JPH0681760B2 - サイトケラチン腫瘍マーカー - Google Patents

サイトケラチン腫瘍マーカー

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JPH0681760B2
JPH0681760B2 JP63177251A JP17725188A JPH0681760B2 JP H0681760 B2 JPH0681760 B2 JP H0681760B2 JP 63177251 A JP63177251 A JP 63177251A JP 17725188 A JP17725188 A JP 17725188A JP H0681760 B2 JPH0681760 B2 JP H0681760B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、サイトケラチン腫瘍マーカーに関する。腫瘍
マーカーの同定を介して癌を検出しそして診断するため
の能力は、広範な興味ある領域である。腫瘍マーカー
は、物質、典型的にはタンパク質、糖タンパク質、多
糖、及び同様のものであり、これらは腫瘍細胞によって
生成されそしてそれらに特徴的である。しばしば、腫瘍
マーカーは、正常細胞及び腫瘍細胞によって生成され
る。しかしながら、腫瘍細胞においては、その生産量は
幾分異常である。たとえば、腫瘍マーカーの生産量は、
癌細胞においてひじょうに増加することができる。一
方、正常細胞内又は表面上に通常存在するタンパク質及
び他の物質は、その細胞が悪性になる時、循環内に放出
又は与えられるかもしれない。従って血清中におけるそ
のような分泌される物質の検出が、悪性の症候であるこ
とができる。
癌診断において遭遇するもう一つの問題は、第１次及び
転移性腫瘍の両者の細胞起源を同定することに関する。
両タイプの腫瘍に関しては、異なる細胞起源の腫瘍、た
とえば上皮起源の腫瘍（癌）、非上皮の結合組織に由来
する腫瘍（肉腫）、及びリンパ腫瘍（リンパ腫）の間で
形態的に区別することは時々困難である。さらに、乳房
上皮癌に関しては、管上皮組織、分泌上皮組織、及び筋
上皮組織に関する腫瘍間で区別することは、しばしば困
難である。
従がって、これまでに認識されていない腫瘍マーカー、
特に、循環中に分泌されそして血清検定によって同定す
ることができる腫瘍マーカーを同定することが望まし
い。また、特定の腫瘍の細胞起源の決定を可能にする方
法及び組成物を開発することが望ましい。
〔従来の技術の記載〕
エストラジオール刺激に応じてある乳房細胞系によって
放出される52,000ドルトンののタンパク質が同定されて
いる。Westley及びRochefort、セル（Cell）（1980）2
0:353〜3362、及びVeithなど。キャンサーリサーチ（Ca
ncer Research）（1983）43:1861〜1868を参照のこと。
MCF−７ヒト乳癌細胞系に対して生じるモノクローナル
抗体は、24キロドルトンのサイトゾルタンパク質を同定
することが示されている。Cioccaなど。キャンサーリサ
ーチ（Cancer Research）（1982）42:4256〜4258。組織
ポリペプチド抗原（TPA）と称されるタンパク質は、上
皮細胞の細胞質中間線維に関係している。TPAは、血清
中において及び細胞表面マーカーとして両方ともの腫瘍
マーカーであると報告されている。Altmannsbergerな
ど、Virchows Arch.〔セルパソロジイ（Cell Patholog
y）〕（1981）37:277〜284（この場合、乳癌細胞がプリ
ケラチンに対する抗体と反応し）:Wagnerなど。オース
トラリアン アンド ニュージーランド ジャーナル
オブ サージェリイ（Australian and New Zealand Jou
rnal of Surgery）（1982）52:41〜43（この場合、TPA
の高められた血清レベルが胃及び腸癌に苦しむいくらか
の患者に検出され）:Mrossなど。Klin.Wochenschr（198
3）61:461〜468（この場合、TPAの高められた血清レベ
ルが乳癌に苦しむいくらかの患者に見つけられ）そして
Luning及びNilson.アクタ ケミカ スカンジナビカ（A
cta Chemica Scandinavica）（1983）37:731〜753（こ
の場合、表皮ケラチンを含む、TPA及びある線維性タン
パク質間の一部相同の配列が報告された）を参照のこ
と。スウェーデンのブロマにある Sangtec Medicalは、
商標Prolifigren RIAキットのもとで血清及び血漿中
のTPAの検出のためのキットを販売している。Mariresse
など。ジャーナル オブ ステロイド バイオケミスト
リイ（Journal of Steroid Biochemistry）（1981）15:
375〜381は、MCF−７細胞の培養培地での約50kdの低転
換速度のタンパク質の存在を報告している。ケラチンの
血清学的検出が、癌患者において報告されている。Madr
iなど、ラボラトリイ インベスティゲーション（Labor
atory Investigation）（1983）48:98〜107。
〔発明の要約〕
この発明は、第１次及び転移性上皮腫瘍、特に上皮乳房
腫瘍を検出してそしてモニターするために有用な組成物
を提供する。細胞外サイトケラチンは、約40〜46キロド
ルトンの分子量を有しそして腫瘍性上皮細胞の細胞表面
上に見出される約42〜48kdのタンパク質に関係してい
る。細胞外サイトケラチン及び細胞表面タンパク質の両
者は、今度は、細胞内サイトケラチンに関係している
が、しかし細胞外サイトケラチンは、ブロックされてい
るＮ−末端を有しそして水性溶液に溶解する点におい
て、細胞内サイトキシン及び細胞表面サイトケラチンの
両者と異なる。細胞外サイトキシンの検出は、ハイブリ
ドーマ細胞系、UCD/AB 6.11、UCD/AB 10.11に由来する
モノクローナル抗体又は類似の特異性を有する他の抗体
との反応によって便利に達成することができる。
この発明の組成物は、また種々の上皮腫瘍の細胞起源を
同定するために有用である。上皮サイトケラチン、特に
UCD/PR 10.11と反応できるモノクローナル抗体は、非上
皮腫瘍、たとえば肉腫及びリンパ腫と上皮腫瘍（癌）を
区別するのに利用することができる。その上、抗体のグ
ループ又はパネルを管上皮、分泌上皮、及び筋上皮起源
の第１次及び転移性乳房腫瘍の間の区別をするために利
用することができる。
〔特定の態様の記載〕
組成物は、上皮腫瘍、特に乳房上皮腫瘍の検出、同定、
及びモニターリングのために提供される。正常及び腫瘍
性上皮細胞の両者は、細胞表面上の約42〜48キロドルト
ン（kd）のタンパク質（これは、細胞内サイトケラチン
に免疫学的に及び組成的に関係している）によって特徴
づけられることが見つけられた。また、サイトケラチン
関連タンパク質の低分子形（約40〜46kd）が正常及び腫
瘍性細胞の両者によって放出されるがしかし腫瘍性細胞
からの放出速度は相当に高いということが見出さられ
た。従って血清中のそのような細胞外サイトケラチンの
存在について検定することによって、患者集団を、上皮
新生物についてスクリーンすることができる。この検定
は特に上皮新生物のために治療を受けている患者の経過
をモニターするために適切である。
中間線維は、多くの細胞型における細胞体質の主成分で
ある。乳腺のような組織の上皮細胞は、ケラチンから成
る可溶性中間線維を含む。サイトケラチンと称するこれ
らのタンパク質は、正常及び腫瘍性乳房細胞の両者中に
見つけられそしてタイプ１から19〔Mollなど。セル（Ce
ll）（1982）31:11〕と称する少なくとも19の異なるタ
ンパク質のグループを含んで成る。これまで、そのよう
なサイトケラチンは、細胞内サイトケラチンタンパク質
であると信じられていた。しかしながら後の実験部分に
報告されている研究は、そのような細胞内サイトケラチ
ンに免疫学的に及び組成的に関連しているタンパク質
を、細胞表面上でも見出すことができ、そして細胞から
分泌され得るということを証明している。
この発明によって同定された細胞表面サイトケラチン及
び細胞外サイトケラチンは、構造的に及び免疫学的に既
知の細胞外サイトケラチンに関連しているがしかし同一
ではない。構造的に関連があるということは細胞外／細
胞表面のサイトケラチン及び細胞内サイトケラチンの間
で少なくとも60％の相同性普通75％又はそれより大きな
相同性が存在するということを意味する。免疫学的に関
連があるということは、サイトケラチン内で共通な少な
くとも１つのエピトープ部位、普通多数のエピトープ部
位しかし、すべてのエピトープ部位よりも少ない部位が
存在するであろうことを意味する。乳房上皮細胞の典型
的な場合においては、タイプ8,18及び19の細胞内サイト
ケラチンと免疫学的に交叉反応をする少なくとも３つの
エピトープが細胞表面サイトケラチン上に存在するとい
うことが見出される。乳房上皮細胞から放出される細胞
外サイトケラチンは、タイプ８及びタイプ18の細胞内サ
イトケラチンと最っとも強く交叉反応し、そして水性溶
液中で可溶性である。細胞外サイトケラチンは、ブロッ
クされているＮ−末端を有するということも、さらに見
出される。
生物学的液体、たとえば血清中での細胞外サイトケラチ
ンの検出は、上皮癌の状態に関係があり得る。腫瘍性上
皮細胞は、正常な上皮細胞と比較して増大された速度で
サイトケラチンを放出し、そして血清中のサイトケラチ
ンレベルを疾患と関係することをできることが観察され
る。たとえば、腫瘍が外科的に取り除かれ又は他の形の
治療によってその後退が誘発された後、血清中のサイト
ケラチンレベルが、減少するすることが予想され得る。
従って患者の血清レベルをモニターすることによって増
大した腫瘍負荷（第１次又は転移性いづれか）の特徴で
ある細胞外サイトケラチンの増加レベルを検出すること
ができる。
この発明は、また腫瘍細胞の細胞起源を決定するために
腫瘍細胞をスクリーニングするのに有用である。腫瘍細
胞におけるサイトケラチンの存在は、その細胞の上皮起
源のを診断するものである。従って、細胞サイトケラチ
ンに対して特異な抗体との反応によって非上皮腫瘍と上
皮腫瘍を区別することができる。さらに、サイトケラチ
ンと反応することができる抗体は、管上皮、分泌上皮及
び筋上皮の乳房細胞間を識別することができるというこ
とが見出された。従って、乳房上皮細胞のおのおのの型
と反応するが、しかし乳房上皮細胞の他の２つの型とは
実質的に反応性が低い抗体のグループ又はパネルを使用
することによって、乳房腫瘍の細胞起源を、組織化学的
染色技法により便利に決定することができる。通常の技
法により抗体との反応性を基礎にして、陽性及び陰性の
サンプルを評価することが可能であろうことが、“実質
的に反応性が低い”ということによって意味される。腫
瘍の細胞起源の知識は、治療の適切な態様を選択する場
合に有用である。
細胞サイトケラチン及び細胞外サイトケラチンの存在
は、タンパク質と反応する抗体を用いる通常のイムノア
ッセイ又は組織化学的染色技法を免疫学的に使用して便
利に決定することができる。免疫原として、細胞サイト
ケラチンもしくは細胞外サイトケラチン、又はそれらの
抗原性フラグメントのいづれかを通常に使用して（下に
記載されているように）そのような抗体を生産すること
ができる。乳房腫瘍細胞系からの完全な又は溶解した細
胞を、免疫原として便利に使用することができる。一
方、サイトケラチンに特異な抗体を利用して、血清、第
１次腫瘍細胞、又は腫瘍細胞系からサイトケラチンを単
離し、免疫原として使用するための精製されたる抗原を
得ることができる。
通常の技法に従って広範囲の種類の脊椎動物中に所望の
免疫原を注入することによって抗体を得ることができ
る。適当な脊椎動物は、マウス、ラット、羊及びヤギ、
を含み、特にマウスが適切である。普通、改良された力
価及び特異性を有する、逐次的な放血により定期的に動
物から採血する。抗原は、筋肉内に、腹腔内に、皮下に
又はこれらと同様にして注入することができる。普通、
完全又は不完全フロインドアジュバンドのような賦形剤
が使用される。所望によりモノクローナル抗体を製造す
ることができる。
モノクローナル抗体を得るために、免疫化されたる脊椎
動物からの脾臓細胞が不滅にされる。不滅化の方法は臨
界ではない。現在、最っとも通常な方法は、骨髄腫融合
パートナーによる融合である。他の技法は、EBV形質転
換、裸のDNA、たとえば、腫瘍遺伝子、レトロビール
ス、等による形質転換、又は細胞系の安定維持及びモノ
クローナル抗体の生成をもたらすいづれか他の方法を含
む。ヒトモノクローナル抗体は、適切なヒト融合パート
ナー、たとえばWI−L2と脾臓細胞の融合によって得るこ
とができる（ヨーロッパ出願番号82.301103.6に記載さ
れ、これと関連する部分を、引用によりこの明細書に組
み入れる）。マウス×マウスモノクローナル抗体を生成
するための詳しい技法は、0i及びHerzenbergの“細胞免
疫学における選択法（Selected Methods in Cellular I
mmunology）,"Mishell及びShiigi（出版）、W.H.Freema
n及びCo.,サンフランシスコ（1980）ページ351〜372に
よって教示されている。この発明の抗体は、いづれかの
免疫グロブリンクラス、すなわちIgG1,IgG2a、及びIgG2
bを含むIgG,IgA,IgD,IgE、並びにIgM、普通IgG又はIgM
であることができる。
特に有用なモノクローナル抗体がこの発明において使用
するために製造されている。抗体UCD/AB 6.11は、上皮
サイトケラチンの細胞内、細胞表面、及び細胞外形と、
特に分泌上皮細胞に特徴的であるタイプ18サイトケラチ
ンと反応的である。抗体UCD/PR 10.11は、サイトケラチ
ンの細胞内及び細胞外形と、特に管上皮細胞に特徴的で
あるタイプ８サイトケラチンと反応的である。UCD/PR
7.01は、筋上皮細胞に特徴的である抗原の細胞内及び細
胞外形と反応的である。これらの３つの抗体は、特に、
それらが管起源、分泌起源、又は筋上皮起源であるかど
うかを決定するために腫瘍性上皮細胞をスクリーニング
するのに適切である。
抗体UCD/PR 10.11は、また、それらが上皮起源のもので
あるかどうかを決定するために腫瘍細胞をスクリーニン
グするのに特に適切である。UCD/PR 10.11抗体は、上皮
細胞のために高い親和性を有しそしてひじょうに低いバ
ックグラウンドレベルを伴って高度に特異的な染色を提
供することが見出される。
いったん適切な特異性を有する抗体が製造されたなら、
広範囲の種類の免疫学的検定法が利用可能である。多く
のコンピティティブ及び非コンピティティブタンパク質
結合検定は、科学及び特許文献に記載され、そしてその
ような検定のひじょうに多くが商業的に使用可能であ
る。血清抗原を検出するために適切である典型的にはイ
ムノアッセイは、アメリカ合衆国特許番号、3,791,932;
3,817,837;3,839,153;3,850,752:3,850,578;3,853,987;
3,867,517;3,879,262:3,901,654;3,935,074;3,984,533;
3,996,345;4,034,074;及び4,098,876に記載されている
方法を含む。
イムノアッセイを実施するより前に、ある種の方法によ
り生物学的サンプルをあらかじめ処理することが普通必
要であろう。サンプルの調製法は、生物学的サンプル源
に依存して異なるであろう。固形腫瘍及び他の組織サン
プルは、細胞を溶解することによって調製されるであろ
う。血清サンプルは、典型的に、良く知られている方法
に従って、全血液を凝固しそして上清液を単離すること
によって調製されるであろう。他の生物学的液体、たと
えば精液、痰、及び尿は、また細胞外サイトケラチンの
存在について検定することができる。
通常の免疫組織化学的染色技法も、また組織サンプル中
のサイトケラチンを検出するために用いることができ
る。たとえば、組織サンプルを、ホルマリン、Ｂ−５又
は他の標準組織学的保存薬中に固定し、脱水しそしてど
の病院の病理実験室においても日常の仕事であるような
パラフィン中に封入することができる。切片をパラフィ
ンから切り離しそしてガラススライド上に置くことがで
きる。次に細胞抗原が、検出されそしてラベルされてい
る抗体及びラベルされている第２抗体に暴露することに
よっておのおの位置決定され得る。一方、細胞学的調製
法を用いることができる。たとえば、組織サンプルから
の細胞は、典型的には、生理学的pHで緩衝液中、ホルマ
リンに暴露し、次にアセトン中に懸濁しそして遠心分離
によりゼラチン−被覆のスライド上にペレット化するこ
とによって、スライド上に固定することができる。次に
ラベルされている抗体に暴露するか、又はラベルされて
いない抗体及びラベルされている第２抗体に暴露するか
いづれかによって、細胞表面受容体を位置決定すること
ができる。サンプル中の細胞表面タンパク質の量は、結
合しているラベルの量に直接的に比例する。
放射性同位体のラベルを使用するホールボディイメージ
ング技法は、上皮腫瘍、特に転移した乳癌の位置を見つ
けるために利用され得る。この発明の抗体、又はそれら
のフラグメントは、適切な放射性同位体、典型的にはテ
クネチウム−99、123I,125、もしくは131I、又はそれら
の組合せに結合され、そして非経腸的に投与された。ラ
ベルの生体分布状態は、シンチグラフィによってモニタ
ーされ、そしてラベルの蓄積を、エストロゲン感受性の
腫瘍性乳房上皮細胞の存在に関係することができる。ホ
ールボディイメージング技法は、アメリカ特許第4,036,
945及び4,311,688に記載され、この開示を引用によりこ
の明細書中に組み入れる。
この実験は、制限的でなく、例示的に提供されている。
実験 次の略語が用いられる： BSA −ウシ血清アルブミン DCC −デキストラン被覆木炭 ER −エストロジン受容体 HMFGM −ヒト乳脂肪乳球膜 IEF −等電点電気泳動 MCA −モノクローナル抗体 PBS −リン酸緩衝化食塩溶液（0.01Mのリン酸 ナトリウム、pH7.3、0.15Mの塩化ナト リウムを含む） RIA −ラジオイムノアッセイ SDS-PAGE−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動 材料及び方法 細胞系 1.MCF−７細胞。MCF−７ヒト乳房腫瘍細胞系を用いて、
抗体生産のために免疫化及びスクリーンの両方を行なっ
た。これは、転移性乳癌を有する患者の胸膜の滲出液に
由来する十分に特徴づけられている細胞系である〔ソウ
ルなど。ジャーナル オブ ナショナル キャンサー
リサーチ（Journal of National Cancer Research）（1
973）51:1409〜1416〕。エストロゲン及びプロエステロ
ジン受容体の両者を含んでいるということが示されてい
る。
2.HBL-100。HBL-100は、授乳中の乳房乳汁サンプルから
開発された非腫瘍性ヒト乳房上皮細胞系である〔ポラノ
ウスキイなどイン ビトロ（InVitro）（1976）12:328
〜336〕。それはエストロゲン受容体を含まない。
3.186-NWT。186-NWTは、転移性乳癌を有する患者からの
腹水から開発されたヒト上皮細胞系である。それはいか
なる乳房細胞マーカも示さずそしてそれはER陰性であ
る。
4.P3×63Ag 8.653。これは、MCA生産のためにハイブリ
ドマ融合パートナーとして用いられるマウス骨髄腫細胞
系である。それは、免疫グロブリン又はいかなる免疫グ
ロブリン サブユニットも生産しない〔ケア−ニイな
ど。ジャーナル オブ イムノロジィ（Journal of Imm
unology）（1979）123:1548〜1555〕。
増殖培地 ハイブリドマ細胞系は、ローズウェル パークメモリア
ル インスティテュート カルチャーメディアム1640
（Gibcoラボラトリィズ，グランド アイランド，ニュ
ーヨーク）（加熱により不活性化されている10％子牛血
清、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、
2mM Ｌ−グルタミン、及び25μg/mlゲンタマイシンが
補充されている）において増殖された。ヒト乳房細胞系
は、５％子牛又は馬血清のいづれか、１μg/mlインシュ
リン、25μg/mlゲンタマイシン及び100nM 17β−エス
トラジオール（シグマ ケミカル カンパニイ，セント
ルイス，ミズウリィ）を含むダルベッコ改変のイーグル
最少必須培地中に維持された。
5.細胞系AE1は、Tsengなど。セル（Cell）（1982）30:
361〜372によって記載されているハイブリドマ細胞系
であり、これは、サイトケラチンによる免疫化によって
製造された。この細胞系によって生産される抗体は、す
べての酸性サイトケラチンに対してそして特にMCF−７
タイプ19に対して特異的である。
6.細胞系βH11は、Gown及びVogel。ジャーナル オブ
セル バイオロジィ（Journal of Cell Biology）（198
2）95: 414〜424により記載されているハイブリドマ細
胞系であり、これはサイトケラチンによる免疫化によっ
て製造された。この細胞系によって生産される抗体は、
MCF−７細胞におけるサイトケラチンタイプ8,18及び19
に対して特異的である。
組織検体 正常な及び腫瘍性ヒト乳房組織のパラフィンブロック
は、カリフォールニア、サクラメントのカリフォールニ
ア大学医学センターの医学部病理学科から得られた。
ヒト乳脂肪乳球膜 破損されたHMFGMは、クロロホルム及びエーテルにより
ヒト乳汁のクリーム画分を抽出することによって製造さ
れた〔Ceriani など。プロスィーディング オブ ザ
ナショナル アカデミィ オブ サイエンス アメリ
カ合衆国（Proceedings of the National Academy of S
cience U.S.A）（1977）74: 582〜586〕。
モノクローナル抗体製造 標準的ポリエチレングリコール融合、すなわち0i及びHe
rzenberg.細胞免疫学における選択された方法（Selecte
d Methods in Cellular Immunology）（1980）、Mishel
l及びShiigi出版、W.H.Feeman 及びカンパニイ，サン
フランシスコ，カリフォールニア，ページ351〜372によ
って記載されているようなヒポキサンチン−アミノプテ
リン−チミジン選択方法によって行なわれる。抗体生産
性クローンは、Tsu及びHerzenberg。前記（1980）ペー
ジ373〜397によって記載されているように固相RIA及び
オートラジオグラフィによって、放射性ヨード化されて
いるウサギ抗−マウスIgGにより同定された。
生きている無傷のMCF−７細胞（２×106細胞）によりBA
LB/cマウスを週１度、４週間にわたって腹腔内高度免疫
した。３週間後、融合の前の３日間、２×106細胞によ
り４度腹腔内にそのマウスを免疫した。次に、マウス脾
臓細胞をP3×63Ag 8.653マウス骨髄腫細胞と共にハイブ
リド形成した。
第１及び第２レベルのスクリーニングのために完全に生
きているMCF−７及びHBL-100細胞も、また固相RIAにお
いて用いた〔ブラウンなど。ジャーナル オブ イムノ
ロジカル メソド（Journal of Immunological Method
s）（1979）31: 201〜209〕。生きている細胞を用い
て、固定人工物についての選択を避けた。MCF−７を陽
性スクリーンとして、ER陽極細胞上の抗原に対する抗体
を同定した。HBL-100を陰性スクリーンとして用いて、E
R陰極抗体を同定した。また正常なヒト乳汁から単離さ
れるHMFGMを用いて、標準固相RIAにより正常な乳房上皮
の表面成分に対して選択した（Tsu 及びHerzenberg前
記（1980）〕。
最終スクリーニン判定基準は、抗原の検出のためのイム
ノパーオキシダーゼ技法を用いて、パラフィンスライド
中の抗原の分布状態を直接的に映像化することに基づい
た。
第２世代のモノクローナル抗体を上記のようにして生産
したが、しかしMCF−７組織培養培地（融合系列10抗
体）又は186-NWTからの膜抽出物（融合系列７抗体）の
いづれかから単離される抗原により、マウスを免疫化し
た。下に記載しているようにして、UCD/AB 6.11抗体に
より調製されたイムノアフィニティ カラムを用いてそ
の抗原を単離した。第２世代の抗体についてのスクリー
ニング方法は、次の通りであった。第２世代の抗体の選
択は、固相RIA、Western Blots及びイムノパーオキシダ
ーゼにおける反応性に基づいた。
免疫拡散法 Ouchterlong及びNilsson。ハンドブック オブ イクス
ペリメンタル イムノロジィ（Handbook of Experiment
al Imunology）（1973）、Weir出版、ブラックウエル，
ロンドン，（チャプター19）の二重拡散法を用いて、MC
Aをアイソタイプ分けした。おのおののクローンからの
上清液及びPBS（0.9％塩化ナトリウム、10mMリン酸ナト
リウム、pH7.5）中1:100に稀釈した腹水をおのおのの免
疫グロブリンクラス:IgM,IgG1,IgG2a,IgG3、及びIgAに
対して特異な抗血清に対して反応せしめた。クラスに特
異的抗血清は、インディアナのエルクハートのマイル
ラボラトリィズから購入された。
生細胞固相RIA トリプシン処理によって、75cm2の組織培養フラスコか
ら細胞を収得し、１つのウエルにつき50,000細胞で96ウ
エル組織培養プレートを平板培養し、そして18〜24時間
培養した。すべての培養は、５％CO2中、37℃であっ
た。増殖培地を、吸引除去し、0.08％ナトリウムアジド
を含む増殖培地150μｌを添加しそして細胞を、30分間
インキュベートした。５％子牛血清及び0.08％ナトリウ
ムアジドを含むハンクス液（洗浄緩衝液）により細胞を
すすいだ。次に、洗浄緩衝液を添加しそして細胞を、30
分間インキュベートした。この細胞を、再び洗浄緩衝液
によりすすぎ、そしてハイブリドマ培養からの組織培養
液又は希釈された腹水50μｌを添加しそして１時間イン
キュベートした。次にその細胞を、洗浄緩衝液により２
度すすぎ、そして125−ウサギ抗−マウスIgG 50μｌ
（２×104cpm）を添加しそして１時間インキュベートし
た。その細胞を、洗浄緩衝液により２度洗浄しそして陽
性ウエルを、オートラジオグラフィーによって可視化し
た。
タンパク質分析 Laemmli.ネーチャー（Nature）（1970）227:680〜685に
よって記載されている通りに、10％分解ゲルを含む４％
アクリルアミド積み重ねゲル（両者は、0.2％SDSを含
む）を用いて、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドスラブゲル電気泳動（SDS-PAGE）によりタンパク
質を分析した。50μｌのサンプル緩衝液（63mM TRIS、p
H6.8、10％グリセロール、５％２−メルカプトエタノー
ル、2.3％SDS）中に、サンプルを加え、そして20mAの一
定電流により４時間電気泳動せしめた。既知の標準タン
パク質の分子量と比較してそれらの移動度によってタン
パク質の分子量を見積った。
Ｏ′Farrell.ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリィ（Journal of Biological Chemistry）（197
5）250:4007〜4021によって記載されている通りに２次
元電気泳動を実施したが、しかし第２次元におけるSDS-
PAGEは、上に記載されている通りであった。イムノアフ
ィニティ精製した組織培養液40μｌ（蒸発乾燥せしめ、
そして溶菌緩衝液に再溶解されている）又は40μｌの溶
菌緩衝液に溶解された細胞タンパク質（溶菌緩衝液2ml
中に溶解されている１コンフルエント100mmペトリディ
ッシュ）のいづれかを分析した。
タンパク質濃度を、色素結合分析（Bio-Radラボラトリ
イズ，リッチモンド，カリフォールニア）を用いて決定
した。
ウエスターン ブロット法 抗体によって同定される抗原を特徴づけるために、Towb
in,など。プロスィーディング オブ ザ ナショナル
アカデミィ オブ サイエンス アメリカ合衆国（Pr
oceeding of the National Academy of Science U.S.
A）（1979）76:4350〜4354によって記載されているよう
なウエスターン法の変法を用い、この場合タンパク質
は、SDS-PAGEゲルからニトロセルロースフィルターに移
されそしてMCAによって同定される。ニトロセルロース
フィルターに移した後、過剰のタンパク質結合性部位
を、３％BSAを含むPBS中にそのフィルターを浸すことに
よってブロックした。１％BSA及び１〜２×107cpmのヨ
ード化された抗体を含むPBS30ml中にそのシートを１時
間、インキュベートすることによって、抗原の位置を決
定した。次にそのフィルターをすすぎ、乾燥せしめそし
てオートラジオグラフ化せしめた。100pgほどの少量の
タンパク質を、この方法により検出することができる。
ラベルされているタンパク質の分析 ステロイドホルモンを除くためにDCCにより処理された
５％子牛血清中に10日間細胞を増殖せしめた。試験の前
２日間、細胞を、トリプシン処理しそして100mmペトリ
ディッシュにつき４×106細胞で平板培養した。24時間
後、エストラジオールを、この培地に添加し、0,1,10、
及び100nMのエストラジオール濃度を得た。この培地
を、24時間後交換した。ホルモン処理の48時間後、細胞
をハンクス液により２度洗浄した。正常なメチオニン濃
度の10％のほかに35S−メチオニン200μCi/mlを含む、
上記のようにホルモンが補充されている血清不含培地を
添加した。細胞及び培地を、６〜12時間の培養の後、収
得した。
イムノパーオキシダーゼ染色 用いられるイムノパーオキシダーゼ染色法は、Horan-Ha
ndなど。キャンサー リサーチ（Cancer Research）（1
983）43:728〜735によって記載されているように、Hsu
など。ジャーナル オブ ヒストケミストリィ アンド
サイトケミストリィ（Journal of Histochemistry an
d Cytochemistry）（1981）29:577〜580のアビジン−ビ
オチンイムノパーオキシダーゼ技法の変法であった。
イムノアフィニティ クロマトグラフィ セファロース 4B（Pharmcia Fine Chemicals,ピスキャ
ットウエイ，ニュージャジィ）を、Marchなど。アナラ
イティカル バイオケミストリィ（Analytical Biochem
istry）（1974）60:149〜152によって記載されているよ
うに臭化シアンより活性化した。４℃で一晩、40％硫酸
アンモニウム中での沈殿によって腹水から抗体を精製し
た。この沈殿物を溶解しそして0.2Mリン酸ナトリウム、
pH7.3に対して透析した。活性化されたセファロース
（濾過され、コンパクトケーキにされた）の１容積を抗
体溶液（2mgタンパク質/ml）の1.5容積に添加した。抗
体を、４℃で16時間、穏かに混合することによりカップ
リングせしめた。セファローズ を、再び濾過し、コン
パクトケーキにし、３容積の水により洗浄しそしてpH9
の1Mエタノールアミンの1.5容積に添加することにより
未反応部位をブロックした。この反応は、27℃で２時間
であった。次に、順にリン酸緩衝液（0.1Mリン酸ナトリ
ウム、pH7.3、1.0M塩化ナトリウム）、0.1M酢酸、及び
再びホスフェート緩衝液のおのおのにつき10容積により
順次セファロース を洗浄した。0.1％ナトリウムアジ
ドを含むリン酸緩衝液中に４℃でこの樹脂を貯蔵した。
アフィニティー樹脂を0.2〜1.0mlのカラム中に注ぎ、５
カラム容積の6Mグウアニジン−HclpH1.5によりストリッ
ピングし、そして使用の前に、少なくとも10容積のPBS
によりすすいだ。組織培養液を集めそして2mM EDTA及び
フェニル−メチル−スルフォニルフルオリドを添加し、
タンパク質分解を抑制した。20分間、5000Xgで遠心分離
により、次にグラスウール及び0.22ミクロンのフィルタ
ーを通しての濾過によって破片を取り除いた。サンプル
を、４℃で20〜30ml/時でアフィニティーカラムを通す
前に、セファロース 4Bの1mlカラムを通した。非特異
的に結合したタンパク質を、PBS中0.5M尿素10〜20mlに
より溶出した。４カラム容積の6Mグウアニジン−HclpH
1.5のにより抗原を溶出し、この溶出物を中和し、そし
て透析した。
抗体のヨード化 クロラミンＴ法〔McConahegなど。メソッド オブ エ
ンザイモロジイ（Methods of Enzymology）（1980）70:
210〜213〕により抗体を約２μCi/μｇの比活性にヨー
ド化した。１％BSAを含むPBS中、セファロース Ｇ−25
（1cm×30cmのカラム）上で分離し、そして使用するま
で−70℃で貯蔵した。
結果 1.モノクローナル抗体の製造及び特徴付け 生細胞RIAにおけるオートラジオグラフィー結合パター
ンはMCAの最初の選択の基礎であった。最初の融合から
の288ウエルのうち87が、MCF−細胞系に対する抗体を生
成するハイブリドコロニイを含んだ。これらのコロニイ
の22を、拡大しそしてさらに特徴付けるために選んだ。
９コロニイを限界希釈によってクローン化した。これら
から、UCD/AB 6.01及びUCD/AB 6.11と命名された２つの
抗体を、さらに特徴付けるために選択した。
MCF−７に対するUCD/AB 6.11の特異性を、ウエスターン
法によって証明した。UCD/AB 6.11は、MCF−７抽出物中
の２つのSDS-PAGEバンドに結合したが、しかし、HBL-10
0、NWT-186 HWT抽出物又はHMFGMにはなんら結合性をも
示さなかった。比較するとUCD/AB 6.13と命名されたも
う一つのクローンは、HMFGMを除く３つのすべての細胞
系に結合性を示した。
アビジン−ビオチン イムノパーオキシダーゼ技法を用
いてのパラフィン切片における細胞抗原の検出を実施例
し、MCAがヒト乳房抗原に結合しそしてMCF−７の組織培
養人工物とは結合しないということを確かめた。
正常の、形成異常の及び悪性の乳房組織において、UCD/
AB 6.11によって同定される抗原の分布状態を、ホルマ
リン及びＢ−５で固定された組織を用いて決定した。Ｂ
−５固定化は、いっそうすぐれた細胞学的な詳細を提供
した。
アビジン−ビオチン イムノパーオキシダーゼ染色を用
いて、UCD/AB 6.11は、正常な筋上皮、支質、又は管腔
分泌生成物とではなく、正常な前泌乳性上皮細胞に結合
することが見出された。UCD/AB 6.11によって検出され
る抗原は、まず第１に核上顆粒に位置決定されたこの抗
原は、乳球間に斑点状分布を有し、その結果陽性的に染
色する乳球が、しばしば陰性的に染色する乳球に隣接し
ているのを見出された。多くの場合、個々の乳球内の隣
接する細胞は、選択的に陽性及び陰性であった。
イムノパーオキシダーゼにより染色された乳癌細胞のパ
ラフィン切片90％（18/20）は、UCD/AB 6.11のためには
陽性であった。特定の組織切片における悪性細胞のほと
んどは染色した。顆粒及び表面染色も観察されたけれど
も、この染色パターは、一般的に拡散的であり且つ細胞
質的であった。染色は、隣接する正常細胞においてより
も腫瘍細胞においてひじょうに濃かった。染色は、また
第１次乳房腫瘍癌においてよりも転移性腫瘍細胞におい
てより濃かった。これらの結果は、転移性乳癌細胞にお
いて、抗原の生成が増大しているということを示す。
いくらかの、しかしすべてではない乳房形成異常（線維
嚢胞疾患）がUCD/AB 6.11により染色された。MCF−７組
織培養培地からの6.11抗体によるイムノクロマトグラフ
ィによって単離された抗原による免疫化から得られる第
２世代のモノクローナル抗体を、シリーズ10と命名し
た。さらに特徴付けそして試験するために選択された特
定の抗体は、UCD/PR 10.02、UCD/PR 10.11、及びUCD/PR
10.12であった。UCD/PRは、タイプ18サイトケラチンと
反応するが、しかしUCD/AB 6.11（6.11抗原）によって
認識される抗原へのUCD/AB 6.11又はUCD/PR 10.11の結
合を抑制しないネズミIgMである。UCD/PR 10.11は、6.1
1抗原及びタイプ８サイトケラチン並びにより低い程度
では、タイプ８サイトケラチンと反応するネズミIgGで
ある。UCD/PR 10.12は、6.11抗原と反応するネズミIgM
である。
186-NWT細胞からの6.11抗体によるイムノクロマトグラ
フィによって単離された抗原による免疫化から得られる
第２世代のモノクローナル抗体を、シリーズ７と命名す
る。UCD/PR 7.01と命名された１つの特定の抗体は、筋
上皮細胞に対して特異的であるということが見出され
た。
2.細胞表面抗原 免疫沈殿法及びこれに続くラクトパーオキシダーゼによ
る生細胞の細胞表面タンパク質のヨード化を用いて、UC
D/AB 6.11によって同定される抗原の細胞表面位置をさ
らに特徴づけた。このデータは、細胞がエストラジオー
ルにより又はエストラジンによらないで増殖される時、
抗原が細胞表面上に位置するということを示した。
3.異なるケラチン−関連タンパク質との抗原の反応性 細胞内ケラチン−関連タンパク質の３つの型（タイプ8,
18及び19に関する）が、MCF−７乳癌細胞系中に同定さ
れた。これらのタンパク質は、約52,46、及び46kdの分
子量及びそれぞれ6.1〜6.0、5.8〜5.3、及び5.2〜5.0の
範囲内に等電点を有することが推定された。観察される
多重等電点形は、多種のケラチンの種々のリン酸化に少
なくとも部分的に基くと信じられている。抗−ケラチン
モノクローナル抗体を用いるイムノブロットは、おのお
ののタンパク質型に対するおのおのの抗体の異なる結合
パターンをもたらす。たとえば、35βH11抗体は、すべ
ての３つのMCF−７細胞ケラチン−関連のタンパク質を
認識し、一方AE1、UCD/AB 6.01、UCD/AB 6.11及びUCD/P
R 10.11のおのおのは、種々のタンパク質型を区別し
た。第１表を参照のこと。
4.6.11及び10.11によって認識されるエピトープの組織
分布 モノクローナル抗体UCD/AB 6.11及びUCD/PR 10.11によ
って認識されるエピトープの組織分布を決定し、そして
免疫診断におけるこれらの抗体の実用性を評価するため
に、多数のホルマリン又はＢ−５固定のパラフィン組織
切片を、アビジン−ビオチン イムノパーオキシダーゼ
法によってスクリーニングした。結果は、下の第２表に
示されている。組織学的に正常な組織において、両抗体
は、乳腺、汗腺及び唾液腺、胃及び腸粘膜、及び腎臓の
遠位尿細管を含む単純上皮を染色した。両抗体は、神経
及び血液要素との反応には機能しないが、しかしUCD/AB
6.11（しかしUCD/PR 10.11ではない）は、しばしば平
滑筋の成分と弱く反応した。
5.生細胞上のエピトープ分布状態 生きている、無傷のMCF−７細胞に間接的イミノフルオ
レセンスを実施することによって細胞表面エピトープに
結合する細胞表面を可視化した。UCD/AB 6.01及びUCD/A
B 6.11が、細胞と細胞の接解の濃縮領域に伴って、全細
胞表面に分散された斑文状の抗原を同定した。細胞表面
エピトープは軽いトリプシン処理によって容易に取り除
かれ、パッチ形成又はキャップ形成の形跡を示さず、そ
して細胞が血清−含有又は血清−不含培地のいづれかで
増殖する場合、存在した。しかしながら、UCD/PR 10.1
1、35βH11及びAE1によって認識されたエピトープは、
類似の間接的イムノフルオレセンス実験では検出され得
なかった。
6.分泌された6.11抗原の特徴付け ケラチンに関係する抗原は、また腫瘍性乳房組織培養培
地において可溶性タンパク質として見出され得る。MCF
−７、T47D、及びSK-BR3ヒト乳房細胞系からの培養液
は、それぞれケラチンのような免疫活性を含んでいるこ
とが見出されている。試験された５つのモノクローナル
抗体のうち４つが、MCF−７培養上清液からの抗原に結
合し（第３表）、そしてこの抗原は40〜46キロドルトン
の分子量範囲及び5.0〜5.2の等電点を有する。追加実験
は、MCF−７組織培養抗原が3.6Sの沈降係数及び1.25g/c
m3の浮力密度を持つということを示した。
第３表 抗体 MCF−７抗原6.11による反応性 UCD/AB 6.01 − UCD/AB 6.11 ＋ UCD/PR 10.11 ＋ AE1 ＋ 35βH11 ＋ 従って、このMCF−７細胞外抗原は、細胞内サイトケラ
チンに関係しているようである。まず、非乳房ケラチン
（たとえば35βH11及びAE1）に対して生じた抗体は、そ
の抗原を認識する。第２に、ハイブリドーマが免疫アフ
ィニティにより生成されたMCF−７組織液抗原により免
疫化されたマウスから生産される場合、この得られる抗
体（たとえば、UCD/PR 10.11）は、非乳房ケラチンと広
く反応する。第３に、精製されたMCF−７抗原のアミノ
酸組成物は、他のケラチンに見つけられるアミノ酸組成
物、特にグリシン及びグルタミン酸−グルタミン残基が
タンパク質の総アミノ酸の25％〜30％を含んで成るとい
うことに密接に近い。
第４表を参照のこと。
7.細胞外サイトケラチンのための血清検定 UCD/AB 6.11をラジオイムノアッセイに使用し、正常な
血清及び乳癌に羅患している患者からの血清を両者中細
胞外サイトケラチンの存在を検定した。この検定は、マ
イルなど。（1973）〔医学におけるラジオイムノアッセ
イ及びそれに関する方法（“Radioimmunoassays and Re
lated Procedures in Medicine"）、インターナショナ
ル アトミック エナージイ エジェンスィ，ビエナ，
オーストリア，ページ149〜164、第１巻〕によって記載
されている２−部位イムノラジオメトリックアッセイ
（IRMA）の変法であった。精製されたモノクローナル抗
体UCD/AB 6.11を、プラスチック マイクロタイター
プレート ウエル上に吸着せしめた。吸着の後、サンプ
ル血清を、おのおののウエル中に置いた。細胞外サイト
ケラチンが、血清サンプル中に存在する場合、固相に結
合したUCD/AB 6.11は、サイトケラチンを捕捉するため
に反応した。次に、サイトケラチン上の異なるエピトー
プのために特異な過剰に精製したウサギIgG抗体を、ミ
イクロタイターウエル〔ここで、結合しているサイトケ
ラチン（もしあるなら）と反応する〕に導入した。次に
125Iによりラジオラベルしたタンパク質の過剰の量を、
ウエル〔ここで、ウサギIgGと反応する〕に導入した。
未結合のラベルされたタンパク質Ａを除くために洗浄し
た後、おのおののウエルの放射能の量を決定した。従っ
て、細胞外サイトケラチンの量は、結合している放射能
の量に直接的に比例した。サイトケラチンの絶対量を、
あらかじめ用意した標準曲線から決定した。
正常な血清を、細胞外サイトケラチンの存在について検
定する場合、得られた値は、140〜3260CPMに対応して0.
02μg/ml〜0.82μg/mlに分布した。乳癌患者についての
この値は、340〜10,800CPMに対応して0.05μg/ml〜33.4
μg/mlであった。任意のカット−オフとして1000CPMを
選択する場合、14の正常な血清サンプルのうち２（14
％）つが、陽性であった。乳癌患者については、83のサ
ンプルのうち30（36％）が陽性であった。従って、血清
中の細胞外サイトケラチンの存在は、上皮腫瘍、たとえ
ば乳癌に羅患している患者中には有意に高められる。
この発明に従えば、正確且つ敏感な検定が、生物学的サ
ンプルにおける特定の42〜48kdの細胞タンパク質及び関
連する40〜46kdの血清タンパク質の存在を検出するため
に提供される。この方法は特に、エストロゲン療法に敏
感であるこれらの乳房腫瘍を同定することのために有用
である。この方法は、また、乳房から転移したエストロ
ゲン−感受性の乳房腫瘍を同定することのために、そし
てそのような腫瘍についての患者の血清をスクリーニン
グすることのために有用である。
前述の発明は、明確に理解するために、例示的及び例的
な方法によって、いくらか詳細に記載しているけれど
も、ある変更及び修飾を、付属の請求の範囲内で実施す
ることができる。
この発明は、デパートメント オブ ヘルス アンド
ヒューマン サービス（Department of Health and Hum
an Services）によって与えられた許可番号No.l cp 010
08下で、政府支援により行なわれた。政府は、この発明
に確かな権利を持つ。
ハイブリドマ細胞系UCD/AB 6.11は、1983年12月８日に
アメリカン タイプ カルチャー コレクション（Amer
ican Type Culture Collection）に寄託されそして受入
番号 HB 8458を付与された。ハイブリドマ細胞系UCD/A
B 6.01及びUCD/PR 10.11は、1985年１月３日にアメリカ
ン タイプ カルチャー コレクションに寄託されそし
て受入番号HB 8693及びHB 8694をそれぞれ付与された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アラン シー．ブラボン アメリカ合衆国，メリーランド 20331, アンドリュース エア フォース ベイ ス，マルコルム グロウ ユーエスエーエ フ メディカル センター（番地なし)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】腫瘍性上皮細胞によって分泌され、そして
    抗体UCD/AB 6.11又はUCD/PR 10.11と反応する細胞外可
    溶性サイトケラチンであって、分子量40〜46kd及び下記
    アミノ酸組成：Asp(+Asn)10.3%;Thr 5.47%;Ser 10.94%;
    Glu(+Gln)14.7%;Gly 11.76%;Ala 8.8%;Val 6.05%;Ile
    4.39%;Leu 9.37%;Tyr 2.66%;Phe 2.67%;His 1.67%;Lys
    6.43%;Arg 5.32%;Pro 3.45%;Met 1.2%;Trp（検出されな
    かった）;Cys（検出されなかった）を有し、そして実質
    的に他の血清成分を含まないサイトケラチン。
  2. 【請求項２】ブロックされているＮ−末端を持つ特許請
    求の範囲第１項に記載の細胞外可溶性サイトケラチン。
  3. 【請求項３】腫瘍性乳房上皮細胞によって分泌される特
    許請求の範囲第１項記載の細胞外可溶性サイトケラチ
    ン。
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