CN108276480A - Pcv3抗原表位的多肽序列筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了PCV3抗原表位的多肽序列筛选方法，包括五条多其氨基酸序列分别为PCV3‑1：GTPQNNKPWH；PCV3‑2：SPAQQTKTMF；PCV3‑3：WLQDDPYAESSTRKV；PCV3‑4：MTSKKKHSRY；PCV3‑5：VPEKTGMTDFYGTKE。本发明采用ELISA的方法检测PCV2与PCV3的抗血清IgG，通过ELISA的方法，筛选出与PCV3抗体特异性结合的短肽。筛选出的短肽，可以为将来PCV3的亚单位疫苗及相关诊断圆环病毒3感染的试剂，治疗圆环病毒3感染的抗体等提供可靠依据。本发明的优点在于，筛选出的五条多肽抗原性良好，抗原表位经鉴定为PCV3所特有，且序列保守，应用其表位序列可以有效的鉴别诊断动物是否感染PCV3，为以后防治PCV3提供有效的检测手段。

Description

PCV3抗原表位的多肽序列筛选方法
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体是一种可以鉴别PCV2与PCV3感染后抗体的PCV3抗原表位的多肽序列筛选方法。
背景技术
圆环病毒对我国的养猪业危害巨大，其本身可以和多种病原体混合感染，容易引起免疫失败。目前对临床上危害较多的是PCV2感染，但近些年，圆环病毒在机体内出现重组、变异，出现了新的型别，PCV3。相关资料表明，PCV3单独感染可以造成猪群发病甚至死亡，其与PCV2混合感染对猪群造成的伤害更大。
然而，由于PCV3属于最近新发现的病毒株，临床上还没有效的防控手段。病毒在进化过程中，其本身为了逃逸机体的免疫监视，势必会进行相关氨基酸位点的突变，或者发生基因片段的重组，从而使得其在宿主内增殖。不论是关键氨基酸位点的突变还是基因片段的重组，其本质是病毒抗原表位的变异，其抗原表位不仅可以制备相应的检测试剂，还可以制备相关的亚单位疫苗，甚至根据其抗原表位制备相应的治疗抗体。
然而，在前期研究中，PCV2感染占主导地位，研究人员主要研究PCV2的相关致病及预防措施。由于PCV3疫病突发，目前还没有相关的诊断、预防及治疗措施。病毒在长期的进化中，机体也会提升自己的监视能力，对于新出现的、变异的病原体，机体自然会提升自己的监察能力，针对不同毒株，机体针对病原体产生的抗体所识别的位点自然不同。因此，根据其位点的差异，可以制备诊断其机体是否存在相关病毒株的抗体，从而推导出其是否感染相关病毒株。
近年的研究表明，根据病毒的表位从而研发相应的诊断试剂，治疗抗体，新型的亚单位疫苗是可行的。
发明内容
本发明的目的是提供PCV3抗原表位的多肽序列及其筛选方法，通过免疫学方法首次鉴定出PCV3蛋白的抗原表位，同时公开PCV3抗原表位的用途。
本发明PCV3抗原表位的多肽序列，包括五条多肽，其氨基酸序列分别为：
PCV3-1：gtpqnnkpwh；
PCV3-2：spaqqtktmf；
PCV3-3：wlqddpyaesstrkv；
PCV3-4：mtskkkhsry ；
PCV3-5：vpektgmtdfygtke；
上述氨基酸序列的核苷酸序列分别为：
PCV3-1：ggaacccctc agaataacaa gccctggcac 30；
PCV3-2：tctccggctc agcaaacaaa aactatgttc 30；
PCV3-3：tggctccaag acgaccctta tgcggaaagt tccactcgta aagtt 45；
PCV3-4：atgacttcta aaaaaaaaca cagccgttac 30；
PCV3-5：gtcccggaaa aaactggaat gacagacttc tacggcacca aagaa 45。
本发明PCV3抗原表位的多肽序列的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）根据NCIBI上边公布的已知PCV3 cap蛋白的氨基酸序列，比对分析PCV2与PCV3结构蛋白的主要差别，观察其氨基酸的保守性；
（2）使用DNASTAR7.0软件对其中一株PCV3的cap蛋白进行氨基酸抗原性预测，预测PCV3结构蛋白的抗原表位区，从而分阶段表达；
（3）通过采取免疫PCV2与PCV3的抗血清分别与PCV3表达一系列短肽进行结合反应，从而筛选出与PCV3特异性结合的短肽，其氨基酸序列分别为：
PCV3-1：gtpqnnkpwh；
PCV3-2：spaqqtktmf；
PCV3-3：wlqddpyaesstrkv；
PCV3-4：mtskkkhsry ；
PCV3-5：vpektgmtdfygtke。
本发明采用ELISA的方法检测PCV2与PCV3的抗血清IgG，通过ELISA的方法，筛选出与PCV3抗体特异性结合的短肽。筛选出的短肽，可以为将来PCV3的亚单位疫苗及相关诊断圆环病毒3感染的试剂，治疗圆环病毒3感染的抗体等提供可靠依据。
本发明的优点在于，筛选出的五条多肽抗原性良好，抗原表位经鉴定为PCV3所特有，且序列保守，应用其表位序列可以有效的鉴别诊断动物是否感染PCV3，为以后防治PCV3提供有效的检测手段。
附图说明
图1为实施例PCV3 cap蛋白的抗原片段预测图。
图2为实施例经过纯化后的蛋白SDS-PAGE后结果图。
图3为PCV2与PCV3的多抗血清分别与5条多肽的间接ELISA结果；其中， 3A为验证试验图，3B为对照试验图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例
PCV3抗原表位的多肽序列的筛选，包括如下步骤：
首先，根据NCIBI上边公布的已知PCV3 cap蛋白的氨基酸序列进行氨基酸序列的比对分析，观察其氨基酸的保守性；
其次，使用DNASTAR7.0软件对其中一株PCV3的cap蛋白进行氨基酸抗原性预测，预测结果见图1所示；
然后，通过PCR的方法，分别扩增预测的5条短肽序列，并克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中，通过转化的方法，转入BL21（DE3）中，诱导表达；将诱导表达的细菌进行超声波破碎，使用GST蛋白纯化柱，纯化后的蛋白经过SDS-PAGE电泳后，其电泳结果如图2所示，1-5分别为5条短肽样品，Marker为170kd蛋白电泳Marker。
鉴别PCV2与PCV3抗体的间接ELISA方法：
（1）将纯化后的5条短肽分别包被ELISA板，所包被使用的蛋白浓度为5ug/ml，包被条件为4℃过夜；
（2）第二天弃去包被液，使用5%脱脂奶粉的PBST封闭ELISA板，37℃封闭2h；
（3）使用PBST溶液清洗3次后，倍比稀释从猪场采集的猪阳性血清；第一列血清1:100稀释，后边一直倍比稀释到第11列，采用2倍梯度稀释法；加入1抗溶液（猪场采集的感染圆环病毒3的阳性），加入1抗后，放于37℃孵育1h；
（4）弃去1抗，PBST洗6次，之后加入1:8000的HRP标记的羊抗猪二抗，37℃孵育1h；
（5）PBST洗6次后，加入显色液以及底物溶液显色，之后加入终止液，在酶标仪上进行OD450波长的读数，判别ELISA反应结果。
ELISA反应结果如图3所示。根据图中所示，PCV3-1：GTPQNNKPWH可以与感染PCV3的阳性血清特异性反应，与感染PCV2的阳性血清没有反应。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> PCV3抗原表位的多肽序列筛选方法
<141> 2018-01-24
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 1
ggaacccctc agaataacaa gccctggcac 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 2
tctccggctc agcaaacaaa aactatgttc 30
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 3
tggctccaag acgaccctta tgcggaaagt tccactcgta aagtt 45
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 4
atgacttcta aaaaaaaaca cagccgttac 30
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 5
gtcccggaaa aaactggaat gacagacttc tacggcacca aagaa 45

Claims (5)

1.PCV3抗原表位的多肽序列，其特征在于，包括五条多肽，其氨基酸序列分别为：
PCV3-1：gtpqnnkpwh；
PCV3-2：spaqqtktmf；
PCV3-3：wlqddpyaesstrkv；
PCV3-4：mtskkkhsry ；
PCV3-5：vpektgmtdfygtke；
上述氨基酸序列的核苷酸序列分别为：
PCV3-1：ggaacccctc agaataacaa gccctggcac 30；
PCV3-2：tctccggctc agcaaacaaa aactatgttc 30；
PCV3-3：tggctccaag acgaccctta tgcggaaagt tccactcgta aagtt 45；
PCV3-4：atgacttcta aaaaaaaaca cagccgttac 30；
PCV3-5：gtcccggaaa aaactggaat gacagacttc tacggcacca aagaa 45。
2.权利要求1所述的PCV3抗原表位的多肽序列的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）根据NCIBI上边公布的已知PCV3 cap蛋白的氨基酸序列，比对分析PCV2与PCV3结构蛋白的主要差别，观察其氨基酸的保守性；
（2）使用DNASTAR7.0软件对其中一株PCV3的cap蛋白进行氨基酸抗原性预测，预测PCV3结构蛋白的抗原表位区，从而分阶段表达；
（3）通过采取免疫PCV2与PCV3的抗血清分别与PCV3表达一系列短肽进行结合反应，从而筛选出与PCV3特异性结合的短肽，其氨基酸序列分别为PCV3-1：gtpqnnkpwh；
PCV3-2：spaqqtktmf；
PCV3-3：wlqddpyaesstrkv；
PCV3-4：mtskkkhsry ；
PCV3-5：vpektgmtdfygtke。
3.权利要求1所述的氨基酸序列在诊断PCV2与PCV3型鉴别诊断试剂盒中的应用。
4.权利要求1所述的氨基酸序列在亚单位疫苗的应用。
5.权利要求1所述的氨基酸序列在治疗PCV3抗体中的应用。
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