RU2818080C1 - Способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-COV-2 - Google Patents
Способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-COV-2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818080C1 RU2818080C1 RU2023124480A RU2023124480A RU2818080C1 RU 2818080 C1 RU2818080 C1 RU 2818080C1 RU 2023124480 A RU2023124480 A RU 2023124480A RU 2023124480 A RU2023124480 A RU 2023124480A RU 2818080 C1 RU2818080 C1 RU 2818080C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- virus
- cov
- sars
- antigens
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 10
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 10
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 6
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 6
- 229930191564 Monensin Natural products 0.000 claims description 5
- GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N Monensin A Natural products O1C(CC)(C2C(CC(O2)C2C(CC(C)C(O)(CO)O2)C)C)CCC1C(O1)(C)CCC21CC(O)C(C)C(C(C)C(OC)C(C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 229960005358 monensin Drugs 0.000 claims description 5
- GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N monensin A Chemical compound C([C@@](O1)(C)[C@H]2CC[C@@](O2)(CC)[C@H]2[C@H](C[C@@H](O2)[C@@H]2[C@H](C[C@@H](C)[C@](O)(CO)O2)C)C)C[C@@]21C[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](OC)[C@H](C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 3
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 claims description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 claims description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 claims 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 10
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 10
- 108010009254 Lysosomal-Associated Membrane Protein 1 Proteins 0.000 description 9
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 5
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 5
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 5
- 229940026205 Gam-COVID-Vac Drugs 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области иммунологии. Описан способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2. Технический результат заключается в разработке простого и удобного способа определения и оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-COV-2, позволяющего количественно определять специфический клеточный компонент иммунного ответа на этот вирус. 1 ил., 1 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета.
Изобретение может быть использовано в медицине для определения специфического клеточного иммунного ответа к N-белку вируса SARS-COV-2 и его количественной оценки у переболевших COVID-19 и привитых от этой инфекции людей.
Оценка гуморального иммунитета к антигенам вируса SARS-CoV-2 не является проблемой на данном этапе, поскольку имеется достаточное количество тест-систем, с помощью которых можно количественно оценить уровень антител разных классов как к S-белку, так и к N-белку вируса SARS-CoV-2. Известно, что именно эти белки у данного вируса являются наиболее иммуногенными. При этом антитела к S-белку являются протективными, тогда как антитела к N-белку рассматриваются как антитела-свидетели, подтверждающие перенесенную инфекцию, но не защищающие от инфицирования, т.к. N-белок находится внутри вириона и антитела к нему не могут помешать вирусу инфицировать клетку хозяина. Увлечение разработчиков тест-систем S-белком оставляло N-белок в тени, тогда как он высоко консервативен среди коронавирусов и является одним из наиболее распространенных структурных белков в инфицированных вирусом клетках.
Иначе обстоят дела с формированием протективного клеточного иммунитета. Специфические CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты распознают антигенные вирусные пептиды в комплексе HLA-I, выставленные на поверхности зараженной вирусом клетки. При этом совершенно неважно, из каких именно белков вируса были нарезаны эти пептиды. Главное, чтобы это были чужеродные пептиды, специфичные для данного вируса. При распознавании комплекса HLA-I-вирусный пептид цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты активируются и выбрасывают в сторону зараженной вирусом клетки содержимое своих цитотоксических гранул, содержащих перфорин, гранзимы и другие биологически активные вещества, индуцирующие апоптоз зараженной клетки. В результате вместе с зараженной клеткой погибают и синтезируемые внутри нее вирусы. Для того чтобы эти биологически активные вещества не повредили сам цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, на внутренней поверхности цитотоксических гранул имеется молекула CD107a, стабилизирующая мембрану. В момент, когда цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит распознал зараженную вирусом клетки и атакует ее, мембрана цитотоксических гранул сливается с внешней мембраной CD8+ лимфоцита, содержимое гранул воздействует на зараженную вирусом клетку, а на поверхности CD8+ Т-лимфоцита экспрессируется молекула CD107a. Используя меченные флуорохромом моноклональные антитела к этой молекуле, можно посчитать процент CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, распознавших конкретный антиген и ответивших атакой на такое распознавание.
Классическим методом определения клеточного иммунитета считают метод ELISpot. Следует отметить, что имеются тест-наборы, разработанные для этого метода, в которых стимуляцию лимфоцитов осуществляют смесью антигенных пептидов из S- и N-белка вируса SARS-COV-2 [1]. Недостатком этого метода, как и других методов, основанных на продукции IFN-γ [2], является то, что IFN-γ синтезируют различные субпопуляции лимфоцитов, такие как NK-, NKT-, CD8+, Thl, и даже γδ-Т клетки, поэтому при оценке методом ELISpot получаются суммарные результаты, из которых невозможно вычленить вклад именно CD8+ цитотоксических лимфоцитов. Есть методы, позволяющие выделить только CD8+ клетки, но для этого требуется большой объем крови (около 20 мл) и дополнительные дорогостоящие импортные реактивы. При этом следует подчеркнуть, что сам IFN-γ не оказывает прямого воздействия на вирус, а лишь организует противовирусный иммунный ответ, поэтому может лишь косвенно свидетельствовать о наличии клеточного цитотоксического иммунитета.
Учитывая высокую степень консервативности N-белка, поскольку он почти не мутирует, и тот факт, что он является репрезентативным антигеном для Т-клеточного ответа, разработка метода оценки Т-клеточного иммунитета является весьма актуальной. Было показано, что Т-клеточные ответы, сформировавшиеся на вирус SARS-CoV-1 сохранялись многие годы [3]. При этом были выявлены перекрестные эпитопы между SARS-CoV-2 и другими коронавирусами человека.
В качестве аналога предлагаемого изобретения можно рассмотреть статью O.-W. Ng et al. [4], в которой исследовали клеточный иммунитет к первому вирусу SARS-CoV-1, эпидемия которого произошла в Китае в 2003 г. При этом клеточный иммунитет сохранялся более 10 лет, а гуморальный исчез спустя 3 года. В данной работе стимуляцию клеточного иммунитета проводили синтетическими пептидами, аналогичными по структуре пептидам различных белков вируса SARS-CoV-1. Недостатком такого способа стимуляции является то, что CD8+ распознают антигенный пептид в комплексе с HLA, а эта молекула весьма гетерогенна в популяции людей и конкретный пептид может хорошо встраиваться в один вариант HLA и не встраиваться в другой. Поэтому результаты могут различаться у разных людей не только в зависимости от наличия или отсутствия CD8+ клеток, способных распознавать конкретный пептид, но и от различий в HLA, способной презентировать данный пептид.
В качестве прототипа выбран патент РФ № 2762616 [5].
Способ предусматривает, что выделенные из крови пациента мононуклеары инкубируют в присутствии 10 мкМ моненсина, меченных флюорохромом моноклональных антител к антигену CD107a в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 20 часов при 37°С в атмосфере 5% CO2 и 100% влажности в лунках 96-луночного планшета в качестве контрольной пробы и в лунках 96-луночного планшета от набора для определения антител к S-белку вируса SARS-COV-2 методом ИФА, в которых на дно лунок сорбирован полноразмерный S-белок, в качестве опытной пробы; затем осуществляют последующее окрашивание лимфоцитов меченными флюорохромом антителами к CD8 и регистрацию на проточном цитофлюорометре процента субпопуляции дважды позитивных Т-лимфоцитов CD8hiqhCD107a+ в контрольной и опытной пробе. Различия состоят в том, что в указанном патенте стимуляцию лимфоцитов проводили S-белком вируса SARS-CoV-2, а в заявленном способе использован N-белок вируса SARS-CoV-2.
Технической проблемой, решаемой изобретением, является разработка простого и удобного способа определения и оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-COV-2, позволяющего количественно определять специфический клеточный компонент иммунного ответа на этот вирус.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и оценки специфического клеточного иммунного ответа на N-белок коронавируса SARS-COV-2 на основании экспрессии молекул CD107a на поверхности распознавших антигены N-белка коронавируса SARS-COV-2 CD8+ цитотокических Т-лимфоцитов, определяемой методом проточной цитометрии.
В предварительных исследованиях была изучена возможность стимулировать выделенные из периферической крови мононуклеары с помощью N-белка, сорбированного на дне лунок 96-луночного планшета от набора для определения антител к N-белку вируса SARS-COV-2 методом ИФА. Показано, что N-белок, сорбированный на дне лунок тест-системы «N-CoV-2-IgG PS» (ФБУН НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург, РФ) эффективно стимулирует CD8+ T-лимфоциты у переболевших COVID-19. Оптимальное время инкубации мононуклеаров с антигеном составило 20 часов.
Технический результат изобретения заключается в том, что заявленный способ определения и оценки специфического клеточного иммунного ответа на N-белок вируса SARS-COV-2, осуществляемый на основании детекции экспрессии CD107a на поверхности распознавших антигены N-белка вируса SARS-COV-2 CD8+ Т-лимфоцитов, позволяет количественно определить клеточный компонент иммунной защиты против вируса SARS-COV-2. При этом преимущество разработанного способа оценки клеточного иммунного ответа на N-белок вируса SARS-CoV-2 состоит в том, что в отличие от S-белка, N-белок практически не подвергается мутациям. Метод позволяет различить перенесших COVID-19 и привитых вакциной, содержащей только S-антигены вируса SARS-CoV-2 (например, «Спутник V»), а также исследовать клеточный иммунитет у привитых вакциной, содержащей N-белок этого вируса (например Конвасэл). В комплексе с рутинной оценкой антител к вирусу SARS-CoV-2 предложенный метод позволяет оценить наличие иммунной защиты против этого вируса. Предложенный метод позволяет измерить процент именно цитотоксических Т-лимфоцитов, специфически распознающих N-белок коронавируса и атакующих зараженные вирусом SARS-CoV-2 клетки, независимо от мутаций, происходящих в S-белке этого вируса.
Данный способ позволяет с чувствительностью 100% и специфичностью 94,74% выявлять клеточный иммунный ответ на антигены N-белка вируса SARS-CoV-2.
Сущность изобретения заключается в следующем:
Для выявления специфического клеточного иммунитета к N-белку вируса SARS-CoV-2 были сформированы 2 группы по 20 человек. Группу 1 составили люди, переболевшие COVID-19, имевшие подтверждение диагноза методом ПЦР, давность заболевания составила 3-12 мес. Группу сравнения 2 составили люди, привитые вакциной Спутник V и не болевшие COVID-19. Следует подчеркнуть, что пандемия COVID-19, продолжавшаяся более 3-х лет и сопровождавшаяся неоднократными подъемами заболеваемости, связанными с частыми мутациями в S-белке коронавируса, привела к тому, что на данный момент практически не осталось людей, так или иначе, не знакомых с этим вирусом. Привитые вакциной Спутник V и не болевшие этой инфекцией имеют иммунитет к S-белку коронавируса, но не имеют иммунитета к N-белку, поскольку этот белок не входит в состав вакцины. Поэтому такие люди были отнесены в группу сравнения.
Венозную кровь для исследования отбирали в вакуумные пробирки с напылением гепарина. Выделение фракции мононуклеаров осуществляли методом градиентного центрифугирования в стерильных условиях и отмывали центрифугированием в среде RPMI-1640 при 600g 10 мин. Надосадок удаляли, а к мононуклеарам добавляли 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глютамина, гентамицин и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Для контрольной пробы в лунку стерильного плоскодонного 96-луночного планшета вносили суспензию мононуклеаров (3×105 на лунку), раствор моненсина в конечной концентрации 10 мкМ и моноклональные антитела к антигену CD107a-PE-Cy5 в конечном разведении 1:100. Для опытной пробы использовали лунки 96-луночного планшета от набора для определения антител к N-белку вируса SARS-COV-2 методом ИФА, в которых на дне лунок был сорбирован N-белок коронавируса, согласно инструкции производителя. Был использован набор «N-CoV-2-IgG PS» (ФБУН НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург, РФ). Перед внесением суспензии мононуклеаров лунки из набора для ИФА были простерилизованы с помощью ультрафиолетового облучения в стерильных условиях в течение 30 минут. Далее вносили суспензию клеток, раствор моненсина и антитела, так же и в тех же количествах, что и в контрольной пробе. Затем пробы инкубировали 20 часов во влажной атмосфере и 5% СО2 при 37°С. После инкубации клетки ресуспендировали, переносили в пробирки типа эппендорф и отмывали центрифугированием (300g 3 мин) в забуференном фосфатами физиологическом растворе с добавлением 0,02% азида натрия и 0,02% Na2-ЭДТА. Надосадок удаляли, а клетки окрашивали антителами к антигену CD8-FITC при 4°С 20 минут в темноте, затем повторно отмывали центрифугированием при тех же условиях, добавляли CellWash раствор для цитометрии и ресуспендировали. Полученную суспензию клеток анализировали с помощью проточного цитометра BD FACS Canto II (технологии и программное обеспечение Becton Dickinson, США). Следует отметить, что для такого анализа подходит любой цитометр любой фирмы. В каждой пробе подсчитывали 50000 клеток. В процессе анализа выделяли лимфоидный гейт (G1), в нем в режиме FITC-SSS выделяли гейт лимфоцитов, высоко экспрессирующих антиген CD8 (CD8high) - это субпопуляция цитотоксических Т-лимфоцитов (G2). И уже в гейте G2 на графике CD107a-PE-Cy5 против CD8-FITC регистрировали облако дважды положительных клеток. Полученное число отражает процент цитотоксических лимфоцитов, распознавших антигены N-белка вируса SARS-CoV-2 относительно общего количества CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов. Затем из результата, полученного в опытной лунке (уровень дегрануляции, индуцированной N-белком) вычитали результат, полученный в контрольной лунке (уровень спонтанной дегрануляции).
Для выяснения информативности разработанного нами метода оценки специфического клеточного ответа на N-белок вируса SARS-CoV-2 провели ROC-анализ полученных данных - метод построения операционных характеристических кривых (Receiver Operating Characteristic curve, сокращенно ROC-кривых), позволяющих оценить диагностическую эффективность метода. Была выявлена высокая вероятность разделения группы переболевших COVID-19, имевших ответ на N-белок коронавируса и группы сравнения, привитых вакциной «Спутник V», в которой содержится только S-белок, но не N-белок вируса SARS-CoV-2. Площадь под ROC-кривой (AUC) составила 0,997 (0,989-1,006), (р<0,05). (Фиг. 1.)
Затем был произведен расчет уровня порогового значения (cut off) для критерия экспрессии антигена CD107a на CD8high T-лимфоцитах в ответ на индукцию антигенами N-белка вируса SARS-CoV-2 за вычетом показателя спонтанной экспрессии этого антигена. В результате был получен уровень cut-off=1,115%, который с чувствительностью 100% и специфичностью 94,74% позволяет выявить специфический клеточный иммунитет на антигены N-белка вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, если у обследуемого человека рассчитанный критерий (процент экспрессии антигена CD107a на CD8high Т-лимфоцитах в ответ на индукцию антигенами N-белка вируса SARS-CoV-2 за вычетом спонтанной экспрессии этого антигена) превышает уровень cut off (1,115%), то данный человек имеет специфический клеточный иммунитет на антигены N-белка вируса SARS-CoV-2. Чем больше полученное число, тем выше клеточный иммунитет к N-белку коронавируса. Дополнительным критерием правильности выполненного теста является то, что уровень спонтанной экспрессии антигена CD107a на CD8high Т-лимфоцитах не превышает 1%.
Осуществление способа изобретения поясняется на следующем примере.
Пример. В качестве примера в таблице 1 приведены результаты измерения уровней экспрессии антигена CD107a на CD8high Т-лимфоцитах (спонтанный и индуцированный антигенами N-белка вируса SARS-CoV-2) у случайно выбранных 10-и человек с неизвестным анамнезом относительно контактов с вирусом SARS-CoV-2. Во всех приведенных случаях спонтанный уровень экспрессии антигена CD107a на CD8high Т-лимфоцитах не превышает 1%, что свидетельствует о правильности проведенной оценки.
Используя значение порогового критерия 1,115% для оценки полученной разницы между индуцированной и спонтанной экспрессией антигена CD107a на CD8high Т-лимфоцитах (правая колонка таблицы), находим, что пациенты под номером 1, 2, 3, 4, 6,8,9 и 10 имеют значения этого показателя выше значения cut off, что свидетельствует о наличии специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2. Важно, что чем выше полученное значение рассчитанного показателя (правая колонка таблицы), тем более выражен специфический клеточный иммунитет к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2. Например, у людей под номером 2 и 10 обнаружен положительный, но невысокий уровень клеточного иммунитета к N-белку вируса SARS-CoV-2, у людей под номером 3,4 и 8 - высокий уровень, а у людей под номером 1,6 и 9 - средний уровень такого ответа. Интересно, что у людей под номером 5 и 7 рассчитанный показатель оказался ниже значения cut off=1,115%, что говорит об отсутствии у данных людей специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, используя предложенный нами способ, по разнице между уровнем индуцированной антигенами N-белка вируса SARS-CoV-2 экспрессии антигена CD107a на CD8high Т-лимфоцитах и уровнем спонтанной экспрессии антигена CD107a, можно выявлять наличие и количественно оценивать специфический клеточный иммунитет к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2. Рассчитанный пороговый критерий (cut off=1,115%) позволяет с чувствительностью 100% и специфичностью 94,74% разделять людей имеющих и не имеющих специфический клеточный иммунитет к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2. Метод прост в исполнении и позволяет получать количественные результаты на следующий день после взятия крови на анализ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Titov A., Shaykhutdinova R., Shcherbakova O.V., Serdyuk Y.V., Sheetikov S.A., Zornikova K.V., Maleeva A.V., Khmelevskaya A., Dianov D.V., Shakirova N.T., Malko D.B., Shkurnikov M., Nersisyan S., Tonevitsky A., Khamaganova E., Ershov A.V., Osipova E.Y., Nikolaev R.V., Pershin D.E., Vedmedskia V.A., Maschan M., Ginanova V.R., Efimov G.A. Immunogenic epitope panel for accurate detection of non-cross-reactive T cell response to SARS-CoV-2. JCI Insight, 2022, Vol. 7(9):e157699. doi: 10.1172/jci.insight.l57699
2. Wang F., Hou H, Luo Y., Tang G., Wu S., Huang M, Liu W., Zhu Y, Lin Q., Mao L., Fang M., Zhang H., Sun Z. The laboratory tests and host immunity of COVID-19 patients with different severity of illness. JCI Insight. 2020;5(10):e137799. https://doi.org/10.1172/jci.insight.137799.
3. Le Bert, N., Tan, A.T., Kunasegaran, K., Tham, C.Y.L., Hafezi, M., Chia, A., Chng, M.H.Y., Lin, M., Tan, N., Linster, M., Chia, W.N., Chen, M.C., Wang, L.-F., Ooi, E.E., Kalimuddin, S., Tambyah, P.A., Low, J.G.-H., Tan, Y.-J., Bertoletti, A. (2020) SARS-CoV-2-specific T cell immunity in cases of COVID-19 and SARS, and uninfected controls, Nature, 584, 457-462. doi: 10.1038/s41586-020-2550-z
4. Ng, O.W., Chia, A., Tan, A.T., Jadi, R.S., Leong, H.N., Bertoletti, A., and Tan, Y.J. (2016) Memory T cell responses targeting the SARS coronavirus persist up to 11 years post-infection, Vaccine, 34, 2008-2014. doi: 10.1016/j.vaccine.2016.02.063
5. Патент RU 2762616 C1 Российской Федерации СПК G01N 33/533 (2021.08); G01N 33/577 (2021.08); A61B 5/145 (2021.08) Способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам S-белка вируса SARS-CoV-2 / А.П. Топтыгина; заявитель и патентообладатель ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (RU), заявл. 22.09.2021, опубл. 21.12.2021 Бюл. №36 -, 12 с.: с ил.
Claims (16)
- Способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2, характеризующийся тем, что последовательно выполняют следующие этапы:
- - из венозной крови пациентов методом градиентного центрифугирования выделяют фракцию мононуклеаров;
- - отмывают центрифугированием в среде RPMI-1640 при 600g 10 мин;
- - надосадок удаляют и к мононуклеарам добавляют 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глютамина, гентамицин и 10% эмбриональной телячьей сыворотки;
- - в качестве контрольной пробы в лунку стерильного плоскодонного 96-луночного планшета вносят 3х105 суспензию мононуклеаров, раствор моненсина в конечной концентрации 10 мкМ и моноклональные антитела к антигену CD107a-PE-Cy5 в конечном разведении 1:100;
- - для опытной пробы используют лунки 96-луночного планшета от набора для определения антител к N-белку вируса SARS-COV-2 методом ИФА, в которых на дне лунок сорбирован N-белок коронавируса;
- - перед внесением суспензии мононуклеаров лунки из набора для ИФА стерилизуют с помощью УФ-облучения в стерильных условиях в течение 30 мин;
- - вносят суспензию клеток, раствор моненсина и антитела в тех же количествах, что и в контрольной пробе;
- - пробы инкубируют 20 ч во влажной атмосфере и 5% CO2 при 37°С;
- - после инкубации клетки ресуспендируют, переносят в пробирки типа эппендорф, отмывают центрифугированием при 300g 3 мин в забуференном фосфатами физиологическом растворе с добавлением 0,02% азида натрия и 0,02% Na2-ЭДТА и надосадок удаляют;
- - клетки окрашивают антителами к антигену CD8-FITC при 4°С в течение 20 мин в темноте, затем повторно отмывают центрифугированием при тех же условиях, добавляют CellWash раствор для цитометрии и ресуспендируют;
- - полученную суспензию клеток анализируют с помощью проточного цитометра, где в каждой пробе подсчитывают 50000 клеток;
- - в процессе анализа выделяют лимфоидный гейт - G1, а в нем в режиме FITC-SSS выделяют гейт лимфоцитов, высокоэкспрессирующих антиген CD8 (CD8high) - гейт G2;
- - в гейте G2 на графике CD107a-PE-Cy5 против CD8-FITC регистрируют облако дважды положительных клеток, где полученное число отражает процент цитотоксических лимфоцитов, распознавших антигены N-белка вируса SARS-CoV-2 относительно общего количества CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов;
- - затем из результата, полученного в опытной пробе, обозначающего уровень дегрануляции, индуцированной N-белком, вычитают результат, полученный в контрольной пробе, представляющий собой уровень спонтанной дегрануляции, и полученную разницу сравнивают с рассчитанным значением cut off, равным 1,115%;
- - если полученная разница у пациента превышает 1,115%, это свидетельствует о наличии у него специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-CoV-2 в количестве, равном полученной разнице, а если разница составляет менее 1,115%, это свидетельствует об отсутствии у пациента специфического клеточного иммунитета к антигенам N белка вируса SARS-CoV-2.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818080C1 true RU2818080C1 (ru) | 2024-04-24 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021163398A1 (en) * | 2020-02-14 | 2021-08-19 | Epivax, Inc. | T cell epitope clusters and related compositions useful in the prevention, diagnosis, and treatment of covid-19 |
| RU2762616C1 (ru) * | 2021-09-22 | 2021-12-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам S-белка вируса SARS-COV-2 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021163398A1 (en) * | 2020-02-14 | 2021-08-19 | Epivax, Inc. | T cell epitope clusters and related compositions useful in the prevention, diagnosis, and treatment of covid-19 |
| RU2762616C1 (ru) * | 2021-09-22 | 2021-12-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам S-белка вируса SARS-COV-2 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Wu J.L., Kuan I.I., Guo J.Y., Hsu W.C., Tang W.C., Chan H.J., Chen Y.J., Chen B.C., Wu H.C., Liao J.C. SARS-CoV-2 N protein mediates intercellular nucleic acid dispersion, a feature reduced in Omicron. iScience. 2023 Feb 17;26(2):105995. doi: 10.1016/j.isci.2023.105995. Epub 2023 Jan 16. PMID: 36687314; PMCID: PMC9841735. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Moore et al. | A 63-year-old woman with a history of non-Hodgkin lymphoma with persistent SARS-CoV-2 infection who was seronegative and treated with convalescent plasma | |
| Cirone et al. | Human herpesvirus 6 and multiple sclerosis: A study of T cell cross‐reactivity to viral and myelin basic protein antigens | |
| JP4515257B2 (ja) | ヒト型結核菌に対する暴露をテストする方法 | |
| LaVergne et al. | Ebola-Specific CD8+ and CD4+ T-Cell responses in sierra leonean ebola virus survivors with or without post-ebola sequelae | |
| Noh et al. | Longitudinal assessment of anti-SARS-CoV-2 immune responses for six months based on the clinical severity of COVID-19 | |
| CA3065952A1 (en) | Systems and methods for determining the risk of severe allergic reactions | |
| Kijlstra | The value of laboratory testing in uveitis | |
| AU2013301368A1 (en) | Method for the direct detection of Mycobacterium tuberculosis | |
| WO2022049600A1 (en) | Methods for assessing t cell-specific immune response against sars-cov-2, and implementations thereof | |
| RU2818080C1 (ru) | Способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам N-белка вируса SARS-COV-2 | |
| JP2015513100A (ja) | Ｈｉｖ特異的ｔ細胞応答のモニタリング方法 | |
| RU2762616C1 (ru) | Способ определения и количественной оценки специфического клеточного иммунитета к антигенам S-белка вируса SARS-COV-2 | |
| WO2015095195A1 (en) | Interferon-gamma release assays for diagnosis of invasive fungal infections | |
| US9678071B2 (en) | Detecting latent tuberculosis infections | |
| RU2310851C1 (ru) | Способ диагностики внутриутробных вирусных инфекций у детей | |
| Matsuura et al. | Dynamic acquisition of HTLV-1 tax protein by mononuclear phagocytes: role in neurologic disease | |
| Basem et al. | Detection of Epstein-Barr virus among chronic kidney disease patients in Najaf, Iraq | |
| CN116102629B (zh) | 一种结核分枝杆菌t细胞抗原表位多肽及其应用 | |
| US20230349889A1 (en) | Methods of Determining Immune Response | |
| RU2754340C1 (ru) | Тест-система и способ дифференцированного выявления антител к SARS-CoV-2 | |
| Ali et al. | The Potential Role of Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen-1 (EBNA-1) in Multiple Sclerosis. | |
| Božić et al. | The comparison of SARS-CoV-2 antibody levels in medical personnel induced by different types of vaccines compared to the natural infection | |
| Abdulkadhim et al. | The Study of Biomarkers in Patients Who Were Re-Infected With COVID-19 After Being Vaccinated With (Pfizer or Sinopharm) Vaccine in Basra, Iraq | |
| US20180120330A1 (en) | Pre-symptomatic diagnosis of a viral illness | |
| RU2431675C1 (ru) | Способ получения антигенного препарата из mycobacterium tuberculosis с расширенным спектром серопозитивных фракций в реакции иммуноблотинга |