ES2394972B2 - Péptido antigénico aislado derivado de la proteína s100-beta, procedimiento de identificación y su uso en la prevención, tratamiento, diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes tipo i. - Google Patents

Abstract

Péptido antigénico aislado derivado de la proteína S100-beta, procedimiento de identificación y su uso en la prevención, tratamiento, diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes tipo I.#La presente invención se refiere a un péptido antigénico aislado derivado de la proteína S100-beta, donde dicho péptido se encuentra unido a una molécula MHC de clase II. La presente invención también se refiere a un procedimiento para la obtención de dicho péptido antigénico, así como la utilización de dicho péptido antigénico en la fabricación de un medicamento para la prevención, seguimiento, diagnóstico y/o tratamiento de la diabetes tipo I. Adicionalmente, la presente invención también se refiere al uso de un péptido antigénico aislado derivado de la proteína S100-beta, pero sin estar unido a una MHC de clase II, para la fabricación de un medicamento para la prevención, tratamiento, diagnóstico o seguimiento de la diabetes tipo I.

Description

Péptido antigénico aislado derivado de la proteína S I OO-beta, procedimiento de identificación y su uso en la prevención, tratamiento, diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes tipo 1. 5

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un peptido antigénico deri vado de la proteína SI OO-beta, así como al procedimiento para su identificación y a su utilización lOen la prevención, tratamiento, diagnóstico O seguimiento de la diabetes tipo l.

Estado de la técnica

La diabetes tipo J (T 1 O) humana es una enfermedad autoinmunc caracterizada

15 clínicamente por la falta de regulación de los niveles de glucosa y que a medio-largo plazo provoca complicaciones ncurológicas y vasculares. La TI O es una de las enfermedades autoinmunes más frecuentes entre la población caucásica. Tan sólo en España, se diagnostican cada año entre 10-20 nuevos casos cada 100.000 niños menores de 14 años, prevalencia que va en aumento, de lo que se deduce que l de cada

20 1.000 niños en esa edad es diabético, de modo que hay unos 10.000 niños diabéticos en nuestro país. La TlD se caracteriza por una deficiencia de insulina, haciendo que los pacientes dependan de inyecciones diarias de insulina exógena para su supervivencia. Antes de la aparición de síntomas clínicos como la hiperglicemia, existe un periodo

25 prcclínico asintomático donde las células productoras de insulina son destruidas de forma progresiva. La destrucción de estas células productoras de insulina, las células beta presentes en los llamados islotes de Langerhans pancreáticos, está asociada a la infiltración de dichos islotes por linfocitos y otras células del sistema inmunológico del paciente. Estas células responden contra proteínas propias expresadas por las células

30 beta, como por ejemplo la propia insulina o su precursor la pre-proinsulina. Los islotes de Langerhans, donde se encuentran las células productoras de insulina, forman una estructura diferenciada dentro del tejido pancreático y se encuentran rodeados por una capa de células de tipo nervioso llamadas células periféricas de Schwann (pSC) ("peri islet Schwann cells") cuyas funciones no están

35 claras pero que sí expresan un conjunto de proteínas O antígenos que las diferencia

claramente de las células que componen los islotes pancrcaticos, entre ellas las células

beta. En el modelo murino de la TI O humana, el ratón NOO ("Non-Obese Diabetic

mice"), que desarroll a un sí ndrome metabólico que comparte mucha.'\ característica..

con la TID humana como son la hipcrgliccmia y la deficiencia de insul ina, estas

5

células pSC son destruidas por linfocitos del sistema inmune del animaL Algunos de

estos linfocitos responden contra antígenos expresados de fonna exclusiva en estas

células pSC como son la proteína fibrilar ácida de la glí a (GFAP) o el factor

neurotrópico S lOO-beta. En pacientes humanos con TI O se ha demostrado la presencia

de autoanticucrpos dirigidos contra GFAP Y SI OO-beta así como linfocitos

lO

autoreactivos específicos para estas dos proteínas, lo que indica que en esos pacientes

las células pSC de los islotes han sido también destruidas por el sistema inmunológico.

En el ratón NOO también sc ha demostrado quc la infiltración linfocitaria de los islotes

comienza con la denominada infiltración periférica de los islotes ("peri-islet

inflltration") durante la cual se produce la destrucción del manto de células pSC que

15

rodea los islotes propiamente dichos. A continuación y una vez que este manto ha sido

destruido, los linfocitos pueden acceder a los islotes, donde destruyen de fonna

selectiva las células beta productoras de insulina.

El hecho de que las células pSC parecen ser el objetivo inicial de la respuesta

auto inmune contra los islotes pancreáticos y que su ralentización, regulación y/o

20

detención absoluta permitiría mantener intactos los islotes pancreáticos, unido al dato

de que hoy en día no existe ninguna terapia que permita tratar la liD humana, señalan

La importancia de descubrir nuevos métodos y/o moléculas que permitan tratar la

enfermedad en momentos que permitan conservar el mayor número de islotes intactos

y durante el mayor tiempo posible.

25

Existe una gran experiencia previa que demuestra que los linfocitos C04+

están implicados en el desarrollo de la liD. Anál isis histológicos de islotes obtenidos

de individuos afectados muestran infiltraciones por parte de li nfocitos C04+. En

modelos animales de la TI O la enfermedad puede ser transferida a un animal sano

usando li nfocitos C04+ de un animal enfermo. Además, existe una asociación genética

30

entre el desarrollo de la T I O y ciertas moléculas del sistema mayor de

histocompatibilidad (MI-IC) de clase n, críticas para que los linfocitos C04+ puedan

desarroll arse y ser estimulados contra su objetivo. Finalmente, es posible detectar la

presencia de linfocitos C04+ activados en sangre periférica de individuos que han

desarroll ado la enfermedad.

Existe un creciente interés por definir los segmentos de las proteínas, denominados epítopos peptídicos, reconocidos por los linfocitos CD4+ implicados en la respuesta autoinmunc contra las célula." pSc. La identificación de estos critopos es importante para comprender los mecanismos que desencadenan la enfermedad, para el

5 desarrollo de ensayos de laboratorio que permitan seguir el daño a los islotes y para diseñar terapias que permitan ralentizar o detener la enfermedad.

Los epítopos peptídicos derivados de antígenos cxógenos son presentados a Linfocitos T CD4+ después de una serie de eventos moleculares denominados en su conjunto como procesamiento y presentación naturaL Para ello, los antígenos o

10 proteínas exógenas son captados por células dcl sistema inmune denominadas células presentadoras de antígeno (APC). Una vez internalizado, cl antígeno correspondiente es fragmentado mediante la combinación de diversos procesos químicos yenzimáticos, generando péptidos que se unen a moléculas MI-IC de clase n que son exportadas a la superficie de la célula presentadora de antígeno. El procesamiento y presentación

15 natural de antígenos exógcnos da lugar a grupos solapantcs de péptidos (Figum 1) que se unen a la molécula MHC de clase U mediante cl mismo "motivo de unión" pero que poseen diferentes extremos amino y carboxilo. Los aminoácidos de ambos extremos, aunque no forman parte del motivo de unión a la molécula de histoeompatibilidad, pueden tener importantes efectos tanto sobre la afinidad de unión a la molécula de

20 histocompatibilidad como en la activación de clones de linfocitos T CD4+. En modelos animales como el ratón NOD, se ha demostrado que las APe captan proteínas del páncreas y las llevan a nódulos linfáticos que drenan este órgano para estimular allí linfocitos autoreactivos que reconocen péptidos derivados de estas proteínas y unidos a moléculas MHC específicas. Una vez estimulados, estos linfocitos

25 autoreactivos se dirigen al páncreas, donde proceden a eliminar aquellas células que expresen el antígeno del cual ha derivado ese epítopo peptídico. Aunque se sabe que la proteína SI OO-beta es un objetivo del proceso auto inmune en la TI D humana a partir de estudios que demuestran la presencia de autoanticuerpos y linfocitos autoreactivos contra la proteína completa en pacientes diabéticos, por el momento no existen datos

30 acerca de los epítopos peptídicos generados a partir de esta proteína y que sean reconocidos por linfocitos CD4+ en pacientes con TI D. Los epítopos peptídieos generados in vivo por una APe a partir de una proteína cxógena y capaces de estimular a un linfocito CD4+ consisten, por tanto, en varios péptidos de una longitud variable pero que comparten una zona común. Esta zona

35 común O secuencia aminoaeídica común contiene los aminoácidos que dctenninan el Llamado "motivo de unión" a la molécula MHC concreta, o lo que es lo mismo, los aminoácidos QllC penniten anclar dicho péptido a la molécula MHC. Este conjunto de pértidos derivados de una zona concreta de la proteína y que comparten una zona común fonnan un conjunto de péptidos solapantcs (Figurd 1), a partir del cual se

5 podría sintetizar un epítopo pcptídico consenso que incluya esa zona común y que incluya aminoácidos de los extremos de alguno o todos los epítopos peptídícos generados a partir de esa zona de la proteína.

Distintos métodos han sido empleados para intentar identificar epitopos pcptídicos presentados por moléculas MHC de clase n y reconocidos por linfocitos T 10 CD4+. Las siguientes aproximaciones experimentales se encuentran entre las

empleadas habitualmente:

1.

Predicción "in silico". Las moléculas MHC de clase n se tienden a unir a péptidos que prcscntan dcterminados aminoácidos cn posiciones concretas de 15 la secuencia lineal, los denominados "motivos de unión" citados anterionnente. Existen aplicaciones informáticas disponibles que permiten buscar en una proteína segmentos de la secuencia lineal de aminoácidos que posean ese "motivo de unión" y que tengan, por tanto, posibilidades tcóricas dc ser presentados a linfocitos T CD4+. Sin embargo, esta aproximación presenta una 20 serie de inconvenientes a la hora de identificar epítopos peptídicos unidos a moléculas MHC de clase n. En primer lugar, no proporciona ninguna información acerca de si dicho péptido va a ser realmente generado in vivo en una APC. En segundo lugar, a partir de una proteína se pueden generar muchos péptidos que tengan posibilidades de unión a una molécula MHC de clase 11,

25 generando muchos falsos positivos. En tercer lugar, la longitud de dichos epítopos peptídieos es variable, de fonna que aunque se identifique un "motivo de unión", no se conoce la longitud del péptido generado in vivo en una APC.

2.

Generación dc linfocitos T CD4+. Esta aproximación supone el clonaje de linfocitos T CD4+ que respondan contra la proteína y mediante el empleo de 30 péptidos sintéticos solapantes entre sí, tratar de identificar cuál cs el/los epítopo(s) contra el cual reacciona. Esta técnica presenta también detenninados inconvenientes, entre los que se pueden citar: a) los péptidos sintetizados in vitro de nuevo no tienen por qué coincidir con el epítopo generado in vivo, y b) es una técnica que ha demostrado tener éxito en aquellas situaciones donde

35 existe un número elevado de linfocitos T CD4+ específicos para dicho

antígeno, como puede ser el caso de una infección viral aguda, pero es mucho más dificil a nivel metodológico en autoinmunidad o en cáncer, donde el número de linfocitos T CD4+ específicos para un cpítopo concreto es muchísimo más bajo.

3.

Procesamiento de la proteína in vi/ro. Se conocen toda una serie de enzimas (protcasas) capaces de digerir proteínas y generar péptidos capaces de unirse a moléculas MHC de clase 11. Sin embargo, el número de estas enzimas que interviene en este proceso o su orden de intervención in vivo en una APe sobre un antígeno o proteína concreta no se conocen con exactitud y hace que sea muy dificil reproducir este proceso in viu'o.

4.

Síntesis de péptidús solapantcs. Olra aproximación experimental habitual a la hora de tratar de identificar péptidos capaces de estimular linfocitos T CD4+ consiste en la síntesis de una librería de péptidos solapantes (Figura 2) en la cual los péptidos poseen una longitud concreta, solapan entre sí y cubren toda la longitud de la proteína. Una vez sintetizados, estos péptidos se emplean como antígenos para estimular linfocitos T CD4+. Esta aproximación, sin embargo, no identifica los epílOpos peptídicos procesados y presentados de forma natural, ya que no determina cuáles son los extremos reales de los péptidos generados en la célula y que pueden influir de fonna significativa en el reconocimiento del epítopo por parte de linfocitos T CD4+. Además, la respuesta de linfocitos T C04+ contra alguno de estos péptidos solapan tes no garantiza que dicho linfocito T C04+ reconozca al epítopo natural generado por una APe in vivo.

Por tanto, no existe hasta la fecha ningún estudio científico en humanos que haya identificado péptidos antigénicos derivados de SI OO-beta, generados in vivo por una célula y que se encuentren unidos posteriormente a una molécula MHC de clase Il como la molécula DRB 1'040 I (DR4).

Los linfocitos humanos no responden contra la proleína complela sino contra segmentos (péptidos o cpítopos peptídicos) generados a partir de ella; sin embargo, la detenninación de dichos segmentos no es obvia, ni puede determinarse de la simple lectura de la secuencia de aminoácidos de la proteína o de la generación de librerías de fragmentos arbitrarios de la proteína.

La publicación de Wi ner S. et al. (Nature Medicine, VoL 9(2): 198-205 (2003» sugiere el tratamiento con SI OO-beta para diabetes, pero emplea la proteína completa y no cpítopos pcptídicos concretos. Sin embargo, tal y como se ha mencionado en el párrafo anterior, los linfocitos de un paciente diabético no responden contra la proteína completa sino contra péptidos O cpítopos peptídicos que deben ser generados a partir de ella Y. de nuevo, la determinación de dichos segmentos no es

5 trivial ni puede determinarse de la simple lectura de la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Los péptidos derivados de SI OO-beta descritos hasta la fecha se basan en meras fragmentaciones de la proteína en segmentos de una longitud arbitraria y la determinación de la presencia de anticuerpos contra dichos fragmentos. La solicitud de

10 patente W09801471, por ejemplo, describe epítopes que se utilizan para generar anticuerpos monoclonales en ratones, de modo que estos anticuerpos permitan posteriormente determinar la presencia del polipéptido SI OO-beta humano en suero de pacientes con rnelanoma. Para ello, en este documento se sintetizan péptidos de SI 00beta, decidiendo de forma arbitraria la longitud de los mismos con la intención de

15 identificar aquellos más útiles para determinar la presencia del polipéptido SI OO-beta humano en una muestra, pero no aquellos capaces de generar una respuesta inmune in vivo. Tal y como se expuso anteriormente, es imposible predecir estudiando únicamente la secuencia de aminoácidos de una proteína cuál o cuáles van a ser los epítopos peptídicos capaces de generar una respuesta inmune in vivo, esto es, que sean

20 generados por una célula presentadora de antígeno, se unan a una molécula MHC de clase 11 y sean presentados en la superficie de dicha célula para que el conjunto molécula MHC-péptido desempeñe su función (por ejemplo, activar la respuesta inmunológica contra dicha proteína o generar una respuesta moduladora que reduzca o elimine dicha respuesta inmune contra la proteína). Esta imposibilidad deriva, en parte,

25 de que las moléculas MHC de clase Il presentan una hendidura en la que encajan segmentos más o menos grandes de una proteína (por ejemplo, SI OO-beta), segmento que luego es "limado O recortado" por ambos extremos por enzimas proteolíticas presentes en el interior celular. Sin embargo, el número, orden de actuación sobre el péptido (si es que dicho orden existe) y si sobre cada proteí na particular actúa un grupo

30 concreto y específico de estas enzimas, no se conoce con exactitud a día de hoy. Por esta razón, una célula presentadora de antígeno no genera un solo epítopo peptídieo (péptido, subfragmcnto) de una región de una proteína sino que genera varios cpítopos de la misma región que pueden agruparse en "grupos solapantes", mencionados anteriormente (Figura 1). Los epítopos peptídicos de un "grupo solapante" comparten

35 un mismo "núcleo común", que interacciona directamente con la hendidura de la

molécula de histocompatibilidad correspondiente, y unos extremos variables,

imposibles de predecir y que son generados, como se ha mencionado, por la acción de

una o varias protca"as en el interior celular. En la solicitud de patente W09RO 1471, se

fabrica una librería de péptidos segmentando S I DO-beta en fragmentos arbitrarios de

5

3 1 aminoácidos, proporciomindosc dos fragmentos obtenidos a partir de dicha librería

(SEQ. 10 . NO. 4 Y 6 en W0980147 1; ver Figura 18 para homología con las secuencias

de la presente invención), en base a las cuales se proponen subfragmentos (SEQ. ID.

NO. 5 en W0980 1471) o fragmentos mayores abarcando a esas secuencias (SEQ. ID.

NO. 2 Y 3 en W0980 1471; ver Figura 18 para homología con las secuencias de la

lO

presente invención), de forma totalmente arbitraria, pero sin determinar su

inmunogenicidad. Por tan to, W0980 147 1 proporciona fragmenLos arbi trarios de S I 00

beta que sirven para determinar la presencia de anticuerpos contra esta proteína en una

muestra de pacientes con mclanoma, pero ni determina qué partes de la proteína son

las que realmente intervienen en la respuesta inmune en un sujeto, ni proporciona

15

información acerca de la implicación de dichos péptidos en la respuesta inmune ante la

TID, por lo que es necesario identificar aquellos péptidos derivados de SIOO-beta que

desencadenan dicha respuesta, de modo que sea posible desarrollar sistemas de

diagnóstico y tratamiento de la TI D mucho más sensibles y precisos.

El documento Tsui H. el al. (Diabetes, VoL 57: 918-928 (2008)) identifica

20

epítopos de GFAP y real iza un tratamiento de inmunoterapia que inhibe

significativamente la diabetes tipo 1, remarcando la importancia de la identificación de

los epítopos en el desarrollo de tetrámeros . Los tetrámeros hechos in virro empleando

una molécula de histoeompatibilidad y un péptido no son equivalentes unos con otros

porque sirven para detectar grupos de células inmunes que pueden tener papeles

25

completamente diferentes dentro de una misma patología, de fonna que aunque

existiesen tetrámeros hechos con una molécula de histocompatibil idad determinada y

péptidos derivados de GFAP, tetrámeros fabricados empleando péptidos derivados de

S IOO-beta detectarían li nfocitos con funciones completamente diferentes a los

linfocitos que detectarían los tetrámeros fabri cados con péptidos derivados de GFAP

30

(Figura 3). En este documento, sc predicen epítopos peptídicos de GF AP mediante el

uso de un algoritmo, obteniendo distintos epítopos (posiciones aminoacídicas 79-87 y

253-261 en GFAP), que son luego empicados para inmunizar ratones. De ellos, tan

sólo uno de los cpítopos peptidieos (79-87) pero no el otro (253-26 1) produce una

inhibición de la diabetes tipo 1, a pesar de que ambos han sido generados de la misma

35

forma. Por tanto, a pesar de que describe el uso de uno de los mú ltiples algoritmos

empicados en la predicción de epitopos pcptídicos, éste no proporciona epítopos útiles

para generar una respuesta inmune ya que algunos de los epítopos pred ichos no

funcionan. Este documento también menciona que no existen algoritmos para predecir

epitopos unidos a una de las moléculas M He de clase U que posee el modelo animal

5

empicado en los experimentos descritos, lo que supone un problema en la

identifi cación de epitopos peptídicos empicando este método. Además, aunque se

predicen epítopos peptídicos para ambas clases de MHC (de clase Il mediante librerías

y de clase I mediante algoritmos), sólo se presentan resultados positivos in vivo al

inmunizar ratones con cpítopos pcptídicos unidos a moléculas MHC de clase 1, pero no

lO

con aquel los unidos a moléculas MHC de clase 11, lo que pone de manifiesto la

dificultad que implica la predicción u obtención dc epítopos peptídicos específicos

presentados por moléculas MHC de clase n.

Por último, la solicitud de patente US 2003/0054414 A I también utiliza para el

diagnóstico y el tratamiento de diabetes tipo 1 la proteína GFAP, pero tampoco

15

identifica epítopos peptídicos específi cos derivados de la proteína S IOO-beta que sean

presentados a linfocitos CD4+ y que generen una respuesta inmune por parte de dichos

Li nfocitos.

Por tanto, se necesita identifi car aquellos epítopos peptídicos específicos de la

proteína SIOO-beta que realmente intervengan en la respuesta inmune in vivo que tiene

20

lugar en la diabetes tipo ] y que sean potencialmente útiles en la prevención,

diagnóstico, seguimiento y tratamiento de esta patología.

Descripción resumida de la invención

25

Los presentes inventores han identificado específicamente los péptidos

antigénicos (también denominados en la presente invención como epítopos peptídicos)

generados in vivo después de que SI OO-beta sea procesada por una célula presentadora

de antígeno (APC) y que están prescntes en la supcrficie de dichas APe unidos a una

molécula MHC de clase IJ ,.aislándose los péptidos que realmente intervienen en la

30

respuesta inmune in vivo. Por tanto, la presente invención proporciona los fragmentos

específicos de la proteína S I DO-beta que son generados durante una respuesta inmune

y que son capaces de activar a li nfocitos, identificando por tanto qué epítopos

peptídicos específi cos son los que pueden emplearse para la prevención, el tratamiento,

el diagnóstico y el seguimiento de la diabetes tipo 1.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para la obtención de dicho péptido antigénico.

La presente invención también se refiere a la utilización de dicho péptido antigénico en sistemas de diagnóstico de la diabetes tipo 1 y en la fabricación de un 5 medicamento para la prevención, seguimiento, diagnóstico y/o tratamiento de la

diabetes tipo 1.

Adicionalmente, los presentes inventores también han observado que cuando el péptido antigénico de la presente invención no se encuentra unido a la MHC de clase n, dicho péptido es útil en la fabricación de un medicamento para la prevención,

10 seguimiento, diagnóstico y/o tratamiento de la diabetes tipo 1.

Breve descripción de las figuras

Figura l. Grupos solapantes de péptidos resultantes del procesamiento

15 intracelular de antígenos exógenos. Las moléculas de histocompatibilidad de clase IJ presentan en la superficie celular péptidos derivados de una misma región del antígeno, que poseen en común un grupo de aminoácidos que interaccionan directamente con aminoácidos de la molécula de histoeompatibilidad ("motivo de unión") (aminoácidos dentro del recuadro) pero que poseen distintos extremos amino

20 y/o carboxi-terminaL

Figura 2. Librerías de péptidos solapantes. Consisten en [a síntesis de péptidos de una longitud determinada e idéntica para todos, los cuales solapan entre sí en un número concreto de aminoácidos y que cubren la longitud completa del antígeno. Se

25 muestra en la figura una librería compuesta por cuatro péptidos de 15 aminoácidos de Longitud solapantes entre sí en 12 aminoácidos y que cubren toda la secuencia de aminoácidos de la proteína (secuencia superior).

Figura 3. Tetrámeros MHC hechos con péptidos diferentes son reconocidos por

30 linfocitos T diferentes. Un tetrámero MHC hecho con una molécula MHC concreta (.1) pero conteniendo péptidos diferentes (2, cuadrados o círculos) son reactivos que detectan de fonna específica linfocitos T diferentes (3), los cuales pueden tener funciones opuestas en una patología. Además, los tetrámeros MHC pueden llevar acoplados otros componentes como nanopartículas magnéticas, para la detección de

35 Li nfocitos in vivo, o toxinas para la eliminación específica de aquellos linfocitos autorcactivos que reconozcan el complejo MHC-péptido, como aquellos que reconozcan tetrámeros conteniendo péptidos derivados de S I aO-beta. Además, estos tetrámeros MHC pueden ser conjugados a otms moléculas o compuestos para generar nuevos reactivos de diagnóstico (por ejemplo, unidos a nanopartículas magnéticas) O

5 de tratamiento de la cnfcnncdad (por ejemplo, unidos a citacinas O toxinas).

Figura 4. Esquema general de la metodología ELISPOT. En este análisis, placas de culti vo celular son recubiertas con un anticuerpo específico para la citocina que se quiere detectar (1). Una vez que los linfocitos T han sido activados empleando

10 el antígeno correspondiente, se añaden a la placa recubierta de anticuerpo anti-citocina de fonna que en aquellos lugares donde exista un linfocito T específico y estimulado por el antígeno quedará capturada la citocina que se quiere detectar (2, célula oscura). Eliminadas las células, se añade un segundo anticuerpo de detección acoplado a una enzima de forma que al añadir un sustrato se genera un color en el lugar donde se

15 encontraba la célula específica de antígeno y productora de la citocina que se quiere detectar (3). La presencia de dicha célula se ve como una mancha ("spot") en la placa (4), de forma que cada spot representa una célula específica para el antígeno empleado en la cstimulaeión.

20 Figura 5. Sistema empleado en la intemalización de SI OO-beta en células Priess. La línea Iinfobla..:;toide Priess (1) fue incubada de forma secuencial con una lectina obtenida de Phylolacca americana (2) biotinilada in vitro (biotina = círculos negros), con avidina (3) y finalmente con S lOO-beta purificada y biotinilada in vill'o

(4) (biotina = círculos negros). Una vez finalizada la incubación con S lOO-beta, las

25 células se incubaron a 37°C para que pudiesen intemalizar y procesar el antígeno y presentar epítopos peptídicos en la superficie celular unidos a moléculas del MHC DR4 (5). Las células empleadas como control fueron incubadas con todos los elementos excepto SI OO-beta.

30 Figura (j. Fraccionamiento por cromatografia líquida de alta eficacia (HPLC) de los péptidos presentes en moléculas MI-IC de clase 11 DR4 en células Priess incubadas

o no con SI OO-beta. Los péptidos obtenidos a partir de células Priess incubadas con SIOO-beta (cromatograma superior) o células Priess sin incubar con SI OO-beta (cromatograma inferior) fueron fraccionados mediante HPLC en columna de fase

35 reversa C18 recogiéndose fracciones cada 30 segundos aproximadamente. Cada fracción fue analizada postcrionncntc mediante cspcctrornctría de masas. mAU: unidades de absorbancia.

Figura 7. Grupos de cpítopos pcptídicos solapan tes derivados de SI OO-beta

5 identificados mediante cspectrornctria de masas (MS). Después de comparar los espectros MS de cada una de las fracciones obtenidas en el HPLC de péptidos obtenidos de células incubadas con S 1 DO-beta con su correspondiente fracción de células Priess control (sin incubar con SIOO-beta) se identificaron 9 masas únicas correspondientes con 3 grupos de péptidos solapan tes (grupos A-e) después de la

10 búsqueda de [a secuencia de aminoácidos en Findpept (http://cxpasy.orgltoolslfindpcpl.html),

Figura 8. Epitopos pcptídicos consenso de S 1 DO-beta sintetizados con la infonnación obtenida dc los trcs grupos solapantcs idcntificados por espcctromctría dc

15 masas (M S). los epítopos conscnso sintetizados contienen al menos un motivo de unión a la molécula de histocompatibilidad de clase IJ DR4. Tal y como se demuestra en los ejemplos de la presente invención, estos péptidos consenso pueden ser cmplcados en la identificación in vitro dc linfocitos T CD4+ autorcactivos cn pacicntes diabéticos.

20 Figura 9. Resultados de EUSPOT para lL-lO de un individuo sano no diabético. Se muestra una fotografia de [os resultados de síntesis de IIr 1 O obtenidos de un individuo sano cuyos linfocitos han sido incubados con dimetil sulfoxido (DMSO, disolvente empleado en la disolución de los péptidos) (fila superior); el péptido

25 EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (SEQ ID NO: 17) derivado de una proteina de Plaslllodiul1I falciparulIl (Pf, empleado corno control negativo) (segunda fila); forbol 12-miristato l3-acetato (PMA, empleado como control positivo) (tercera fila) y el epitopo peptidico consenso S I OO-beta 68-92 (SEQ ID NO: 15) (última fila). Se detecta algún "sput" en aquellas células incubadas con PMA y una enorme cantidad de "SPu(~"'"

30 en aquellas células incubadas en presencia del epítopo peptídico consenso.

Figura 10. Secuencias de aminoácidos de [os epítopos pcptídicos correspondientes a [a Región 1 de S I OO-beta y de la [ibrena de péptidos solapantes de 15 aminoácidos de longitud sintetizados a partir del epítopo peptídico consenso SEQ

35 ID NO: 12.

Figura ¡l. Resultados de los ensayos de unión a la molécula de clase 11 OR4 del epítopo pcptídico consenso SEQ ID NO: 12 y de los cpítopos pcptídicos de la Región I de S I aO-beta. Para cada péptido se muestra la unión a O horas de ensayo (columnas en b lanco) y la cantidad de péptido que permanece unido a la molécula DR4 después de 24 horas de incubación a 37°C (parte negra de las columnas). Como comparación se muestran los resultados de unión de un epítopo con alta afinidad (control positivo) y de afinidad intermedia (control intennedio).

Figura 12. Secuencias de aminoácidos de los epítopos pcptídicos correspondientes a la Región 3 de SI aO-beta y de la librería de péptidos solapan Les de 15 aminoácidos de longitud sintetizados a partir dcl epitopo peptídico consenso SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14.

Figura 13. Resultados de los ensayos de unión a la molécula de clase 11 OR4 dcl epítopo peptídico consenso SEQ lO NO: 13 y de los epítopos peptídicos de la Región 3 de S l aa-beta. Para cada péptido se muestra la unión a ahoras de ensayo (columnas cn blanco) y la cantidad dc péptido quc pcnnanccc unido a la molécula OR4 después de 24 horas de incubación a 37°C (parte negra de las columnas). Como comparación se muestran los resultados de unión de un epítopo con alta afinidad (control positivo) y de afinidad intermedia (control intennedio).

Figura 14. Resultados de los ensayos de unión a la molécula de clase JI OR4 del epítopo peptidico consenso SEQ 10 NO: 14 y de los epitopos peptidicos de la Región 3 de S I aa-beta. Para cada péptido se muestra la unión a O horas de ensayo (columnas en blanco) y la cantidad de péptido que permanece unido a la molécula DR4 después de 24 horas de incubación a 37°C (parte negra de las columnas). Como comparación se muestran los resultados de unión de un epítopo con alta afinidad (control positivo) y de afinidad intermedia (control intennedio).

Figura 15. Secuencias de aminoácidos de los epítopos pcptídicos corrcspondientcs a la Región 2 dc S I aa-beta y de la libreria de péptidos solapantes de 15 aminoácidos de longitud sintetizados a partir del epitopo peptídico consenso SEQ ID NO: 15.

Figura 16. Resultados de los ensayos de unión a la molécula de clase U DR4 del epitopo peptídico consenso SEQ lO NO: 15 y de los epítopos peptídicos de la Región 2 de S lOO-beta. Para cada péptido se muestra la unión a O hora" de ensayo (columnas en blanco) y la cantidad de péptido que permanece unido a la molécula DR4

5 después de 24 honts de incubación a 37°C (parte negra de las columnas). Como comparación se muestran los resultados de unión de un epítopo con alta afinidad (control positivo) y de afinidad intermedia (control intermedio).

Figura J 7. Se muestra una Tabla que hace referencia a [as homologías con

10 respecto a los cpítopos descritos en la presente invención, de secuencias conteniendo cambios en 1, 2 Ó 3 aminoácidos. El asterisco (*) indicado en el encabezamiento de las columnas cuarta a sexta indica que se ha calculado como el nO de aminoácidos idénticos/no de aminoácidos totales * 100.

15 Figura 18. Se muestra una Tabla que hace referencia a homologías de las secuencias de La presente invención con las secuencias del documento WO 9810 1471.

Descripción de la invención Los presentes inventores han identificado específicamente los péptidos

20 antigénicos (también denominados en la presente invención como epítopos peptídicos) generados in vivo después de que S I aa-beta sea procesada por una célula presentadora de antígeno (APC) y que están presentes en la superficie de dichas APC unidos a una molécula MHC de clase n, aislándose los péptidos que realmente intervienen en la respuesta inmune in vivo. Por tanto, la presente invención proporciona los fragmentos

25 específicos de la proteína S I aa-beta que son generados durante una respuesta inmune y que son capaces de activar a linfocitos, identificando por tanto qué epítopos peptídicos específicos son los que pueden emplearse para la prevención, el tratamiento, el diagnóstico y el seguimiento de la diabetes tipo 1.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido antigénico 30 (epítopo pcptídico) aislado y derivado de la proteína S 1 aa-beta, donde dicho péptido se encuentra unido a una molécula MI-IC de clase O.

En la presente invención por "péptido antigénico" se entiende una secuencia lineal de aminoácidos presente en la hendidura de una molécula de histocompatibilidad y que posee por tanto capacidad de comportarse como un antígeno.

En la presente invención por "MHC de clase 11" se entiende una molécula de histocompatibilidad formada por dos cadenas a (alfa) y ~ (beta) presentes en la superficie celular, la cual presenta una hendidura capaz de alojar un péptido antigénico.

En una realización preferida, dicho péptido se localiza en la región 1 de la proteína SI aO-beta, y comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

En otra realización preferida, dicho peptido se localiza en la región 2 de la proteína S lOO-beta, y comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7.

En otra realización prcrcrida, dicho péptido se localiza en la región 3 de la proteína SI aO-beta, y comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 8, SEQ lD NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

Se entiende por región I de la proteína S IDO-beta a la comprendida entre los aminoácidos 2 y 25, por región 2 a la comprendida entre los aminoácidos 6D-92 y a la región 3 a la comprendida entre los aminoácidos 19~46 de la proteína S I DO-beta (la secuencia de la proteína SI OO-beta está disponible en el número de acceso NP _06263 de la base de datos de proteínas NCBJ), ambos extremos incluidos.

En otra realización preferida, dicho péptido es un péptido consenso para cada una de las regiones 1, 2 Y 3, seleccionado del grupo que comprende: a) péptido de secuencia SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, b) péptido que al menos muestra un 80% de homología con los péptidos descritos en a).

Preferiblemente, la homología del péptido con los péptidos descritos en a) es del 85%, más preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95%, y aún más preferiblemente es del 98%.

En la presente invención por "péptido consenso" se entiende una secuencia 1 ineal de aminoácidos que solapa con las secuencias de aminoácidos de los péptidos identificados de una región de S IDO-beta y que posee al menos una posible región de unión a moléculas MI-IC de clase 11.

En una realización más preferida, la molécula MHC de clase IJ unida al péptido según cualquiera de las realizaciones anteriores es DR4.

En la presente invención se entiende como moléculas MHC de clase IJ DR4 a la fonnada por las cadenas a y ~ codificadas por los alelas ORA 1 *0 101 Y ORB 1"'0401 respectivamente.

En la presente invención, por "homología" se entiende el porcentaje de residuos

5 de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos de las secuencias de péptidos SEQ 10 NO: 12, SEQ 10 NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ 10 NO: 15 o SEQ ID NO: 16, después de alinear las secuencias e introducir los espacios que sean necesarios para conseguir el máximo porcentaje de identidad con dichas secuencias. Los péptidos que mantienen al menos un 80% de homología con las

10 secuencias SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, son aquellas que difieren en 1,2 Ó 3 aminoácidos con respecto a dichas secuencias (Figura 17). Preferiblemente, la homología del péptido candidato con los péptidos de la invención es del 80%, más preferiblemente del 85%, más preferiblemente dcl 90%, más preferiblemente dcl 95%, Y aún más preferiblemente es

15 dcl98%.

La presente invención hace referencia, por primem vez, a péptidos aislados localizados en tres regiones de la proteína S 1 aa-beta, de una longitud variable, y que han sido generados in vivo por una APC a la que se le ha proporcionado la proteína S l00-beta purificada para que la APe pudiese procesarla, generar epítopos peptídieos

20 y presentar dichos epítopos en su superficie unidos a la molécula MHC de clase U. Más específicamente, la presente invención da a conocer la secuencia de una serie de péptidos aislados cuya longitud varía entre 11-27 aminoácidos y que se agrupan en tres regiones de la proteína S 1 aa-beta completa, formando tres grupos de péptidos solapantes. Dichos péptidos son los siguientes:

25 a) Región 1: tres péptidos cuyo núcleo es la secuencia KAMVALJDVFHQYSG SEQ ID NO: 1: KAMV ALIDVFHQYSGREGD SEQ ID NO: 2: AMV ALlDVFHQYSGREGDK SEQ ID NO: 3: SELEKAMVALlDVFHQYSG

30 b) Región 2: cuatro péptidos cuyo núcleo es la secuenCia FQEFMAFFVAMVTTAC SEQ ID NO: 4: TLDNDGDGECDFQEFMAFVAMVTTACH SEQ ID NO: 5: FQEFMAFVAMVTT ACHEFFEHE SEQ ID NO, 6, EFMAFVAMVTT AC

35 SEQ ID NO: 7: FQEFMAFVAMVT

e) Región 3: cuatro pépt-idos cuyo núcleo es la secuencia KHKLKKSELKELlNN SEQ ID NO: 8: REGOKHKLKKS SEQ ID NO: 9: HKLKKSELKEL SEQ ID NO: 10: KHKLKKSELKELlNNELSHFLE SEQ ID NO: I 1: SGREGOKHKLKKSELKELINN

Para cada una de las tres regiones descritas anterionnente se pueden sintetizar uno o más epítopos peptídicos consenso que incluyen toda o parte de las secuencias descritas anteriormente. Estos "epítopos peptídicos consenso" incluyen uno O más posibles "motivos de unión" a la molécula MHC de clase n, preferiblemente DR4. Las secuencias aminúacídicas de dichos "epítopos peptídicos consenso" son:

a) KAMVALlOVFHQYSGREGOK (SEQ ID NO: 12)

b) REGOKHKLKKSELKEL (SEQ ID NO: 13)

e) KHKLKKSELKELINNELSHFLE (SEQ ID NO: 14)

d) ECOFQEFMAFV AMVTT ACHEFFEHE (SEQ ID NO: 15)

e) MAFVAMVTTACHEFFEH(SEQJDNO 16)

A partir de las secuencias descritas anteriormente y de sus deri vados (ligandos peptídicos alterados) se pueden generar distintas moléculas o reactivos útiles en la prevención, tratamiento, diagnóMico o seguimiento de enfermedades.

Entre estas moléculas, la presente invención se refiere a los tetrámeros MHC de clase []-péptido antigénico.

Dichos tetrameros también pueden fusionarse a una O mas de otras moléculas. Preferiblemente, con fines terapéuticos, dichas moléculas son citocinas, por ejemplo la interleucina-IO, la interleucina-5, la interleucina-4 o la interleucina-I3, toxinas, por ejemplo, la saporina, O algunos isótopos, por ejemplo, el actinio-225, que regulan la actividad de los linfocitos C04+ específicos para SIOO-beta o los eliminan de fonna específica (Figura 3). Con fines diagnósticos, dichos tetrámeros también pueden fusionarse a nanopal1ículas magnéticas o a compuestos fluorescentes para la detección de linfocitos CD4+ específicos para SI OO-beta, por ejemplo para la detección in vivo mediante tomografia axial (Figura 3) cuando se fusionan a nanopartículas magnéticas,

o para la detección ex vivo mediante citomctría de flujo cuando se fusionan a compuestos fluorescentes. El diagnóstico se realiza de modo que cuando un sujeto presenta un número de linfocitos C04+ específicos para SI OO-beta por encima de un dctcnninado valor, éste es diagnosticado como diabético, considerando como sanos a aquellos sujetos que muestran niveles por debajo del mismo. Asimismo, los tetrámeros pueden fusionarse a distinta" combinaciones de toxinas, citocinas, nanopartícula.. magnéticas y/o compuestos fluorescentes.

5 En un segundo aspecto, la presente invención también se refiere a un procedimiento que permite la identificación directa y el aislamiento de los epítopos peptídicos procesados de fOlTI1a natural a partir de un antígeno específico y presentados por moléculas de histocompatibilidad de clase n a linfocitos CD4+. Dicho procedimiento comprende las ctapas de:

10 a) purificación de la molécula de histocompatibilidad de clase n, b) clución de los péptidos unidos a la molécula de histocompatibilidad de clase 1]; e c) identificación de los péptidos eluidos en la etapa b).

15 La purificación de la molécula de histocompatibilidad de clase 11 cn la etapa a) se puede llevar a cabo mediante distintos procedimientos, tales como la precipitación con sulfato amónico, cromatografia de exclusión molecular, cromatografia de intercambio aniónico o preferiblemente mediante la cromatografía de afinidad empleando un anticuerpo específico. La clueión de los péptidos unidos a la molécula

20 de histocompatibilidad en la etapa b) se puede llevar a cabo mediante distintos procedimiento.s, tales como la incubación en tampón citrato-fosfato pH: 3,3 a temperatura ambiente o preferiblemente mediante incubación en ácido acético al 10% a 70°C. La identificación de los péptidos según la etapa c) se puede llevar a cabo mediante distintos procedimientos, preferiblemente mediante HPLC y espectrometria

25 de masas. En un tercer aspecto, la presente invención también se refiere a un péptido antigénico aislado derivado de la proteína SI OO-beta, donde dicho péptido se encuentra unido a una molécula MHC de clase n, para su utilización en la prevención, tratamiento, diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes tipo 1. Dicho péptido

30 antigénico puede ser aquel descrito en cualquiera de las realizaciones anteriores. La presente invención también se refiere a la utilización de un péptido antigénico aislado derivado de la proteína S I OO-bcta, donde dicho péptido sc cncuentra unido a una molécula MHC de clase TI, para la fabricación de un medicamento para la prevención, tratamiento, diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes tipo L Dicho

,.

péptido antigénico puede ser aquel descrito en cualquiera de las realizaciones anteri ores. En la presente invención por "prevención" se entiende evitar la aparición de una cnfcnncdad, en este caso la diabetes tipo 1.

5 En la presente invención por "tratamiento" se entiende la intervención clínica en un intento por alterar la evolución natural de la enfermedad y se realiza durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la reaparición de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa O indirecta de la enfermedad, disminución de

10 la velocidad de progresión de la cnfcn:ncdad, mejora o cura parcial del estado patológico y remisión o pronóstico mejorado.

En la presente invención por "diagnóstico" se entiende la capacidad de identificar una detenninada enfennedad o estado patológico, en este caso la diabetes tipo l.

15 En la presente invención por "seguimiento" se entiende el proceso continuo y dinámico de recogida dc datos sobre el estado patológico del paciente, en este caso con respecto a la diabetes tipo 1 a efectos de establecer la fase en que se encuentra la cnfennedad y consecuentemente aplicar la acción terapéutica adecuada.

En una realización preferida, el péptido antigénico unido a la MHC de clase IJ

20 según cualquiera de las realizaciones anteriores se utiliza como reactivo para identificar y cuantificar linfocitos C04+ e~pecíficos para epitopos peptidicos de SI 00beta, en sistemas de diagnóstico o seguimiento de la diabetes tipo I. En una realización preferida, la detección de linfocitos CD4+ específicos para S-l OO beta se lleva a cabo in vivo mediante tornografia axial o ex vivo mediante citometría de flujo, fusionando

25 los tetrámeros a nanopartículas magnéticas O a compuestos fluorescentes, respectivamente. La presente invención también se refiere a un método de prevención o tratamiento de la diabetcs tipo I que comprende la administración de una cantidad terapéuticarncntc eficaz de un péptido antigénico unido a MHC de clase n según la

30 presente invención en sus diferentes realizaciones a un sujeto con necesidad del mismo. La administración dc una cantidad terapéuticamente eficaz se haría de fonna preferida mediante vía intradénnica o subcutánea, pudiendo hacerse de manera alternativa mediante vía oral, parenteral o nasal. La administración de una cantidad terapéutica de péptido se realizaría de forma preferida mediante su mezcla en "alum"

35 (sulfato de aluminio y pota..:;io hidratado) O en solución salina, preferiblemente al 0,9%.

Adicionalmente, los péptidos antigénicos unidos a MHC de clase n según cualquiera de las realizaciones de la presente invención se pueden utilizar pam el tratamiento, prevención, seguimiento y diagnóstico específico de cnfcnncdadcs donde intervengan tanto SI aO-beta como DR4, por ejemplo, artritis rcumatoidc.

5 En un cuarto aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un péptido antigénico aislado derivado de la proteína SI aO-beta tal como se ha definido anterionnente, pero sin estar unido a una MHC de clase n, para la fabricación de un medicamento para la prevención, tratamiento, diagnóstico o seguimiento de la diabetes tipo 1, así como a dicho péptido antigénico aislado derivado de la proteína SI aO-beta

10 para su uso en la prevención, tratamiento, diagnóstico o seguimiento de la diabetes tipo L Dicha prevención o tratamiento de la diabetes tipo I comprende la administración de una cantidad terapéuticamcnte eficaz de un péptido antigénico según la presente invención en sus diferentes realizaciones a un sujeto con necesidad del mismo. La administración de una cantidad tcrapéutieamcnte eficaz se haría de fonna preferida

15 mediante vía intradérmica o subcutánea, pudiendo hacerse de manera alternativa mediante vía oral, parenteral O nasal. La administración de una cantidad terapéutica de péptido se realizaría de forma preferida mediante su mezcla en "alum" (sulfato de aluminio y potasio hidratado) o en solución salina a[ 0,9%, pudiendo hacerse en otra realización preferida con el péptido encapsulado en un vehículo, o bien unido a la

20 superficie externa de un vehículo, donde dicho vehículo es seleccionado del gn.po que comprende: un liposoma, una mi cela, una vesícula, una micropartícula, una microcápsula, una microesfera, una nanoparticula, una nanocápsula y una nanoesfera. El diagnóstico o seguimiento de la diabetes tipo 1 empleando los péptidos de la invención por sí solos, sin estar unidos a una MHC, se lleva a cabo mediante la

25 cuantificación de [a cantidad de linfocitos CD4+ productores de distintas moléculas. En una realización preferida, el sistema de diagnóstico o seguimiento consiste en detectar la síntesis de interferón-gamma, interleucina-IO, interleucina-1 7, o combinaciones de los mismos por parte de linfocitos CD4+ en respuesta a dichos péptidos antigénieos (Figura 4, Ejemplo 2), preferentemente mediante ELlSPOT.

30 En una realización preferida de este cuarto aspecto, el péptido se localiza en la región I de la proteína S I OO-beta, y comprende cualquiera de las secuencias SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3.

En otra realización preferida de este cuarto aspecto, el péptido se localiza en la región 2 de la proteína SI OO-beta y comprende cualquiera de las secuencias SEC ID 35 NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, o SEC ID NO: 7.

En otra realización preferida de este cuarto aspecto, el péptido se localiza en la región 3 de la proteína SI aO-beta y comprende cualquiera de las secuencias SEC lD NO: R, SEC ID NO: 9, SEC ro NO: 10 O SEC ID NO: 11.

En otra realización preferida de este cuarto aspecto, el péptido es un péptido 5 consenso para cada una de las regiones 1, 2 Y 3, Y es seleccionado del grupo que comprende: al péptido de secuencia SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ro NO: 14, SEC ID NO: 15 o SEC ID NO: 16, b) péptido que al menos muestra un 80%, preferiblemente un 85%, más 10 preferiblemente un 90%, más preferiblemente un 95% y aún más preferiblemente un 98% de homología con los péptidos descritos en a).

Los términos "péptido consenso" y "homología" en este cuarto aspecto de la invención significan tal como se han definido antcrionncntc teniendo en cuenta que el péptido no está unido a la MHC.

15 Los presentes inventores han observado que los epítopos peptídieos consenso (no unidos a una molécula MHC de clase U) diseñados para cada una de las tres regiones, a partir de los péptidos identificados (ver Ejemplo 1, donde la identificación se hace mediante espcctrometría de masas), poseen las mismas características de unión a la molécula MHC de clase n DR4 tal y como se muestra en los ensayos realizados,

20 además de que en dichos ensayos se puede delimitar con exactitud cuál puede ser la secuencia de aminoácidos que sirve como "motivo de unión" (Ejemplo 3). La validez de estos epítopos peptídicos (no unidos a una molécula MHC de clase 11), tanto de las SEQ ID NO: I a SEQ ID NO: I I como de los epitopos peptidieos consenso, en el diagnóstico y seguimiento de la diabetes tipo 1, se ha demostrado

25 empleando estos últimos (SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 16) en muestras clínicas procedentes de pacientes con TID. Mediante amHisis ELlSPOT (Figura 4), se analizó la frecuencia de linfocitos C04+ productores de interfefÓn-gamma (IFN-y), interleucina-17 (IL-17) e interlcucina-IO (lL-IO) en respuesta a dichos péptidos en pacientes sanos y diabéticos (Ejemplo 2), demostrándose la capacidad de los péptidos

30 para discriminar eficazmente entre ambos grupos y por tanto poniendo de relieve la capacidad de diagnóstico de los péptidos en la diabetes tipo 1, tanto para diagnosticar la presencia o ausencia de la enfermedad, como para determinar la evolución de la misma en un sujeto. Además, los inventores han demostrado que las secuencias SEQ [D NO; 1-11 son también útiles en la prevención. tratamiento, diagnóstico o

35 seguimiento de la diabetes tipo 1, ya que en los ensayos de unión (Figuras 11, 13, 14 Y 16), tanto los péptidos consenso como los de SEQ ID NO: 1-11 tienen similares patrones de unión a las moléculas MHC y por tanto tendrán similares capacidades antigénicas.

Los péptidos no unidos a una molécula MHC de clase J] se pueden utilizar directamente o pueden ser encapsulados en un vehículo, o ser unidos a la superficie externa del mismo. Por tanto, en otra realización preferida, el péptido se encuentra o bien encapsulado en un vehículo, o bien unido a la superficie externa de un vehículo, donde dicho vehículo es seleccionado del grupo que comprende: un liposoma, una miccla, una vesícula, una micropartícula, una microcápsula, una microcsfcra, una nanopartícula, una nanocápsula y una nanúcsfcra, preferiblemente lipúsúmas, que pel1l1iten mejorar la inmunogenicidad de los péptidos frente a la diabetes tipo L

A continuación se muestran una serie de ej emplos que pretenden ilustrar la presente invención pero que en ningún caso deben interpretarse como limitantes de la misma.

Ejemplos Ejemplo t: Aislamiento e identificación de los epítopos peptídicos derivados de SlOO-beta unidos a MHC de clase 11

Metodología

El sistema empleado para la identiticación de epi topos peptídicos derivados de SIOO-beta se esquematiza en la Figura 5. Resumiendo, la proteína SI OO-beta humana fue expresada en bacterias conteniendo una secuencia de biotinilización en su extremo carboxilo-terminal, secuencia empleada para biotinilar in vitro SI OO-beta empleando la enzima BirA o biotín ligasa (Ee 6.3 .4.15), y una secuencia de 6 histidinas en el extremo amino-tcl1l1inal para poder purificarla empicando resinas de niquel. Una vez purifi cada y biotinilada, S lOO-beta rue incubada con células Priess, una línea I infoblastoide homozigota para la molécula MHC de clase J] DR4, que habían sido preincubadas con los demás elementos del sistema de intemalización (en primer lugar, una lectina obtenida a partir de Phylolacca americana (pokeweed mitogen, nombre en inglés) biotinilada y en segundo lugar, avidina). Una vez incubadas con S IOO-beta, las células fueron incubadas a 37°C para permitir la entrada de SI OO-beta, su procesamiento y la presentación de epitopos en la superficie celular unidos a moléculas

MHC de clase 11 DR4. Como células control se usaron las mismas células Pricss que habían sido incubadas con todos los elementos del sistema excluyendo S I aO-beta.

Una vez pasado el periodo de incubación, las células Pricss incubadas con S I aO-beta o control sin S I aO-beta, fueron recogidas y se purificaron de forma específica mediante cromatografia de afinidad las moléculas MHC de clase O DR4, empleando columnas de Sepharosa conteniendo el anticuerpo monoclonal L243 conjugado. Los epítopos peptídicos unidos a estas moléculas MHC fueron eluidos mediante pH ácido, filtrados empleando filtros con un punto de corte de 10.000 daltons, secados para reducir su volumen y fraccionados mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) empicando una columna de fase reversa C-[g (Figura 6). Cada una de las fracciones obtenidas en el HPLC fue analizada mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y [os espectros de masas del repertorio peptídico obtenido a partir de las moléculas MI-IC DR4 purificadas de células Pricss incubadas con SIOO-beta fue comparado con los espectros de masas del repertorio pcptídico obtenido de células Priess control, no incubadas con S I OO-beta, para identificar valores miz únicos correspondientes a péptidos derivados de S IDO-beta. Los valores miz únicos fueron comparados con la secuencia lineal de S I OO-beta mediante el programa FindPcpt (http://www.cxpasy.ch/toolslfindpcpt.html) para identificar la secuencia de aminoácidos correspondiente en la proteína.

Resultados

De este análisis. 9 valores m/z fueron identificados como únicos. quc se corresponden con tres conjuntos solapantes de péptidos. conjuntos donde existe al menos un motivo de unión a la molécula DR4 (Figura 7). Una vez identificados estos epítopos peptídicos se sintetizaron 4 epítopos peptídicos consenso (Figura 8) que representasen a cada uno de los tres conjuntos de epitopos peptídicos solapantes y que pudiesen ser empleados en la identificación específica de linfocitos T CD4+ autoreactivos en pacientes diabéticos e individuos sanos.

Ejemplo 2: capacidad de diagnóstico de los péptidos/complejos MHC-péptido en diabetes tipo 1

Metodología El fundamento de la técnica de ELlSPOT se describe esquemáticamente en la Figura 4. Para la identificación de linfocitos CD4+ en sangre periférica de pacientes

con TID (28 pacientes) e individuos sanos (24 personas), se añadió durante 1 hora a 37°C a distintos pocillos de placas Maxisorp una solución de anticuerpo monoclonal específico para tres citocinas: intcrfcrón-gamma (lFN-y), intcrlcucina-17 (IL-17) e intcrlcucina-lO (1L-IO). Una vez lavadas, se añadió a las placas una solución de albúmina bovina para bloquear los lugares donde no hubiese anticuerpo y, después de 1 hora de incubación a 37°C y de haber retirado la solución de albúmina, se añadieron por triplicado linfocitos periféricos obtenidos de pacientes con TI O o sujetos sanos añadiendo los antígenos y controles correspondientes. Las células fueron incubadas 37°C durante 72 horas y, una vez pasado el periodo de incubación, las placas fueron lavadas e incubadas a 3JOC durante l hora con un anticuerpo monoclonal específico correspondiente para cada una de las tres citocinas conjugado a biotina (anticuerpo de revelado). Lavado el exceso de anticuerpo de revelado, la presencia de lFN-'Y, IL-1 7 o lL-IO fue revelada empleando un anticuerpo dirigido contra biotina (GADA) y conjugado a una enzima, que una vez añadido el eorrcspondiente sustrato, lo transforma en una sustancia insoluble que se deposita sobre la placa en forma de mancha ("spot").

Resultados

La frecuencia de linfocitos CD4+ productores de IFN-y, IL-17 e [L-IO medida como índice de Estimulación (número de "spots" en presencia de antígeno I número de "spots" en presencia de DMSO) en respuesta a los epítopos peptídicos consenso se muestran en las Tablas 1,2 Y 3, respectivamente. Un índice de estimulación superior a 3 se considera significativo y en las Tablas donde se indica un índice de estimulación >3 es debido a que existe una respuesta positiva pero en DMSO el número de "spots" es cero. Como se desprende de los resultados mostrados en dichas Tablas, los linfocitos CD4+ de pacientes con TI O responden con mayor frecuencia sintetizando [FN-y (Tabla 1) e IL-17 (Tabla 2) contra alguno de los epítopos peptídieos consenso, los cuales discriminan de forma eficaz entre individuos sanos y pacientes diabéticos, poniendo de relieve su ut ilidad en el diagnóstico de la diabctes tipo T humana. Es de resaltar el hecho de que mientras algunos pacientes diabéticos responden contra alguno de los epítopos peptídieos consenso secretando IL-IO (Tabla 3), en especial contra el epítopo peptídico consenso S 100 68-92 (SEQ ID NO: 15), todos los individuos sanos analizados responden contra dicho epítopo sintetizando grandes cantidades de esta citocina (Tabla 3 y Figura 9) cuyo papel inmunoregulador está ampliamente estudiado. Además, en la Tabla se incluyen toda una serie de antigenos que sirvan tanto como controles positivos (forbol 1 2~miristato l3-acetato (PMA» para comprobar la viabilidad celular y como controles negativos (dimetilsufóxido (DMSO) O un péptido correspondiente a una proteí na de Plas1IIodiu11l JalciparulIl (Pf), éste último siempre que se hubiesen aislado células suficientes) para comprobar la especificidad de la

5 respuesta.

Ejemplo 3. Ensayos de unión a la molécula MHC de clase 11 DR4 de los eoítopos peptídicos v delimitación del "motivo de unión"

1 O Metodología

Los ensayos de unión han sido realizados por la empresa Prolmmunc Ud (http://www.proimmunc.com) empicando tecnología propiedad de la empresa. Los experimentos realizados consisten en mezclar un péptido con [a molécula MI-le de clase JI DR4 purificada de forma que, en función de su afinidad, dicho péptido pueda

15 unirse a la molécula DR4 y esta unión péptido-DR4 se detecta mediante el empleo de un anticuerpo específico. La afinidad y la estabilidad de unión de cada péptido se midió como la cantidad de señal generada a las O horas después de mezclar los componentes y después de incubar las mezclas durante 24 horas a 37°C, midiéndose posteriormente la cantidad de péptido-DR4 remanente. Como controles para compardr

20 la compañía emplea dos epitopos peptidicos de afinidad conocida por la molécula MHC de clase nDR4, uno con alta afinidad y otro con afinidad media. En un intento de acotar el posible "motivo de unión" a la molécula MHC de clase JI DR4 de los péptidos consenso empleados en los experimentos de ELlSPOT, se sintetizaron nuevos péptidos de 15 aminoácidos de longitud (15-mer) y desplazados

25 entre sí un solo aminoácido hasta cubrir la longitud del cpitopo peptidieo consenso corrcspondiente. Una vez sintetizados, la afinidad de unión por DR4 de cada uno de Los péptidos de la librería fue determinada.

Resultados

30 La Región incluye tres epítopos peptídicos identificados mediante espectrometría de masas (SEQ 10 NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3) y un epítopo peptídico consenso (SEQ ID NO: 12) (Figura 10). A partír de SEQ ID NO: 12 se sintetizaron seis péptidos de 15 aminoácidos de longitud y desplazados entre sí un solo aminoácido (15-mer # 1, 15-mer #2, 15-mer #3, 15-mer #4, 15-mer #5 y 15-mer #6)

35 (Figura lO). Los ensayos de unión para cada uno de los epítopos peptídicos de esta Región I se muestran en la Figura 11. Como puede verse en la Figura 11, los cpítopos peptídicos de esta región poseen una afinidad de unión a la molécula MHC de clase n DR4 intermedia, similar al epítopo de afinidad intcnnedia empicado como control. Además, el cpÍIOpO pcptídico consenso (SEQ ID NO: 12) posee una afinidad similar a los tres epítopos pcptídicos identificados mediante cspcctrornctría de masas (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3).

La Región 3 incluye cuatro epítopos peptídicos identificados mediante espeetrometria de masas (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11) a partir de los cuales se sintetizaron dos cpítopos pcptídicos consenso (SEQ lO NO: 13, SEQ ID NO: 14). A partir de SEQ lO NO: 13 se sintetizaron dos péptidos de 15 aminoácidos de longitud y desplazados entre sí un solo aminoácido (¡S-mer #1 Y 15-mcr #2) (Figura 12) mientras que a pa11ir de SEQ ID NO: 14 se sintetizaron ocho péptidos de 15 aminoácidos de longitud y desplazados entre sí un solo aminoácido (15mcr #3, 15-mcr #4, 15-mcr #5, 15-mcr #6, 15-mer #7, 15-mcr #8, 15-mcr #9, 15-mer # 1O) (Figura 12).

Los ensayos de unión del epítopo peptídico consenso SEQ ID NO: 13 muestran que éste no posee afinidad por la molécula de histocompatibilidad MHC de clase 11 DR4, circunstancia que OCUlTe con algunos cpítopos implicados en autoinmunidad (Figura 13). De [a misma manera, ninguno de [os dos péptidos de 15 aminoácidos de longitud sintetizados a partir de SEQ ID NO: 13 posee afinidad por dicha molécula OR4 (Figura 13). Los ensayos de unión del epítopo peptídico consenso SEQ ID NO: 14 muestran que, de la misma forma que SEQ ID NO: 13 derivado de la misma región de SIOO-beta, tampoco posee afinidad por la molécula de histocompatibilidad MHC de clase 11 DR4 (Figura 14). De la misma manera, ninguno de los ocho péptidos de 15 aminoácidos de longitud sintetizados a partir de SEQ ro NO: 14 posee afinidad por dicha molécula DR4 (Figura 14).

La Región 2 incluye cuatro epitopos peptídicos identificados mediante espcetrometria de masas (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7) y un epítopo peptídico consenso (SEQ ID NO: 15) (Figura 15). A partir de SEQ ID NO: 15 se sintetizaron once péptidos de 15 aminoácidos de longitud y desplazados entre sí un solo aminoácido (IS-mer #1, 15-mer #2, IS-mer #3, IS-mer #4, IS-mer #S, 15-mcr #6, 15-mcr #7, 15-mer #8, 15-mer #9 15-mer #10 y 15-mcr #11) (Figura 15). Los ensayos de unión para cada uno de los cpítopos peptídicos de esta Región 2 se muestran en la Figura 16. Como puede verse en esta Figura, los epítopos peptídicos

3S descritos para esta región son los quc posee mayor afinidad de unión por la molécula

MHC de clase IJ DR4, característica que es replicada por el cpítopo pcptídico consenso (SEQ ID NO: 15) diseñado para esta región y empleado en los ensayos de ELISPOT para cuantificar linfocitos autorcactivos. Oc los ensayos de unión a la molécula MHC de clase 11 DR4 empIcando la librería de once péptidos de 15 aminoácidos de longitud 5 sintetizados a partir de SEQ ID NO: 15 puede deducirse que el "motivo de unión" de SEQ ID NO: 1 S a la molécula de clase 11 DR4 parece encontrarse en la secuencia de aminoácidos MAFVAMVTTACHEFFEH (SEQ ID NO: 16) ya que los péptidos de 15 aminoácidos de longitud que poseen esta secuencia en su totalidad o en parte (15-mer #8, ¡S-rner #9, 15-mcr # 1 O) son los que poseen mayor afinidad y estabilidad de unión

10 a la molécula de clase 1] DR4.

Tabla l. Frecuencia de linfocitos CD4+ productores de IFN-y frente a epítopos peptídicos derivados de SIOO-heta

Sujeto

DMSO' PMA" 51006-25 (SEO ID NO: 12) 510021-36 (S EO ID NO: 13) 510025-46 (5EQ ID NO: 14) 510068-92 (SEO ID NO: 15)

Individuos sanos

C14

3 "O 17,67 18,33

C15

147 "O

C16

7 "O 3,64

C17

llO "O

C18

26 '10

C19

220 "O

C20

96 "O

C21

11 "O

C22

'02 "O

C23

145 "O

C24

81 '10

Respuestas positivas (%)

100 18,2 O 9,'

Pacientes diabéticos tipo 1

D17

2 '10 8,50

D18

3 "O

D19

2 "O 4,50 5,00

D20

"O 11 ,00

D21

2 "O

D22

2 '10

D23

'10

D24

'10

D25

O "O '3

D26

O "O '3 '3

D27

O '10 '3 '3

D28

O '10 '3 '3

Respuestas positivas (%)

100 44,44 0,00 30,00 44,44

5 ~En DMSO los resultados se indican como número de spots por cada millón de células u Los resultados para PMA y los epítopos peptídicos se indican como índice de Estimulación (número de spots muestra I número de spots DMSO). Un índice de estimulación superior a 3 se considera positivo. Un índice de cstimulación >3 indica que hay una respuesta positiva pero el número de

10 spots en DMSO es cero.

Tabla 2. Frecuencia de linfocitos CD4+ productores de IL-17 frente a epítopos ~e~tídicos derivados de SlOO-beta

S10021-36 510025-46

S1006-25 S10068-92

Sujeto DMSO' pr PMA" (SEQID NO: (SEO IONO:

(SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 15)

13) 14)

Individuos sanos

Cl O "0 C2 2 "0 C3 O O "0

C, O

'10 C5 "0 C6 O O "0 C7 2 '10

•

C8 2 2 "0 C9 O "0 C10 O '10 C11 O "0 C12 O O '10 C13 O O '10

Respuestas positivas (%) 100 O O O

Pacientes diabéticos tipo 1

Dl

O '10 " " "

D2

O "0 " " " "

D3

O "0 ' ,1

D4

2 "0

D5

4 '10

D6

"0

D7

6 '10

Da

O '10 "

D9

O O '10 " " "

Dl0

O O "0 "

D11

O 8 "0

D12

1 • "0

D13

O "0

D14

O '10

D15

O O '10

Respuestas positivas (%) 100 13,3 26,7 20 26,7

*En DMSO los resultados se indican como número de spOIS por cada millón de célul as

**Los resultados pam PMA y los cpítopos pcptídicos se indican como índice de

Estimulación (número de spots muestra J número de spots DMSO). Un índice de

estimulación superior a 3 se considera positivo.

Un índice de cstimulación >3 indica que hay una respuesta positiva pero el número de

spots en DM SO es cero.

Tabla 3. Frecuencia de linfocitos CD4+ productores de IL-IO frente a epítopos ~e~tídicos derivados de SIOO-beta

))MS 51006-25 S10021·36 S10025-46 510068·92

Sujeto PMA"

O· ¡SEQ ID NO: 12J ¡SEO ID NO: 13) ¡SEO ID NO: 14) ¡SEO ID NO: 15)

Individuos sanos

C14

8 >10 >10

C15

18 >10 >10

C16

>10

C17

7,5 >10 >10 >10

C18

6 >10 >10

C19

8 >10 8,1 >10

C20

4 >10 >10 >10

C21

8 >10 4,4 >10

C21

9 >10 >10

C23

16 >10 >10

C24

>10 >10

Respuestas

100 40 O O 100

E!0sitivas (%)

Pacientes diabéticos tipo 1

017

2 >10

018

>10

019

7 >10 6,9

020

3 >10

021

5 >10 6,6

021

2 >10 9

023

O >10 >3

024

O >10 >3 >3

025

>10

026

2 >10 4

027

>10

028

2 >10 >10

Respuestas

100 11 11 21

E!0sitivas (%) "

""En DMSO los resu ltados se indican como número de .<,pots por cada millón de células

5 >UoLos resultados para PMA y los cpítopos pcptídicos se indican como índice de Estimulación (número de spots muestra / número de spots DMSO). Un índice de cstimulación superior a 3 se considera positivo. Un índice de cstimulación >3 indica que hay una respuesta positiva pero el número de spots en DMSO es cero.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Tetrámero que comprende una molécula MHC de clase II y un péptido S antigénico aislado derivado de la proteína SI aO-beta.
2. 2. Tetrámero según la reivindicación 1, en el que el péptido se localiza en la región I de la proteína SI aO-beta y en el que dicho peptido comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ 10 NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
3. 3. Tetrámero según la reivindicación 1, en el que el péptido se localiza en la región 2 de la proteína SI aO-beta y en el que dicho péptido comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO 6, o SEQ ID NO 7
4. 4. Tetrámero según la reivindicación 1, en el que el péptido se localiza en Ja región 3 de la proteína SI aO-beta y en el que dicho peptido comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.
5. 5. Tetrámero según la reivindicación 1, en el que el peptido es un péptido consenso para cada una de las regiones 1,2 Y 3, seleccionado del grupo que comprende: al péptido de secuencia SEQ ID NO 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14,

   25 SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, b) péptido que al menos muestra un 80% de homología con los péptidos descritos en a).
6. 6. Tetrámero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a S, en el que la molécula 30 MHC de clase [] es DR4
7. 7. Tetrámero según cualquiera de las reivindicaciones l a 6, en el que el péptido además se encuentra unido a una o más citocinas, una o más toxinas, una o más

   nanopartículas magnéticas y/o uno o más compuestos fluorescentes.

   S

   8. Procedimiento para la obtención del tetrámero según cualquiera de las reivindicacione~ 1 a 7 que comprende" a) purificación de la molécula de histocompatibilidad de clase O, b) elución de los péptidos unidos a la molécula de histocompatibilidad de clase O; e e) identificación de los péptidos eluidos en la etapa b).

   10

   9. Procedimiento para la obtención del tetrámero según la reivindicación 8, en el que en [a etapa e) la identificación de los péptidos se lleva a cabo mediante HPLC y especLromelría de masas.

   15

   10. Uso del tetrámero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para identificar y cuantificar linfocitos C04+ específicos para epítopos peptídicos de S lOO-beta.

8. 11. Uso del tetrámero según la reivindicación 10, en el que dicha identificación y cuantificación se ll eva a cabo mediante tomografia axial o citometria de flujo.

   20

   12. Uso del tetrámero según cualquiera de las reivindicaciones I a 7 en la fabricación de un medicamento para la prevención, tratamiento, diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes tipo l.