吸弃培养孔中培养基。碳酸铀酰浓度为300μmol/L，按照实验分组给予相应药物处理细胞后。每孔加入400μL裂解液冰上裂解后，分别收集细胞上清液检测ATP含量。黑底96孔板每孔加入100μL ATP检测工作液，室温放置5min。准备0.01、0.04、0.1、0.4、1、4、10μmol/L的ATP标准溶液。每孔加入20μL待测样品或标准溶液，用酶标仪化学发光模式测定各孔发光强度。根据标准曲线计算样品中ATP的浓度，用BCA法测定样品中的蛋白浓度，最后将ATP的浓度换算成μmol/mg蛋白的形式。

5活性氧检测

利用荧光探针DCFH-DA检测细胞内的活性氧水平。DCFH-DA进入细胞以后，被胞内的酯酶水解成DCFH，无荧光的DCFH可以被ROS氧化生成绿色荧光的DCF。检测DCF的荧光强度可以反映细胞内的活性氧水平。HK-2细胞按3.5×10⁵个/孔接种于6孔板中，每孔3mL，贴壁24h后，吸弃培养孔中培养基。碳酸铀酰浓度为600μmol/L，按照实验分组给予相应药物处理细胞后，分别收集1×10⁶个细胞，用PBS洗涤细胞2次，加入2.5μmol/L DCFH-DA 1mL后，37℃细胞培养箱内孵育20min，用预冷的无血清培养基洗涤细胞3次(2500rpm，离心5min)，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，最后流式细胞仪FITC通道检测细胞内DCF的平均荧光强度(计2×10⁴个细胞)。细胞内ROS相对水平＝处理组MFI_DCF/对照组MFI_DCF。

6.结果：

线粒体被认为是铀诱导肾毒性的重要靶点，之前的研究表明，铀可诱导ROS产生、MMP塌陷和线粒体肿胀。我们通过检测细胞ATP、MMP和ROS水平来研究线粒体功能的改变。如图4所示，在黄精多糖和黄精水提物处理48h的细胞中，ATP、MMP和ROS水平没有显著变化。对于碳酸铀处理的细胞，观察到MMP和ATP水平显著下降。用黄精多糖或黄精水提物预处理24h后，MMP和ATP水平的下降得以恢复(图4A-B)。同时，暴露铀24h后，细胞内ROS水平增加了60％(图4C)，这与现有技术报道的500μmol/L硝酸铀酰染毒肾细胞24h后，ROS升高水平一致。黄精多糖和黄精水提物预处理降低了铀诱导ROS的产生，且黄精水提物预处理比黄精多糖预处理更有效。黄精预处理组的活性氧水平甚至低于对照组，这与黄精多糖或黄精水提物的抗氧化成分直接清除活性氧有关。因此，黄精多糖和黄精水提物预处理可以改善铀诱导的HK-2细胞线粒体功能障碍。

实验例5

本实验例公开了黄精多糖和水提取物对铀激活的线粒体凋亡通路和抑制的抗氧化GSK-3β/Fyn/Nrf2通路的影响实验。

1.材料：

本实验例中所用的黄精多糖、黄精水提取物、碳酸铀酰及HK-2细胞均同实验例1。

2.细胞培养及分组：

细胞培养同实验例1；分组如下：

(1)对照组：含3％胎牛血清的DMEM/F12培养基3mL(或10mL)处理48h；

(2)黄精多糖预处理组：40μg/mL的5蒸黄精多糖3mL(或10mL)预处理HK-2细胞24h后加10mmol/L的碳酸铀酰125μL(或639μL)继续处理24h；

(3)黄精水提取物预处理组：5μg/mL的5蒸黄精水提取物3mL(或10mL)预处理HK-2细胞24h后加10mmol/L的碳酸铀酰125μL(或639μL)继续处理24h；

(4)铀处理组：含3％胎牛血清的DMEM/F12培养基3mL(或10mL)处理24h后加入10mmol/L的碳酸铀酰125μL(或639μL)处理24h；

(5)黄精多糖单独处理组：40μg/mL的5蒸黄精多糖3mL(或10mL)处理HK-2细胞48h；

(6)黄精水提物单独处理组：5μg/mL的5蒸黄精水提取物3mL(或10mL)预处理HK-2细胞48h。

3.Caspase活性检测

检测参照Caspase 3和Caspase 9活性检测试剂盒的说明书进行。HK-2细胞按2.5×10⁵个/孔接种于6孔板中，每孔3mL，贴壁24h后，吸弃培养孔中培养基。碳酸铀酰浓度为400μmol/L，按照实验分组给予相应药物处理细胞后，每孔加入400μL裂解液冰上裂解后，分别收集50μL细胞上清液，加入40μL反应缓冲液和5μL酶底物(DEVD-ρNA、LEHD-ρNA)，37℃孵育1h，用酶标仪在405nm波长下测吸光度(A)值，根据标准曲线计算样品中pNA的量。以当底物饱和时，在37℃一个h内可以剪切1nmol Ac-DEVD-pNA产生1nmol pNA的Caspase的酶量定义为一个酶活力单位。

4.酶联免疫吸附试验(ELISA)

10mL的Hk-2细胞悬液(约2.7×10⁶个细胞)接种于55cm²的培养皿中，贴壁24h后，吸弃培养孔中培养基。酶联免疫吸附试验所用碳酸铀酰的浓度为600μmol/L，按照实验分组给予相应药物处理细胞后，收集各孔全部细胞，按照GSK-3β(pS9)+Toal GSK-3βSimple StepELISA Kit说明书测定糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的磷酸化水平。利用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，用BCA法测定细胞浆蛋白和细胞核蛋白浓度。通过ELISA试剂盒，分别测定细胞浆中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2关联X蛋白Bcl-2(Bax)的水平，细胞核中人酪氨酸蛋白激酶(Fyn)和细胞内核因子E2相关因子2(Nrf2)的水平。用酶标仪在450nm处测定吸光度，通过绘制标准曲线算出对应的Bcl-2、Bax和Fyn、Nrf2的浓度。最后将浓度换算成ng/mg蛋白的形式。

5.结果

1.已有研究表明，铀(≤600μM)可通过激活线粒体介导的凋亡通路诱导肾细胞凋亡。在此，我们探讨黄精多糖和黄精水提物减轻铀诱导的HK-2细胞凋亡的机制。黄精多糖和黄精水提物处理48h后，细胞中Caspase 3和Caspase 9的活性以及Bcl-2和Bax的含量均未发生显著变化。碳酸铀暴露后，细胞浆中Bcl-2(图5A)和Bax(图5B)的含量显著下降。经黄精多糖和黄精水提物预处理后，这些变化减弱。黄精水提物预处理在提高Bcl-2和Bax水平方面优于黄精多糖。同时，经过碳酸铀暴露后，细胞裂解液中Caspases 3(图5C)和Caspases 9(图5D)的活性显著增加。经黄精多糖和黄精水提物预处理后，活力有所减弱。这些结果表明黄精多糖和黄精水提物通过与线粒体介导的凋亡通路中的关键调控因子相互作用来抑制铀诱导的HK-2细胞凋亡。

2.已有研究证实，铀可通过增加ROS的产生来抑制Akt/GSK-3β/Fyn/Nrf2通路，进而加重氧化应激。我们通过测定蛋白磷酸化水平和GSK-3β/Fyn/Nrf2通路的表达水平，进一步探讨黄精多糖和黄精水提物减轻铀诱导的氧化应激的机制。碳酸铀暴露24h后，GSK-3β磷酸化水平降低至65％(图6A)。用黄精多糖和黄精水提物预处理可以明显缓解这一变化。同时，经碳酸铀暴露后，Fyn含量增加了100％(图6B)。这种增加被黄精多糖和黄精水提物预处理抑制。铀组Nrf2含量明显降低(图6C)。用黄精多糖和黄精水提物预处理也使这种影响最小化。上述结果表明PKP和PKAE可通过GSK-3β/Fyn/Nrf2通路的分子干预，对HK-2细胞中铀诱导的氧化应激具有较强的抗氧化作用。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.黄精水提取物作为唯一活性成分在制备防治低剂量铀暴露或/和慢性铀暴露药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是对线粒体凋亡通路具有抑制作用的药物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物是对内源性的抗氧化通路具有激活作用的药物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄精水提取物包括黄精多糖。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物由黄精水提取物以及一种或多种药学上可接受的载体组成。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物由黄精多糖以及一种或多种药学上可接受的载体组成。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂或注射制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述口服制剂包括固体口服制剂或液体口服制剂。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述注射制剂包括粉针注射制剂或液体注射制剂。

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