ES2228208B1

ES2228208B1 - Metodo de diagnostico inmunologico de la dirofilariosis felina en diversas fases de la infeccion.

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Publication number: ES2228208B1
Application number: ES200200561A
Authority: ES
Inventors: Guadalupe Prieto Maza; Fernando Simon Martin; Claudio Genchi; Claudio Bandi; Silvia Alcoba; Rodrigo Morchon; Fabricio Ceciliani
Original assignee: CHEMICAL IBERICA PRODUCTOS VET; CHEMICAL IBERICA PRODUCTOS VETERINARIOS SL
Current assignee: CHEMICAL IBERICA PRODUCTOS VET; CHEMICAL IBERICA PRODUCTOS VETERINARIOS SL
Priority date: 2002-03-08
Filing date: 2002-03-08
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2022-03-08
Also published as: ES2228208A1

Abstract

Método de diagnóstico inmunológico de la dirofilariosis felina en diversas fases de la infección.

Método de diagnóstico de la dirofilariosis felina en cualquiera de las diferentes etapas de infección seleccionados entre la provocada por parásitos en estado larvario pre-adulto (fase precoz), la producida por vermes adultos (fase clínica) o por ambos, así como a un método de seguimiento serológico de la infección por Dirofilaria Immitis en felinos tras la aplicación de un tratamiento quimioprofiláctico o quirúrgico para la eliminación de los parásitos, mediante el empleo de diversas combinaciones de epítopos de polipéptidos que forman parte de complejos antigénicos de Dirofilaria Immitis.

Description

Método de diagnóstico serológico in vitro de la dirofilariosis felina en diversas fases de la infección.

La presente invención se refiere a un método analítico polivalente por ensayo inmunosorbente con enzima ligando (ELISA) para la detección de la dirofilariosis felina en cualquiera de las diferentes etapas de infección seleccionados entre la provocada por parásitos en estado larvario pre-adulto (fase precoz), la producida por vermes adultos (fase clínica) o por ambos, así como a un método de seguimiento serológico de la infección por Dirofilaria Immitis en felinos tras la aplicación de un tratamiento quimioprofiláctico o quirúrgico para la eliminación de los parásitos, mediante el empleo de diversas combinaciones de péptidos sintéticos que se corresponden con determinados epítopos de polipéptidos que forman parte de complejos antigénicos de Dirofilaria Immitis.

Estado de la técnica anterior

La dirofilariosis es una enfermedad provocada por la infección por nematodos del género Dirofilaria. Se trata de una zoonosis común en cánidos, que afecta principalmente a perros y gatos.

En gatos, se caracteriza principalmente por el hecho de que las larvas tardan un tiempo más largo en alcanzar la madurez y los gusanos son de menor tamaño en comparación con los encontrados en perros. La mayoría de las infecciones cursan en ausencia de microfilarias y con una carga media de gusanos muy baja, en áreas endémicas la carga media de gusanos en perros es de aproximadamente 15 y en gatos de 1 a 3.

Experimentalmente, la infección es más difícil de producir en gatos que en perros; el porcentaje de parásitos en estado larvario L3 que se desarrollan hasta el estado adulto es significativamente menor en gatos (1-25%) que en perros (40-90%).

Clínicamente la dirofilariosis en la mayoría de los gatos, se presenta de modo asintomático, y en caso de presentarse algún síntoma, éstos no son específicos, y coinciden con la llegada de los parásitos en estado larvario L5 a las arterias pulmonares, a las cámaras del ventrículo derecho del corazón o con la muerte de alguno de los parásitos. En un porcentaje significativo de casos, animales asintomáticos pueden manifestar súbitamente síntomas agudos, sobreviniendo su muerte en muy poco tiempo.

Tras la inoculación de los parásitos en estado larvario L3, por parte del mosquito vector, éstas mudan y migran hacia las arterias pulmonares, llegando como L5 (1-2 cm de longitud) aproximadamente a los 100 días después de la infección. Estas larvas en estado L5 son distribuidas principalmente en los caudales distales de las arterias pulmonares, y en los siguientes 2-3 meses, alcanzan la madurez sexual y migran hacia el ventrículo derecho.

El diagnóstico clínico de la enfermedad temprana es complicado especialmente en el gato, puesto que no se observa ninguna patología asociada con la presencia de vermes inmaduros.

La media de tiempo que transcurre desde que las larvas de estado L3 son introducidas en el gato (por la picadura de un mosquito portador), hasta la aparición de los vermes adultos, es de aproximadamente 8 meses y ocasionalmente superior.

En cuanto a los métodos de detección de la infección por Dirofilaria Immitis en gatos, los métodos ecocardiográficos permiten la visualización de los parásitos adultos sólo cuando han llegado a las cavidades cardíacas y arterias pulmonares. Los tests de concentración de microfilarias son poco útiles, puesto que la mayoría de las infecciones en gatos cursan de un modo amicrofilarémico. Por otro lado, la detección de antígenos circulantes presenta muy poca sensibilidad debido a que dependen de la existencia de un número suficiente de parásitos hembra maduros, y las infecciones felinas son frecuentemente causadas por parásitos inmaduros, parásitos macho únicamente o por un número muy reducido de hembras.

Frank et. al. (J. Parasitol., 84(6), 1998 p. 1231-1236) describe la detección de anticuerpos específicos contra una molécula recombinante de 33 kDa (rPDi33) en gatos experimentalmente infectados a partir del día 83 post- infección.

En WO 98/12563 se describe un test de un solo paso que emplea moléculas recombinantes de 33 kDa para la detección de la infección por D. Immitis a partir del día 83 post-infección.

En Prieto et. al. (Vet. Parasitol., 86, 1999 p. 5-13) se describe el empleo de antígenos somáticos y de antígenos excretores/secretores obtenidos de adultos de D. Immitis, en la detección precoz de la infección utilizando técnicas de ensayo inmunosorbente con enzima ligando (ELISA), y en la detección de cambios en los niveles serológicos de IgG tras un tratamiento quimioprofiláctico con ivermectina.

Por lo tanto, existe la necesidad de un método analítico para la detección de la dirofilariosis felina que permita detectar la infección en los primeros estadios de la infección, la detección y/o confirmación de la infección por parásitos en estado larvario pre-adulto y/o adultos y, que permita monitorizar la disminución de anticuerpos específicos tras la aplicación de un tratamiento quimioprofiláctico o quirúrgico para la eliminación de los parásitos, donde los antígenos utilizados sean obtenidos industrialmente de manera totalmente estandarizada, manteniendo la sensibilidad y especificidad.

Se ha encontrado que determinados epítopos de polipéptidos que forman parte de complejos antigénicos de Dirofilaria Immitis, pueden ser empleados como antígenos en técnicas de ensayo inmunosorbente con enzima ligando (ELISA) para el diagnóstico de la dirofilariosis felina, siendo posible detectar la infección en los primeros estadios de la misma, la detección y/o confirmación de la infección por parásitos en estado larvario pre-adulto y/o adultos y, es posible monitorizar la disminución de anticuerpos específicos tras la aplicación de un tratamiento quimioprofiláctico o quirúrgico para la eliminación de los parásitos.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un nuevo método analítico para la detección de la dirofilariosis felina que comprende el uso de péptidos sintéticos derivados de moléculas presentes en Dirofilaria Immitis, como antígenos en técnicas de ensayo inmunosorbente con enzima ligando (ELISA), que permite detectar la infección en cualquiera de las diferentes etapas de infección seleccionados entre el grupo formado por infección causada por parásitos en estado larvario pre-adulto, infección causada por vermes adultos o por ambos, así como a un método de seguimiento serológico de la infección por Dirofilaria Immitis en felinos tras la aplicación de un tratamiento quimioprofiláctico o quirúrgico para la eliminación de los parásitos, donde es posible monitorizar la disminución de anticuerpos específicos tras la aplicación de un tratamiento quimioprofiláctico o quirúrgico para la eliminación de los parásitos.

Según el método analítico para la detección de la dirofilariosis felina de la presente invención, al igual que los kits de diagnóstico proporcionados por la misma, es posible detectar la infección por D. Immitis en gatos antes de la maduración de las larvas de D. Immitis. El método y los kits de diagnóstico proporcionados por la presente invención, permiten detectar la infección por D. Immitis en gatos a partir de 2 meses post-infección, es decir dos meses tras la inoculación de las larvas en estadio larvario L3 por parte del mosquito vector, incluyendo el estado de vermes adulto de D. Immitis.

Por lo tanto, el método analítico, así como los kits de diagnóstico, proporcionados por la presente invención, permiten detectar la infección por Dirofilaria Immitis en un gato en cualquier momento de la misma, desde los 2 meses post-infección hasta el estado de vermes adulto, que en el caso de infección en gatos puede ser aproximadamente 2 a 3 años post-infección.

Del mismo modo, el método y los kits de diagnóstico proporcionados por la presente invención, permiten detectar la disminución del nivel de anticuerpos anti-D. Immitis, tras un tratamiento quirúrgico o quimioprofiláctico al animal para la eliminación de los vermes, siendo una consecuencia directa de la eliminación de los vermes la disminución del nivel de anticuerpos anti-D. Immitis.

Los péptidos sintéticos empleados derivan de polipéptidos que forman parte de complejos antigénicos de D. Immitis, principalmente del complejo antigénico somático de adultos de D. Immitis. No obstante muchas de las moléculas del antígeno somático son excretadas y pasan a formar parte de los antígenos excretores/secretores.

Los antígenos somáticos y antígenos excretores/secretores de D. Immitis son obtenidos mediante técnicas conocidas en el estado del arte, como por ejemplo en Simon et al., Trop. Med. Parasitol. 42, 106-108, 1991, y en Santamaría et al., Parasite 2, 269-273, 1995.

Se ha encontrado que determinados epítopos de dichos polipéptidos que forman parte de complejos antigénicos de D. Immitis, pueden ser empleados como antígenos en técnicas de ensayo inmunosorbente con enzima ligando (ELISA) para el diagnóstico de la dirofilariosis felina.

Se ha utilizado el algoritmo GOR (Secondary Structure Prediction Method Version IV, J. Garnier et al. Methods in Enzymology, vol. 266: 540-553, 1996), en el análisis de las secuencias de las moléculas de 22 y 30-33 kDa provenientes de los complejos antigénicos de Dirofilaria Immitis, para la identificación de los epítopos correspondientes que son utilizados como antígenos en el método inmunoenzimático ELISA para la detección de la dirofilariosis
felina.

La secuencia peptídica de dichos epítopos es sintetizada mediante técnicas conocidas en el estado del arte, dando lugar a los péptidos sintéticos cuyo empleo como antígenos en el método de análisis para la detección de la dirofilariosis felina en cualquiera de las diferentes etapas de infección seleccionados entre el grupo formado por infección causada por parásitos en estado larvario pre-adulto, infección causada por vermes adultos o por ambos, así como la monitorización de la disminución de anticuerpos específicos tras la aplicación de un tratamiento quimioprofiláctico o quirúrgico para la eliminación de los parásitos, mediante técnicas de ensayo inmunosorbente (ELISA) es objeto de la presente invención.

En una realización preferida de la presente invención, el péptido empleado como antígeno está constituido por secuencias peptídicas seleccionadas entre el grupo formado por:

NH2-MGIANQVTQLISQGR-COOH (SEQ ID NO 1)

NH2-KCSDIAPCQLTAVQS-COOH (SEQ ID NO 2)

NH2-KEEVKESLEERRKG-COOH (SEQ ID NO 3)

NH2-TQLKTFDAKMTA-COOH (SEQ ID NO 4)

NH2-SSTIQKQVDS-COOH (SEQ ID NO 5)

NH2-RTEATSQASDDATA-COOH (SEQ ID NO 6)

y sus mezclas.

En esta solicitud los aminoácidos se abrevian utilizando los códigos de una letra aceptados en el campo, en la forma que se muestra a continuación:

A= Ala= alanina,

C= Cys= cisteína,

D= Asp= ácido aspártico,

E= Glu= ácido glutámico,

F= Phe= fenilalanina,

G= Gly= glicina,

H= His= histidina,

I= Ile= isoleucina,

K= Lys= lisina,

L= Leu= leucina,

M= Met= metionina,

N= Asn= asparagina,

P= Pro= prolina

Q= Gln= glutamina,

R= Arg= arginina,

S= Ser= serina,

T= Thr= treonina,

V= Val= valina,

W= Trp= triptofano,

Y= Tyr= tirosina.

En una realización preferida de la presente invención, se emplea el conjunto de los péptidos anteriormente descritos a partes iguales.

El método analítico para la detección de la dirofilariosis felina según la presente invención, se realiza in vitro mediante técnicas de ensayo inmunosorbente (ELISA), donde se requiere el empleo de suero problema o sangre completa procedente del animal sospechoso al que se va a practicar el diagnóstico, y comprende las etapas de:

a): tapizar los pocillos de una placa de poliestireno con los péptidos sintéticos derivados de moléculas presentes en Dirofilaria Immitis, por incubación de la placa durante 16 horas a una temperatura de 4ºC, con 200 \mul/pocillo de una solución de 0,8 \mug/pocillo de los péptidos diluidos en PBS (pH 7,2);

b): lavar 3 veces la placa con PBS (pH 7,2), para separar los antígenos sintéticos que no se hayan ligado;

c): postapizar con BSA 1% en PBS pH 7,2 durante 1 hora a 37ºC;

d): lavar de nuevo como en el caso anterior;

e): añadir 100 \mul/pocillo de los sueros problema diluidos 1/10 en tampón diluyente e incubar durante 1 hora. Siendo este tampón diluyente NaCl 1,7 gr, Na_{2}HPO_{4} 0,426 gr, NaH_{2}PO_{4} 0,078 gr, BSA 2 gr, Tween 20 0,05 ml, H_{2}O destilada 200 ml;

f): lavar con PBS/Tween 20 al 0,05% 3 veces;

g): añadir 100 µl/pocillo del anticuerpo secundario anti-IgG anti-gato marcado con un enzima generalmente empleado en un análisis inmunoenzimático de diagnóstico seleccionada entre el grupo formado por peroxidasa, fosfatasa alcalina y glucoxidasa, diluido 1/4000 en el tampón diluyente del apartado (e), e incubar durante 2 horas a 37ºC;

h): lavar con PBS/Tween 20 al 0,05% 3 veces;

i): revelar la reacción mediante la adicción de una solución de substrato incolora específica para el enzima del conjugado usado en la etapa (g), e incubar durante un tiempo de 10 a 15 minutos a temperatura ambiente de 22º a 25ºC; y

j): detener la reacción con H_{2}SO_{4} 3N y leer la absorbancia a 492 nm

Etapas a) - d)

En la etapa a) del método de la presente invención, la placa de microvaloración de poliestireno se trata previamente por métodos en general conocidos. En la práctica, 0,8 \mug/pocillo de una combinación de los péptidos sintéticos, se disuelven en tampón PBS (0,01 M fosfato sódico, 0,15 M NaCl, pH 7,2). Introduciéndose 200 \mul/pocillo de dicha solución a todos los pocillos de una placa de microvaloración.

Según una realización preferida de la presente invención, se utiliza una combinación del conjunto de los péptidos en el tapizado de las placas de microvaloración.

En una realización más preferida, se utiliza una combinación a partes iguales del conjunto de los péptidos en el tapizado de las placas de microvaloración.

Las placas son incubadas durante 16 horas a una temperatura de 4ºC, tiempo necesario para que los péptidos se adsorban en las paredes de los pocillos. Las placas se lavan con tampón PBS para separar el exceso de péptidos.

Se realiza un post-tapizado con BSA al 1% en tampón PBS pH 7,2, durante 1 hora a 37ºC

Etapas e) - f)

De acuerdo con el método de la presente invención, las muestras empleadas pueden ser suero, plasma o sangre total. Las muestras se diluyen en proporción 1/10 en tampón diluyente constituido por NaCl 1,7 gr, Na_{2}HPO_{4} 0,426 gr, NaH_{2}PO_{4} 0,078 gr, BSA 2 gr, Tween 20 0,05 ml y H_{2}O destilada 200 ml.

Las placas son lavadas con la mezcla PBS/Tween 20 al 0,05%.

En general, se llevan a cabo 3 lavados de 3, 2 y 1 minuto cada vez.

Al añadir sobre las placas tapizadas con los antígenos la muestra de suero, plasma o sangre total problema, los anticuerpos anti-D. Immitis, si es que están presentes en los sueros, se unirán al antígeno fijado en la placa.

Etapas g) - h)

En la etapa g) del método de la presente invención, se añade a cada pocillo el anticuerpo secundario anti-IgG anti-gato marcado con un enzima adecuado para los fines de la presente invención, en general es válida cualquier enzima generalmente empleado en un análisis inmunoenzimático de diagnóstico como por ejemplo peroxidasa, fosfatasa alcalina y glucoxidasa. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, se emplea el anticuerpo anti-IgG anti-gato marcado con peroxidasa diluido 1/4000 en el tampón diluyente del apartado (e).

Las placas tratadas de este modo son incubadas durante 2 horas a una temperatura de 37ºC.

Las placas se lavan luego con PBS/Tween 20 al 0,05%

Es conocido que durante la infección felina por Dirofilaria Immitis, se produce un bajo nivel de antígenos lo que dificulta su detección por serología. Sin embargo, específicos anticuerpos anti-D. Immitis han sido localizados en animales diagnosticados con dirofilariosis. En concreto, anticuerpos anti-D. Immitis Di22 y Di30-33 immunoglobulina G (anticuerpos anti-D. Immitis IgG), son localizados en gatos diagnosticados con dirofilariosis.

Al añadir el conjugado enzima-anti-IgG, éste se une a cualquier IgG que podría haberse unido al antígeno fijado a la placa. Si la muestra de suero no contiene ningún anticuerpo anti-D. Immitis, el conjugado permanecerá libre o en suspensión y será eliminado durante el lavado.

Etapas i) - j)

En estas etapas, se añade a cada pocillo una solución de substrato incolora específica para el enzima del conjugado usado en la etapa (g).

La solución de substrato utilizado cuando el enzima es peroxidasa tiene la siguiente composición: tampón OPD 10 ml (ácido cítrico 2,14 gr, Na_{2}HPO_{4} x 12 H_{2}O 6,54 gr, H_{2}O destilada 400 ml, ajustar a pH 7,5) + OPD 0,0028 gr
+ H_{2}O_{2} 4 \mul.

La presencia del enzima inmovilizada dentro del conjugado unido se pone de manifiesto mediante la adición del substrato específico, produciendo una reacción que cursa con un cambio de color.

Para una determinación cuantitativa, la placa es leída en un lector ELISA para medir la absorbancia (A) para cada pocillo a una longitud óptica que es específica para cada tipo de substrato enzimático, en el caso de la peroxidasa y el substrato descrito anteriormente, la medición se hace a 492 nm.

Se consideran positivos los sueros con una densidad óptica (D.O.) igual o superior a 0,5, en casos de diagnóstico en fase clínica o precoz. Una D.O. inferior a 0,5 sería un resultado positivo en el seguimiento de un animal tras una intervención quirúrgica para extraer vermes o tras un tratamiento medicamentoso, puesto que en este caso tras la extracción de los vermes o el tratamiento medicamentoso se produciría una bajada del nivel de anticuerpos que es lo que se pretende detectar.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método analítico para la detección de la dirofilariosis felina en cualquiera de las diferentes etapas de infección seleccionados entre el grupo formado por infección causada por parásitos en estado larvario pre-adulto (fase precoz), infección causada por vermes adultos (fase clínica) o por ambos, así como la monitorización de la disminución de anticuerpos específicos tras la aplicación de un tratamiento quimioprofiláctico o quirúrgico para la eliminación de los parásitos, mediante el empleo de una combinación de péptidos sintéticos constituidos por secuencias peptídicas seleccionadas entre el grupo formado por: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 6 como antígenos en el método ELISA, los cuales son obtenidos industrialmente de manera totalmente estandarizada, manteniendo la sensibilidad y especificidad.

De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un kit de diagnóstico ELISA que emplea una combinación de péptidos sintéticos constituidos por secuencias peptídicas seleccionadas entre el grupo formado por: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 6 como antígenos, para detectar la dirofilariosis felina en una muestra de suero, plasma o sangre completa, en cualquiera de las diferentes etapas de infección seleccionados entre el grupo formado por infección causada por parásitos en estado larvario pre adulto (fase precoz), infección causada por vermes adultos (fase clínica) o por ambos, así como la monitorización de la disminución de anticuerpos específicos tras la aplicación de un tratamiento quimioprofiláctico o quirúrgico para la eliminación de los parásitos.

Una realización aún más preferida de la presente invención, es un kit de diagnóstico para detectar la dirofilariosis felina en una muestra de suero, plasma o sangre completa por el método ELISA según el método descrito anteriormente, caracterizado porque comprende:

a): una placa tratada previamente con una combinación, de los péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias peptidicas seleccionadas entre el grupo formado por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 y sus mezclas, para la unión a los anticuerpos anti-Dirofilaria Immitis, presentes en la muestra de suero, plasma o sangre completa a analizar;

b): un anticuerpo secundario anti-IgG anti-gato marcada con un enzima generalmente empleado en un análisis inmunoenzimático de diagnóstico seleccionada entre el grupo formado por peroxidasa, fosfatasa alcalina y glucoxidasa;

Los kits de diagnóstico ELISA de la presente invención pueden contener además lo siguiente:

c): una solución de substrato incolora específica para el enzima del conjugado usado en la etapa (b).

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Ejemplos

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitativos:

Ejemplo 1 Sensibilidad del método analítico de la Dirofilariosis en gatos en fase precoz

Según el método descrito anteriormente, se analizaron un total de 12 gatos los cuales fueron infectados experimentalmente con parásitos de estado larvario L3 de Dirofilaria Immitis.

A los 2 meses post-infección resultaron positivos el 16,6%, mientras que a los 4 meses post-infección la positividad fue del 91,6%

Ejemplo 2 Sensibilidad del método analítico de la Dirofilariosis en gatos en fase clínica

Se analizaron 21 sueros de gatos infectados naturalmente, los cuales fueron estudiados previamente por ecocardiografia.

Resultando positivos 19 de ellos, lo cual supone una sensibilidad del 90%.

Paralelamente se estudiaron sueros de 14 gatos infectados experimentalmente, mediante la inoculación de parásitos de estado larvario L3 de Dirofilaria Immitis. Resultando positivos todos ellos y corroborando este resultado mediante ecocardiografía y posterior visualización de vermes en la arteria pulmonar de todos ellos tras ser sacrificados al final del experimento. Lo cual supone una sensibilidad del 100%.

Ejemplo 3 Sensibilidad del método analítico de la Dirifilariosis en gatos tras un tratamiento quirúrgico o quimioprofiláctico

Se analizaron sueros de 5 gatos infectados experimentalmente siguiendo el mismo método que en los ejemplos anteriores, los cuales habían sido tratados con ivermectina. A los 4,5 meses post-tratamiento se obtienen resultados de D.O. inferior a 0,5 (valores negativos) en un 40%, mientras que a los 5,5 meses post-tratamiento se obtiene un 80% de efectividad.

Se analiza el suero extraído de un gato infectado por D. Immitis, al que se le extrajeron quirúrgicamente los vermes a través de la yugular. La D.O. medida antes de la operación fue de 0.579 y 45 días después fue de 0,285.

Claims

1. Método analítico para la detección de la dirofilariosis felina caracterizado por el empleo de péptidos sintéticos constituidos por las secuencias peptídicas seleccionadas entre el grupo formado por SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, que derivan de polipéptidos que forman parte de complejos antigénicos de Dirofilaria Immitis, como antígenos en técnicas de ensayo inmunosorbente con enzima ligando (ELISA).

2. Método según la reivindicación anterior caracterizado porque comprende las etapas de:

a.: tapizar los pocillos de una placa de ELISA con los péptidos sintéticos derivados de moléculas presentes en Dirofilaria Immitis, por incubación de la placa con una solución de los péptidos diluidos en PBS;

b.: postapizar con BSA 1% en PBS;

c.: añadir el suero problema diluido 1:10 en tampón diluyente e incubar;

d.: añadir el anticuerpo secundario anti-IgG anti-gato marcada con un enzima generalmente empleado en un análisis inmunoenzimático de diagnóstico seleccionada entre el grupo formado por peroxidasa, Eosfatasa alcalina y glucoxidasa, diluido 1:4000 en el tampón diluyente del apartado c) e incubar;

e.: revelar la reacción mediante la adicción de una solución de sustrato incolora específica para el enzima del conjugado usado en la etapa anterior, e incubar;

f.: leer la absorbancia a 492 nm.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque el tampón diluyente empleado está compuesto por NaCl 1,7 gr, Na_{2}HPO_{4} 0,426 gr, NaH_{2}PO_{4} 0,078 gr, BSA 2 gr, Tween 20 0,05 ml, H_{2}O destilada 200 ml.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, caracterizado porque el enzima empleada es peroxidasa.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, caracterizado porque la solución de substrato utilizado tiene la siguiente composición: tampón OPD 10 ml (ácido cítrico 2,14 gr, Na_{2}HPO_{4} x 12 H_{2}O 6,54 gr, H_{2}O destilada 400 ml, ajustar a pH 7,5) + OPD 0,0028 gr + H_{2}O_{2} 4 \mul.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, donde la infección es provocada por parásitos en estado larvario pre-adulto, por vermes adultos o por ambos, caracterizado porque la reacción se considera positiva cuando la densidad óptica es superior a 0,5.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, donde se diagnostica la infección por Dirofilaria Immitis tras un tratamiento quirúrgico o quimioprofiláctico caracterizado porque la reacción se considera positiva cuando la densidad óptica es inferior a 0,5.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7, caracterizado porque los péptidos empleados como antígenos se corresponden con epítopos de las moléculas de 22 y 30-33 kDa de Dirofilaria Immitis.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 A 8, caracterizado porque se utiliza una mezcla del conjunto de los 6 péptidos.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque se utiliza una mezcla del conjunto de los 6 péptidos a partes iguales.

11. Un kit de diagnóstico para la detección in vitro de la dirofilariosis felina en una muestra de suero, plasma o sangre completa por el método ELISA, caracterizado porque comprende:

a.: una placa tratada previamente con una combinación, de los péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias peptídicas seleccionadas entre el grupo formado por SEQ NO 1, SEQ NO 2, SEQ NO 3, SEQ NO 4, SEQ NO 5, SEQ NO 6 y sus mezclas, para la unión a los anticuerpos anti-Dirofilaria Immitis, presentes en la muestra de suero, plasma o sangre completa a analizar;

b.: un anticuerpo secundario anti-IgG anti-gato marcada con un enzima generalmente empleado en un análisis inmunoenzimático de diagnóstico seleccionada entre el grupo formado por peroxidasa, fosfatasa alcalina y glucoxidasa;

c.: una solución de substrato incolora específica para el enzima del conjugado usado en la etapa (b).

12. Un kit de diagnóstico ELISA según la reivindicación anterior 11, caracterizado porque se utiliza una mezcla del conjunto de los 6 péptidos a partes iguales.

13. Un kit de diagnóstico ELISA según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, caracterizado porque el enzima empleada es peroxidasa.

14. Un kit de diagnóstico ELISA según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la solución de substrato utilizado tiene la siguiente composición: tampón OPD 10 ml (ácido cítrico 2,14 gr, Na_{2}HPO_{4} x 12 H_{2}O 6,54 gr, H_{2}O destilada 400 ml, ajustar a pH 7,5) + OPD 0,0028 gr + H_{2}O_{2} 4 ml.

15. Uso del método analítico según la reivindicación 1, caracterizado porque la dirofilariosis felina es detectada en cualquiera de las diferentes etapas de infección seleccionadas entre la provocada por parásitos en estado larvario pre-adulto, la producida por vermes adultos, tras la aplicación de un tratamiento quimioprofiláctico o quirúrgico para la eliminación de los parásitos, y sus posibles combinaciones.

16. Uso del método analítico según la reivindicación 15, caracterizado porque es posible diagnosticar la dirofilariosis felina antes de la maduración de las larvas de Dirofilaria Immitis en vermes adultos.

17. Uso del método analítico según la reivindicación 15, caracterizado porque es posible diagnosticar la dirofilariosis felina a partir de los 2 meses post-infección del hospedador por Dirofilaria Immitis.

18. Uso del método analítico según la reivindicación 15, caracterizado porque es posible diagnosticar la dirofilariosis felina resultante de la presencia de vermes adultos de Dirofilaria Immitis.

19. Uso del método analítico según la reivindicación 15, caracterizado porque es posible diagnosticar la infección por Dirofilaria Immitis tras un tratamiento quirúrgico o quimioprofiláctico.

20. Uso del método analítico según la reivindicación 19, caracterizado porque el diagnóstico es efectivo a partir de los 45 días tras la extracción quirúrgica de los vermes.

21. Uso del método analítico según la reivindicación 19, caracterizado porque el diagnóstico es efectivo 4 meses después de un tratamiento quimioprofiláctico.