CN110292563B - 基于叶酸热敏脂质体的阴离子载体诱导癌细胞凋亡的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于叶酸靶向热敏脂质体作为纳米载体对不同阴离子进行跨膜转运的方法及转运阴离子在诱导人宫颈癌细胞凋亡中的应用。通过薄膜蒸发的方法制备得到叶酸靶向型热敏脂质体，进行阴离子的靶向特异性跨膜转运，载体本身的温敏性能实现了包封阴离子的可控释放。在体外细胞实验中，温度差异导致阴离子释放速率存在差异，并最终影响了阴离子在诱导癌细胞凋亡时的作用效果。通过转运阴离子对癌细胞的毒性、凋亡、线粒体膜电位及细胞凋亡蛋白酶Caspase‑3活性表达等方面的研究，说明载入的阴离子诱导Hela细胞凋亡的主要途径为Caspase介导的线粒体路径。同时，协同的Na+不会影响Cl‑及H2PO4 ‑的作用表达，但是会显著降低F‑的作用效果。

Description

基于叶酸热敏脂质体的阴离子载体诱导癌细胞凋亡的方法
技术领域
本发明涉及的是一种纳米载体跨膜转运阴离子并诱导癌细胞产生凋亡的方法，属于功能材料领域。
技术背景
生物体内分布着大量的离子，细胞膜表面的离子通道蛋白以可控方式对这些离子进行运输，维持着细胞及细胞器内的离子平衡，使身体机能正常运转。阴离子的跨膜转运，可以用于调节因离子通道蛋白缺陷而引起的离子失衡，更重要的是可诱导癌细胞死亡，为癌症治疗提供新的手段，具有及其深远的研究意义。目前，常规的阴离子转运载体研究主要集中在超分子离子通道及离子载体的设计与合成方面，具有良好生物相容性的纳米材料则鲜少涉及，这为阴离子纳米载体的研究留下了广阔的发展空间。
热敏性脂质体(TSL)是一种通过加热触发释放包封在亲水核心中药物的脂质体。制备热敏脂质体常用的磷脂分子包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，Tm＝41.3℃)、1-肉豆蔻酰基 -2-硬脂酰基卵磷脂(MSPC，Tm＝40℃)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油磷酸胆碱(DSPC，Tm＝55℃)等。当加热到相转变温度(Tm)时，磷脂酰基烷烃链发生紊乱，脂质双层经历从排布紧密的凝胶态到疏松混乱的液晶态的相转变过程，此时膜的通透性及流动性会显著增强，可快速将包封的药物释放出来。在生物体环境中的稳定性，释放动力学和相转变温度很大程度上取决于脂质双层的确切成分及包封药物的化学性质。目前，将热敏脂质体与局部热疗相结合，是实现抗癌药物特异性靶向递送和快速释放的有效策略之一。
发明内容
鉴于上述，本发明的目的是通过叶酸靶向热敏脂质体实现细胞膜表面阴离子的跨膜转运。
本发明的另一目的是通过转运的阴离子诱导Hela细胞凋亡。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
叶酸靶向热敏脂质体的合成分别称取18mg DPPC、2mg FA-PEG2000-DSPE溶于2mL氯仿，超声15min，此时固体全部溶解，45℃旋转蒸发，于茄形瓶的内壁形成磷脂薄膜。油泵抽1～2h除残留氯仿。向其中加不同浓度的阴离子溶液(含5mM、pH＝4的柠檬酸盐缓冲)2mL，恒温振荡器中，55～60℃水合3h，真空抽滤过200nm的聚碳酸酯滤膜10次后，3000Da透析袋透析8～12h除去未包封的阴离子，冰箱4℃保存。
叶酸靶向型热敏脂质体进行阴离子转运的机理制备叶酸靶向型热敏脂质体用到的磷脂分子为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，其相转变温度 (Tm)是41.3℃。所以在常温条件下，包封阴离子的脂质体可以稳定存在，而加热到42℃时，温度达到DPPC发生相转变的条件，磷脂酰基烷烃链发生紊乱，脂质双层经历从排布紧密的凝胶态到疏松混乱的液晶态的相转变过程，此时膜的通透性及流动性会显著增强，可快速将包封的阴离子释放出来。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明克服了现有技术的不足之处。首先，克服了有机超分子阴离子转运受体在生物体系中相容性差、溶解度低等缺点，叶酸靶向热敏脂质体本身具有的易制备、成本低、良好的生物相容性等优点，使其成为理想的阴离子跨膜转运纳米载体。其次，合成的叶酸靶向热敏脂质体可分别转运Cl-、F-、H2PO4 -等多种阴离子，并能同时研究协同阳离子对阴离子作用表达的影响，而有机超分子阴离子转运受体只能对单一阴离子进行跨膜转运。最后，超分子阴离子受体通常是不具备特异性靶向性能的，同样会导致正常细胞的死亡，从而限制了阴离子转运载体在生物医学领域的应用。而合成的热敏脂质体则克服了这一缺点，可通过叶酸介导的靶向作用进入癌细胞。
附图说明
图1为叶酸靶向型热敏脂质体的作用机理图2为包封不同浓度阴离子的叶酸靶向热敏脂质体的透射电镜图。
图3为包封不同浓度阴离子的叶酸靶向热敏脂质体的动态光散射图。
图4为不同温度条件下叶酸靶向热敏脂质体的释放曲线图。
图5为不同温度条件下包封不同阴离子的热敏脂质体对Hela细胞的毒性作用。
图6为包封罗丹明B的叶酸靶向热敏脂质体在Hela内的荧光成像。
图7为包封F-的叶酸靶向热敏脂质体在Hela细胞内的荧光成像，成像体系为10μ M的氟离子探针Z1，2500mg/mL包封了F-的叶酸靶向热敏脂质体物与Hela细胞共同孵化。
图8为不同温度条件下包封不同阴离子的叶酸靶向热敏脂质体对Hela细胞凋亡率的影响，测试体系为2500mg/mL的阴离子载体与Hela细胞共同孵化24h。
图9为不同温度条件下包封不同阴离子的叶酸靶向热敏脂质体对JC-1染色后流式细胞分布图的影响，测试体系为Hela细胞与2500mg/mL的阴离子载体共同孵化24h后，再与JC-1共同孵化20min。
图10为不同温度条件下包封不同阴离子的叶酸靶向热敏脂质体对JC-1染色后Hela 细胞荧光成像的影响，测试体系为Hela细胞与2500mg/mL的阴离子载体共同孵化24h后，再与JC-1共同孵化20min。
图11为不同温度条件下包封不同阴离子的叶酸靶向热敏脂质体对Hela细胞中AMC相对荧光强度的影响。
图12为不同温度条件下无叶酸热敏脂质体对Hela的毒性作用。
具体实施方式
下面结合附图和实施例及实验例对本发明技术方案再做进一步说明：
实施例1
分别称取18mg DPPC、2mg FA-PEG2000-DSPE溶于2mL氯仿，超声15min，此时固体全部溶解，45℃旋转蒸发，于茄形瓶的内壁形成磷脂薄膜。油泵抽1～2h除残留氯仿。向其中加不同浓度的阴离子溶液(含5mM、pH＝4的柠檬酸盐缓冲)2mL，恒温振荡器中， 55～60℃水合3h，真空抽滤过200nm的聚碳酸酯滤膜10次后，3000Da透析袋透析8～12h 除去未包封的阴离子，冰箱4℃保存。
将包封了不同阴离子的叶酸靶向热敏脂质体依次分散于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，与Hela细胞共同孵化，载体通过叶酸靶向作用特异性进入癌细胞后，对其进行42℃热处理，致使包封的阴离子快速释放出来。接着通过对细胞毒性、细胞凋亡率、线粒体膜电位及Caspase-3活性的测定，确定载入的阴离子具有诱导癌细胞凋亡的作用，且其凋亡途径主要为Caspase介导的线粒体通路。
本发明主要通过高分辨透射电子显微镜、动态光散射及体外释放等实验，研究了不同温度条件下叶酸靶向热敏脂质体对各种阴离子的转运性能。
1.高分辨透射电子显微镜成像试验通过透射电镜来验证热敏脂质体是否制备成功，如图2所示，图2-a为包封500mM NaCl的热敏脂质体，粒径范围在80-100nm。图2-b为包封1M NaCl的热敏脂质体，粒径范围相同。表明材料成功制备，也说明了包封不同浓度的阴离子，不会影响热敏脂质体的尺寸。
2.动态光散射实验根据动态光散射结果(图3)，包封500mM NaCl及1M NaCl的两种热敏脂质体粒径分布较集中，大小均为100nm左右。与TEM结果相同。
3.体外释放实验移取2mL包封1M NaCl的热敏脂质体(10mg/mL)2份，超声分散在含50mL水的烧杯中，分别置于37、42℃水浴中，磁力搅拌，分别在0，0.25，0.5，1，2，4，8h处移取3mL 样，装入超滤离心管中，12000rpm离心收集滤液，测其阴离子的浓度。
移取1mL包封1M NaCl的热敏脂质体(10mg/mL)于5mL离心管中，60℃氮气吹干。后加入2mL氯仿破乳，50℃氮气吹干，接着加2mL的超纯水，超声15min使其分散，置于超滤离心管中，12000rpm离心收集下层的滤液，测包封的阴离子总浓度。
为了评估热敏脂质体作为阴离子载体的可行性，以NaCl为例，我们对不同温度下，在纯水溶液中的脂质体释放过程进行了研究。热敏脂质体对氯离子的包封率为6.73％。37℃条件下，热敏脂质体在开始的2h间释放速度较快，释放率达到39.6％，随后的2-8h间为缓释阶段，最终进入平稳释放阶段，期间氯离子仍在缓慢释放，说明合成的热敏脂质体对阴离子拥有相应的缓释能力。42℃条件下的释放过程与37℃相似，但前2h内的释放量显著增大，释放率增加了近一倍，为81.6％。温度升高，达到脂质体的相变温度，磷脂酰基链发生紊乱，膜的通透性增大，是导致阴离子短时间内大量释放的主要原因。42℃水浴8h后，释放率已达到97.9％，可以认为此时脂质体所包封的离子被完全释放出来。不同温度条件下释放率的差异，也说明制备的脂质体材料拥有良好的热敏性能。
4.细胞毒性实验以Hela细胞铺设两组平行96孔板，向其中分别加入200μL不同浓度的包封1M NaCl的热敏脂质体(2500、2000、1500、1000、500μg/mL)，对照组加入200mL的培养液。于 37℃、含5％二氧化碳的培养箱中共同孵化2h，拿出其中一组细胞，放入42℃烘箱中，热处理30min，接着放回37℃、含5％二氧化碳的培养箱中共同孵育20h。吸出培养基，每孔依次加入浓度为5mg/mL的MTT 10μL及90μL DMEM，混合均匀，接着培养4h，缓缓地吸弃混合液，防止细胞单层破裂导致甲瓒结晶损失。每孔加入100μL甲瓒增溶溶液，置于37℃恒温摇床上震摇10min后，普通光学显微镜下观察甲瓒结晶已经完全溶解。多功能酶标仪在570nm处检测其吸光度值，对照组和实验组设了6个重复平行实验。
为了研究不同阴离子对细胞的影响，我们进行了细胞毒性实验。图5中，5-1a，5-2a为包封NaCl热敏脂质体分别在37、42℃条件下对Hela细胞产生的增殖抑制效果，因为37℃环境中，热敏脂质体对所包封离子具有一定的缓释效果，所以其细胞毒性较小。而42℃环境下，载入的NaCl对Hela细胞产生较大的毒性，当热敏脂质体的浓度为2500μg/mL时， Hela细胞的存活率降低至38.5％。说明较短时间内大量Cl-内流，使得细胞内氯离子浓度变化超过细胞自我调节能力，是Cl-抑制Hela细胞增殖的前提条件。同时也说明协同载入的 Na+不会影响Cl-对Hela细胞的作用表达。5-1b，5-2b为包封NaH2PO4的热敏脂质体在37℃及42℃环境中对Hela细胞存活率的影响结果。与包封NaCl热敏脂质体作用结果类似， 42℃，脂质体浓度为2500mg/mL时，细胞存活率仅为41.1％。与包封NaCl及NaH2PO4的脂质体不同，包封NaF的热敏脂质体(5-1c，5-2c)，在37℃和42℃条件下，均未对Hela细胞产生明显毒性。说明协同载入的Na+阻碍了F-诱导Hela细胞走向凋亡，导致其无法对 Hela细胞产生显著影响。为了进一步验证这一结论，我们制备了包封NH4F的热敏脂质体并研究了其对Hela细胞的毒性作用，如图5-1d，5-2d所示，37℃条件下，因热敏脂质体自身的缓释特性，NH4F的载入对细胞的存活率未产生明显影响。而在42℃条件下，加入2500 mg/mL脂质体后，细胞存活率下降为40.8％，有较大的细胞毒性。证明了Na+会阻碍F-对 Hela细胞的作用表达，而NH4 +则不会对其产生影响。
5.脂质体胞内荧光成像制备包封5mg/mL罗丹明B的热敏脂质体Rho-TP。以Hela细胞铺设两组平行12孔板，一组加入1000μg/mL Rho-TP，另一组作对照加入相同体积的培养基。共同孵化5h后，进行荧光成像。
为了确定合成的热敏脂质体可以借助叶酸主导的靶向作用胞吞进细胞，我们对包封 Rho B的热敏脂质体进行了细胞内的荧光成像。如图6，Rho B-TP与Hela细胞共同培养5h后的荧光成像呈现强烈的红色荧光发射，说明制备的热敏脂质体可以借助叶酸主导的靶向作用胞吞入Hela细胞。
6.Hela细胞中F-的荧光成像在超净台中，用镊子夹取12孔板专用细胞爬片放置于12孔细胞培养板底部。将处在对数生长阶段的Hela细胞用PBS洗涤三次后，胰酶消解，吹匀得单细胞悬浮液，然后接种于12 孔细胞培养板中，每孔接105个细胞，加入2mL培养基。细胞摇匀后于培养箱中孵化12h。将细胞分为三组，向第三组细胞中加入2500μg/mL包含1M NaF的热敏脂质体分散液 2mL，其余两组仅补添2mL的培养液。放入37℃，含5％CO2的细胞培养箱中共同孵化2h 后，拿出第三组细胞放入42℃烘箱中，热处理30min，接着置于培养箱中共孵化6h。向第二、三组中分别添加荧光探针Z1(10μM)，第一组细胞为对照组，不作处理。放回培养箱接着共培养2h后进行荧光成像。
为了确定制备的热敏脂质体可以将阴离子成功运载进入细胞并释放，我们以包封NaF 的热敏脂质体为例，对Hela细胞内的F-进行荧光成像。如图7所示，1a，2a，3a为对照组细胞，在不同通道下均无荧光产生，1b，2b，3b为加入10mM探针Z1孵化后细胞的荧光成像及叠加图像，蓝色通道有明显荧光产生，而绿色通道无明显荧光发生产生，即Hela细胞中无内源性F-存在。1c，2c，3c为与包封NaF的热敏脂质体共同孵化8h后(期间进行 42℃热处理30min)，然后和10mM探针Z1共同孵化2h的荧光成像，蓝色通道的荧光发射消失，绿色通道呈现出较强的绿色荧光，说明热敏脂质体载入细胞内的F-与探针Z1发生反应，使其荧光发生改变，即热敏脂质体可以作为载体运载阴离子进入细胞。
7.细胞凋亡实验分别移取5mg包封不同阴离子的叶酸靶向热敏脂质体，分散于2mLDMEM培养基中，制备得2500μg/mL阴离子载体分散液。将处在对数生长阶段的Hela细胞，用胰酶消化下来，吹匀制成单细胞悬浮液，接种于6孔细胞培养板中，每孔接105个细胞，2.5mL/孔。孵化 24h后，弃去原有培养基，分别向孔板中加入2500μg/mL包封不同阴离子的热敏脂质体分散液2mL，对照组只加入2mL的培养基，孵化24h。弃去培养基，PBS洗2次，用不含 EDTA的胰蛋白酶消化至细胞间隙增大，孔板底部呈花斑状时，即加入含血清的培养基终止消解。2000rpm，室温离心3min收集细胞，用4℃的PBS离心洗细胞两次，转速为2000 rpm，室温3min。吸弃PBS，加入100μL 1×Binding Buffer重悬细胞，后加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI Staining Solution，混合均匀，室温避光反应15min后，加入 400μL 1×Binding Buffer，混匀后过400目尼龙筛网，将混合液转至流式细胞仪进样管中，放置于冰袋上，样品在1h内完成流式进样检测。
基于细胞毒性实验结果，我们进一步探讨了载入不同阴离子对Hela细胞凋亡率的影响，结果如图8及表1所示，1a，2a为空白细胞在37、42℃条件下的凋亡流式细胞图，凋亡率依次为8.16％和11.6％。1b，2b为包封了NaH2PO4的热敏脂质体与Hela孵化后的凋亡流式细胞图，与37℃相比，经过42℃热处理后的Hela细胞产生明显凋亡，细胞凋亡率增至58.2％，包封了NaCl的热敏脂质体(1c，2c)对Hela细胞的作用结果与之一致，证明短时间内大量磷酸根/氯离子的内流可导致细胞凋亡，且协同的Na+不会影响他们的作用表达。而包封了NaF的热敏脂质体(1d，2d)在37及42℃条件下的细胞凋亡率分别为18.3％和 25.2％，均未见显著凋亡。将协同阳离子Na+替换为NH4 +时(1e，2e)，42℃条件下细胞产生显著凋亡，凋亡率由37℃条件下的25.8％增至75.9％。说明协同的Na+影响了F-对Hela 细胞的作用表达，而NH4 +则不会，与细胞毒性实验结果一致。
表1包封不同阴离子的热敏脂质体与Hela细胞共培养后凋亡率
Figure RE-GDA0002180221070000071
8.JC-1线粒体膜电位实验首先按需要取一定体积的JC-1(200×)存储液，通常将是100μL JC-1(200×)加到16 mL超纯水中，涡旋混匀5min，使JC-1溶解完全。接着加入4mLJC-1染色缓冲液(5×)，振荡使其均匀混合，即得到JC-1染色工作液。
移取试剂盒自带的JC-1染色缓冲液(5×)5mL加入到20mL超纯水中，稀释得到 1×的JC-1染色缓冲液，放于4℃冰箱中备用，以上试剂均现配现用。
取20μL CCCP(50mM)存储液加入到10mL DMEM细胞培养基中，得到浓度为 100μMCCCP稀释液，用它处理Hela细胞3h。之后按照相同的方法进行JC-1染色，完成对线粒体膜电位的测定。
把处在对数生长阶段的Hela细胞，胰酶消化后，接种于6孔细胞培养板中，每孔接105个细胞，2.5mL/孔。孵化24h后，弃去原培养基，分两组向孔板中加入2500μg/mL包封不同阴离子的热敏脂质体分散液2mL，对照组仅加入的2mL培养基，孵化24h(期间一组在孵化两小时后42℃热处理30min)。弃除培养基后，PBS洗涤2次，接着胰酶消解3 min，并用0.5mL含血清的培养基终止消解。2000rpm，室温离心3min后，将细胞重新悬浮于0.5mL的离心管中，每管加0.5mL JC-1染色工作液，反复震荡使其接触完全，37℃、含5％二氧化碳的细胞培养箱中孵育20min。后室温2000rpm离心3min，轻轻吸弃上清液，收集细胞沉淀。再实验1mL JC-1染色缓冲液(1×)重悬Hela细胞，与前述同样的离心条件，洗涤两次，弃上清。最后将细胞重悬于500μL JC-1染色缓冲液(1×)中，进流式分析细胞状态。
为了进一步确定不同离子作用下Hela细胞的凋亡路径，我们进行了JC-1线粒体的膜电位实验。如图9和表2的实验结果，1a为未处理的Hela细胞，被JC-1染色后胞内的红、绿荧光强度的比为168，2a为阳性对照，Hela细胞经CCCP处理后，细胞分布整体向绿色荧光增强方向移动，JC-1染色的红绿荧光强度比值降至56.2。与对照组相比较，37℃条件下，包封了NaH2PO4，NH4F，NaCl的热敏脂质体(1b，1c，1d)与Hela细胞作用后，细胞分布未见明显改变，且红色与绿色荧光强度的比值也未出现大幅度下降，即此条件下Hela细胞的线粒体膜电位没有降低。而42℃条件下，包封了NaH2PO4，NH4F，NaCl的热敏脂质体(2b， 2c，2d)与细胞作用后，细胞分布存在不同程度上向绿光增强方向迁移的现象，且红绿荧光强度的比值大幅降低，分别为70.8，58.1，75.3，即此条件下Hela细胞线粒体膜电位显著降低，内流的阴离子引起细胞产生凋亡的主要路径为线粒体通路。同时，实验结果也说明了只有短时间内大量阴离子内流，才能明显改变线粒体的膜电位，从而进一步促进细胞产生凋亡，这与细胞毒性及细胞凋亡的实验结果一致。
为了更直观的观察JC-1染料作用后细胞内红绿荧光强度的变化，我们对与JC-1孵化后的Hela细胞进行了荧光成像。如图10，图10-1b，10-2b，10-3b为阴性对照组，细胞整体呈现红色荧光发射，图10-1c，10-2c，10-3c为阳性对照组，细胞整体呈现绿色荧光。37℃条件下，包封了NaCl，NH4F，NaH2PO4的热敏脂质体与Hela细胞共同培养后，与阴性对照组比较，绿色及红色荧光强度未见显著变化，荧光叠加图像(10-3d，10-3e，10-3f)整体呈红色荧光发射，即Hela细胞线粒体的膜电位未发生改变。而42℃条件下，绿色荧光强度明显增强，红色荧光强度显著降低，荧光叠加图像(10-3g，10-3h，10-3i)整体呈绿色荧光发射，说明此时线粒体的膜电位显著降低，与JC-1流式细胞图结果一致。
表2JC-1染色后，不同阴离子对Hela细胞中绿色及红色荧光相对强度的影响
Figure RE-GDA0002180221070000081
9.凋亡蛋白酶Caspase-3活性测定称取5mg的Ac-DEVD-AMC，溶于7.4mL的DMSO中，配制成浓度为0.2mM的储备液， -20℃，避光保存。
将Hela细胞消解吹匀得单细胞悬浮液，以每孔105个细胞，2.5mL培养液接种到6孔细胞培养板中，孵化24h后，弃去原有培养液，平行两组加入2500μg/mL的载体材料分散液2mL，对照组则加入2mL培养基，接着共同孵化12h(期间一组在孵化两小时后 42℃热处理30min)。PBS洗涤细胞2次，用胰酶将细胞消解下来，转移至1.5mL的离心管中，室温，2000rpm离心3min得细胞，接着用PBS离心洗涤2次，以除去其中的培养基和胰酶。依次加入500μL的动物细胞蛋白裂解液，剧烈晃动使得细胞和裂解液完全接触。然后将离心管插入冰中20min，期间涡旋3次，每次30秒。4℃，12000rpm，离心5min，取500μL上清液。分别加入50μL的Ac-DEVD-AMC储备液，混合均匀，37℃恒温水浴反应2h后，荧光分光光度计分析荧光强度。激发波长为351nm，狭缝的宽度为3-3nm。
通过对Hela细胞中凋亡蛋白酶Caspase-3活性的检测，我们对阴离子引起Hela细胞凋亡的机理进行了研究，结果如图11所示，37℃条件下，包封了NaH2PO4，NH4F，NaCl 的热敏脂质体与细胞共同培养后，AMC的荧光强度未见显著改变，即凋亡蛋白酶Caspase-3 未被激活。而经过42℃热处理后，AMC的荧光强度显著增强，分别增加了147，358，238，说明此时大量的Caspase-3蛋白酶被活化，导致下游Caspase的级联酶促反应，最终引起细胞的凋亡，同时也说明了协同的阳离子对阴离子诱导细胞凋亡的途径不会产生影响。
10.叶酸靶向性能实验称取7mg Suc-DSPE、2mg DCC，溶于1mL氯仿，N2条件下反应过夜，后加入18mg NH2- PEG2000-NH2(溶于1mL氯仿)，搅拌反应24h，旋干，无水丙酮离心洗3次，透析除未反应原料，即得不含叶酸的DSPE-PEG2000-DSPE/NH2-PEG2000-DSPE混合物。与DPPC以1:9 比例制备包封1M NaCl的无叶酸热敏脂质体。同实验4部分进行细胞毒性实验。
为了验证热敏脂质体的靶向性能，我们制备了包封NaCl的无叶酸热敏脂质体，并应用于细胞毒性实验中。结果如图12，37℃条件下，未对Hela细胞产生显著毒性。42℃条件下，与叶酸靶向热敏脂质体的细胞毒性结果相比较，无叶酸热敏脂质体对Hela细胞的毒性显著降低，浓度为2500μg/mL时，细胞存活率为76.5％。充分说明了含叶酸热敏脂质体是通过叶酸特异性靶向内吞作用进入细胞并释放阴离子诱导细胞凋亡的。

Claims (1)

1.一种跨膜转运阴离子并诱导癌细胞产生凋亡的基于叶酸靶向热敏脂质体的纳米载体的制备方法，其步骤是：
分别称取二棕榈酰磷脂酰胆碱、叶酸-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇溶于氯仿中，超声 15min，此时固体全部溶解，45℃旋转蒸发，于茄形瓶的 内壁形成磷脂薄膜，油泵抽 1~2 h除残留氯仿，向其中加不同浓度的阴离子溶液，恒温振荡器中，55~60℃水合3 h，真空抽滤过 200 nm 的聚碳酸酯 滤膜 10 次后，3000Da透析袋透析 8~12h 除去未包封的阴离子，冰箱 4℃保存，所述 DPPC、FA-PEG2000-DSPE与氯仿的比例为 9g：1g：1L。
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