CN116367855A - 特异型性结合成纤维细胞生长因子受体2的拮抗性双互补位抗体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文描述并提出特异性地结合并抑制FGF受体(例如，FGFR2)的拮抗性双互补位抗体以及使用此类抗体来治疗癌症(包括胆管癌(CCA))的方法。

Description

特异型性结合成纤维细胞生长因子受体2的拮抗性双互补位 抗体及其使用方法

相关申请的交叉引用

本国际PCT申请主张2020年6月3日提交的美国临时专利申请号63/033,975的优先权和权益，所述临时专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。

背景技术

胆管癌(CCA)是从胆管引起的侵袭性肿瘤，其治疗选择有限且总生存不佳。成纤维细胞生长因子受体(FGFR)途径牵涉到细胞生存和分化所需的细胞过程中，且异常FGFR信号传导可导致致癌改变。近年来，已经发现FGFR2基因融合物与CCA相关联。据此，抑制FGFR的药剂可能有用于CCA的治疗。

拮抗性抗体的研发代表了一种具有显著临床潜能的治疗性策略。然而，在实现临床功效方面仍具有挑战。双特异性和双互补位抗体代表了一类新兴药物分子，相对于它们的单特异性对应物，这类新兴药物分子能够实现独特的作用机制。双特异性抗体为包括两个Fab可变结构域的单个分子，每个可变结构域结合不同的抗原。杵-入-臼技术已经用来驱动双特异性抗体向着异源二聚体形成而组装。双互补位抗体为包括两个Fab可变结构域的单个分子，每个可变结构域结合单个抗原上的不同表位。很多双价抗体用作激动剂。针对FGFR2受体的拮抗性双互补位抗体将会为CCA的治疗提供重要的治疗剂，并且此类药剂是亟需的。

发明内容

本文提出特异性地结合并抑制FGF受体(例如，FGFR2)的拮抗性双互补位抗体以及使用此类抗体来治疗癌症(包括胆管癌(CCA))的方法。

一方面，提供一种多肽，其特异性地结合成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的细胞外结构域中的两个表位，其中所述多肽含有抗FGFR2抗体的两个抗原结合片段。在一个实施方案中，抗FGFR2抗体是M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21和12433中的任何一者或多者。

另一方面，提供一种双互补位抗体，其特异性地结合成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的细胞外结构域中的两个表位，其中所述双互补位抗体含有抗体的抗原结合片段，所述抗体选自M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21和12433中的一者或多者。

另一方面，提供一种抑制赘生性细胞的增殖或降低其生存率的方法，其中所述方法涉及使所述细胞与有效量的任何前述方面所述的多肽或抗体接触，从而抑制增殖或降低活力。在一个实施方案中，多肽或抗体诱导赘生性细胞的细胞死亡。在另一实施方案中，赘生性细胞是胆管癌(CCA)细胞。在另一实施方案中，细胞是体外的或体内的。

另一方面，提供一种治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者给药有效量的任何前述方面所述的多肽或抗体，从而治疗所述癌症。在一个实施方案中，赘生性细胞是胆管癌(CCA)细胞。

另一方面，提供一种治疗受试者的胆管癌的方法，其中所述方法涉及向受试者给药有效量的双互补位抗体，所述双互补位抗体含有选自由M048-D01、GAL-FR23、10164、2B1.3.12、GAL-FR21或12433所组成的组的抗原结合片段。在所述方法的一个实施方案中，向受试者给药有效量的双互补位抗体，所述双互补位抗体包含抗体M048-D01和抗体12433的FGFR2抗原结合片段；或抗体GAL-FR21和抗体12433的抗原结合片段；或HuGAL-FR21和抗体12433的抗原结合片段；或抗体HuGAL-FR21和抗体GAL-FR23的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段；或抗体M048-D01和抗体12433的抗原结合片段；或抗体2B 1.3.12和抗体10164的抗原结合片段；或抗体2B1.3.12和抗体12433的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体2B1.3.12的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体HuGAL-FR21的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段。在一实施方案中，受试者的细胞包含FGFR2融合物。在一种实施方案中，FGFR2融合物是FGFR2-PHGDH或FGFR2-BICC1。在所述方法的实施方案中，所述双互补位抗体与FGFR2的结合具有约7.7E-09至约9.1E-10的KD。

另一方面，提供一种分离的核酸分子，其编码任何前述方面所述的多肽或抗体。

另一方面，提供一种含有核酸分子的载体，所述核酸分子编码任何前述方面所述的多肽或抗体。在一个实施方案中，载体是慢病毒载体。在另一实施方案中，表达载体是病毒或非病毒表达载体。在另一实施方案中，表达载体编码可操作地链接至多肽或抗体的亲和力标签或可检测的氨基酸序列。

在另一方面，提供一种宿主细胞，其含有任何前述方面所述的载体。

另一方面，提供一种药物组合物，其包含处于药学上可接受的赋形剂中的有效量的任何前述方面所述的多肽或抗体或其片段。

另一方面，提供一种治疗受试者的胆管癌的方法，其中所述方法包括向受试者给药有效量的任何前述方面所述的抗体和有效量的培米替尼(pemigatinib)或NVP-BGJ398。

在任何上述方面或任何其他方面和/或如本文所述的其实施方案的多个实施方案中，多肽或抗体含有所述抗体的一个或多个互补决定区。在任何上述方面或如本文所述的任何其他方面的多个实施方案中，多肽或抗体含有重链可变结构域(VH)或轻链可变结构域(VL)。在任何上述方面或如本文所述的任何其他方面的多个实施方案中，抗体或多肽特异性地结合FGFR2信号肽(SP)或免疫球蛋白样结构域IgI、IgII或IgIII。在任何上述方面或如本文所述的任何其他方面的多个实施方案中，抗体或多肽特异性地结合FGFR2免疫球蛋白样结构域IgI、IgII或IgIII。在任何上述方面的特定实施方案中，抗体结合SP和IgI、SP和IgII、SP和IgIII、SP和IgII+IgIII、IgI和IgII、IgI和IgIII、IgI和IgII+IgIII、IgII和IgIII、IgII和IgII+IgIII、或IgIII和IgII+IgIII。在任何上述方面或如本文所述的任何其他方面的多个实施方案中，抗体或多肽特异性地结合FGFR2免疫球蛋白样结构域的两个片段，其中所述片段源自IgI和IgII、IgI和IgIII、或者IgII和IgIII。在任何上述方面或如本文所述的任何其他方面的多个实施方案中，抗体或多肽特异性地结合FGFR2免疫球蛋白样结构域IgI、IgII或IgIII的两个片段。在任何上述方面或如本文所述的任何其他方面的多个实施方案中，抗体或多肽结合阻断配体与FGFR2的结合。在任何上述方面或如本文所述的任何其他方面的多个实施方案中，抗体或多肽结合降低FGFR2活性。在另一实施方案中，抗原结合片段与M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21或12433的序列具有至少85％氨基酸序列一致性。在另一实施方案中，抗原结合片段与M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21或12433的序列具有至少90％氨基酸序列一致性。在另一实施方案中，抗原结合片段与M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21或12433的序列具有至少95％氨基酸序列一致性。在另一实施方案中，抗原结合片段含有M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21或12433的互补决定区或基本上由所述互补决定区组成。在另一实施方案中，多肽包含亲和力标签。在另一实施方案中，多肽包含可检测的氨基酸序列。

在其他实施方案中，上述方面和/或其实施方案的双互补位抗体包含抗体M048-D01和抗体12433的抗原结合片段；或抗体GAL-FR21和抗体12433的抗原结合片段；或HuGAL-FR21和抗体12433的抗原结合片段；或抗体HuGAL-FR21和抗体GAL-FR23的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段；或抗体M048-D01和抗体12433的抗原结合片段；或抗体2B 1.3.12和抗体10164的抗原结合片段；或抗体2B 1.3.12和抗体12433的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体2B 1.3.12的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体HuGAL-FR21的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段。

在其他实施方案中，任何上述方面和/或其实施方案的多肽或双互补位抗体与FGFR2的结合具有约7.7E-09至约9.1E-10的KD。在其他实施方案中，上述方面和/或其实施方案的多肽或双互补位抗体与FGFR2的结合具有选自约1.3E-09、7.7E-09、2.5E-10、3.7E-10、3.9E-10、4.2E-10、5.0E-10、5.3E-10、6.8E-10、7.7E-10、8.7E-10或9.1E-10的KD。

在上述方面或其实施方案的其他实施方案中，双互补位抗体包含抗体HuGAL-FR21和抗体12433的FGFR2抗原结合片段；或抗体HuGAL-FR21和抗体GAL-FR23的抗原结合片段；或抗体GAL-FR21和抗体12433的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段，其抑制表达或过表达FGFR2融合物的细胞的生长。在一实施方案中，FGFR2融合物是FGFR1-PHGDH。在上述方面或其实施方案的其他实施方案中，双互补位抗体包含抗体2B1.3.12和抗体10164的FGFR2抗原结合片段；或抗体2B 1.3.12和抗体12433的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体2B 1.3.12的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体HuGAL-FR21的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段，其抑制表达或过表达FGFR2融合物的细胞的生长。在一实施方案中，FGFR2融合物是FGFR2-BICC1。

定义

除非另做定义，否则本文使用的全部科技术语均具有本文所述的方面和实施方案所属领域技术人员通常理解的意义。下述参考文献向技术人员提供很多本文所述的方法和实施方案所用术语的一般定义：《微生物学和分子生物学词典(第二版)》(Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994))；《剑桥科技词典》(he Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988))；《遗传性专业词典(第五版)》(The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger等人(eds.),Springer Verlag(1991))；以及《哈珀·柯林斯生物学词典》(Hale&Marham,The HarperCollins Dictionary of Biology(1991))。如本文中所用，除非明确指定，否则下列术语具有其下方所述意义。

“药剂”意为小分子化学化合物、蛋白质、核酸分子或其片段。在多个实施方案中，提供药剂(例如，双互补位抗体及其片段)，其结合并拮抗FGF受体(例如，FGFR2)。

“缓解”意为减少、压制、衰减、消除、阻止疾病的发展或进展或令疾病的发展或进展稳定化。胆管癌是一种适用于使用本文所述双互补位抗体治疗的示例性疾病。

如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指一种免疫球蛋白分子，其特异性地结合至特定抗原或具有与特定抗原的免疫学反应性，并且包括多克隆、单克隆、基因和分子工程改造的和其他修饰形式的抗体，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、异源缀合物抗体(例如，双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体、双体抗体、三体抗体和四体抗体)和抗体的抗原结合片段，包括例如Fab'、F(ab')₂、Fab、Fv、rlgG和scFv片段。此外，除非另外指出，否则术语“单克隆抗体”(mAb)意为包括完整分子以及能够特异性地结合至靶标蛋白的抗体片段(例如，Fab和F(ab')₂片段)两者。Fab和F(ab')₂片段缺乏完整抗体的Fc片段，更快速地从动物循环中清除，并且可具有比完整抗体更非特异性的组织结合(见，Wahl等人,J.Nucl.Med.24:316,1983；通过引用并入本文)。在一个实施方案中，抗体是双互补位抗体。下文定义的示例性抗体A至F可用于本文所述多个方面和实施方案中的方法中。不旨在限制，双特异性抗体提供如单个分子一样同步识别并结合至两种不同抗原或表位(抗原结构域)的能力。双互补位抗体构成双特异性抗体的子集，包含抗原结合物位点(互补位)，所述互补位提供识别并结合至相同靶抗原上的两个不同表位或抗原位点的能力。在一实施方案中，双互补位抗体的抗原结合结构域识别并结合相同靶抗原诸如受体上的独特的非重叠表位。在一实施方案中，受体是FGFR受体，例如，FGFR1、FGFR2、FGFR2αIIIb、FGFR3和FGFR4。此类抗体作为有益治疗性抗体用于治疗疾病诸如CCA是有优势的。

“M048-D01多肽”(也称为抗体A)意为抗体或其抗原结合片段，其与WO2013076186中描述的特异性结合FGFR2的M048-D01的抗体序列具有至少约85％氨基酸序列一致性。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段与M048-D01的抗体序列具有至少约90％、93％、95％、98％、99％或更大的氨基酸序列一致性。M048-D01的示例性序列提供如下：

M048-D01 VH链

M048-D01 VL链

WO2013076186的SEQ ID NO:32提供如下。

“M048-D01多核苷酸”意为一种编码M048-D01抗体的核酸分子。

“GAL-FR23多肽”或“FR23多肽”(也称为抗体B)意为抗体或其抗原结合片段，其与美国专利号9,382,324中描述的特异性结合FGFR2的根据布达佩斯条约在2008年8月12日以PTA-9408保藏的杂交瘤产生的抗体序列具有至少约85％氨基酸序列一致性。

“GAL-FR23多核苷酸”意为一种编码GAL-FR23抗体的核酸分子。

“10164多肽”(也称为抗体C)意为抗体或其抗原结合片段，其与美国专利号9,498,532和WO2014163714A2中描述的特异性结合FGFR2的10164的抗体序列具有至少约85％氨基酸序列一致性。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段与10164的抗体序列具有至少约90％、93％、95％、98％、99％或更大的氨基酸序列一致性。

FGFR_10164

重链

轻链

“10164多核苷酸”意为一种编码GAL-FR23抗体的核酸分子。

“2B 1.3.12多肽”(也称为抗体D)意为抗体或其抗原结合片段，其与美国专利号10,208,120中描述的特异性结合FGFR2的2B 1.3.12的序列具有至少约85％氨基酸序列一致性。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段与2B 1.3.12的抗体序列具有至少约90％、93％、95％、98％、99％或更大的氨基酸序列一致性。

2B.1.3.12重链，氨基酸

2B.1.3.12轻链，氨基酸

“2B 1.3.12多核苷酸”意为一种编码2B 1.3.12抗体的核酸分子。

“HuGAL-FR21多肽”或“FR21”(也称为抗体E)意为抗体或其抗原结合片段，其与美国专利号9,382,324中描述的特异性结合FGFR2的GAL-FR21的抗体序列具有至少约85％氨基酸序列一致性。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段与GAL-FR21或HuGal-Fr21的抗体序列具有至少约90％、93％、95％、98％、99％或更大的氨基酸序列一致性。在一个实施方案中，抗体GAL-FR21包含根据布达佩斯条约在2008年11月6日作为PTA-9586保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,P.O.Box 1549Manassas,Va.20108)的杂交瘤产生的单克隆抗体(mAB)。

HuGal-Fr21包括下列序列：

mAB HuGal-FR21的轻链可变区：

mAB HuGal-FR21的重链可变区：

“HuGAL-FR21多核苷酸”意为一种编码HuGAL-FR21抗体的核酸分子。

“12433多肽”(也称为抗体F)意为抗体或其抗原结合片段，其与美国专利公开号20190345250中描述的特异性结合FGFR2的12433的抗体序列具有至少约85％氨基酸序列一致性。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段与12433的抗体序列具有至少约90％、93％、95％、98％、99％或更大的氨基酸序列一致性。抗体F，编号12433，描述在美国专利公开号20190345250的表1中。抗体12433包括下列示例性序列：HCDR1 NYYIH(Kabat)；HCDR2AIYPDNSDTTYSPSFQG；HCDR3GADI；LCDR1 RASQDIDPYLSN、LCDR2 DASNLQS、LCDR3QQTTSHPYT。

“12433多核苷酸”意为一种编码12433抗体的核酸分子。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性地结合至靶抗原的能力。抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来实施。抗体片段可以是Fab、F(ab')₂、scFv、SMIP、双体抗体、三体抗体、亲和抗体、纳米抗体、适体或结构域抗体。术语抗体的“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的示例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，一种在铰链区包含通过二硫桥链接的两个Fab片段的双价片段；(i ii)Fd片段，由V_H和C_H1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成；(v)dAb，包括V_H和V_L结构域；(vi)dAb片段(Ward等人,Nature341:544-546,1989)，其由V_H结构域组成；(vii)dAb，其由V_H结构域或V_L结构域组成；(viii)分离的互补决定区(CDR)；和(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，这些分离的CDR可以任选地通过合成连接子接合。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由独立的基因编码，但它们可以使用重组方法通过连接子接合，所述连接子能够将它们作成单个蛋白质链，其中所述V_L区和V_H区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；间，例如，Bird等人,Science242:423-426,1988，和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883,1988)。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且这些片段可以经筛选以通过与完整抗体相同的模式利用。抗原结合片段可通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学切割、或者在一些实施方案中通过本领域已知的化学肽合成程序产生。在一些实施方案中，提供双互补位抗体的抗原结合片段(例如，Fab'、F(ab')₂、Fab、scFab、Fv、rlgG和scFv片段)，这些抗原结合片段通过合成连接子接合。

“改变”意为通过该领域的标准已知方法例如本文所述的那些方法检测的基因或多肽的结构、表达水平或活性的变化(增加或减少)。如本文所用，改变包括表达或活性水平变化10％、表达或活性水平变化25％、变化40％、变化50％或更大。在一些实施方案中，双互补位抗体中的改变是序列改变，所述序列改变提升与靶蛋白的结合、稳定性、表达或活性。在另一实施方案中，改变涉及FGFR2活性的降低，这与本文所述双互补位抗体的结合相关联。

“类似物”意为不相同但具有类似的功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留对应的天然出现多肽的生物学活性，同时具有某些生物化学修饰，这些修饰将所述类似物的功能相对于天然出现的多肽增强。此类生物化学修饰可增加所述类似物的耐蛋白酶性、膜渗透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可包括非天然氨基酸。此外，提供双互补位抗体的类似物，其保留或提升原始抗体的活性。

如本文所用，术语“双互补位抗体”是指例如能够结合至单个靶(例如，多肽)上的两个不同表位的抗体。在一个实施方案中，如本文所述的双互补位抗体的结合特异性中的一者针对呈递在FGFR2的细胞外结构域中存在的三个免疫球蛋白样结构域(IgI、IgII和IgIII)中的第一个上的表位，且第二结合特异性针对第二或第三个免疫球蛋白样结构域。在另一实施方案中，第一结合特异性针对FGF2的第二个免疫球蛋白样结构域，且第二结合特异性针对第三个免疫球蛋白样结构域。在另一实施方案中，如本文所述的双互补位抗体针对呈递在信号肽(SP)上的表位和/或存在于FGF2的第二或第三个免疫球蛋白样结构域(即，Ig2或Ig3结构域)中的表位。在多个实施方案中，如本文所述的双互补位抗体针对此类表位的组合。例如，针对SP和Ig1、Ig2或Ig3；或针对Ig1和Ig2或Ig3；或针对Ig2和Ig3。

本公开中，“包含”、“包含有”、“含有”和“具有”等可具有美国专利法所规定的意义，并且可意为“包括”、“包括在内”等；“主要由...组成”或“基本由...组成”等具有美国专利法所规定的意义，并且该术语是开放性的，允许超过其所引用者的存在，只要超过其所引用者的存在不改变其所引用者的基本特征或新颖特征即可，但不包括先前技术实施方案。

如本文所用，术语“互补决定区”(CDR)是指在轻链和重链可变结构域两者中发现的高变区。可变结构域的更高度保守部分称为框架区(FR)。如本领域中理解的，阐述抗体高变区的氨基酸位置可变，取决于情境和本领域中已知的各种定义。可变结构域内的一些位置可视为杂交高变位置，其中这些位置可以在一组标准下被认为处于高变区内，而在不同的一组标准下被认为处于高变区外。这些位置中的一个或多个也可以在延长的高变区内发现。在多个方面和实施方案中，提供在这些杂交高边位置中包含修饰的抗体。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个框架区，这些框架区主要适应于β-折叠构型，通过三个CDR连接，这形成环，而这些环连接所述β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。各链中的CDR以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序通过FR区保持靠近，并且由于CDR形成其他抗体链，有贡献于抗体靶结合位点的形成(见，Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.1987；通过引用并入本文)。如本文所用，除非另做指定，否则免疫球蛋白氨基酸残基的编号根据Kabat等人的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行。

“检测”是指鉴定待检测分析物的存在、不存在或量。在一些实施方案中，分析物是抗原、表位或其片段。在一个实施方案中，术语“检测”是指检测结合至目标试剂的抗体。

“可检测标签”意为一种组合物，其链接至感兴趣的分子，使得后者可经由光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测。例如，可用的标签包括放射活性同位素、磁珠、金属性珠、胶体颗粒、荧光染料、电子密集型试剂、酶(例如，如ELISA中常用者)、生物素、地高辛或半抗原。在一些实施方案中，如本文所述的抗体直接或间接地链接至可检测的标签。

“疾病”意为损害或干扰细胞、组织或器官正常功能的任何病症或病变。疾病的示例包括癌症(例如，CCA、子宫内膜癌、黑素瘤、食管癌、膀胱癌、乳腺癌和肺癌)以及其他与异常FGFR2活性相关联的过度增殖性疾患。

“有效量”意为相对于未治疗的患者缓解疾病症状所需的药剂的量。用来实践用于对疾病进行治疗性处理的方法的活性化合物的有效量一句给药方式以及受试者的年龄、体重和一般健康状况而变。最终，主治医师或兽医将决定适宜的量和剂量方案。此量称为“有效”量。在一些实施方案中，药剂的有效量是阻断与FGFR2的接货或降低FGFR2活性所需的双互补位抗体的量。

如本文所用，术语“内源性”描述一种分子(例如，多肽、核酸或辅因子)，其天然地见于特定生物体(例如，人类)中或生物体内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，诸如人类细胞)中。

如本文所用，术语“外源性”描述一种分子(例如，多肽、核酸或辅因子)，其天然地不见于特定生物体(例如，人类)中或生物体内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，诸如人类细胞)中。外源性材料包括那些从生物体或自其提取的培养物而言的外部来源提供的。

“成纤维细胞生长因子受体(FGFR)”意为一种结合至FGF配体的受体，其结合典型地诱导酪氨酸激酶活性。示例性FGFR包括FGFR1、FGFR2、FGFR2αIIIb、FGFR3和FGFR4。

术语“FGFR2”是指成纤维细胞生长因子受体2，其是受体酪氨酸激酶超家族的成员。FGFR2的核酸和氨基酸序列是已知的，并且已经公布在GenBank登录号NM_000141.4、NM_001144913.1、NM_001144914.1、NM_001144915.1、NM_001144916.1、NM_001144917.1、NM_001144918.1、NM_001144919.1、NM_022970.3、NM_023029.2中。

示例性FGFR2氨基酸序列在NP_000132提供，所述序列转载如下：

结构上，FGFR2氨基酸序列是一种受体酪氨酸激酶蛋白，其具有信号肽、至少一个或多个免疫球蛋白(Ig)样结构域、酸性盒、跨膜结构域和分体酪氨酸激酶结构域，并且在其全长上与GenBank登录号NM_000141.4、NM_001144913.1、NM_001144914.1、NM_001144915.1、NM_001144916.1、NM_001144917.1、NM_001144918.1、NM_001144919.1、NM_022970.3、NM_023029.2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。结构上，FGFR2核酸序列在其全长上与GenBank登录号NM_000141.4、NM_001144913.1、NM_001144914.1、NM_001144915.1、NM_001144916.1、NM_001144917.1、NM_001144918.1、NM_001144919.1、NM_022970.3、NM_023029.2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。FGFR2信号肽可被保留或切除。

“FGFR2活性”意为酪氨酸激酶活性。

如本文所用，术语“框架区”或“FW区”包括与CDR相邻的氨基酸残基。FW区残基可存在于例如人类抗体、啮齿动物来源的抗体(例如，鼠抗体)、人源化抗体、专有化抗体、嵌合抗体、抗体片段(例如，Fab片段)、单链抗体片段(例如，scFv片段)、抗体结构域和双特异性抗体等。

“片段”意为多肽或核酸分子的一部分。这一部分优选含有所述参考核酸分子或多肽整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个核苷酸或氨基酸。

如本文所用，术语“融合蛋白”或简称“融合物”是指经由共价键与另一分子接合的蛋白质。融合蛋白可通过例如一种蛋白质的N末端与另一蛋白质的C末端之间的酰胺键形成而化学地合成。或者，含有一种蛋白质共价键结至另一蛋白质的融合蛋白可通过表达编码所述融合蛋白的多核苷酸(例如，来自载体或细胞的基因组)而在细胞(例如，真核细胞或原核细胞)中重组地表达。融合蛋白可含有，一种蛋白质，其共价键结至连接子，所述连接子继而共价键结至另一分子。可用于形成融合蛋白的连接子的示例包括含肽连接子，诸如含有天然存在或非天然存在的氨基酸的那些。在一些实施方案中，可能希望在连接子中包括D-氨基酸，因为这些残基不存在于天然存在的蛋白质内并因此对内源性蛋白酶降解具有抗性。连接子可使用本领域已知的多种策略制备，并且依据连接子的反应性组分，可通过酶促水解、光解、在酸性条件下水解、在碱性条件下水解、氧化、二硫键还原、亲核裂解或有机金属裂解而裂解(Leriche等人,2012,Bioorg.Med.Chem.,20:571-582)。示例性FGFR2融合蛋白在已经经历基因组重组的癌症中出现。此类融合蛋白可使用本领域中已知的和本文中描述的方法和序列重组地表达。

如本文所用，术语“人类抗体”是指一种抗体，其中基本上蛋白质的每一部分(例如，CDR、框架、C_L、C_H结构域(例如，C_H1、C_H2、C_H3)、铰链、(V_L、V_H))在人类体内是基本上非免疫原性的，仅具有极小的序列改变或变异。人类抗体可在人类细胞中(例如，通过重组表达)表达，或通过能够表达功能上重组的人类免疫球蛋白(例如，重链和/或轻链)基因的非人类动物或原核或真核细胞(例如，酵母)中表达。再者，当人类抗体为单链抗体时，它可包括未见于天然人类抗体中的链接肽。例如，Fv可包含链接肽，诸如两个至约八个甘氨酸或其他氨基酸残基，其连接重链的可变区与轻链的可变区。此类链接肽被认为是起源于人类的。人类抗体可使用源自人类免疫球蛋白序列的抗体文库通过包括噬菌体展示方法在内的本领域中的多种方法制备。见，例如，美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO 1998/46645、WO 1998/50433、WO 1998/24893、WO 1998/16654、WO 1996/34096、WO 1996/33735和WO 1991/10741，它们通过引用并入本文。人类抗体亦可使用转基因小鼠生产，所述转基因小鼠不能能够表达功能性内源性免疫球蛋白，但其可表达人类免疫球蛋白基因。见，例如，PCT公开WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735；美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5,939,598；它们通过引用并入本文。

如本文所用，术语“人源化”抗体是指非人类(例如，鼠)抗体的形式，这些形式为嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(诸如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或其他靶结合子结构域)，其含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含至少一个且典型地两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的那些CDR区。全部或基本上全部的FR区也可以是人类免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体也可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地包含人类免疫球蛋白接续序列的恒定区。抗体人源化的方法是本领域中已知的。见，例如，Riechmann等人,Nature332:323-7,1988；Queen等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762和美国专利号6,180,370；EP239400；PCT公开WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106和EP519596；通过引用并入本文。

“杂交”意为互补核碱基之间的氢键键合，所述氢键键合可以是沃森-克里克、胡斯坦或反向胡斯坦氢键键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键进行配对的互补核碱基。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指在不同程度上不含通常伴随它的成分(如在其原生状态下所见)的材料。“分离”表示与原始来源或周围物质分隔的程度。“纯化”表示高于分离的分割程度。“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质足够不含其他材料，使得任何杂质在材料层面不影响所述蛋白质的生物学性质或造成其他负面后果。换句话说，当通过重组DNA技术生产时，如果一些方面和实施方案的核酸或肽基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，则它是纯化的；或者当化学合成时，如果不含化学前体或其他化学物质，则它是纯化的。典型地使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱测定纯度及同质性。术语“纯化的”可表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上的一个带。对于可进行修饰例如磷酸化或糖基化的蛋白质，不同的修饰可产生不同的分离蛋白质，这些蛋白质可独立纯化。

“分离的多核苷酸”意为一种核酸(例如，DNA)，其不含在本文一些方面和实施方案的核酸分子所来源的有机体的天然基因组中位于所述基因侧翼的基因。因此所述术语包括，举例而言，重组DNA，其被并入载体内、自主复制质粒或病毒内、或并入原核生物或真核生物的基因组DNA内；或作为独立于其他序列的单独分子存在(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)。此外，所述术语包括从DNA分子转录的RNA分子，以及作为编码附加多肽序列的杂交基因的一部分的重组DNA。

“分离的多肽”意为已经与其天然伴随组分分隔的一些方面和实施方案的多肽。典型地，当多肽不含至少60重量％的天然与其相关的蛋白质和天然有机分子。优选地，所述制剂是至少75重量％、更优选至少90重量％、且最优选至少99重量％的本文一些方面和实施方案的多肽。本文一些方面和实施方案的分离多肽可以例如通过从天然来源萃取、通过表达编码此多肽的重组核酸、或通过化学合成所述蛋白质而获得。可通过任何适宜的方法，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析，来测量纯度。

如本文所用，术语“杵-入-臼”或“KnH”技术是指通过在两个多肽相互作用的界面处将凸起(杵)引入一个多肽中并将空穴(臼)引入另一多肽中而在体外或体内引导两条多肽配对在一起的技术。例如，KnH已经被引入抗体的Fc:Fc结合界面、C_L:C_H1界面或V_H/V_L界面中(例如，US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人(1997)ProteinScience 6:781-788)。这尤其可用于在双互补位抗体的制备期间驱动两个不同的重链配对在一起。例如，在其Fc区内具有KnH的双互补位抗体可进一步包含链接至各Fc区的单个可变结构域，或进一步包含与相似或不同轻链结构域配对的不同重链可变结构域。KnH技术也可用于将两个不同的受体细胞外结构域或包含不同靶识别序列的任何其他多肽序列(例如，包括亲和抗体、肽类抗体及其他Fc融合物)配对在一起。

双互补位抗体也使用不依赖于KnH技术的方法获得。Labrijn,等人(ControlledFab-arm exchange for the generation of stable bispecific IgG1,NatureProtocols 9:2450-2463,2014)描述受控的Fab臂交换(cFAE)，这是一种易使用的生成双特异性IgG1(bsIgG1)和双互补位抗体的方法。所述方案涉及下列：(i)独立表达两种含有在CH3结构域中的单个匹配点突变的亲代IgG1；(ii)将亲代IgG1在允许氧化还原条件下在体外混合以使得能够进行半分子的重组；(ii i)去除还原剂以允许链间二硫键的再氧化；和(iv)使用基于色谱的方法或基于质谱(MS)的方法分析交换效率和最终产物。所述方案以实验室规模(微克级至毫克级)和小型生物反应器规模(毫克级至克级)两者生成具有常规的IgG架构、特征和品质属性的bsAb，其旨在模拟大规模制造(千克级)。从良好品质的纯化蛋白质起始，在2至3天内可常规地获得≥95％的交换效率(包括品控)。在一些实施方案中，两种亲代IgG1含有匹配点突变，任一IgG1中有一个突变，分别在CH3:CH3界面处，即K409R和F405L(EU编号规定)。

在一个特定实施方案中，Labrijn,等人(Efficient generation of stablebispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange,PNAS.110:5145–5150,2013)描述使用HER2×CD3(T细胞募集)和HER2×HER2(双重表位靶向)bsAb进行的概念验证研究，其表明优于亲代抗体对的体内活性。前述Labrijn出版物中的每一个通过引用以其整体并入本文。

可用于生成双互补位抗体的方法在例如美国专利号9,212,230、9,150,663、10,344,050中描述，其各自通过引用以其整体并入本文。

如本文所用，在多核苷酸片段情境中的术语“可操作地链接”旨在意为将两个多核苷酸片段接合，使得由这两个多核苷酸片段编码的氨基酸序列保留在框内。

“降低”意为至少10％、25％、50％、75％或100％的反向改变。

“参考”意为标准或对照条件。在一些实施方案中，使赘生性细胞接触本文所述的抗体，并且相对于不接触所述抗体的相应参考细胞来测定所述抗体结合至所述细胞上抗原的效应。在一些实施方案中，参考是在对照细胞中观察到的增殖、细胞生存或细胞死亡。

“参考序列”是用作序列比对基础的定义序列。参考序列可以是特定序列的子集或整体，例如，全长度cDNA或基因序列的节段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常将会是至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，甚至更优选约35个氨基酸、约50个氨基酸、或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常将会是至少约50个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，甚至更优选约100个核苷酸或约300个核苷酸或其附近或之间的任意整数个核苷酸。

如本文所用，术语“scFv”是指单链Fv抗体，其中来自抗体的重链和轻链的可变结构域已经接合以形成一条链。scFv片段含有单个多肽链，其包括通过链接子分隔的抗体轻链可变区(VL)(例如，CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3)和抗体重链可变区(VH)(例如，CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3)。将scFv片段的VL区和VH区接合的链接子可以是由蛋白氨基酸构成的肽链接子。替代性链接子可用来增加scFv片段对于蛋白质水解降解的抗性(例如，含有D-氨基酸的链接子)，为了增强scFv片段的溶解度(例如，亲水性链接子诸如含聚乙二醇的链接子或者含重复甘氨酸和丝氨酸残基的多肽)，改善分子的生物物理稳定性(例如，含形成分子内或分子间二硫键的半胱氨酸残基的链接子)，或削弱scFv片段的免疫原性(例如，含糖基化位点的链接子)。scFv分子是本领域中已知的，并且例如在美国专利号5,892,019、Flo等人,(Gene77:51,1989)、Bird等人,(Science 242:423,1988)、Pantoliano等人,(Biochemistry 30:10117,1991)、Milenic等人,(Cancer Research 51:6363,1991)和Takkinen等人,(Protein Engineering4:837,1991)中描述。scFv分子的VL和VH结构域可源自一个或多个抗体分子。本领域一般技术人员应理解，本文一些方面和实施方案的scFv分子的可变区可经修饰，使得它们在氨基酸序列方面不同于它们所源自的抗体分子。例如，在一个实施方案中，可在氨基酸残基处作出导致保守性置换或改变的核苷酸或氨基酸置换(例如，在CDR和/或框架残基中)。或者或此外，使用本领域公认的技术对CDR氨基酸残基作出突变以优化抗原结合。scFv片段在例如通过引用并入本文的WO2011/084714中描述。

“特异性地结合”意为多肽或抗体识别并结合目标多肽(例如，FGFR，诸如FGFR2)，但基本上不识别并结合天然地包括本文一些方面和实施方案的多肽的样品如生物学样品中的其它分子。特异性地结合至抗原的抗体或其抗原结合片段将会以小于100nM的KD结合至抗原。例如，特异性地结合至抗原的抗体或其抗原结合片段将会以最高100nM(例如，介于1pM至100nM之间)的KD结合至抗原。对特定抗原或其表位不表现出特异性结合的抗体或其抗原结合片段将会表现出大于100nM(例如，大于500nm、1uM、100uM、500uM或1mM)的对于所述特定抗原或其表位的KD。多种免疫分析形式可用来选择与特定蛋白质或碳水化合物具有特异性免疫反应性的抗体。例如，固相ELISA免疫分析常规地用来选择与蛋白质或碳水化合物具有特异性免疫反应性的抗体。见，Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,New York(1988)和Harlow&Lane,Using Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,New York(1999)，关于可用来测定特异性免疫反应性的免疫分析形式和条件的描述。

可用于本文一些方面和实施方案的方法中的核酸分子包括任何编码本文一些方面和实施方案的多肽或其片段的核酸分子。此类核酸分子无需与内源性核酸序列100％一致，但典型地将表现出基本一致性。具有与内源性序列的“基本一致性”的多核苷酸典型地能与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本文一些方面和实施方案的方法中的核酸分子包括任何编码本文一些方面和实施方案的多肽或其片段的核酸分子。此类核酸分子无需与内源性核酸序列100％一致，但典型地将表现出基本一致性。具有与内源性序列的“基本一致性”的多核苷酸典型地能与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”意为在各种严格条件下在互补多核苷酸序列(例如，本文所述的基因)或其片段之间配对以形成双链分子。(见，例如，Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。

例如，严格的盐浓度一般将低于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选低于500mMNaCl和50mM柠檬酸三钠，且更优选约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。在有机溶剂例如甲酰胺的缺席下可获得低严格度杂交，而在至少约35％甲酰胺且更优选至少约50％甲酰胺的存在下可获得高严格度杂交。严格的温度条件一般将包括至少约30℃、更优选至少约37℃且最优选至少约42℃的温度。不同的其它参数例如杂交时间、表面活性剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及载剂DNA的包含或不包含，是本领域技术人员所熟知的。通过按需要将这些条件组合，实现各种水平的严格度。在一种优选的实施方案中，杂交将在30℃下在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％ SDS中发生。一个更优选的实施方案中，杂交将在37℃下在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％ SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中发生。在一种最优选的实施方案中，杂交将在42℃下在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％ SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中发生。这些条件的可用改变对于本领域技术人员是显而易见的。

对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤也将改变严格度。洗涤严格度条件可通过盐浓度并且通过温度界定。如上，可通过减低盐浓度或升高温度来增加洗涤严格度。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度优选将低于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，且最优选约15mMNaCl和1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件一般将包括至少约25℃、更优选至少约42℃、甚至更优选至少约68℃的温度。一个优选实施方案中，洗涤步骤将在25℃下在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中发生。在一种更优选的实施方案中，洗涤步骤将在42℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中发生。在一种更优选的实施方案中，洗涤步骤将在68℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中发生。这些条件的其他改变对于本领域技术人员是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员所熟知的，并且在例如Benton and Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；《分子生物学现代方法》(Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001))；《分子克隆技术指南》(Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York))；和《分子克隆：实验室手册》(Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)中有所描述。

“基本上相同”意为多肽或核酸分子表现出至少50％的与参考氨基酸序列(例如，本文所述氨基酸序列中的任何一个)或核酸分子(例如，本文所述核酸序列中的任何一个)的一致性。优选地，此序列在氨基酸水平上或核酸水平上具有与用于比对的序列的至少60％、更优选80％或85％、且更优选90％、95％或甚至99％的一致性。

典型地使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组(Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705)的序列分析软件包(Sequence AnalysisSoftware Package)，BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列一致性。此类软件通过对不同的替换、删除和/或其他修饰指定同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守替换典型地包括系列各组的组内替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在测定一致性程度的一个示例性方法中，可使用BLAST程序，e^-3和e^-100之间的概率评分指示密切相关的序列。

“受试者”意为哺乳动物，包括但不限于，人类和非人类哺乳动物，例如牛、马、犬、羊或猫。

本文提供的范围理解为是所述范围内所有值的简写。例如，1至50的范围理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成组的任何数字、数字组合或子范围。

术语“转染”的动名词和名词形式同义地使用，并且根据本文一些方面和实施方案，意为将异源核酸(DNA/RNA)引入真核细胞特别是酵母细胞内。

根据本文一些方面和实施方案，抗体片段理解为意为抗体的功能性部分，诸如Fc、Fab、Fab'、Fv、F(ab')2、scFv。根据本文一些方面和实施方案，相应生物活性片段理解为意为抗体的那些能够结合至抗原的部分，诸如Fc、Fab、Fab'、Fv、F(ab')2和scFv。

如本文所用，术语“处理”、“治疗”等是指减轻或缓解病变和/或与之关联的症状。应理解，尽管没有排除，但治疗病变或病症并不需要完全消除所述病变、病症或与之关联的症状。

如本文所用，术语“可变区CDR”包括CDR或互补决定区的氨基酸，如使用基于序列或结构的方法所鉴定的。如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链多肽和轻链多肽两者的可变区内发现的非接续抗原结合位点。这些特定区已经由Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616,1977和Kabat,等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242,1991描述；由Chothia等人,(J.Mol.Biol.196:901-917,1987)并且由MacCallum等人,(J.Mol.Biol.262:732-745,1996)描述，其中定义包括当针对彼此进行比较时，氨基酸残基的重叠或子集。在某些实施方案中，术语“CDR”是由Kabat基于序列比较而定义的CDR。

如本文所用，术语“载体”包括核酸载体，例如，DNA载体诸如质粒、RNA载体、病毒或其他合适的复制子(例如，病毒载体)。已经研发了多种载体用于将编码外源性蛋白质的多核苷酸递送至原核细胞或真核细胞内。此类表达载体的示例在例如通过引用并入本文的WO1994/11026中公开。本文一些方面和实施方案的表达载体含有多核苷酸序列以及，例如，用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组内的其他序列元件。可用于表达本文一些方面和实施方案的抗体和抗体片段的某些载体包括含有调节序列，诸如启动子和增强子区的质粒，其引导基因转录。其他可用于表达抗体和抗体片段的载体含有多核苷酸序列，所述多核苷酸序列增强这些基因的翻译率或改善由基因转录所得的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括，例如，5'和3'非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和多腺苷酸化信号位点，以便引导所述表达载体上携带的基因的有效转录。本文一些方面和实施方案的表达载体也可含有编码用于选择含有此类载体的细胞的标记物的多核苷酸。合适的标记物的示例包括编码抗生素(诸如氨苄西林、氯霉素、卡那霉素或诺尔斯菌素)耐药性的基因。

如本文所用，术语“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv或Fab的重链。“VL”的表述是指抗体的免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv或Fab的轻链。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体表现出对于特异性靶的结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺乏靶特异性的其他抗体样分子两者。天然抗体和免疫球蛋白一般是约150,000道尔顿的异源四聚糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。天然抗体的各重链具有在氨基末端的可变结构域(VH)，后随大量恒定结构域。天然抗体的各轻链具有在氨基末端的可变结构域(VL)和在羧基末端的恒定结构域。

如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“或”理解为包括性的。如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“一”或“所述”理解为单数或复数。

如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“约”理解为处于本领域正常公差范围内，例如处于平均值的2个标准偏差内。“约”可理解为处于所指定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非上下文明确排除，否则本文提供的所有数值均以术语“约”修饰。

本文中的任何变量定义中对一系列化学基团的叙述包括所述变量作为任何单一基团或所列基团的组合的定义。本文中对于变量或方面的实施方案的叙述包括所述实施方案作为任何单一实施方案或与其他实施方案或其部分组合。

本文所提供的任何组合物或方法可与本文所提供的任何其他组合物和方法中的一者或多者合用。

附图说明

图1A提供示意图，其显示FGFR2融合蛋白。

图1B提供三幅图，其将细胞的群体倍增定量。FGFR2融合物转化BaF3细胞。在存在或不存在IL3的情况下，用表达FGFR2受体酪氨酸激酶结构域与磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)、腺苷高半胱氨酸样1AHCYL1、或BicC家族RNA结合蛋白1(BICC1)的融合物的逆转录病毒载体转导BaF3细胞。在IL3耗尽分析中，FGFR2-AHCYL1和FGFR2-PHGDH融合物FGFR2-BICC1(部分地)赋予BaF3细胞以IL3依赖性生长。

图2提供三幅图，其将活力/存活率作为FGFR抑制剂NVP-BGJ398剂量的函数进行定量。NVP-BGJ398，也称为英菲格拉替尼(Infigratinib)，是FDA批准的可口服给药的FGFR1/2/3的选择性FGFR抑制剂。据报导，NVP-BGJ398在使用FGFR1/2/3的无细胞分析中分别具有0.9nM/1.4nM/1nM的IC50。数据表明，FGFR2融合物转化的BaF3细胞对于FGFR抑制剂(NVP-BGJ398)敏感。也提供显示IC50(uM)的表。

图3A提供显微照片，其显示表达FGFR2融合蛋白的NIH3T3细胞的转化灶形成。

图3B为显示在表达FGFR2融合物的NIH3T3细胞的培养物中存在的集落数量。这一数据表明，FGFR2融合物足以转化NIH3T3细胞。

图4A至4F呈现示意图、印迹图、图像、表格和图形，其显示FGFR2细胞外结构域对于FGFR2融合物驱动的细胞生长和转化而言是重要的，并且源自患者的FGFR2细胞外结构域突变增加了转化能力。也如其所示，一些亲代抗体在抑制ECD突变驱动的细胞生长方面有效。图4A为显示FGFR2-BICC1、FGFR2-AHCYL1和FGFR2-PHGDH融合物比对照生长更快且响应于FGF配体的图。FGFR2细胞外结构域(ECD)有贡献于经转化的表达FGFR2融合物的NIH3T3细胞的生长。图4B显示FGFR2-BICC1融合物的ECD缺失构建体的示意图，其中FGFR2-BICC1融合物的Ig1、Ig2、Ig3细胞外结构域中的任一者或者Ig2和Ig3细胞外结构域两者缺失。此类缺失突变体用于基于细胞的分析中以评估ECD在用于在NIH3T3和BaF3细胞中引起致癌性转化的FGFR2-BICC1融合物中的重要性。此外，评估了本文所述的抗体抑制过表达ECD突变体FGFR2融合物的细胞的生长的能力。图4C呈现印迹图，其显示ECD突变体FGFR2融合物在经转化的细胞中的表达水平。图4D显示用突变体ECD FGFR2-BICC1融合物(FGFR2-BICC1突变体)中的每一种转化的NIH3T3细胞的图像，和显示FGFR2-BICC1变体中的每一种在用所述变体转化细胞后的转化能力和生长效应的图。图4D中的代表性图像显示，在转化灶形成分析中，在用不同FGFR2-BICC1变体转导NIH3T3细胞后形成的集落。对于每种变体，用5次平行实验执行所述分析。图4E表面，当将源自患有胆管癌的患者(例如，患者1至4(PT1至PT4))的FGFR2的ECD中的缺失突变引入NIH3T3细胞内时，所述突变增加转化能力，并因此为活化突变，如在经转化的细胞集落的照片图像中和描述所形成的经转化的集落数量的图中所示。图4F示例性说明，一些亲代抗体(例如，抗体A至F)在抑制ECD突变驱动的细胞生长中有效，所述细胞已经用具有ECD活化缺失突变的源自患者的FGFR2进行转化。在图4F的图中，使用以具有ECD活化缺失突变的源自患者1的FGFR2(如图4F中的表中所呈现的)转化并与所示抗体接触的细胞进行的分析结果显示在左起第一组方框中；使用以具有ECD活化缺失突变的源自患者2的FGFR2(如图4F中的表中所呈现的)转化并与所示抗体接触的细胞进行的分析结果显示在左起第二组方框中；使用以具有ECD活化缺失突变的源自患者3的FGFR2(如图4F中的表中所呈现的)转化并与所示抗体接触的细胞进行的分析结果显示在左起第三组方框中；且使用以具有ECD活化缺失突变的源自患者4的FGFR2(如图4F中的表中所呈现的)转化并与所示抗体接触的细胞进行的分析结果显示在所述图的最右一组方框中。

图5为显示FGFR2-BICC1、FGFR2-AHCYL1和FGFR2-PHGDH融合物对于NVP-BGJ398治疗敏感的图，指示这些融合物信号是经由FGFR的。用FGFR2融合物转化的NIH3T3细胞对FGFR抑制剂NVP-BGJ398敏感。

图6A和6B为显示FGF配体(FGF10)放大表达FGFR2-PHGDH融合物的BaF3细胞的生长。

图7A包括示意图和图形。所述示意图指示FGFR2表位被所指示的抗体结合。被抗体结合的FGFR2细胞外结构域的区包括信号肽(SP)和三个免疫球蛋白样结构域(IgI、IgII和IgIII)。FGF受体也包括跨膜结构域(TM)和两个激酶结构域。在该图的左侧，提供了一系列显示使用抗体A至F进行的FACS分析结果的直方图。在该图的右侧，GFP阳性细胞的百分比显示为针对示意图中所示各种FGFR2结构域的抗体A至F的抗体浓度的对数的函数。

图7B为表，其显示如本文所述和使用的抗体A至F的来源、替代性命名名称和性质。举例而言，在图7B中，“抗体A”的替代性名称为“拜耳(Bayer)”和“M048-D01”；“抗体B”的替代性名称为“Gal23”和“GAL-FR23”；“抗体C”的替代性名称为“N10164”、“N10”和“10164”；“抗体D”的替代性名称为“GE”和“2B1.3.12”；“抗体E”的替代性名称为“GA”和“HuGAL-FR21”；且“抗体F”的替代性名称为“N12433”、“N12”和“12433”。

图8为示意图(在图7A描述)和图形，其显示当用FGF10处理时，表达FGFR2IIIb的BaF3细胞的生长。抗FGFR2抗体阻断表达野生型FGFR2b的BaF3细胞的配体依赖性刺激。FGFR2b是FGFR2的同种型，其主要在胆管癌中表达。

图9为显示抗体F在BaF3细胞中具有针对FGFR2-PHDGH活化复合物的抑制活性的图。在不存在FGF配体的情况下，抗体A和C具有激动剂活性，且抗体D具有较低程度的激动剂活性。

图10为显示抗体C、D、E和F具有针对表达FGFR2-PHDGH融合物的BaF3细胞的配体刺激性生长的活性的图。

图11A至11D示例性说明双互补位抗体的生成。图11A显示类似于可用于生成双互补位抗体的那些的FGFR2抗体组合。亲代抗FGFR2抗体的组合增对所述抗体对于细胞(例如，BaF3)生长的抑制效应。图11B和11C提供用于生成双互补位抗体的设计。图11C提供基于duobody技术(Genmab)来生成双互补位抗体的示意图。举例而言，duobody抗体(例如，IgG1抗体)通过抗体的CH3结构域中的匹配的(去稳定)突变的受控Fab臂交换来制备。K409R和F405L是CH3界面中此类去稳定突变的示例。互补突变有利于异源二聚化。通过受控Fab臂交换生成稳定的双特异性抗体由A.F.Labrijn等人,March 2013,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,110(13):5145-5150和A.F.Labrijn等人,May 2017(在线的),Nature ScientificReports,7:2476报导。图11D示例性说明双特异性抗体的纯化，使用镍纯化从仅在抗体(双特异性)的一半中包含His标签的异源二聚双互补位、His标记抗体分离并纯化同源二聚抗体(未标记的或His/His标记的抗体)。

图12包括两幅图。左图显示，使用具有FGFR2扩增的SNU-16细胞系的FACS分析的结合偏移。右图显示在各种浓度的GA抗体下结合至FGFR2抗体(具有GFP+)的细胞的百分比。在先前研究中，GA抗体具有大约1nM的Kd(nM)(FACS)。在本研究中，抗体E具有1.58nM的Kd。Kd是基于结合曲线计算的。GA抗体(来自Galaxy的HuGAL-FR21)在美国专利公开号20160362496中描述。在右侧图中，具有正荧光的细胞数量百分比显示为Galaxy抗体浓度的对数的函数。

图13提供FACS数据(在顶部)和％结合(在底部)，它们都用来计算Kd。各FACS曲线代表不同的浓度。向右偏移越远，Ab浓度越高。

图14A至14E显示图表、等辐射热图和Loewe得分，表明在不存在FGF配体(FGF10)的情况下，FGFR2双价抗体与FGFR抑制剂协同作用以抑制FGFR2融合物驱动的细胞生长。图14A呈现图表，其显示在使用过表达FGFR2融合物分子(FGFR2-PHGDH)的BaF3细胞的基于细胞的分析中，在用抑制剂和抗体处理3、4、和5天后，在不存在FGF配体(-FGF)的情况下，浓度为0、0.84、1.69、3.39、6.78μM的FGFR2小分子抑制剂BGJ398(也称NVP-BGJ398)(见，例如，实施例3)与浓度为0、5、15、30、40μg/mL的抗FGFR2双价抗体(抗体F)之间的协同作用。在图14A中的图表中，较浅颜色的方框和数值与较低的分子生存率相关，表明在不存在FGF的情况下，抗体F显示与BGJ398的抑制效应。图14B至14D提供等辐射热图，其显示在不同日期的FGFR抑制剂与抗FGF2双价抗体之间的协同作用，并且支持图14A中所示的结果。图14B对应于用BGJ398抑制剂处理3天后；图14C对应于用BGJ398抑制剂处理4天后；且图14D对应于用BGJ398抑制剂处理5天后。图14E提供Loewe得分，其显示在不同日期的FGFR抑制剂与抗FGF2双价抗体之间的协同作用，并且支持图14A中所示的结果。结果显示，在不存在FGF10的情况下，在处理5天时，BGJ398与抗体F协同作用以抑制FGFR2-PHGDH驱动的BaF3细胞生长。

图15A至15E显示图表、等辐射热图和Loewe得分，表明在存在FGF配体(FGF10)的情况下，FGFR2双价抗体与FGFR抑制剂协同作用以抑制FGFR2融合物驱动的细胞生长。图15A呈现图表，其显示在使用过表达FGFR2融合物分子(FGFR2-PHGDH)的BaF3细胞的基于细胞的分析中，在用抑制剂和抗体处理3、4、和5天后，在存在FGF配体(-FGF)的情况下，FGFR2小分子抑制剂BGJ398与抗FGFR2双价抗体(抗体D)之间的协同作用。在图15A中的图表中，较浅颜色的方框和数值与较低的分子生存率相关，表明在存在FGF的情况下，抗体D显示与BGJ398的抑制效应。图15B至15D提供等辐射热图，其显示在不同日期的FGFR抑制剂与抗FGF2双价抗体之间的协同作用，并且支持图15A中所示的结果。图15B对应于用BGJ398抑制剂处理3天后；图15C对应于用BGJ398抑制剂处理4天后；且图15D对应于用BGJ398抑制剂处理5天后。图15E提供Loewe得分，其显示在不同日期的FGFR抑制剂与抗FGF2双价抗体之间的协同作用，并且支持图15A中所示的结果。在存在FGF10的情况下，在处理5天时，BGJ398与抗体D协同作用以抑制FGFR2-PHGDH驱动的BaF3细胞生长。在实施方案中，另一FGFR2融合物，例如，FGFR2-BICC1，可与NIH3T3细胞例如过表达FGFR2-BICC1的NIH3T3细胞合用，以评估在具有和不具有FGF配体的情况下，BGJ398与抗体F和D之间的协同作用。

图16A至16F提供示意性示例性说明、印迹图和图形，其涉及

分析的研发以测量FGFR2二聚化。此类分析用来针对双互补位抗体中断FGFR2二聚化的能力进行双互补位抗体筛选。图16A显示，使用/>

测量FGFR2受体二聚化，如通过来自FGF配体结合至FGFR2的ECD导致的受体二聚化(左)以及通过FGFR2融合物导致的受体二聚化(右)所描述的。蛋白质相互作用将亚基带至靠近以形成功能性酶，所述酶生成明亮的发光信号(图16B)。图16C(左)显示在转染后3天，用于在HEK293T细胞中瞬时表达的FGFR2-WT(野生型)、FGFR2-ACHYL1和FGFR2-BICC1的/>

表达构建体的蛋白质印迹图。图16C(右)显示使用FGFR2融合物和FGFR2表达细胞进行的/>

分析结果的图。图16D显示用于FGFR2融合物在HEK293T细胞中稳定表达的FGFR2-WT(野生型)、FGFR2-ACHYL1和FGFR2-BICC1的/>

构建体的印迹图。图16E呈现使用具有或不具有FGF10配体的/>

构建体的/>

分析的结果图。图16F显示分析结果，在所述分析中，表达FGFR2的稳定细胞系经历抗体A至F(如图7B中所鉴定的)并执行/>

分析。如图16F左侧的图中所示，抗体A至F中的某些抑制稳定地过表达FGFR2(FGFR2IIIb)的BaF3细胞的生长。抗体D用于/>

分析中(图16F右侧的图)。在图16F的最右侧图中，在所述分析中，FGFR2 WT(野生型)所得的倍数发光由各组三条柱中的左侧柱表示；在所述分析中，FGFR2+FGF10所得的倍数发光由各组三条柱中的中间柱表示；并且在所述分析中，+/-FGF10配体差异导致的倍数发光由图16F中所示各组三条柱中的右侧柱表示。

图17A至17C提供示意图和列表数据，涉及用来比较双互补位抗体的亲合力与其亲代(双价单特异性)抗体的亲合力的评估。图17A示例性说明双价且双特异性的双互补位抗体，这些双互补位抗体被发现比其亲代(双价单特异性)抗体更紧密地结合至配体(FGFR2)，并且因此，更紧密地结合至FGFR2的双互补位抗体似乎在阻断FGFR2二聚化中更有效。图17B和17C呈现表，其显示亲代抗体和双互补位抗体的结合亲合力，如使用表面等离子体共振(SPR)所测量。在表中，在结合分析中评估的几乎全部的亲代单特异性抗体，即FGFR_B(KD(M)1.6E-08)、FGFR_N_12433(KD(M)7.5E-09)、FGFR_GA(KD(M)7.5E-09)、FGFR_Gal23(KD(M)2.1E-09)、FGFR_N_10164(KD(M)1.7E-09)和FGFR_GE_FL(KD(M)9.9E-10)都显示比双互补位抗体低的结合亲和力。双互补位抗体的命名是基于图7B中的表中所示的抗体说明。

图18A至18D呈现图，其显示在经分子工程化以过表达FGFR2-PHGDH融合物的BaF3细胞中，双互补位抗体影响FGFR2融合物驱动的细胞生长的能力。如图18A至18D中所示，与过表达空载体的对照细胞相比，双互补位抗体GA/N12、GA/Gal23、Gal23/N12和B/N12在抑制过表达FGFR2-PHGDH融合物(见于胆管癌患者中)的BaF3细胞的生长中更有效。与其亲代抗体相比，这些双互补位抗体在抑制过表达FGFR2-PHGDH融合物的BaF3细胞的生长方面也更有效。双互补位抗体的命名是基于图7B中呈现的亲代抗体的名称和说明。

图19A至19D呈现显示在经分子工程化以过表达FGFR2-BICC1融合物的NIH3T3细胞中双互补位抗体影响FGFR2融合物驱动的细胞生长的能力的图。如图19A至19E中所示，与其亲代抗体相比，双互补位抗体：GE/N10、GE/N12、B/GE、B/GA和B/N12在抑制过表达FGFR2-BICC1融合物(见于胆管癌患者中)的NIH3T3细胞的生长方法更有效且更强劲。双互补位抗体的命名是基于图7B中呈现的亲代抗体的名称和说明。

主要组件符号说明

无。

具体实施方式

本文提出特异性地结合并抑制FGF受体(例如，FGFR2)的拮抗性双互补位抗体以及使用此类抗体来治疗癌症(包括胆管癌(CCA))的方法。

本文所述的方面和实施方案至少部分地基于以下发现：双互补位抗体结合成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)上的两个不同表位且抑制FGFR2活性。不受缚于理论，本文一些方面和实施方案的双互补位抗体步进通过阻断配体与FGFR2的结合而且通过空间位阻地阻断FGF受体之间的相互作用/二聚化来抑制FGFR2。

六种结合至FGFR2的细胞外结构域中不同表位的抗体用来生成针对FGFR2的双互补位抗体。那些抗体的VH和VL序列提供如下：

M048-D01 VH

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGTSTYYA

DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRYNWNHGDWFDPWGQGTLVTVS

S

M048-D01 VL

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYENYNRPAGVPDRF

SGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSWDDSLNYWVFGGGTKLTVLG HuGAL-FR21 VH

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYIFTTYNVHWVRQAPGQGLEWIGSIYPDNGDTSY

NQNFKGRATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDFAYWGQGTLVTVSS HuGAL-FR21 VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQGVSNDYAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRF

SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHSTTPYTFGQGTKLEIK GAL-FR23 VH

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDFGMNWMKQAPGKGFKWMGWINTSTGESTY

ADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARNSYYGGSYGYWGQGTTLTVSS GAL-FR23VL

DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMKCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRES

GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPWTFGGGTKLEIK

2B 1.3.12VH

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFTSTGISWVRQAPGKGLEWVGRTHLGDGSTNYA

DSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTYGIYDTYDMYTEYVMDYWGQGT

LVTVSS

2B 1.3.12VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVDTSLAWYKQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFS

GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSTGHPQTFGQGTKVEIK10164VH

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYALSWVRQAPGKGLEWVGRIRSKIDGGTTD

YAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDRSPSDSSAFAIWGQGTLVTVSS10164VL

DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNLGSQYVDWYQQKPGQAPVLVIYDDNDRPSGIPERFSG

SNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSWDSLSVVFGGGTKLTVLG

12433VH

QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYYIHWVRQMPGKGLEWMGAIYPDNSDTTY

SPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGADIWGQGTLVTVSS12433VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDPYLSNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQSGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTTSHPYTFGQGTKVEIK

使用六种抗体的全部可能(即，二十一种)组合来生成双互补位抗体。在特定实施方案中，所述抗体包括创建轻链与重链配对的特异性突变。在其他实施方案中，使用DuoBody技术来创建双互补位抗体。在结合、增殖和二聚化分析中测试这些双互补位抗体，以找出那些结合至允许同步结合并产生功能性结果的表位的抗体。

胆管癌

胆管癌(CCA)是最常见的原发性胆道恶性肿瘤和第二常见的原发性肝恶性肿瘤。总体上，CCA占全部胃肠道恶性肿瘤的3％。在过去三十年间，CCA的发病率增加；然而，5年生存期仍保持在大约10％。基于其在胆道树内的解剖学位置，将CCA归类为肝内CCA(iCCA)、肝门周CCA(pCCA)和远端CCA(dCCA)亚型。生长因子酪氨酸激酶，包括FGFR、EGFR和EGFR途径的失调在CCA启动和进展中扮演重要角色。HGF是MET受体的一种配体，其促进肿瘤侵袭和转移。HGF和MET的异常过表达发生在CCA中并且与不良预后相关联。

成纤维细胞生长因子(FGF)和FGF受体(FGFR)

FGF途径包括22种人类FGF和大量跨膜受体酪氨酸激酶，FGFR 1至4。FGF信号传导牵涉到大量生物过程中，这些生物过程包括增殖、分化、生存、迁移和血管生成。FGF-FGFR轴由FGF与FGF和细胞表面上的特定复合物中的硫酸肝素蛋白聚糖的结合激活。在这一复合物中，两个分子的硫酸肝素将两个FGF链接为二聚体，所述二聚体桥接两条FGFR链(2个FGF、2个肝素、2个FGFR)。FGFR二聚化是均二聚体驱动的。一旦形成，这一复合物就激活FGFR酪氨酸激酶，导致自身磷酸化。FGFR酪氨酸激酶活性激活细胞内信号传导级联，所述细胞内信号传导级联促进细胞生存和增殖。Ras-MAPK、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白质激酶Akt/蛋白质激酶B途径、和Src全部在这一细胞内信号传导级联中发挥作用。

异常的FGFR信号传导往往导致致癌性改变。FGFR的基因组改变可导致激活性突变、受体基因扩增和染色体易位。基因内易位可导致由融合至FGFR激酶结构域的转录因子组成的融合物蛋白质的形成，以及随之而来的FGFR二聚化和激活。基因组异常导致不依赖于配体的FGF信号传导。如本文所述的FGFR2融合物，例如而不限于，FGFR2-PHGDH、FGFR2-AHCYL1和FGFR2-BICC1，已经在10％至16％的患有肝内CCA的患者中观察到并且可在细胞转化、异常细胞生长和瘤形成中发挥作用。

本文提供双互补位抗体，其特异性地结合FGFR2的细胞外结构域中的表位，并且抑制FGFR2和FGFR2融合物活性。

双互补位抗体的生成和筛选

特异性地结合FGFR2的双互补位抗体在本文中提供并描述。在一个示例中，双互补位抗体结合FGFR2并抑制配体驱动的受体二聚化和酪氨酸激酶活性。在另一实施方案中，双互补位抗体结合FGFR2融合物并抑制不依赖于配体的酪氨酸激酶活性。在另一实施方案中，双互补位抗体结合FGFR2并加速受体内化，从而下调受体功能。用于生成针对目标蛋白质的抗体的方法是本领域中已知的。

当用抗原使动物免疫时，动物通过生成由多种个体单克隆抗体特异性构成的多克隆抗体应答来产生应答。这些个体特异性的总和使得多克隆抗体可用于如此多的不同分析中。个体单克隆抗体最初通过使用杂交瘤技术使个体B细胞永生化进行分离(Kohler andMilstein,Nature 256,495,2011)，其中来自免疫动物的B细胞与黑素瘤细胞融合。随着分子生物学的出现，已经研发了生成包括双互补位抗体在内的针对目标蛋白质的抗体的体外方法。

术语“目标抗原”或“靶抗原”在本文中可互换使用，并且通常是指被抗体识别并特异性地结合的药剂。

抗体是具有特定类型的含多肽链的分子，其特异性地结合表位，其中一种或多种非共价结合相互作用使得所述分子结构与表位之间的复合物稳定化。在一个实施方案中，抗体分子是免疫球蛋白(例如，IgG、IgM、IgA、IgE、IgD)。来自多种来源，例如，人类、啮齿动物、兔、牛、绵羊、猪、狗或禽类的抗体视为“抗体”。已经描述了大量抗体编码序列；并且其他可通过本领域已知方法发现。

例如，抗体(包括双互补位抗体)或抗原结合片段可通过基因工程化生产。目标抗体编码序列包括由天然序列编码的那些，以及凭借基因代码的简并性而在序列上与野生型核酸序列不同的核酸。变体多肽可包括氨基酸(aa)置换、添加或缺失。氨基酸置换可以是保守氨基酸置换或消除非必需氨基酸的置换，诸如改变糖基化位点，或通过功能上并非必需的一个或多个半胱氨酸残基的置换或缺失来最小化错误折叠。变体可经设计以使得所述蛋白质的特定区(例如，功能结构域、催化性氨基酸残基)的生物学活性保留或增强。变体也包括本文所公开的多肽的片段，特别是生物学活性片段和/或对应于功能结构域的片段。用于所克隆基因的体外突变的技术是已知的。本文一些方面和实施方案中也包括多肽，所述多肽已经使用常规分子生物学技术修饰以改善它们对于蛋白水解降解的抗性或优化溶解性质或使得它们更稳定地作为治疗剂。

嵌合抗体可以通过重组手段制备，通过将获自一个物种的产抗体细胞的可变轻链和重链区与来自另一物种的恒定轻链和重链区组合来制备。典型地，嵌合抗体利用啮齿动物或兔可变区和人恒定区，以便产生人类结构域占主导的抗体。此类嵌合抗体的产生是本领域中周知的，且可通过标准方法实现(如例如美国专利号5,624,659中所述，其通过引用而完全并入本文)。

人源化抗体经工程化以含有甚至更多的人类样免疫球蛋白结构域，并且仅合并动物源抗体的互补决定区。这通过小心地检查单克隆抗体的可变区的高变环序列并将它们匹配至人类抗体链的结构而实现。所述过程虽然看起来很复杂，但实际上很容易实现。见，例如，美国专利号6,187,287，其通过引用完全并入本文。

除了完整免疫球蛋白(或其重组配偶体)之外，可合成包含表位结合位点的免疫球蛋白片段(例如，Fab'、F(ab')₂或其他片段)。“片段”或最小免疫球蛋白可使用重组免疫球蛋白技术来设计。例如，用于本文一些方面和实施方案中的“Fv”免疫球蛋白可通过合成可变轻链区和可变重链区来产生。还关注抗体的组合，例如，双体抗体，其包含两个不同的Fv特异性。

免疫球蛋白可进行翻译后修饰以例如添加化学链接子、可检测的部分(诸如荧光染料、酶、底物、化学发光部分等)或特异性结合部分(诸如链霉亲和素、亲和素或生物素)等，这些物质可用于本文一些方面和实施方案的方法和组合物中。

定位促进受体拮抗的FGFR2的表位

拮抗性FGFR2双互补位抗体及其抗原结合片段可通过对多肽(例如，其抗体及其抗原结合部分)库进行功能分子的筛选来产生，所述功能分子能够结合选择性地促进受体拮抗作用而非受体激活作用的FGFR2内的表位。此类表位可通过针对含有对应于FGFR2内的所希望表位的残基的一系列线性或环状肽来筛选抗体或其抗原结合片段来模拟。

作为示例，含有从FGFR2分离的促进受体拮抗作用的个体片段的肽可通过本文所述或本领域已知的肽合成技术来合成。可将这些肽固定在固体表面上，并例如使用基于ELISA的筛选平台使用确立的过程对其进行筛选以得到结合拮抗性FGFR2抗体(例如，双互补位抗体及其抗原结合部分)诸如抗体A至F的分子。使用所述分析，以高亲和力特异性地结合抗体A至F的肽含有FGFR2的表位内的残基，所述表位优先结合这些抗体。以这种方式找出的肽(例如，FGFR2细胞外结构域的肽片段，包括例如免疫球蛋白样结构域(IgI、IgII和IgIII)，可用来筛选抗体及其抗原结合片段的库，以便找出可用于生成本文一些方面和实施方案的双互补位抗体的抗FGFR2抗体。此外，由于这些肽用作促进受体拮抗作用的FGFR2内表位的替代物，使用这一筛选技术生成的抗体似乎结合FGFR2中的相应表位并且预期拮抗受体活性。

拮抗性FGFR2多肽库的筛选

对多肽(例如，双互补位抗体或抗体片段)库进行高通量筛选以获得能够结合FGFR2内的表位的分子的方法包括但不限于，展示技术，包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示、核糖体展示、mRNA展示和cDNA展示。使用噬菌体展示来分析结合生物学相关分子的配体以及在例如Felici等人(Biotechnol.Annual Rev.1:149-183,1995)、Katz(Annual Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:27-45,1997)和Hoogenboom等人(Immunotechnology 4:1-20,1998)中综述。已经构建了几个随机组合肽库以选择结合不同靶(例如，细胞表面受体或DNA)的多肽(由Kay(Perspect.Drug Discovery Des.2,251-268,1995)、Kay等人,(Mol.Divers.1:139-140,1996)综述)。蛋白质和多聚蛋白质已经成功地经噬菌体展示为功能分子(见，EP 0349578A、EP 4527839A、EP 0589877A；Chiswell andMcCafferty(Trends Biotechnol.10,80-84 1992))。此外，已经表达了功能性抗体片段(例如，单链Fv[scFv])(McCafferty等人(Nature 348:552-554,1990)、Barbas等人(Proc.Natl.Acad Sci.USA 88:7978-7982,1991)、Clackson等人(Nature 352:624-628,1991))。这些参考文献通过引用以其整体并入本文。

除了生成本文一些方面和实施方案的抗FGFR2多肽(例如，双互补位抗体及其抗原结合片段)之外，体外展示技术(例如，本文描述的那些和本领域已知的那些)也提供用于改善本文一些方面和实施方案的抗FGFR2多肽的亲和力的方法。例如，可以不筛选含有完全随机化的高变区的抗体及其片段库，而是筛选更窄范围的抗体及其抗原结合片段库，这些抗体及其抗原结合片段的特征为靶向高变区内特定位点处的突变。这可例如通过组装编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸库而实现，这些抗体或其抗原结合片段编码仅位于高变区内特定位点处的随机突变。然后，这些多核苷酸可在例如丝状噬菌体、细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞中表达，或使用例如核糖体展示、mRNA展示或cDNA展示技术在体外表达，以便筛选以改善的结合亲和力特异性地结合FGFR2表位的抗体或其抗原结合片段。例如，酵母展示非常适合亲和力成熟，且先前已经用来将单链抗体的亲和力提高至48fM的KD(Boder等人(Proc Natl Acad Sci USA 97:10701,2000))。

其他可用于本文一些方面和实施方案的拮抗性FGFR2多肽(例如，单链多肽、抗体及其抗原结合片段)的生成和亲和力成熟的体外技术包括筛选抗体或其抗原结合片段的组合库以获得能够特异性地结合FGFR2衍生肽的功能分子。组合抗体库可例如通过在真核或原核细胞中表达编码抗体或其抗原结合片段的随机高变区的多核苷酸来获得。这可例如使用本文所述或本领域已知的基因表达技术来实现。抗体的异质混合物可例如通过蛋白A或蛋白G选择、定径柱色谱(sizing column chromatography)、离心、差异性溶解度和/或通过任何其他用于蛋白质纯化的标准技术来纯化。如此获得的库或组合库可例如通过将这些抗体的异质混合物与原子已经固定在表面上的FGFR2一起培养足以允许抗体-抗原结合的时间。非结合抗体或其片段可通过用适当的缓冲液(例如，缓冲在生理pH(大约7.4)且含有生理盐浓度和离子强度的溶液，且任选地含有洗涤剂诸如TWEEN-20)洗涤表面来去除。然后，可使用例如基于ELISA的检测方案来检测保持结合的抗体(见，例如，美国专利号4,661,445，通过引用并入本文)。

其他用于筛选多肽(例如，抗体及其抗原结合片段)组合库以获得那些特异性地结合FGFR2衍生肽的多肽的技术包括筛选抗体片段的一珠一化合物库。抗体片段可化学地合成在由亲水性的水可溶胀材料构成的实心珠上(例如，使用确立的裂池固相肽合成方案)，使得各珠展示单个抗体片段。然后，异质珠混合物可与任选地用可检测部分(例如，荧光染料)标记的或缀合至表位标签(例如，生物素、亲和素、FLAG标签、HAH标签)的FGFR2衍生肽一起培养，所述表位标签后期可通过用互补标签(例如，分别为亲和素、生物素、抗FLAG抗体、抗HA抗体)处理而检测。含有特异性地结合FGFR2衍生肽的抗体片段的珠可通过在与荧光标记的抗原或互补标签一起培养后分析珠的荧光性质来找出(例如，通过共焦荧光显微镜或通过荧光激活珠分选；见，例如，Muller等人(J.Biol.Chem.,16500-16505,1996)；其通过引用并入本文)。因此，含有特异性地结合FGFR2衍生肽的抗体片段的珠可与不含高亲和力抗体片段的珠分离。特异性地结合FGFR2衍生肽的抗体片段的序列可通过本领域已知的技术测定，包括，例如，Edman降解、串联质谱、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、核磁共振(NMR)和2D凝胶电泳等(见，例如，WO 2004/062553；通过引用并入本文)。

找出抗体和配体的方法

用于抗体、抗体片段和配体库进行高通量筛选以获得能够结合FGFR2的分子可用来找出适用于可用于治疗本文所述CCA的双互补位抗体的抗体。此类方法包括本领域中已知的体外展示技术，诸如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示、核糖体展示、mRNA展示和cDNA展示等。使用噬菌体展示来分析结合生物学相关分子的配体以及在例如Felici等人Biotechnol.Annual Rev.1:149-183,1995、Katz AnnualRev.Biophys.Biomol.Struct.26:27-45,1997和Hoogenboom等人Immunotechnology 4:1-20,1998中综述，其各自的公开内容通过引用整体并入本文，因为它们涉及体外展示技术。已经构建了随机化组合肽库来选择结合细胞表面抗原的多肽，如Kay,Perspect.DrugDiscovery Des.2:251-268,1995和Kay等人,Mol.Divers.1:139-140,1996中所述，其各自的公开内容通过引用并入本文，因为它们涉及对抗原结合分子的发现。蛋白质(诸如多聚蛋白质)已经成功地经噬菌体展示为功能分子(见，例如，EP 0349578、EP4527839和EP0589877，以及Chiswell and McCafferty,Trends Biotechnol.10:80-84 1992，其各自的公开内容通过引用并入本文，因为它们涉及使用体外展示技术来发现抗原结合分子)。此外，功能抗体片段，诸如Fab和scFv片段，已经以体外展示形式表达(见，例如，McCafferty等人,Nature 348:552-554,1990；Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982,1991；和Clackson等人,Nature352:624-628,1991，其各自的公开内容通过引用并入本文，因为它们涉及用于发现抗原结合分子的体外展示平台)。这些技术等可用于找出并改善结合FGFR2的抗体的亲和力。

用于表达拮抗性FGFR2抗体的宿主细胞

哺乳动物细胞可使用编码本文一些方面和实施方案的抗体的多核苷酸共转染，所述抗体表达为重组多肽并通过宿主细胞组装为双互补位抗体。在一个实施方案中，哺乳动物细胞用编码双互补位抗体的四条链的多核苷酸共转染，所述抗体的表达获得双互补位抗体的正确组装体(图11B)。

可在原核或真核宿主细胞内表达抗体(例如，双互补位抗体或其抗原结合片段)。在某些实施方案中，多肽(例如，双互补位抗体或其抗原结合片段)的表达在真核细胞例如哺乳动物宿主细胞内执行，以优化适宜地折叠且具有免疫学活性的抗体的分泌。用于表达本文一些方面和实施方案的重组抗体或其抗原结合片段的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括DHFR CHO细胞，在Urlaub and Chasin(1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220)中描述，与DHFR可选择标记物合用，例如，如Kaufman and Sharp(1982,Mol.Biol.159:601-621)中所述)、NSO黑素瘤细胞、COS细胞、HEK293T细胞、SP2/0、NIH3T3和BaF3细胞。其他可用于表达抗体及其片段的细胞类型包括细菌细胞，诸如BL-21(DE3)大肠杆菌细胞，其可以用含有外来DNA的载体根据确立的方案进行转化。其他可用于表达抗体的真核细胞包括酵母细胞，诸如营养缺陷型酿酒酵母(S.cerevisiae)株，其可以在不完全培养基中根据本领域已知的确立过程转化并选择性地生长。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞内表达或将抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中的时间，来产生抗体。

多肽(例如，双互补位抗体或其抗原结合片段)可使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收。宿主细胞也可用来产生完整抗体的一部分，诸如Fab片段或scFv分子。本文一些方面和实施方案还包括其中上述过程根据本领域已知的确立方案改变的方法。例如，可能希望用编码本文一些方面和实施例的抗FGFR2抗体的轻链或重链(而非两者)的DNA转染宿主细胞，以便产生所述抗体的抗原结合片段。

一旦本文一些方面和实施方案的抗FGFR2多肽(例如，双互补位抗体或其抗原结合片段)已经通过重组表达产生，它就可通过本领域已知的任何方法进行纯化，诸如可用于纯化免疫球蛋白分子的方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱；亲和力色谱，特别是在蛋白A或蛋白G选择后的FGFR2亲和力色谱；和定径柱色谱)、离心、差异性溶解，或通过任何其他用于蛋白质纯化的标准技术。再者，本文一些方面和实施方案的抗FGFR2多肽或其抗原结合片段可融合至本文所述或本领域中另外已知的异源多肽序列，以促进纯化或产生治疗性缀合物(见下文的“拮抗性FGFR2多肽缀合物”)。

一旦分离，若需要，抗FGFR2双互补位抗体或其抗原结合片段可以进一步纯化，例如通过高效液相色谱(见，例如，Fisher,Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology(Work andBurdon,eds.,Elsevier,1980)；通过引用并入本文)或通过凝胶过滤色谱诸如在Superdex.TM.75色谱柱(Pharmacia Biotech AB,Uppsala,Sweden)上纯化。

治疗性方法

被鉴定为结合至并拮抗FGFR2多肽的双互补位抗体可用于预防或减轻CCA。

在一个治疗性方法中，将如本文所述找出的抗体给药至受试者，所述给药可以是局部的或全身性的。所给药的药剂的计量取决于大量因素，包括个体患者的体格和健康状况。对于任何特定的受试者，应根据个体需要和对给药组合物或监督给药组合物的人的专业判断，随时间而调整具体给药方案。

在一个实施方案中，本文一些方面和实施方案的抗体与FGFR的小分子抑制剂联合给药。在一个实施方案中，所述小分子抑制剂是培米替尼或NVP-BGJ398。

药物制剂

本文还提供用于找出能够结合至并拮抗目标多肽(例如，FGFR2)的双互补位抗体的简单手段。对于治疗性用途，使用本文所公开的方法找出的抗体可全身性给药，例如，配制在药学上可接受的缓冲液诸如生理盐水中。优选的给药途径包括，例如，皮下注射、静脉注射、腹膜注射、肌肉注射或皮内注射，这向患者体内提供连续、持续的药物水平。将会使用处于生理学可接收载剂内的治疗有效量的本文中找出的治疗剂进行对人类患者或其它动物的治疗。合适的载剂即其配方在例如E.W.Martin的《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)中有所描述。待给药的治疗剂的量依据给药方式、患者的年龄和体重、以及赘生物的临床症状而变。通常，所述量将会在其它用于治疗其它与赘生物相关疾病的治疗中的剂所使用的范围内，但在某些情况下，因为所述化合物的特异性增加，将会需要较低的量。本文一些方面和实施方案的药剂以阻断配体结合至受体和/或抑制受体活性的剂量给药。

药物组合物制剂

双互补位抗体的给药可以通过任何合适手段进行，导致与其他组分组合的治疗剂的浓度在减轻、减少或稳定化瘤形成中有效。所述化合物可以任何适宜的量包含在任何合适的载剂物质中，并且通常以按组合物的总重计1重量％至95重量％的量存在。组合物可提供为适用于胃肠外(例如，皮下、静脉内、肌肉内、血管内或腹腔内)给药途径的剂型。可以根据传统药学实践配制药物组合物(见，例如，《雷明顿：制药药物科学与实践(第二十版)》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000)和《制药技术百科全书》(Encyclopedia ofPharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,MarcelDekker,New York))。

根据本文一些方面和实施方案的药物组合物可以经配制以在给药后立即或者在给药后在任何预设时间或时间段持续地释放活性化合物。后者类型的组合物通常称为控释制剂，其包括(i)在延长的时间段内在身体内创建基本上恒定的药物浓度的制剂；(ii)在预设的滞后时间后，在延长的时间段内在身体内创建基本上恒定的药物浓度的制剂；(iii)通过在体内保持相对恒定的有效水平，同时将与活性物质血浆水平波动相关的不良副作用降至最低(锯齿形动力学模式)，从而在预设时间段内维持作用的制剂；(iv)通过例如在胸腺附近或与胸腺接触的控释组合物的空间放置来定位作用的制剂；(v)允许方便给药的制剂，例如，每一周或两周给药一次；和(vi)通过使用载体或化学衍生物将治疗剂递送至特定细胞类型(例如肿瘤细胞)来靶向肿瘤形成的制剂。对于一些应用，控释制剂免除了对于在白天频繁投药以将血浆水平维持在治疗水平的需求。

为了获得释放速率大于所研究的化合物代谢速率的控制释放，可以采用多种策略中的任何一种。在一个示例中，通过对各种制剂参数和成分(包括，例如，各种类型的控制组合物和包衣)的适宜选择获得控制释放。因此，使用适宜的赋形剂将药物组合物配制为治疗剂，所述药物组合物在给药时以受控的方式释放治疗剂。示例包括单个或多个单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、微球、分子复合物、纳米颗粒、贴剂和脂质体。

胃肠外组合物

药物组合物可通过以含有传统的、无毒的药学可接受的载剂和佐剂的剂型、制剂或经由合适的递送装置或移植物注射、滴注或移植来(皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内等)给药。此类组合物的制剂和制备是药物制剂领域技术人员所熟知的。制剂可见于前述《雷明顿：制药科学与实践》中。

用于肠胃外用途的组合物可以单位剂型(例如，在单剂量安瓿中)提供，或提供在含有几个剂量且其中可添加合适防腐剂(见下文)的小瓶中。组合物的形式可以是溶液、悬浮液、乳液、输注装置、或用于移植的递送装置，或者它可作为待使用水或另一合适的媒介物在使用前重建的干粉而存在。组合物除了包括减轻或缓解赘生物的活性剂之外，还可包括合适的胃肠外制剂可接收的载剂和/或赋形剂。活性治疗剂可并入微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中以备受控的释放。此外，组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张度调节剂和/或分散剂。

如上所示，根据本文一些方面和实施方案的药物组合物可以是适用于无菌注射的形式。为了制备这一组合物，将合适的活性治疗剂溶解或悬浮在胃肠外给药可接收的液体媒介物中。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水；通过加入适宜量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲剂调节至合适pH的水；1,3-丁二醇；林格溶液；以及等渗氯化钠溶液和葡萄糖溶液。水性制剂也可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在化合物之一只能少量地或微溶于水中的情况下，可加入溶解增强剂或增溶剂，或者溶剂可包括10％至60％w/w的丙二醇等。

识别FGFR2细胞外表位的双互补位抗体

本文一些方面和实施方案至少部分地基于以下发现：能够拮抗FGFR2的双互补位抗体可用作治疗剂来直接治疗癌症诸如CCA。例如，这些治疗活性可通过下述过程引起：抗体结合至表达在细胞诸如癌细胞表面上的两个表位，然后阻断FGFR配体结合且/或抑制FGFR2活性，从而抑制增殖或诱导细胞死亡。在一些实施方案中，双互补位抗体用来在癌细胞中增强源自抗体的细胞毒性(ADCC)。

除非另外指定，否则本文多个方面和实施方案的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术，这些技术完全在本领域技术人员的权限之内。此类技术在文献中有完整阐述，例如，《分子克隆：实验室手册(第二版)》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,1989)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis(Gait,1984))；《动物细胞培养》(Animal CellCulture(Freshney,1987))；《酶学方法：实验免疫学手册》(Methods in EnzymologyHandbook of Experimental Immunology(Weir,1996))；《用于哺乳动物细胞的转基因载体》(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller and Calos,1987))；《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,1987))；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,1994))；《免疫学现代方法》(Current Protocols in Immunology(Coligan,1991))。这些技术可用于生产本文一些方面和实施方案的多核苷酸和多肽，并因此可视为作出并实践本文的一些方面和实施方案。尤其可用于具体实施方案的技术将在以下章节中讨论。

详述以下实施例以向本领域技术人员提供对如何制备和使用本文一些方面和实施方案的分析、筛选和治疗性方法的完全公开和说明，并且以下实施例不试图限制发明人所认为的本文各种方面和实施方案的范畴。

[实施例]

实施例1：靶向胆管癌(CCA)中的FGFR2

导致FGFR2融合至另一蛋白的基因组改变是CCA中共有的。为了促进FGFR2融合物驱动肝内CCA，生成了下列FGFR2融合物：FGFR2-磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)、FGFR2-腺苷高半胱氨酸酶氧1(AHCYL1)和FGFR2-BICC1(图1A)。分析了FGFR2融合物对于细胞增殖的效应(图1B)。FGFR2-AHCYL1、FGFR2-PHGDH融合物在IL3耗尽分析中转化BaF3细胞(图1B)。FGFR2-BICC1也部分地转化BaF3细胞。

实施例2：FGFR2融合物表达足以用于转化

也测试了FGFR2融合物表达对于NIH3T3细胞的效应。有趣的是，FGFR2融合物足以转化细胞，如转化灶形成分析中所示。表达FGFR2-AHCYL1、FGFR2-PHGDH和FGFR2-BICC1的NIH3T3细胞在培养物中全部形成集落，这是致癌性转化的标志(图3A)。图3B将在表达FGFR2融合物的NIH3T3细胞的培养物中存在的集落定量。这一数据表明，FGFR2融合物的表达足以转化NIH3T3细胞。

FGFR2-BICC1、FGFR2-AHCYL1和FGFR2-PHGDH在NIH3T3细胞中的表达诱导增殖增加。表达FGFR2融合物的细胞的生长比对照细胞快，且这一应答在存在FGF配体的情况下增强(图4A)。使FGFR2-BICC1融合物的Ig样细胞外结构域缺失对于细胞转化和生长的效应显示在图4B至4D中。在图4E和4F中，CCA患者1至4具有在FGFR2的ECD中的突变。特别地，对于CCA患者1、3和4，FGFR2突变是在ECD的结构域IgIII中，而对于患者2，所述FGFR2突变是在ECD的IgII中。FGFR2 ECD中的此类突变可增加细胞的转化。如图4E中所示，源自CCA患者的FGFR2细胞外结构域突变增加了转化能力。如图4F中所表明，一些亲代抗体在抑制或阻断源自患者的FGFR2 ECD突变驱动的细胞生长中有效。举例而言，抗体C、D和E在阻断具有源自患者的FGFR2 ECD激活性突变的细胞生长中有效，如通过评估相对于非特异性Ab(IgG)对照的倍数增加或减少而确定的(图4F)；因此，这些抗体的结合区在双互补位抗体中的组合可能导致了协同阻断效应。

实施例3：FGFR2融合物的抑制

BGJ398(也称NVP-BGJ398)是FGFR2的小分子抑制剂，其在II期试验中在患有FGFR2融合物阳性ICC的患者中展示出令人鼓舞的功效。针对表达FGFR2融合物的BaF3细胞，测试了NVP-BGJ398的抑制活性。有趣的是，所述细胞在存活率分析中显示对于FGFR2抑制剂的敏感性(图2)。用FGFR2-BICC1、FGFR2-AHCYL1和FGFR2-PHGDH融合物转化的NIH3T3细胞对于BGJ398治疗也是敏感的(图5)。这些结果表明，这些融合物经由FGFR传导信号。

FGF配体FGF10放大了表达FGFR2-PHGDH融合物的BaF3细胞的生长(图6A)。这一效应在IL3耗尽分析中进行定量(图6B)。细胞在不存在IL3的情况下生长的能力指示“转化能力”。在图6B中，+IL3状态的亲代细胞是对照，且FGFR2-PHGDH的生长测量为相对于对照的倍数差异。BaF3亲代细胞在不存在-IL3的情况下死亡，而表达FGFR2-PHGDH的细胞在-IL3条件下继续生长，指示FGFR2-PHGDH转化了BaF3细胞。

实施例4：双互补位抗体的设计

如上文所详述的，BGJ398能够抑制FGFR2。在多种脑细胞类型中，这一抑制在降低FGFR2融合物表达的致癌效应方面有效。结合并识别FGFR2受体的双互补位抗体预期可用于治疗癌症(例如，CCA)。可以在通过FGFR2融合物表达来转化的BaF3和NIH3T3细胞中的存活率分析、结合分析和二聚化分析中测试此类抗体的抗致癌活性。

在设计双互补位抗体时，申请人已经关注特异性地结合FGFR2细胞外结构域的抗体，这有贡献于通过FGFR2融合物的表达来转形的细胞的生长。抗体A至F是专利文献中描述的可商购获得的抗体(图7B)，并且其结合FGFR2的细胞外结构域中存在的表位(图7A)。

被抗体结合的FGFR2细胞外结构域的区包括信号肽(SP)和三个免疫球蛋白样结构域(IgI、IgII和IgIII)。抗体A至F用于具有FGFR2扩增的SNU-16胃癌细胞系的FACS分析中(图7A、7B)。在该图的右侧，GFP阳性细胞的百分比显示为针对示意图中所示各种FGFR2结构域的抗体A至F的抗体浓度的对数的函数这些结果表明，抗体A至F全部特异性地结合表达FGFR2的细胞。

测试抗体A至F以确定它们是否能已知表达FGFR2IIIb的BaF3细胞的配体诱导型生长。结合FGFR2 Ig-2和Ig-3的抗体C、D和E在阻断表达野生型FGFR2IIIb的BaF3细胞的配体诱导型生长方面有效(图8)。随后，用表达FGFR2-PHDGH融合物的BaF3细胞测试了抗体A至F的效应。有趣的是，在不存在FGF配体的情况下，抗体A和C全部具有激动剂活性，且抗体D具有较低程度的激动剂活性。抗体F在BaF3细胞中抑制FGFR2-PHDGH激活性融合物(图9)。

在存在FGF配体FGF10的情况下，分析表达FGFR2-PHDGH融合物的BaF3细胞的生长。抗体C、D、E和F抑制表达FGFR2-PHDGH的BaF3细胞的配体刺激的生长(图10)。基于上文报导的结果，使用图11A中所示的FGFR2抗体组合制备拮抗性双互补位抗体。这些组合在过表达FGF2融合物的致癌细胞或癌细胞(例如，经转化的BaF3细胞)中导致生长抑制效应增加。因此，结合至表位的抗体针对癌细胞的抑制效应和杀伤效应增加。关于拮抗性双互补位抗体的设计显示在图11B和11C中。有利的是，在双互补位抗体的一半上的VH-VL和CH1-CL包括互补突变，导致两条不同链之间而非来自相同抗体的另一半的链之间的优先异源二聚配对。或者，使用链接子方法来创建scFab、scFv或DuoBodies。在这一方法中，抗体链各自在不同的细胞内生成并在体外混合。此类方法是本领域中已知的并且例如由K.Ding等人,March2017,Appl.Microbiol.Biotechnol.,101(5):1889-1898和V.

等人,2013,BMCBiotechnol.,13:52描述。

使用FACS分析来检验FGFR2抗体验证(图12)。在结合分析中，当抗体结合FGFR2时，在阴性和IgG对照中观察到荧光水平偏移的发生(图12)。该偏移随着结合至FGFR2的增加而增加(图12)。各条曲线代表所使用的抗体浓度。GA抗体(也称“抗体E”)从Galaxy获得。在先前研究中，发现其具有约1nM的30.68Kd，而在实验中发现该数值为1.58nM，如图7B(nM)中所示(FACS)。右图显示，在各种GA抗体浓度下显示荧光的细胞的百分比。在右侧图中，具有正荧光的细胞数量百分比显示为Galaxy抗体浓度的对数的函数。所分析的FGFR2抗体全部特异性地结合FGFR2(图13)。

据此，使用抗体A至F中的任一者来生成结合FGFR2的细胞外结构域中存在的表位的双互补位抗体(图11A至11C)。编码此类抗体的多核苷酸可在所希望的培养细胞类型中重组地表达，并且从培养物中纯化所述抗体。在一个实施方案中，HEK细胞的培养物用编码双互补位抗体的四条链共转染，获得双互补位抗体的正确组装体。在实施方案中，抗体的纯化可通过镍纯化进行，例如，使用HisTrap Excel Nickel柱进行。如图11D中所示，对于同源二聚K409R抗体和异源二聚F405L/K409R duobodies，使用镍纯化，使用0至400nM的咪唑梯度，历经20个柱体积，任何未标记的同源二聚K409R(亲代抗体，未标记的)抗体均不结合至镍柱。如图11D中所示，含有一条His标记的重链的异源二聚F405L/K409R第一个从镍柱洗出(顶部洗脱曲线轨迹，“His/His亲代Ab”)，而含有两个His标签的同源二聚F405L抗体显示较晚的洗出时间(底部洗脱曲线轨迹，“His/无His双互补位Ab”)。将含有异源二聚duobody抗体的级分合并，经缓冲液交换至PBS中并浓缩至1mg/ml浓度。

实施例5：研发

分析法以测量FGFR2二聚化

研发

分析法以测量细胞中的FGFR2二聚化，特别是筛选能够中断FGFR2二聚化的双互补位抗体。在患有CCA的患者中发现的FGFR2融合物促进细胞中的FGFR2二聚化，所述二聚化继而激活组成型FGFR2信号传导，导致细胞的致癌性转化并且增加癌细胞的细胞生长和增殖。/>

是基于NanoLuc萤光素酶的二亚基体系，其可用于进行蛋白质：蛋白质相互作用的细胞内检测。(见，例如，Promega Corporation,Madison,WI,2017,“Using

Technology to Study the Dynamics of Protein Interactions in LiveCells”)。它由融合至目标蛋白质的大的BiT(LgBiT；17.6kDa)和小的BiT(SmBiT；11个氨基酸)构成(图16B)。蛋白质相互作用将亚基带至靠近以形成功能性酶，所述酶生成明亮的发光信号。Lg和sm亚基是基于自发缔合的亲和力降低而选择的。在FGFR2受体的情况下，FGF10配体或FGFR2融合物将FGFR2受体带至一起，导致/>

分析中的发光信号增加。

制备编码融合至蛋白质：蛋白质对的N末端和C末端的LgBiT和SmBiT的不同表达构建体(例如，多达八种)。这些构建体用于瞬时或稳定低转染细胞。FGFR2-WT(野生型)、FGFR2-ACHYL1和FGFR2-BICC1的

构建体用于在HEK293T细胞中进行瞬时表达(图16C)。FGFR2-WT(野生型)、FGFR2-ACHYL1和FGFR2-BICC1的/>

构建体用于在HEK293T细胞中进行稳定表达(图16D和16E)。图16F显示使表达FGFR2的稳定细胞系经历抗体A至F(如图7B中所找出的)并执行/>

分析的结果。如图16F左侧的图中所示，抗体A至F中的一些抑制稳定地过表达FGFR2(FGFR2IIIb)的HEK293T细胞的生长。特别地，在/>

分析中使用抗体D，与其他抗体相比，抗体D表明最显著的细胞生长抑制效应(图16F右侧的图)。如图中所示，在分析中向稳定低表达FGFR2的细胞中添加递增浓度的抗体D，阻断了FGFR2受体的FGF诱导的二聚化。在图16F的最右侧图中，在所述分析中，FGFR2 WT(野生型)所得的倍数发光由各组三条柱中的左侧柱表示；在所述分析中，FGFR2+FGF10所得的倍数发光由各组三条柱中的中间柱表示；并且在所述分析中，+/-FGF10配体差异导致的倍数发光由图16F中所示各组三条柱中的右侧柱表示。

实施例6：双互补位抗体结合亲和力

如本领域中已知的表面等离子体共振(SPR)用来测定双互补位抗体的结合亲和力。基于SPR的结合方法包括配体(抗体)在传感器芯片表面上的固定化。目标结合配偶体或分析物(FGFR2 ECD)流经流动通道。不同浓度的分析物在流过配体，且可表征配体-分析物的相互作用。SPR信号起源自光源在传感器芯片处的折射系数的改变。与结合事件相关联的质量增加造成折射系数的成比例增加，这作为相应-共振信号的改变而被观察到。简而言之，对于使用本文所述抗体进行的实验，SPR分析通过将抗体(用作分析物)以1至1000nM范围内的浓度固定并流经FGFR2bαlllb抗原(用作配体)来执行。使用Biocore软件将关于与FGFR2bαIIIb抗原相互作用的抗体动力学数据拟合为2状态和1-1结合模型。均值和标准偏差KD值从至少三个独立轮次导出。

使用SPR测量6种单特异性和13种双互补位抗体结合至单个抗原FGFR2bαIIIb的动力学，以将双互补位抗体的亲合力与其亲代抗体进行比较。不欲受缚于理论，预期双互补位抗体将会比其亲代抗体更紧密地结合至FGFR2抗原，并且所评估抗体中的更紧密结合的双互补位抗体在阻断FGFR2二聚化方面将会更有效(图17A)，从而导致对于组成型FGFR2信号传导和/或致癌性转化的抑制或阻断。结合动力学评估的结果呈现在图17B和17C中。

图17B中的表显示关于6种单特异性和13种双互补位抗体结合至单个FGFR2抗原FGFR2bαIIIb的动力学测量值。结合至FGFR2bαIIIb的全部抗体的KD值的比较图17B中，其中抗体的排名基于KD值(最低亲和力结合物到最高亲和力结合物)。通常，双互补位抗体比单特异性抗他更紧密地结合至FGFR2bαIIIb，但FGFR_GA/N_12433和FGFR_B/GA双特异性抗体除外(图17B)。FGFR_GA/N_12433和FGFR_B/GA两者均展示显著大于针对双互补位抗体预期者的结合化学计量学(即，接近1的结合化学计量学)。不试图受缚于理论，特定双互补位抗体的结合结果表明，它们可能不经由传统工程化双互补位机制结合，而代之以可能表现出类似于单特异性抗体的那些结合特征或混合结合机制的结合特征。

与双互补位抗体表现出的结合亲和力相比，亲代(单特异性)抗体表现出对于FGFR2bαIIIb作为靶抗原的较低结合亲和力。对于FGFR2具有较低结合亲和力的6种单特异性抗体包括抗体FGFR_B(KD(M)1.6E-08)、FGFR_N_12433(KD(M)7.5E-09)、FGFR_GA(KD(M)7.5E-09)、FGFR_Gal23(KD(M)2.1E-09)、FGFR_N_10164(KD(M)1.7E-09)和FGFR_GE_FL(KD(M)9.9E-10)，基于图7B的命名法。图17B的表中的剩余13种抗体代表对于FGFR2αIIIb具有更高结合亲和力的双互补位抗体，如通过SPR所测定的。图17C中的矩阵提供针对双互补位抗体的各臂导出的KD的比较。

实施例7：双互补位抗体对FGFR2融合物驱动的细胞生长的影响

双互补位抗体对FGFR2融合物驱动的细胞生长的影响使用双互补位抗体在基于细胞分析中评估，所述双互补位抗体结合至FGFR2的ECD并且如上文所述生成(实施例4)。如本文所述，将双互补位抗体添加至经分子工程化以过表达FGFR2融合物的细胞(例如，NIH3T3细胞或BaF3细胞)的培养物中。

特别地，对于使用BaF3细胞进行分析(图18A至18D)，将过表达空载体对照或FGFR2-PHGDH融合物构建体的BaF3细胞在不存在IL3和FGF的情况下以750个细胞/孔的浓度在黑色384孔板中平板培养过夜。将6种亲代抗体和13种双互补位抗体一式两份以从1μM到0.013μM(1μM、0.833μM、0.600μM、0.450μM、0.316μM、0.233μM、0.166μM、0.125μM、0.091μM、0.066μM、0.048μM、0.035μM、0.025μM、0.018μM和0.013μM)范围的各种浓度添加至各孔。使用CellTiter-Glo在治疗后5天测量细胞生存率，并且使用PRISM 9软件中的非线性拟合来生成IC50曲线。包含图7B中表征的抗体的结合区的FGFR2 ECD结合双互补位抗体，即双互补位抗体GA/N12(图18A)、双互补位抗体GA/Gal23(图18B)、双互补位抗体Gal23/N12(图18C)和双互补位抗体B/N12(图18D)，用于基于BaF3细胞的分析中以评估其活性和各双互补位抗体对于抑制过表达FGFR2-PHGDH的BaF3细胞的生长的效应。如图18A至18D中所示，与过表达空载体的对照细胞相比，双互补位抗体GA/N12、GA/Gal23、Gal23/N12和B/N12在抑制经分子工程化以过表达FGFR2-PHGDH融合物(见于胆管癌患者中)的BaF3细胞的生长中更有效。与其亲代抗体想不，这些双互补位抗体在抑制过表达FGFR2-PHGDH融合物的BaF3细胞的生长方面也更有效。

对于使用NIH3T3细胞进行分析(图19A至19E)，将过表达FGFR2-BICC1融合物构建体的NIH3T3细胞以1000个细胞/孔的浓度在黑色384孔板中平盘培养过夜。将6种亲代抗体和13种双互补位抗体一式两份以从1μM到0.013μM(1μM、0.833μM、0.600μM、0.450μM、0.316μM、0.233μM、0.166μM、0.125μM、0.091μM、0.066μM、0.048μM、0.035μM、0.025μM、0.018μM和0.013μM)范围的各种浓度添加至各孔。使用Incucyte在治疗后60小时测量细胞融合度，并且使用PRISM 9软件中的非线性拟合来生成IC50曲线。如图19A至19E中所示，与其亲代抗体相比，双互补位抗体：GE/N10、GE/N12、B/GE、B/GA和B/N12在抑制过表达FGFR2-BICC1融合物(见于胆管癌患者中)的NIH3T3细胞的生长方法更有效且更强劲。

上述6种亲代抗体包括抗体A(B)、抗体B(Gal23)、抗体C(N10)、抗体D(GE)、抗体E(GA)、抗体F(N12)，例如，如图7B中所呈现。双互补位抗体为六(6)种亲代抗体的成对组合。十三(13)种双互补位抗体经由duobody反应成功地生成。(见，例如，图17B，其呈现双互补位抗体及其用于结合FGFR2的KD)。

其他实施方案

从前述说明书明显可见，可对本文的一些方面和实施方案作出变更和修饰以使其适用于各种用途和条件。此类实施方案也处于权利要求书的范畴内。

本文中的任何变量定义中对一系列元件的叙述包括所述变量作为任何单一元件或所列元件的组合(亚组合)的定义。本文中对于实施方案的叙述包括所述实施方案作为任何单一实施方案或与其他实施方案或其部分组合。

本说明书中提及的全部专利和出版物为通过引用以与各独立专利和出版为被具体且独立地指明为通过引用并入相同的程度并入本文。

Claims (44)

1.一种多肽，其特异性地结合成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的细胞外结构域中的两个表位，其中，所述多肽包含抗FGFR2抗体的两个抗原结合片段。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述抗FGFE2抗体选自由M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21和12433所组成的组。

3.一种双互补位抗体，其特异性地结合成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的细胞外结构域中的两个表位，其中，所述双互补位抗体包含抗体的抗原结合片段，所述抗体选自由M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21和12433所组成的组。

4.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述多肽或抗体包括所述抗体的一个或多个互补决定区。

5.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述多肽或抗体包含重链可变结构域(VH)或轻链可变结构域(VL)。

6.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗体或多肽特异性地结合FGFR2信号肽(SP)或免疫球蛋白样结构域IgI、IgII、IgIII、IgII和IgIII，或它们的其他组合。

7.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗体或多肽特异性地结合FGFR2免疫球蛋白样结构域IgI、IgII或IgIII。

8.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗体或多肽特异性地结合FGFR2免疫球蛋白样结构域的两个片段，其中，所述片段源自IgI和IgII、IgI和IgIII、或者IgII和IgIII。

9.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗体或多肽特异性地结合FGFR2免疫球蛋白样结构域IgI、IgII、IgIII或信号肽(SP)、IgII和IgIII的两个片段。

10.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗体或多肽结合阻断配体与FGFR2的结合。

11.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗体或多肽结合降低FGFR2活性。

12.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗原结合片段与M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21或12433的序列具有至少85％氨基酸序列一致性。

13.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗原结合片段与M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21或12433的序列具有至少90％氨基酸序列一致性。

14.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗原结合片段与M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21或12433的序列具有至少95％氨基酸序列一致性。

15.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗原结合片段包含M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21或12433的互补决定区或基本上由所述互补决定区组成。

16.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述多肽包含亲和力标签。

17.根据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的抗体，其中，所述多肽包含可检测的氨基酸序列。

18.根据权利要求3至17中任一项所述的双互补位抗体，其中，所述双互补位抗体包含抗体M048-D01和抗体12433的FGFR2抗原结合片段；或抗体GAL-FR21和抗体12433的抗原结合片段；或HuGAL-FR21和抗体12433的抗原结合片段；或抗体HuGAL-FR21和抗体GAL-FR23的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段；或抗体M048-D01和抗体12433的抗原结合片段；或抗体2B 1.3.12和抗体10164的抗原结合片段；或抗体2B 1.3.12和抗体12433的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体2B 1.3.12的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体HuGAL-FR21的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段。

19.据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的双互补位抗体，其中，所述多肽或双互补位抗体与FGFR2的结合具有约7.7E-09至约9.1E-10的KD。

20.据权利要求1所述的多肽或根据权利要求3所述的双互补位抗体，其中，所述多肽或双互补位抗体与FGFR2的结合具有选自由约1.3E-09、7.7E-09、2.5E-10、3.7E-10、3.9E-10、4.2E-10、5.0E-10、5.3E-10、6.8E-10、7.7E-10、8.7E-10和9.1E-10所组成的组的KD。

21.一种抑制赘生性细胞的增殖或降低其生存率的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的多肽或抗体接触，从而抑制增殖或降低活力。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述多肽或抗体诱导所述赘生性细胞的细胞死亡。

23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述赘生性细胞是胆管癌(CCA)、子宫内膜癌、黑素瘤、食管癌、膀胱癌、乳腺癌或肺癌细胞。

24.根据权利要求21所述的方法，其中，所述细胞是体外的。

25.根据权利要求21所述的方法，其中，所述细胞是体内细胞。

26.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的多肽或抗体，从而治疗所述癌症。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述癌症是胆管癌(CCA)、子宫内膜癌、黑素瘤、食管癌、膀胱癌、乳腺癌或肺癌。

28.一种治疗受试者的胆管癌的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的双互补位抗体，所述双互补位抗体包含选自由M048-D01、GAL-FR23、10164、2B 1.3.12、GAL-FR21或12433所组成的组的抗原结合片段。

29.根据权利要求28所述的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的双互补位抗体，其中，所述双互补位抗体包含抗体M048-D01和抗体12433的FGFR2抗原结合片段；或抗体GAL-FR21和抗体12433的抗原结合片段；或HuGAL-FR21和抗体12433的抗原结合片段；或抗体HuGAL-FR21和抗体GAL-FR23的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段；或抗体M048-D01和抗体12433的抗原结合片段；或抗体2B 1.3.12和抗体10164的抗原结合片段；或抗体2B1.3.12和抗体12433的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体2B1.3.12的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体HuGAL-FR21的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段。

30.据权利要求28或29所述的方法，其中，所述双互补位抗体与FGFR2的结合具有约7.7E-09至约9.1E-10的KD。

31.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1至20中任一项所述的多肽或抗体。

32.一种载体，其包含编码根据权利要求1至20中任一项所述的多肽或抗体的核酸分子。

33.根据权利要求32所述的载体，其中，所述载体是表达载体。

34.根据权利要求32所述的载体，其中，所述表达载体是病毒或非病毒表达载体。

35.根据权利要求32至34中任一项所述的载体，其中，所述表达载体编码可操作地链接至所述多肽或抗体的亲和力标签或可检测的氨基酸序列。

36.一种宿主细胞，其包含根据权利要求32至35中任一项所述的载体。

37.一种药物组合物，其包含处于药学上可接受的赋形剂中的有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的多肽或抗体或其片段。

38.一种治疗受试者的胆管癌的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的抗体和有效量的培米替尼或NVP-BGJ398。

39.根据权利要求18所述的双互补位抗体，其中，所述双互补位抗体包含抗体HuGAL-FR21和抗体12433的FGFR2抗原结合片段；或抗体HuGAL-FR21和抗体GAL-FR23的抗原结合片段；或抗体GAL-FR21和抗体12433的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段，其抑制表达FGFR2融合物的细胞的生长。

40.根据权利要求39所述的双互补位抗体，其中，所述FGFR2融合物是FGFR2-PHGDH。

41.根据权利要求18所述的双互补位抗体，其中，所述双互补位抗体包含抗体2B1.3.12和抗体10164的FGFR2抗原结合片段；或抗体2B 1.3.12和抗体12433的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体2B 1.3.12的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体HuGAL-FR21的抗原结合片段；或抗体GAL-FR23和抗体12433的抗原结合片段，其抑制表达FGFR2融合物的细胞的生长。

42.根据权利要求41所述的双互补位抗体，其中，所述FGFR2融合物是FGFR2-BICC1。

43.根据权利要求28至30或38中任一项所述的方法，其中，所述受试者的细胞包含FGFR2融合物。

44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述FGFR2融合物是FGFR2-PHGDH或FGFR2-BICC1。

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