IT202100027929A1 - Un nuovo anticorpo bispecifico asimmetrico(UMG2/CD1a-CD3e) per il trattamento immunologico della forma corticale di leucemia linfoblastica acuta T (T-ALL) pediatrica e dell’adulto - Google Patents

Un nuovo anticorpo bispecifico asimmetrico(UMG2/CD1a-CD3e) per il trattamento immunologico della forma corticale di leucemia linfoblastica acuta T (T-ALL) pediatrica e dell’adulto Download PDF

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cd1a
umg2
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btce
bispecific antibody
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Pierfrancesco Tassone
Daniele Caracciolo
Martino Maria Teresa Di
Licia Pensabene
Pierosandro Tagliaferri
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Univ Degli Studi Magna Graecia Di Catanzaro
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Description

DESCRIZIONE
del brevetto per invenzione industriale dal titolo: ?Un nuovo anticorpo bispecifico asimmetrico(UMG2/CD1a-CD3 ?) per il trattamento immunologico della forma corticale di leucemia linfoblastica acuta T (T-ALL) pediatrica e dell?adulto?
La presente invenzione ? relativa ad un anticorpo bispecifico asimmetrico, diretto verso cellule tumorali di T-ALL di derivazione corticale esprimenti CD1a, capace di reclutare, attivare e re-direzionare cellule T normali contro le cellule tumorali.
La T-ALL ? una neoplasia ematologica caratterizzata da una proliferazione aberrante di progenitori delle cellule T a partenza da uno step di differenziazione intratimica che porta alla progressiva infiltrazione del midollo osseo e degli organi linfoidi e alla diffusione delle cellule T leucemiche immature nel sangue periferico.
La T-ALL ? una neoplasia ematologica, rara, orfana e molto aggressiva caratterizzata da evoluzione frequentemente sfavorevole e pessima prognosi nei pazienti recidivati/refrattari ai trattamenti convenzionali. Mentre il progresso dell?immunoterapia ha notevolmente migliorato il trattamento della leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL), la mancanza di antigeni con ristretta espressione sulle cellule T tumorali, adatti quindi ad un targeting selettivo delle stesse risparmiando il compartimento T normale, ha ostacolato significativamente la messa a punto di nuove strategie di immunoterapia verso questa importante condizione clinica. ? assolutamente importante quindi l?identificazione e l?uso di target terapeutici che forniscano i razionali per la messa a punto di nuove strategie terapeutiche.
Scopo della presente invenzione, ? offrire un nuovo anticorpo bispecifico capace di attivare e re-direzionare cellule T citotossiche (bispecific T cell engager, BTCE), mediante il legame con CD3 ? ,verso CD1a che ? espresso da circa il 40% dei casi di T-ALL.
Secondo la presente invenzione viene realizzato un nuovo anticorpo bispecifico asimmetrico, BTCE, contro la T-ALL, come definito nella rivendicazione 1.
Per una migliore comprensione della presente invenzione viene ora descritta una forma di realizzazione preferita, a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento alle figure, nelle quali:
- Le Figure 1A-1D mostrano i risultati sperimentali relativi alla reattivit? di legame dell?anticorpo (mAb) UMG2, in particolare la figura 1A mostra la reattivit? di UMG2 su linee cellulari HEK293T che non esprimono CD1a trasfettate con un vettore di controllo (a sinistra) e su HEK293T/CD1a trasfettate con un plasmide codificante per CD1a (a destra); la figura 1B mostra la reattivit? di UMG2 su cellule T-ALL derivate dal paziente; la figura 1C mostra la reattivit? di UMG2 su linee cellulari di T-ALL di derivazione corticale; la figura 1D mostra il legame di UMG2 sulle cellule di sangue periferico di donatori sani.
Le figure 2A-2F mostrano dati sperimentali relativi all?attivit? citotossica in vitro del costrutto UMG2/CD1a-CD3? BTCE; in particolare la figura 2A mostra a sinistra: struttura di UMG2-CD3? BTCE, a destra: targeting di linfociti T CD3+ verso cellule T-ALL CD1a+ mediato dal costrutto UMG2/CD1a-CD3? BTCE valutato mediante analisi di microscopia a immunofluorescenza; la figura 2B mostra dati relativi alla valutazione della costante di dissociazione(Kd) di UMG2/CD1a-CD3? BTCE valutata mediante esperimenti di titolazione su linee cellulari di T-ALL corticali ed esprimenti CD1a; la figura 2C mostra la percentuale relativa (%) di citotossicit? indotta cellule HEK293T trasfettate con un plasmide vuoto o con un plasmide codificante per CD1a; la figura 2D mostra la percentuale relativa (%) di citotossicit? su linee cellulari T-ALL di derivazione corticale, CD1a+ e CD1a-; la figura 2E mostra dati della percentuale relativa (%) di citotossicit? contro le cellule T-ALL CD1a+ primarie (derivate da pazienti); la figura 2F mostra l?aumento della concentrazione di CD107a sui linfociti T cocoltivati in un rapporto E:T di 10 a 1 (10:1) sia in linee cellulari di T-ALL che esprimono UMG2 che cellule primarie derivati da pazienti di T-ALL;
- La Figura 3 mostra dati sperimentali relativi all?attivazione funzionale in vitro di linfociti T in maniera dipendente dalla concentrazione di UMG2/CD1a-CD3? BTCE,valutata mediante l?attivazione di marcatori precoci e tardivi (rispettivamente CD69 e CD25) sia su linfociti T CD4 che CD8 positivi, mediante il rilascio di enzimi e molecole citotossiche (granulisina, perforina e granzima), e la produzione di citochine (TNF-a, IFN-y e IL-2) valutati mediante esperimenti di co-coltura con HPB-ALL (A), TALL-1 (B) e Jurkat (C) in presenza di concentrazione crescente (0,01-0,1-1 ?g/ml) di UMG2/CD1a-CD3? BTCE.
- La Figura 4 mostra l'attivit? in vitro di UMG2/CD1a-CD3? BTCE mediata dalle cellule T, in particolare la figura 4A mostra il livello della proteina NFAT1 su peripheral blood mononuclear cell (PBMC)in co-coltura con cellule T-ALL in presenza di UMG2/CD1a-CD3? BTCE o del veicolo come controllo; la figura 4B mostra la proliferazione di cellule T in co-coltura con cellule HPB-ALL, TALL-1 e Jurkat rispettivamente, in presenza di UMG2/CD1a-CD3? BTCE; la figura 4C mostra l?entit? di citotossicit? verso le cellule neoplastiche da parte dei PBMC, a cui sono stati sottratti i linfociti esprimenti CD4 e CD8, co-coltivati con cellule T-ALL e concentrazioni crescenti di UMG2/CD1a-CD3? BTCE. La figura 4D mostra la percentuale relativa (%) di citotossicit? indotta sulle cellule neoplastiche da parte dei PBMC, sottratti dei linfociti esprimenti il CD56, o arricchiti di CD56 positivi, e PBMCs in presenza di bloccante del frammento Fc, in co-coltura con cellule T-ALL Jurkat che esprimono il CD1a e concentrazione crescente (0,01-0,1- 1 ?g/ml) del costrutto BTCE;
- La Figura 5 mostra dati sperimentali relativi all?attivit? in vivo di UMG2/CD1a-CD3? BTCE; in particolare la figura 5A mostra la valutazione della fluorescenza in vivo in topi immunodepressi NSG(NOD/SCID gamma, non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency), inoculati sottocute con cellule HPB-ALL e trattati con due dosi settimanali intraperitoneali del costrutto BTCE alla concentrazione di 0,1 mg/kg o 0,5 mg/kg, o con il veicolo (PBS), come controllo; in figura 5B sono riportate le curve di sopravvivenza (Kaplan-Meier) dei topi trattati rispetto al gruppo di controllo (log-rank test, p<0.05);
- La figura 6 riporta i dati del trattamento combinato di UMG2/CD1a-CD3? BTCE e di immuno-checkpoint inhibitors (ICIs). La figura 6A riporta l?espressione dei marcatori indicatori di esaurimento (exhaustion) della funzione antitumorale delle cellule T (PD-1, TIM3 e TIGIT) su linfociti T CD4 e CD8 positivi co-coltivati con cellule T-ALL che esprimono CD1a in presenza del costrutto BTCE in presenza di nivolumab e/o avelumab, rispetto al trattamento con il costrutto BTCE soltanto. La figura 5B riporta la percentuale relativa (%) di citotossicit? su cellule T-ALL esprimenti CD1a cocoltivate con PBMC in presenza del solo costrutto BTCE, del solo nivolumab, del solo avelumab, del costrutto BTCE pi? nivolumab o avelumab.
Secondo l?invenzione, ? stato sviluppato un nuovo anticorpo bispecifico asimmetrico(UMG2/CD1a-CD3?)BTCE capace di reclutare cellule T contro le cellule di T-ALL di derivazione corticale. In particolare, il costrutto generato ? un asimmetrico 2+1, con un legame bivalente verso CD1a e monovalente verso CD3?, realizzato utilizzando la tecnologia ?knobs into holes? e partendo dalla sequenza delle scFv dell?anticorpo UMG2. Quest?ultimo deriva dall?omonimo ibridoma ottenuto mediante coltura a lungo termine e numerosi subclonaggi dell?ibridoma parentale UN5, gi? caratterizzato e clusterizzato come anti-CD1a. L?ibridoma UMG2 depositato in data 17 Settembre 2021, numero di accesso assegnato dall?Autorit? Internazionale di deposito PD21003,produce l?anticorpo UMG2 che presenta, rispetto all?anticorpo parentale, elevata affinit? per l?epitopo e lieve differenza del pattern di reattivit? verso il target. L?anticorpo UMG2 ? quindi nuovo e diretto verso un epitopo unico di CD1a, una glicoproteina altamente espressa dalle cellule T-ALL.
Il Richiedente ha svolto prove sperimentali, di cui nelle figure sono riportati alcuni risultati, in cui l?attivit? in vitro del costrutto UMG2/CD1a-CD3? BTCE ? stata valutata su cellule tumorali co-coltivate con cellule mononucleate del sangue periferico derivate da donatori sani (PBMC) in toto o depleti dei linfociti CD4/CD8 o arricchiti dei linfociti CD56 con un rapporto E:T pari a 10:1. L'attivit? antitumorale in vivo di UMG2/CD1a-CD3? BTCE ? stata valutata in un modello murino NSG ricostituito con cellule mononucleate del sangue periferico umano (Hu-PBMC) e inoculato con cellule T-ALL. La crescita del tumore in vivo ? stata valutata mediante imaging a fluorescenza.
Il Richiedente ha studiato il targeting di CD1a come potenziale bersaglio specifico per T-ALL. CD1a ? una glicoproteina transmembranaria espressa su ?40% dei casi di T-ALL di derivazione corticale e su una popolazione di timociti corticali ma non sulle cellule di sangue periferico. Sulle cellule non ematopoietiche, solo un sottogruppo di cellule dendritiche residenti nella cute (cellule di Langerhans, LC) esprime l'antigene CD1a.
Con lo scopo di sviluppare una terapia contro la T-ALL, il Richiedente ha sviluppato, secondo la presente invenzione, un nuovo costrutto BTCE CD3?-monovalente che lega simultaneamente un epitopo unico di CD1a al fine di reclutare e innescare una potente risposta antitumorale mediata dalle cellule T.
Viene riportata nel seguito l'attivit? in vitro e in vivo di questo BTCE, supportando il valore traslazionale delle strategie di targeting CD1a come una nuova terapia per i pazienti affetti da questa malattia aggressiva.
Mediante coltura a lungo termine e diverse procedure di subclonaggio, ? stato selezionato il clone UMG2 da un ibridoma murino precedentemente generato dal gruppo dei ricercatori proponenti, che ? stato successivamente caratterizzato come un mAb anti-CD1a. L?anticorpo UMG2 riconosce il suo epitopo su CD1a, mentre l'affinit? contro il sito combinatorio ? leggermente migliorata rispetto al clone parentale originale. Questo clone ? stato sequenziato per la generazione di un costrutto bi-specifico con un braccio monovalente CD3?.
Per confermare che UMG2 riconosce un epitopo CD1a, la linea cellulare HEK293T, negativa per l'espressione di CD1a, ? stata transfettata con un plasmide codificante per CD1a o con un vettore vuoto negativo (EV). Dopo la selezione del clone transfettato, il legame specifico di UMG2 o degli anticorpi anti-CD1a (SK9, BL6 HI149) a CD1a ? stato valutato mediante citometria a flusso. ? stato trovato un forte legame di UMG2 sulle cellule HEK293T che esprimono CD1a mentre non ? stata osservata alcuna reattivit? sulle cellule HEK293T transfettate con il controllo negativo (Figura 1A). ? importante sottolineare che un modello di reattivit? simile ? stato osservato per gli altri mAbs anti-CD1a testati, confermando ulteriormente la reattivit? di UMG2 verso CD1a (Figura complementare 1A-B). Inoltre, per indagare se UMG2 si lega a un epitopo CD1a originale, ? stato eseguito un saggio di legame competitivo tra UMG2 coniugato con fluorocromo e mAb coniugati con fluorocromo SK9, BL6 e HI149 anti-CD1a. ? interessante notare che nessuno degli mAb anti-CD1a compete con il legame UMG2 (Figura 2A supplementare), indicando cos? che UMG2 riconosce un epitopo CD1a precedentemente non descritto.
Successivamente, la reattivit? di UMG2 ? stata valutata su un pannello di campioni di cellule primarie T-ALL e linee cellulari. Come mostrato nella Figura 1B, le cellule T-ALL corticali primarie sono riconosciute da UMG2. Tra le 8 diverse linee cellulari T-ALL corticali testate, 3/8 risultano fortemente positive per il legame con UMG2 marcato, 1/8 con intensit? inferiore e 4 linee cellulari non esprimono l'antigene (Figura 1C). ? interessante notare che le linee cellulari Ke-37, DND-41 e CCRF-CEM non reattive con UMG2 sono invece fortemente reattive agli anticorpi anti-CD1a SK9, BL6 e HI149, indicando ancora una volta che l'epitopo riconosciuto da UMG2 ? unico e caratterizzato da un pattern ristretto di espressione (Figura supplementare 2B) rispetto ad altri mAbs anti-CD1a.
Infine, ? stata valutata la reattivit? di UMG2 su cellule del sangue periferico di donatori sani. Nessuna reattivit? ? stata trovata sui diversi sottotipi di cellule del sangue (cellule T, linfociti B, NK, monociti e neutrofili) come previsto (Figura 1D), confermando un pattern di espressione ristretto dell'epitopo riconosciuto.
Le caratteristiche strutturali del UMG2/CD1a-CD3? BTCE asimmetrico, monovalente per il braccio CD3? (2+1), sono state sviluppate per ridurre l'attivazione aspecifica delle cellule T in assenza di un concomitante legame CD1a, mentre il dominio di reattivit? a CD1a ? stato progettato con un braccio bivalente per potenziare l?avidit? del costrutto per cellule che esprimono CD1a (Figura 2A). A tal fine, quindi ? stato generato(2+1) UMG2/CD1a-CD3? (clone L2K-07)BTCE.
Per definire la costante apparente di dissociazione (Kd) del nuovo costrutto BTCE, sono stati eseguiti esperimenti di titolazione. La Kd apparente media ? stata stimata a 0,014 ?g/mL, mentre la saturazione del legame ? stata raggiunta a concentrazioni di circa 1 ?g/mL (Figura 2B).
L'attivit? in vitro del costrutto BTCE ? stata valutata per la prima volta utilizzando cellule HEK293T/EV e HEK293T/CD1a, coltivate insieme a PBMC come cellule effettrici con rapporto effettore/bersaglio (E:T) 10:1.? stata osservata una citotossicit? delle cellule T concentrazione-dipendente verso cellule HEK293T/CD1a ma non verso HEK293T/EV (Figura 2C). Per indagare se il BTCE induce un effetto citotossico diretto in assenza di cellule T, ? stata valutata la vitalit? delle cellule HEK293T/CD1a e HEK293T/EV dopo 72 ore di trattamento con il solo costrutto BTCE. Non ? stata osservata alcuna differenza nella vitalit? cellulare tra le cellule HEK293T/CD1a e HEK293T/EV (Figura supplementare 3A).
Per convalidare la rilevanza traslazionale di questi risultati, le cellule T-ALL che esprimono CD1a (Jurkat, HPB-ALL, TALL-1 e PF-382) o le cellule che non lo esprimono (Ke-37), sono state co-coltivate con PBMC con un rapporto E:T di 10:1 in presenza di concentrazione crescente del BTCE. Il trattamento ha determinato un forte effetto citotossico contro le cellule T-ALL che esprimono CD1a, mentre non ? stata osservata alcuna significativa citotossicit? delle cellule T contro le cellule Ke-37 CD1a-negative (Figura 2D). Su cellule primarie provenienti da pazienti portatori T-ALL, ? stata osservato un effetto citotossico pari al 60% delle cellule tumorali esprimenti CD1a (Figura 2E). Ancora una volta, non ? stata osservata alcuna citotossicit? diretta in assenza di cellule effettrici (Figura complementare 3B) e il trattamento con il costrutto BTCE non innesca un effetto citotossico diretto. Inoltre, l'espressione di CD107a valutata in maniera dipendente dalla concentrazione del costrutto BTCE risulta aumentata nei linfociti T cocoltivati, con un rapporto E:T di 10:1, con entrambe le linee cellulari T-ALL che esprimono CD1a e con le cellule T-ALL primarie, indicando la degranulazione citotossica indotta dal costrutto BTCE (Figura 2F).
Per dimostrare l'attivazione delle cellule T guidate dal BTCE contro le cellule leucemiche T-ALL che esprimono CD1a, le linee cellulari T-ALL con espressione alta (HPB-ALL e TALL-1) e media di CD1a (Jurkat) sono state co-coltivate con PBMC con un rapporto E:T pari a 10:1 in presenza di concentrazione crescente del costrutto BTCE.
? importante sottolineare che UMG2/CD1a-CD3? BTCE determina l'attivazione dei linfociti T concentrazionedipendente, come valutato dall'up-regolazione dei marcatori di attivazione precoce e tardiva rispettivamente CD69 e CD25 su entrambi i linfociti T CD4/CD8, nonch? dal rilascio di granzima, perforina e granulisina, e la produzione di citochine proinfiammatorie, come TNF-?, IFN-? e IL-2 (Figura 3 A-3 D).
Per studiare l'attivazione delle cellule T ? stata esplorata la via di segnalazione a valle di CD3?. In particolare, sono stati valutati i livelli di proteina NFAT1 in PBMC co-coltivati a un rapporto E:T di 10:1 con linee cellulari T-ALL che esprimono CD1a, in presenza del costrutto BTCE o del veicolo come controllo. Il trattamento con il costrutto BTCE ha indotto livelli maggiori di proteina NFAT1 rispetto al controllo(Figura 4A), inducendo una proliferazione delle cellule T (Figura 4B).
Infine, per dimostrare che l'effetto citotossico indotto da UMG2/CD1a-CD3? BTCE ? effettivamente dipendente dai linfociti T, le cellule T-ALL che esprimono CD1a sono state esposte a una concentrazione crescente di UMG2/CD1a-CD3? BTCE e co-coltivate con PBMC in toto, o PBMC privati della frazione di linfociti T esprimenti CD4 o CD8. ? importante sottolineare che ? stata osservata un'attivit? citotossica minima in entrambi i campioni privati di linfociti T CD4 o CD8 positivi rispetto ai PBMC in toto (Figura 4C). Inoltre, per escludere che la presenza del dominio Fc nel costrutto BTCE possa indurre il reclutamento di cellule effettrici dell'immunit? naturale attraverso l'interazione Fc-Fc?R inducendo la sindrome da rilascio di citochine, sono stati ulteriormente studiati i meccanismi d'azione del costrutto BTCE impiegando un bloccante del frammento Fc. Le cellule Jurkat che esprimono CD1a sono state co-coltivate con un rapporto E:T di 10:1 con PBMC in toto, o privati di linfociti T esprimenti il CD56, o PBMC in toto esposti a bloccanti di Fc o, infine, solo linfociti T CD56+. Considerando che l'attivit? minima ? stata trovata in presenza di soli linfociti T CD56+, sia i PBMC privati di linfociti T CD56+ che i PBMC in toto con Fc bloccato, sono stati in grado di raggiungere un'attivit? citotossica paragonabile ai PBMC totali non depleti dalla componente CD56+(Figura 4D).
L'insieme di questi risultati indica che il costrutto BTCE esercita una citotossicit? mediata dalle cellule T contro le cellule T-ALL che esprimono CD1a che non comporta l'attivazione di altre cellule citotossiche.
Successivamente, il Richiedente ha studiato l'attivit? antitumorale in vivo del costrutto BTCE contro le cellule T-ALL che esprimono CD1a. Le cellule HPB-ALL fluorescenti sono state inoculate per via sottocutanea in topi immunocompromessi NSG. Sette giorni dopo l'inoculo sottocutaneo di cellule HPB-ALL, sono state inoculate per via ematica PBMC umane derivate da donatore sano con lo scopo di ricostituire gli effettori citotossici umani negli animali da esperimento. Quindi, tre giorni dopo l'attecchimento di PBMC, i topi sono stati randomizzati per ricevere il costrutto BTCE per via intraperitoneale con due somministrazioni alla settimana. La crescita del tumore ? stata valutata con sistema di imaging in vivo che rileva la fluorescenza delle cellule tumorali.
Gli animali trattati sono stati suddivisi in due gruppi per ricevere la dose di 0,1 o 0,5 mg/kg del costrutto BTCE, ed entrambi i gruppi sperimentali hanno mostrato una riduzione della crescita tumorale significativa ad entrambe le dosi(Figura 5A). Questo effetto si ? tradotto in un aumento della sopravvivenza degli animali dei gruppi trattati. Precisamente ? stata valutata una sopravvivenza mediana di 41 giorni nel gruppo che ha ricevuto solo il veicolo mentre 62 e 63 giorni era la sopravvivenza mediana nei gruppi di animali che ricevevano rispettivamente 0,1 mg/kg e 0,5 mg/kg del costrutto BTCE (Figura 5B).
E? noto che, la stimolazione antigenica cronica induce la over-espressione degli immuno-checkpoint PDL-1/PDL-2 sulle cellule tumorali e l'espressione di marcatori di esaurimento della funzione T, come PD-1, TIM-3, LAG-3 e TIGIT sui linfociti T, compromettendo cos? la risposta antitumorale in vivo. Il Richiedente ha indagato sul fatto che gli inibitori degli immuno-checkpoint usati in combinazione con il costrutto BTCE possono contrastare la disfunzione delle cellule T rappresentando un promettente campo di indagine.
Per valutare se la stimolazione cronica dell'antigene induce disfunzione delle cellule T sui linfociti T, le cellule PBMC e le cellule marcate sono state co-coltivate in presenza del costrutto BTCE o del veicolo, come controllo. Dopo 72 ore, i linfociti T sono stati nuovamente stimolati con cellule T-ALL marcate con un rapporto E:T di 10:1 in presenza del costrutto BTCE, o anti-PD-1, o anti PDL1 da solo o in combinazione o il veicolo (controllo). E? stata trovata una significativa riduzione dei marcatori di esaurimento delle cellule T sui linfociti T co-coltivati con cellule che esprimono CD1a trattati con la combinazione di anti-PD-1/anti-PDL-1 e il costrutto BTCE, rispetto al solo BTCE (Figura 6A).
Ad oggi, la cura dei pazienti con T-ALL refrattari/recidivanti ? ancora un obiettivo da raggiungere. Sebbene gli approcci immunoterapeutici abbiano rivoluzionato le prospettive dei pazienti con B-ALL, nessuna strategia basata sull'immunoterapia ? attualmente approvata e disponibile per il trattamento della T-ALL.
I costrutti BTCE rappresentano un approccio emergente dell'immunoterapia del cancro, che si basa sulla promozione della sinapsi immunitaria tra i linfociti T effettori e le cellule bersaglio del tumore, mediante domini di legame anticorpale sia per gli antigeni associati al tumore che per quelli specifici delle cellule T. Pertanto, la tecnologia BTCE fornisce una nuova funzionalit? che non ? presente in nessuna combinazione degli anticorpi parentali.
Esistono diversi formati di costrutti BTCE, che vanno da proteine molto piccole, costituite da due frammenti variabili a catena singola (a base di frammenti), a molecole simili alle immunoglobuline G (IgG), di dimensioni maggiori.
Secondo l?invenzione si ? sviluppato un costrutto formato dalla struttura dell?anticorpo UMG2, IgG2A con due bracci di legame per CD1a, con un singolo scFv, derivato da un mAb anti-CD3 OKT3. Questa struttura(asimmetrica, 2+1) ? stata scelta sulla base di considerazioni di ordine farmacodinamico e farmacocinetico vantaggiose. In primo luogo, la presenza di domini di legame bivalenti per CD1a pu? aumentare il riconoscimento selettivo e l'eliminazione di cellule T-ALL di origine corticale altamente esprimenti l'antigene CD1a, risparmiando le cellule sane che lo esprimono a livelli bassi. In secondo luogo, il braccio monovalente per CD3 ? preferito al legame bivalente per evitare l'attivazione aspecifica delle cellule T mediante CD3e per ridurre al minimo l'intrappolamento del costrutto BTCE nei tessuti normali ricchi di linfociti T. In terzo luogo, la presenza del recettore Fc neonatale (FcRn), che protegge il BTCE IgG-simile dalla degradazione, conferisce una lunga emivita plasmatica (giorni) rispetto alla pi? breve emivita plasmatica del BTCE a base di frammenti (ore), che quindi devono essere infusi continuamente. In particolare, in vitro, il BTCE ha prodotto un'attivazione delle cellule T dipendente dalla concentrazione, il rilascio di citochine infiammatorie e l'induzione della proliferazione e dell'attivazione delle cellule T, portando alla lisi delle cellule T-ALL con un rapporto E:T dipendente. Coerentemente con i dati in vitro, il BTCE ha portato ad una significativa attivit? antitumorale e a un vantaggio di sopravvivenza negli animali trattati nella sperimentazione in vivo. ? importante sottolineare che per il valore traslazionale del costrutto BTCE, il Richiedente ha trovato questa attivit? in un range di concentrazione sovrapponibile alle dosi utilizzate per il primo BTCE gi? noto e clinicamente approvato, il blinatumomab.
Per quanto fin?ora descritto, l?invenzione fornisce una nuova potenziale strategia immunoterapeutica per il trattamento della T-ALL. Inoltre,la terapia basata su BTCE ? un'efficace strategia standard che non richiede la complessa e costosa manipolazione ex-vivo delle cellule effettrici come nel caso dei CAR-T per il re-direzionamento dell?immunit? cellulare sul tumore. Infine, i BTCE sono caratterizzati da una migliore gestione della dose, che riduce i rischi associati alla sindrome da rilascio di citochine (CRS) e ad altre tossicit? comunemente associate alla terapia con CAR-T.
I dati sperimentali ottenuti in base all?invenzione supportano la fattibilit? e l'efficacia di un nuovo BTCE mirato alle cellule T-ALL, con un rischio potenziale di immunosoppressione molto basso, supportando il concetto di immunoterapia di precisione in questi pazienti.
In conclusione, si ? dimostrato che l?invenzione del costrutto UMG2/CD1a-CD3? BTCE, potrebbe rappresentare una strategia anti-T-ALL sicura ed efficace da indagare in uno studio clinico first-in-human come trattamento di mantenimento, al pari del blinatumomab, per l'eliminazione della malattia minima residua (MRD) o in pazienti refrattari/recidivanti che esprimono CD1a per migliorare lo scarso tasso di controllo della malattia ottenuto con nelarabina. Inoltre, tenendo conto della buona prognosi dei pazienti con T-ALL che esprimono CD1a, la presente invenzione pu? fornire un quadro per l'incorporazione del nuovo costrutto BTCE all'interno di un trattamento di prima linea senza chemio come ponte per il trapianto allogenico di cellule staminali, aprendo quindi nuove opportunit? per il trattamento della T-ALL, a tutt?oggi ancora incurabile.
Inoltre, l?anticorpo bispecifico asimmetrico (UMG2/CD1a-CD3 ?) avente le caratteristiche descritte ? applicabile al trattamento immunologico di altre condizioni patologiche come l?istiocitosi di Langherans caratterizzate da elevata espressione di CD1a.
Risulta, infine, chiaro che al nuovo anticorpo bispecifico asimmetrico (UMG2/CD1a-CD3?) per il trattamento immunologico della forma corticale di leucemia linfoblastica acuta T (T-ALL)qui descritto ed illustrato possono essere apportate modifiche e varianti senza per questo uscire dall?ambito protettivo della presente invenzione, come definito nelle rivendicazioni allegate.

Claims (5)

RIVENDICAZIONI:
1. Anticorpo bispecifico asimmetrico (UMG2/CD1a-CD3 ?) per il trattamento immunologico della forma corticale di leucemia linfoblastica acuta T (T-ALL) diretto verso cellule tumorali di derivazione corticale timica esprimenti CD1a, in cui l?anticorpo recluta, attiva e redireziona cellule T normali contro le cellule tumorali.
2. Anticorpo bispecifico asimmetrico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di essere un costrutto sintetico asimmetrico, 2+1 formato da due scFv specifiche per CD1a (per un legame bivalente) derivate dalla sequenza anticorpale di UMG2 legate ad un backbone IgG1 a sua volta legato a un singolo scFv specifico per CD3 ? (monovalente), derivato da un mAb anti-CD3 OKT3.
3. Anticorpo bispecifico asimmetrico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di essere atto ad attivare e re-direzionare cellule T citotossiche, mediante il legame con CD3? verso CD1a
4. Anticorpo bispecifico asimmetrico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di essere un costrutto asimmetrico 2+1, con un legame bivalente verso CD1a e monovalente verso CD3?, realizzato utilizzando la tecnologia ?knobs into holes? e partendo dallo sviluppo dell?anticorpo UMG2, diretto contro CD1a.
5. Anticorpo bispecifico asimmetrico (UMG2/CD1a-CD3 ?) per il trattamento immunologico di condizioni patologiche come l?istiocitosi di Langherans caratterizzate da elevata espressione di CD1a.
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