CN104474548B

CN104474548B - 预防和/或治疗慢性病毒感染的产品及方法

Info

Publication number: CN104474548B
Application number: CN201410664602.7A
Authority: CN
Inventors: 傅阳心
Original assignee: Suzhou Alphamab Co Ltd
Current assignee: Suzhou Alphamab Co Ltd
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2019-07-16
Anticipated expiration: 2034-11-20

Abstract

本发明涉及病毒感染的预防和/或治疗领域,特别是对由慢性病毒感染引起的疾病，例如肝炎的预防和/或治疗。本发明涉及一种能够减少细胞外病毒抗原的试剂及其用途。本发明还涉及一种试剂盒和/或药物，其包含:a)一种或多种能够减少细胞外病毒抗原的试剂；b)针对所述病毒的疫苗；以及c)任选的使用说明书；优选地，在所述试剂盒和/或药物中，所述a)和b)各自被包含在单独的容器中且彼此不相混合。本发明还提供能够减少细胞外病毒抗原的试剂和针对所述病毒的疫苗联合用于制备试剂盒和/或药物的用途，其中所述试剂盒和/或药物用于预防和/或治疗受试者中慢性病毒感染引起的疾病，例如慢性乙型肝炎。

Description

预防和/或治疗慢性病毒感染的产品及方法

技术领域

本发明属于病毒感染的预防和/或治疗领域,特别是对由慢性病毒感染引起的疾病(例如慢性肝炎，特别是慢性乙型肝炎)的治疗。

背景技术

估计全球范围内有二十亿人被乙型肝炎病毒(HBV)感染，并且其中三亿五千万人患有慢性乙型肝炎病毒感染(CHB)。许多慢性乙型肝炎病例的特征在于：慢性活动性肝炎，以及大约四分之一的成年慢性乙型肝炎患者之后死于乙型肝炎病毒相关的肝硬化并发症，甚至是死于肝细胞癌[1,2]。尽管付诸了大量的努力来开发有效的抗病毒剂，未见有成功治疗慢性乙型肝炎的报道，特别是仍没有有效的治疗手段能够清除血清乙型肝炎病毒并产生保护性抗-HBsAg抗体。目前用于乙型肝炎病毒感染的临床疗法包括用核苷/核苷酸类似物或干扰素α(IFNα)进行治疗。二者均能够抑制乙型肝炎病毒复制和降低病毒抗原以及病毒基因组DNA的血清水平，但是它们都不能破坏乙型肝炎病毒诱导的耐受性，也不能诱导抗-HBsAg抗体的产生。因此，目前，治疗完成后的复发是无法避免的结果[3,4]。病毒特异性的获得性应答在慢性乙型肝炎患者中是弱的或者检测不到的[5,6]。持续存在的抗原可能引起病毒特异性T细胞的进行性耗竭以及与更高的病毒负荷相关的更严重的T细胞耗竭[7,8]。然而，诱导这种耐受性的此类病毒蛋白的性质仍不清楚。

HBsAg的血清转化以及产生抗-HBsAg抗体是从慢性乙型肝炎中恢复的临床指征，并且被认为是治疗慢性乙型肝炎的金标准[9,10]。目前的抗-乙型肝炎病毒免疫疗法还不能在慢性乙型肝炎患者中诱导抗-HBsAg抗体的产生[11-14]。乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)被用于预防乙型肝炎病毒的围产期传布以及防止肝移植后乙型肝炎病毒感染的复发[15,16]。明矾吸附的HBsAg是被广泛使用的预防性疫苗，其在90％的未被感染的个体中诱导保护性抗-HBsAg抗体的产生，但是其在HBV携带者或者具有活动性肝炎的慢性乙型肝炎患者中完全没有治疗效果。

发明内容

如上文中所讨论的，目前被广泛使用的预防性乙肝疫苗对于已经感染了乙型肝炎病毒的患者完全没有治疗效果。然而，当前的发明人惊讶地发现，通过破除由持续的病毒感染诱导的耐受，能够将仅有预防效果的乙肝疫苗转化为治疗性疫苗。

当前的发明人考虑到，长期存在的循环HBsAg可能诱导宿主免疫系统的耐受性，而使得所述宿主不再对HBsAg免疫接种产生免疫应答反应。因此，发明人设想清除细胞外长期存在HBsAg可能会改变所述耐受状态并且恢复宿主对于HBsAg疫苗的应答能力。

为了开发出新的治疗策略来破除由持续的感染诱导的耐受，需要了解病毒诱导耐受的机制。而对于了解人类中病毒诱导耐受的机制而言，主要的障碍在于缺少适当的动物模型，这种适当的动物模型应当能够有效且准确地模拟持续的病原体感染和免疫耐受。之前，当前的发明人报道了通过在具有免疫能力的小鼠中进行AAV8/HBV1.3感染而建立的HBV-持续性表达模型，其显示出高水平的病毒血症和循环病毒抗原，正常的丙氨酸氨基转移酶(ALT)以及对临床上使用的预防性疫苗的耐受，这些特征均与人CHB患者相似[17]。乙型肝炎病毒相关抗原持续至少6个月而不在此模型中引起明显的肝损伤[17]。重要地，在此模型中，血清HBsAg能够持续处于高水平(>μg/ml的水平)，这与大多数HBV携带者相似。与慢性乙型肝炎患者类似，在此模型中发现了乙型肝炎病毒特异性免疫耐受性，并且甚至在重复进行免疫接种后仍未发现HBsAg血清转化或者抗-HBs抗体的产生。通过利用这一模型，当前的发明人研究了从宿主中清除细胞外HBsAg对于在免疫耐受性HBV携带者小鼠中重建抗病毒免疫性的影响。

在本研究中，发明人开发出了简单但强效的组合治疗策略，其成功地破坏了病毒抗原诱导的耐受性并且将仅有预防效果的乙肝疫苗转化称为了治疗性疫苗，其中，发明人通过用抗体预处理经感染的宿主清除了循环抗原，从而恢复了免疫耐受宿主对于疫苗的保护性应答。

在此项工作中，当前的发明人发现了免疫耐受状态与HBsAg的水平相关。从宿主中清除HBsAg将随时间逆转HBV诱导的耐受并且逐渐允许宿主对疫苗有应答。当前的发明人发现了在施用抗体以清除HBsAg 4周之后，AAV/HBV携带者小鼠能够对疫苗有应答，特别令人惊讶的是，即使是对于常规的预防性疫苗也有应答。重要的是，这一新颖而简单的策略可被用于将预防性疫苗转变为治疗性疫苗，并且该策略也可能适用于其它的慢性感染或持续性感染。

本申请中的结果表明，清除循环HBsAg数周将使得宿主响应于免疫接种，而具有不完全和/或瞬时病毒减少的小鼠不能响应于免疫接种，并且没有观察到耐受的逆转。与此观察结果一致的是，长时间使用抗病毒药物来抑制HBV复制能够恢复HBV特异性T细胞的体外反应性，但是没有逆转离体HBV特异性T细胞应答[19]。虽然人们对于通过创造无抗原环境来克服T细胞耐受的机制并不完全清楚，本申请的数据支持了下述观点：清除慢性感染宿主中的耐受原能够逆转由病毒诱导的耐受并且允许宿主对之前不反应的疫苗产生免疫应答反应。虽然现有的抗-HBV药物抑制病毒复制并且减少DNA负荷，但是它们不能有效地清除现存的细胞外HBsAg，而本发明中使用的中和性抗体联合常规预防性疫苗的治疗却能够实现有效地清除现存的细胞外HBsAg并且在受试者中产生抗-HBsAg抗体，从而成功地治疗慢性乙型肝炎。

虽然人们进行了巨大的努力来开发抵抗慢性病毒(例如HBV)感染的治疗性疫苗，长久以来，临床的结果仍然是令人失望的。基于HBsAg的乙型肝炎DNA疫苗在患者中没能诱导产生持续的治疗效果，虽然其在免疫接种的过程中诱导了T细胞应答[20]。测试抗原-抗体复合疫苗的大型临床试验显示出，其增加了HBeAg血清转化的发生；然而，与其它的试验相似，没有患者出现保护性抗-HBsAg抗体应答[21]。在本研究中，当前的发明人设计了简单但实用的方案，其至少成功地实现了下列两个目标：1)中和抗体(NAb)处理有效地中和了循环抗原(例如HBsAg)，这在淋巴组织中提供了相对无抗原的窗口，其允许免疫细胞恢复其对疫苗响应的能力；2)一旦通过HBsAg耗竭逐渐降低了宿主的耐受程度，目前所使用的现有HBV疫苗(甚至完全无治疗效果的预防性HBV疫苗)在促进HBV携带者宿主产生免疫应答方面便是有效的。因此，用中和性抗体或通过其它减少细胞外抗原的方式(例如抗病毒治疗)对经慢性感染的宿主进行延长的治疗将是关键性的第一步，其后继以适当的免疫接种作为重要的第二步来诱导保护性免疫应答，激活自身的免疫力进行持续的病毒控制。因此，适当的组合治疗将最终清除持续性的病毒感染。

可选地，为了进一步提高所述组合治疗方案的效率和针对性，在进行治疗前，可首先通过向来自受试者的样品(例如血液样品)施用一种或多种针对不同血清亚型的检测抗体来快速诊断所述受试者体内病毒所属的血清亚型(例如，本发明的抗体H可用于诊断ayw和adr亚型)。特别地，所述血清亚型包括但不限于，例如adr、adw、ayr或ayw亚型。

因此，在一个方面，本发明提供了一种能够减少细胞外病毒抗原的试剂，优选地，其为所述病毒抗原的中和性抗体。在一个具体的实施方式中，所述中和性抗体为乙肝表面抗原的中和抗体。在本发明的优选实施方式中，所述乙肝表面抗原的中和抗体为抗体H、其片段和/或其变体。本发明还提供能够编码所述试剂(例如病毒抗原的中和性抗体，如乙肝表面抗原的中和抗体，优选抗体H、其片段和/或其变体)的核酸分子。

在另一个方面中，本发明提供一种药物组合物或试剂盒，其包含本发明的能够减少细胞外病毒抗原的试剂(例如病毒抗原的中和性抗体，如乙肝表面抗原的中和抗体，优选抗体H、其片段和/或其变体)以及任选的可药用载体。

在又一个方面中，本发明提供本申请中所述的能够减少细胞外病毒抗原的试剂(例如乙肝表面抗原的中和抗体，优选抗体H、其片段和/或其变体)用于制备试剂盒和/或药物组合物的用途，其中所述试剂盒和/或药物组合物用于降低受试者中对于所述病毒抗原(例如乙肝表面抗原)的耐受性，和/或用于预防和/或治疗受试者中慢性病毒感染引起的疾病，例如慢性乙型肝炎。

在另一个方面，本发明提供一种试剂盒和/或药物，其包含:

a)一种或多种能够减少细胞外病毒抗原的试剂；

b)针对所述病毒的疫苗；以及

c)任选的使用说明书。

优选地，在所述试剂盒和/或药物中，所述a)和b)各自被包含在单独的容器中且彼此不相混合。

任选地，所述试剂盒和/或药物还可包含d)一种或多种针对不同血清亚型的检测抗体，其用于快速诊断受试者体内病毒所属的血清亚型。优选地，在所述试剂盒和/或药物中，所述a)、b)和d)各自被包含在单独的容器中且彼此不相混合。

在又一个方面中，本发明提供本申请中所述的能够减少细胞外病毒抗原的试剂和针对所述病毒的疫苗联合用于制备试剂盒和/或药物的用途，其中所述试剂盒和/或药物用于预防和/或治疗受试者中慢性病毒感染引起的疾病，例如慢性乙型肝炎。

在具体的实施方案中，本发明的试剂、药物组合物、试剂盒和/或药物在所述受试者中降低耐受性和/或在免疫接种后产生保护性应答，例如重建所述受试者对于所述病毒抗原(特别是乙型肝炎病毒表面抗原)的免疫性。

在又一个方面，本发明涉及预防和/或治疗病毒感染的方法，所述方法包括下列步骤：

a)向动物或人施用预防和/或治疗有效量的上文中所述的本发明的试剂、药物组合物、试剂盒和/或药物。

在一个具体的实施方案中，所述方法包括下列步骤：

a)向有需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的、本发明的能够减少细胞外病毒抗原的试剂；特别地，可施用例如1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，1周，2周，3周，4周，5周，6周或更长时间；以及

b)然后，向所述受试者施用预防和/或治疗有效量的、本发明的针对所述病毒的疫苗。

在一个具体的实施方式中，在所述步骤a)之前还包括下列步骤：

i)从受试者获取样品，例如血液样品；

ii)通过向获自受试者的所述样品施用检测抗体来判断所述受试者体内病毒所属的血清亚型；以及

iii)根据步骤ii)的检测结果确定需要施用的所述能够减少细胞外病毒抗原的试剂。

所述预防和/或治疗病毒感染的方法可用于预防和/或治疗由于慢性感染的病原体(例如HBV)引起的疾病或病况。所述疾病或病况包括但不限于乙型肝炎，例如慢性乙型肝炎。

在具体的实施方案中，所述方法用于重建受试者对于所述病毒抗原(特别是乙型肝炎病毒表面抗原)的免疫性。

在其它的实施方案中，所述方法用于在受试者(例如慢性乙型肝炎患者)中建立免疫记忆。

病毒抗原

在本发明的情境中，所述病毒抗原可以是例如肝炎病毒抗原，如乙肝病毒抗原，特别是乙肝表面抗原，所述乙肝表面抗原可以具有任何血清亚型，包括但不限于乙肝表面抗原adr、adw、ayr和ayw亚型。

能够减少细胞外病毒抗原的试剂

在本发明的情境中，能够减少细胞外病毒抗原的试剂可以是，包括但不限于针对所述病毒抗原的抗体，例如中和抗体。特别地，所述中和抗体可以是乙肝表面抗原的一种或多种中和抗体。在具体的实施方式中，所述中和抗体为抗体H、其免疫原性片段和/或其变体。

在本申请的情境中，抗体H、其免疫原性片段和/或其变体是指乙肝表面抗原的中和抗体。具体而言，本发明的抗体H包含重链和轻链，其中重链的可变结构域包含如SEQ IDNO:1中所示的CDR-1序列、如SEQ ID NO:2中所示的CDR-2序列和如SEQ ID NO:3中所示CDR-3序列，并且轻链的可变结构域包含如SEQ ID NO:4中所示的CDR-1的序列、如SEQ ID NO:5中所示的CDR-2序列和如SEQ ID NO:6中所示的CDR-3的序列。所述抗体H的重链可变区(VH)序列如SEQ ID NO:8所示，抗体H的轻链可变区(VL)序列如SEQ ID NO:7所示。

此外，在本发明的情境中，所述中和抗体还涵盖上述抗体的衍生物。所述衍生物可以是例如下述中和抗体中的一种或多种：其能够特异性地消除其目标抗原引起的耐受性。例如，所述中和抗体对于其各自的目标病毒抗原的亲和力与抗体H、其免疫原性片段或其变体对于HBsAg的亲和力相当(所述亲和力可以为例如Kd≤1x10^-8M，优选Kd≤1x10^-9M)。

具体地，所述中和抗体可以为例如氨基酸序列与抗体H、其免疫原性片段和/或其变体的氨基酸序列具有至少60％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)序列同一性的抗体。

在一个具体的实施方式中，所述中和抗体的重链和/或轻链可变区的氨基酸序列分别与抗体H、其免疫原性片段和/或其变体的重链和/或轻链可变区的氨基酸序列具有至少60％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)的序列同一性。

在其它的实施方式中，所述中和抗体的轻链和/或重链互补决定区(CDR)的氨基酸序列分别与抗体H、其免疫原性片段和/或其变体的轻链和/或重链互补决定区(CDR)的氨基酸序列相同或具有至少60％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)的序列同一性。

在具体的实施方式中，本发明中的所述中和抗体的重链CDR1－3的氨基酸序列分别与抗体H、其免疫原性片段和/或其变体的重链CDR1－3的氨基酸序列相同或具有至少60％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)的序列同一性；和/或所述中和抗体的轻链CDR1－3的氨基酸序列分别与抗体H、其免疫原性片段和/或其变体的轻链CDR1－3的氨基酸序列相同或具有至少60％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)的序列同一性。在又一个具体实施方式中，所述中和抗体的重链和轻链CDR1-3的氨基酸序列分别与抗体H、其免疫原性片段和/或其变体的重链和轻链CDR1-3的氨基酸序列相同或具有至少60％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)的序列同一性。

在另外的实施方式中，所述中和抗体的重链和/或轻链可变区的氨基酸序列是通过对抗体H、其免疫原性片段和/或其变体的重链和/或轻链可变区的氨基酸序列进行一个或多个(例如一个或几个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)氨基酸的添加、缺失和/或置换而得到的。在其它的实施方式中，所述中和抗体的重链CDR1－3的氨基酸序列是通过对抗体H、其免疫原性片段和/或其变体的重链CDR1－3的氨基酸序列进行一个或多个(例如一个或几个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)氨基酸的添加、缺失和/或置换而得到的。在另外的实施方式中，所述中和抗体的轻链CDR1－3的氨基酸序列是通过对抗体H、其免疫原性片段和/或其变体的轻链CDR1－3的氨基酸序列进行一个或多个(例如一个或几个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)氨基酸的添加、缺失和/或置换而得到的。在又一个具体实施方式中，所述中和抗体的轻链CDR1－3和重链CDR1－3的氨基酸序列是通过对抗体H、其免疫原性片段和/或其变体的轻链CDR1－3和重链CDR1－3的氨基酸序列进行一个或多个(例如一个或几个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)氨基酸的添加、缺失和/或置换而得到的。

优选地，所述氨基酸置换为保守性氨基酸的置换。即，一种氨基酸被具有相似形状和电荷的氨基酸替代。保守置换在本领域是公知的，包括例如如下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸,亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。

在具体的实施方式中，所述一个或多个(例如一个或几个)氨基酸的添加、缺失或置换可发生在选自下述一个或多个位置的氨基酸处：对应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第4位的氨基酸；对应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第8位的氨基酸；对应于SEQ IDNO:5所示氨基酸序列的第3位的氨基酸和/或对应于SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的第9位的氨基酸。

在一个具体的实施方式中，所述抗体H的变体为抗体H2，其重链可变区的CDR1-3分别如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9所示；其轻链可变区的CDR1-3分别如SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10所示。

在另一个具体的实施方式中，所述抗体H的变体为抗体H5或H19，其重链可变区的CDR1-3分别如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:11所示；其轻链可变区的CDR1-3分别如SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

在又一个具体的实施方式中，所述抗体H的变体为抗体H16，其重链可变区的CDR1-3分别如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区的CDR1-3分别如SEQID NO:4,SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:6所示。

本发明的发明人发现，所述抗体H的变体，例如抗体H2、抗体H5、抗体H16和抗体H19具有与抗体H相当的亲和性，如图9(a)和图9(b)所示。

在具体的实施方式中，当所述试剂盒和/或药物中包含针对不同血清亚型的检测抗体时，首先通过向来自受试者的样品(例如血液样品)施用所述检测抗体来判断所述受试者体内病毒所属的血清亚型。进一步地，根据所述判断结果来确定需使用的中和抗体。特别地，当所述病毒抗原为乙肝表面抗原时，所述血清亚型包括但不限于，例如adr、adw、ayr或ayw亚型。在具体的实施方式中，所述检测抗体包括但不限于例如抗体H、其免疫原性片段或其变体。在特别的实施方式中，对应于adr、adw、ayr或ayw血清亚型可以使用的中和抗体分别为例如抗体H、其免疫原性片段或其变体或它们的衍生物，它们可以中和ayw和adr亚型的抗原。所述衍生物所涵盖的中和抗体为如上文中所定义的。

在一个具体的实施方式中，所述试剂盒和/或药物中所包含的能够减少细胞外病毒抗原(例如肝炎病毒抗原，特别是乙肝表面抗原(HBsAg))的试剂(例如病毒抗原的中和抗体，特别是肝炎病毒抗原的中和抗体，特别是乙肝表面抗原(HBsAg)的中和抗体，例如抗体H、其免疫原性片段或其变体)的量足以在例如1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，1周，2周，3周，4周，5周，6周或更长时间内使得受试者中循环病毒抗原(例如乙肝表面抗原)的量持续下降，直至低于常规检测手段(例如ELISA法)的检测阈值(例如检测值下限500pg/ml)。

病毒疫苗

在本发明的情境中，所述病毒疫苗包括但不限于肝炎疫苗，特别是乙肝疫苗，例如预防性乙肝疫苗。在本发明的情境中，所述预防性乙肝疫苗可以例如包含重组HBsAg、明矾以及任选的其它佐剂和/或赋形剂。在具体的实施方式中，所述病毒疫苗可以是例如HBsAg/明矾，HBsAg/明矾或HBsAg与CpG以有效剂量相混合,EngerixB或EngerixB与CpG以有效剂量相混合。

在一个具体实施方式中，所述试剂盒和/或药物中所包含的疫苗(例如乙型肝炎疫苗)的量足以在受试者中根据本发明产生保护性应答，例如产生治疗和/或预防有效量的病毒抗体(例如抗-HBsAg抗体)；特别地，所述乙型肝炎疫苗和/或其含量足以在受试者中产生HBsAg-特异性CTL应答。

检测抗体

在具体的实施方式中，当所述试剂盒和/或药物中包含针对不同血清亚型的检测抗体时，首先通过向来自受试者的样品(例如血液样品)施用所述检测抗体来判断所述受试者体内病毒所属的血清亚型。进一步地，根据所述判断结果来确定需使用的中和抗体。

特别地，当所述病毒抗原为乙肝表面抗原时，所述血清亚型包括但不限于，例如adr、adw、ayr或ayw亚型。在具体的实施方式中，所述检测抗体包括但不限于例如抗体H、其免疫原性片段或其变体。在特别的实施方式中，对应于adr、adw、ayr或ayw血清亚型可以使用的中和抗体分别为例如抗体H、其免疫原性片段或其变体或它们的衍生物，它们可以中和ayw和adr亚型的抗原。所述衍生物所涵盖的中和抗体为如上文中所定义的。

使用说明书

在又一个实施方式中，所述试剂盒和/或药物中包含使用说明书，其中指示在向受试者施用所述针对病毒的疫苗(例如预防性乙型肝炎疫苗)之前施用所述能够减少细胞外病毒抗原的试剂(例如本发明的乙肝表面抗原(HBsAg)中和抗体)至少1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，1周，2周，3周，4周，5周，6周或更长时间。此外/备选地，在一个具体的实施方式中，所述说明书中指示首先通过向来自受试者的样品(例如血液样品)施用所述检测抗体来判断所述受试者体内病毒所属的血清亚型，然后根据所述判断结果来确定需使用的中和抗体。特别地，所述血清亚型包括但不限于，例如adr、adw、ayr或ayw亚型。

受试者

在本申请中，术语“受试者”可以指例如，包括但不限于脊椎动物例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物或鱼，例如小鼠、大鼠、兔；更有利地为灵长类动物或人；产生食物或产生饲料的动物；例如但不限于牛、犬、猫科动物、山羊、绵羊、猪、马和禽类；特别地，所述受试者患有慢性感染性疾病，例如慢性乙型肝炎。

本发明还涉及上述各种具体实施方式的各种任意组合。

附图说明

图1.循环HBsAg诱导的体液免疫耐受依赖于抗原水平

用0.5x10¹⁰vg(病毒基因组拷贝)或1.0x10¹¹vgAAV8/HBV1.3(血清型ayw,基因型D)/小鼠感染C57/BL6小鼠(5-7周龄，雄性)(1A和1B)或者向所述小鼠流体动力学地注射0.25μg或5.0μg的pAAV/HBV1.2质粒(1C和1D)，如本申请说明书的实施例部分所详细描述的。一个月之后，将小鼠分为高抗原血症组(>1000.0ng/ml)和低抗原血症组(<50.0ng/ml)，然后两次皮下免疫接种1μg EngerixB/小鼠，或单次免疫接种2μg EngerixB/小鼠，如所示的；通过标准的ELISA随时间监测HBsAg(A、C)和抗-HBs(B、D)的血清水平。

图2.HBsAg是慢性乙型肝炎模型中主要的体液免疫耐受原

用5.0x 10¹⁰μgAAV8/HBV1.3/小鼠感染C57/BL6小鼠(雄性,n＝3-4小鼠/组)，4周后，向所述小鼠皮下免疫接种2μg EngerixB混合30μg CpG，如所示的；通过标准ELISA监测HBsAg(A)。向野生型小鼠和AAV/HBV乙肝携带者小鼠分别皮下免疫接种下列疫苗：EngerixB(2μg)，EngerixB+CpG(2μg+50ug)，明矾吸附的重组的HBsAg(2μg)和明矾吸附的HCV核心蛋白(2μg)，如图所示；通过标准ELISA监测抗-HBs(B)和抗-HCV核心蛋白(C)的血清水平。D)在感染AAV8/HBV1.3后4周或8周时监测抗-HBs和抗-HBc的血清水平。

图3.HBsAg的持续时间促成诱导或破除对HBsAg的耐受

A)使C57/BL6小鼠静脉内感染2.0x10¹⁰vg AAV8/HBV1.3,然后在所示的时刻用EngerixB(1μg/小鼠)对小鼠进行初始免疫和加强免疫。通过HBsAg ELISA试剂盒监测HBsAg的血清水平，使用相同的ayw HBsAg抗原通过ELISA测定抗-HBs，所述ayw HBsAg抗原是通过将表达质粒转化到293细胞中、并通过蔗糖梯度纯化而制备的。B)将来自AAV/HBV携带者小鼠(感染了1x10¹¹vgAAV8/HBV1.3两个月的C57/BL6小鼠)或WT小鼠的7.0x 10⁷活的脾细胞转移至Rag-/-小鼠，在转移后1周、2周、3周和4周时，用5μg EngerixB对小鼠进行皮下免疫接种(初始免疫)，并且在初始免疫接种后2周进行加强免疫。通过标准ELISA，使用同样的HBsAg涂覆板监测抗-HBs的血清水平。数据代表来自两次独立试验的结果并且表示为平均值±SD。

图4.通过中和HBsAg逆转免疫耐受:新的策略

A)用中和抗体H和疫苗处理HBV携带者小鼠的时间进程的图示。B)通过标准ELISA测定监测不同处理组中HBsAg的血清水平。C)通过ELISA、使用相同的ayw HBsAg抗原测定从新产生的抗-HBs，亚型为IgG2b。D)在最后一次免疫接种后的第21天，通过自动化的生物化学分析仪监测了丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清水平。E)用HE染色对肝切片进行了肝病理学分析。

图5.通过组合疗法重建HBsAg特异性细胞毒性T细胞

A)用中和抗体H和EngerixB+CpG处理HBV携带者小鼠的时间进程示意图，向HBV携带者小鼠腹腔内施用抗体H 1mg/小鼠，2次/周，连续施用5周，然后用EngerixB+CpG(1μg+50μg)进行了免疫接种。B)和C)在加强免疫后第16天时处死小鼠。在用5vg ENV¹⁹⁰/ml或对照肽OVA²⁵⁷处理小鼠之后，通过ELISPots测定监测肝内HBsAg-特异性CTL和监测ALT的血清水平。D)、E)和F)在治疗过程的不同时间点采血取样，之后对血清中HBsAg,HBeAg和HBV的基因组DNA进行的病毒学分析。

图6.慢性乙型肝炎中重建的免疫性是CD4+T细胞依赖性的并且是可转移的

A)脾细胞转移测定的图示。B)将来自非免疫小鼠、或经EngerixB免疫接种的小鼠(在免疫接种后第10天)、或经EngerixB免疫接种的HBV携带者小鼠、或以NAb联合EngerixB方案处理的经恢复的HBV携带者小鼠的5x 10⁷个脾细胞转移至Rag^-/-小鼠，然后在转移的次日用1x10¹⁰vgAAV8/HBV1.3进行攻击。在感染后的第3、14和28天监测血清中HBsAg的水平。C)分别用GK1.5或TIB210耗竭经联合治疗而恢复的小鼠中的CD4+细胞或CD8+细胞，然后转移到Rag^-/-小鼠中，然后在转移的次日用1x 10¹⁰vgAAV8/HBV1.3进行攻击。随时间监测血清中HBsAg的水平。

图7.AAV/HBV携带者模型中病毒抗原和DNA的持续性C57/BL6小鼠(5-7周，雄性)被感染了5.0x10¹⁰vgAAV8/HBV1.3，每月监测HBsAg,HBeAg和基因组DNA的血清水平和肝水平。使用包含2％FBS的1x PBS对样品进行系列稀释，分别使用商购的HBsAg和HBeAg(北京康彻思坦生物技术有限公司，目录号:090148)建立标准曲线,将HBsAg和HBeAg分别标准化为ng/ml和mIU/ml。

图8.EngerixB/CpG在WT小鼠中诱导HBsAg特异性T细胞免疫应答

使C57/BL6小鼠被皮下免疫接种EngerixB(2μg)或EngerixB/CpG(2μg+50μg)，在免疫接种后的第10天，将小鼠处死，并通过ELISPots测定监测引流淋巴结、脾和肝中的HBsAg特异性CTL，将未经免疫接种的幼稚小鼠用作对照，将肽ENV¹⁹⁰和OVA²⁵⁷分别用作刺激物和对照物。

图9.抗体H的变体也能够与乙肝表面抗原HBsAg特异性结合

将5x10E6酵母悬浮于100μl 0.5％BSA/PBS中,将100nM(图9a)或10nM(图9b)的乙肝表面抗原(ayw-bio)和0.4μg抗-c-myc抗体(克隆号:9E10)加入所述100μl酵母悬浮液中，然后将混合物在4℃下避光孵育30分钟。用2ml清洗缓冲液(0.5％BSA/PBS)清洗酵母2次，并将酵母重悬于100μl的0.5％BSA/PBS中。将0.25μg的抗生蛋白链菌素-PE和山羊抗-mIgG-APC加入所述100μl酵母悬浮液中。将所述酵母在4℃下孵育30分钟。孵育后，用2ml清洗缓冲液清洗酵母2次，然后通过流式细胞术分析染色结果。对C-myc阳性酵母群体进行门控用于抗原结合分析。

具体实施方式

在本申请中，“能够减少细胞外病毒抗原(例如乙肝表面抗原)的试剂”是指能够在一定的周期内(例如1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，1周，2周，3周，4周，5周，6周或更长时间内)使得受试者中的循环病毒抗原(例如HBsAg)的量下降至不可检测的任何试剂。例如，所述试剂可以是所述病毒抗原的中和抗体，例如乙肝表面抗原的中和抗体，优选本发明的抗体H、其免疫原性片段或其变体。其中所述检测可以是例如ELISA等常规检测方法。

在本申请中，术语“疫苗”包括任何下述组合物：一旦将其施用给受试者，其保护受试者免受慢性病毒感染(例如慢性乙型肝炎病毒感染)，和/或其防止已经被感染的受试者中相关疾病/病况的进展。这可通过例如，监测受试者中HBsAg的血清转化以及是否产生抗-HBsAg抗体来进行判断。例如，可通过测量血清乙型肝炎病毒DNA的含量、进行标准ELISA测定、按照制造商的说明进行Elispots测定和/或对HBsAg特异性T细胞进行四聚体染色等进行。

在本申请中，适合的容器包括例如袋子、瓶子、小瓶、注射器等。容器可由各种材料形成，例如玻璃或塑料。容器容纳有效治疗响应病况的试剂、药物疫苗、组合物和/或试剂盒，且可具有无菌接入口(例如容器可为具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。

在本申请中，“使得受试者中循环病毒抗原抗原(例如HBsAg)的量不可检测”意指不能通过常规的手段检测到受试者循环系统(例如血液样品)中的所述病毒抗原(例如乙肝表面抗原)(例如低于所述常规检测的阈值，或者在所述常规检测中没有可探测或可见的信号)。所述常规检测手段包括但不限于，例如测量血清乙型肝炎病毒DNA的含量、标准ELISA测定等。

在本申请中，“保护性应答”是指在受试者中产生的、由所述试剂、疫苗、药物和/或试剂盒介导的免疫应答。通常，“保护性应答”或“保护性免疫应答”包括但不限于一种或更多以下效应：产生特别针对包括在目标试剂、药物或疫苗中的抗原的抗体，B细胞，辅助性T细胞，和/或细胞毒性T细胞。优选地，保护性免疫应答使得受试者对于新感染的抵抗力增强和/或使得疾病/病状的临床症状减轻。其可显示为，例如经感染的受试者不显示通常的疾病症状、或所述症状减轻；或者显示为受试者中更快的恢复时间和/或经感染的宿主中降低的病毒滴度。

在本申请中，“HBsAg-特异性CTL应答”是指在受试者中重建、或产生和/或加强HBsAg特异性的细胞毒性T细胞的免疫应答。

在本申请中，“免疫记忆”是指在获得性免疫方面，一度对某抗原(例如HBsAg)发生应答，则在下一次同样的抗原刺激时，可看到更强烈的应答。

在本申请中，“耐受性”或“免疫耐受性”是指对特定抗原(例如HBsAg)的无反应或低反应状态。例如，受试者不能显示出或显示出较弱的针对特定抗原(例如HBsAg)的免疫应答(例如体液免疫应答)，疫苗不能降低受试者中的血清抗原(例如HBsAg)含量或诱导受试者中的特异性抗体应答(例如抗-HBs抗体应答)。

在本申请中，“同一性”或“一致性”可互换地使用，其可应用多种由NCBI(Bethesda,Maryland)开发的公开可得的软件工具计算得到。示例性的工具包括AltschulSF等的启发式算法(J Mol Biol,1990,215:403-410),也称为BLAST。Pairwise和ClustalW比对(BLOSUM30矩阵设置)以及Kyte－Doolittle水疗分析，其可应用公开的(EMBL,Heidelberg,Germany)和商业来源(例如来自Oxford Molecular Group/GeneticsComputer Group,Madison,WI的MacVector序列分析软件)的软件而进行。

在本申请中，“可药用的载体”是指不会在所施用的细胞或受试者中引发过敏反应或其他不适影响，并且不会影响药物活性的载体。合适的可药用载体包括但不限于，例如，下列中的一种或多种：水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物，以及上述物质的组合。可药用载体还可进一步包括能提高有效成分(例如核酸、多肽、病毒颗粒或细胞)的保存期限或效用的微量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。

本发明中的“中和抗体”是指任何能够清除或显著降低目标病毒抗原结合毒力的抗体或抗体片段。然而，本领域技术人员将会明了，本发明中的所述中和抗体是用于清除预先存在的病毒抗原的，因此，凡是能够中和目标病毒抗原(例如HBsAg)的抗体均可用于本发明的目的。根据具体的实验要求和应用目的，本领域技术人员完全有能力选择合适的中和抗体，从而达到降低免疫耐受性的目的。

优选的，所述中和抗体为本发明的抗体H、其免疫原性片段或其变体，如上文中所详述的。

本发明中的“试剂盒”指任何包含本发明所述的试剂(例如中和抗体)、疫苗和/或检测抗体的组合、装置或产品。特别地，其设计使得所述能够减少细胞外病毒抗原的试剂(例如乙肝表面抗原的中和抗体)、所述疫苗和/或所述检测抗体各自被包含在单独的容器中且彼此不相混合。

本发明中的“预防有效量”或“治疗有效量”指足以防止或减轻因病毒感染而引起的病状或病况的量。

本发明所述的试剂盒(例如其中包含的试剂(例如中和抗体和/或检测抗体)和/或疫苗)的施用方式可以是传统的施用途径，包括但不限于静脉滴注、肌肉注射、阴道、口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径等。优选的，所述施用途径是注射及输注形式。

本发明中所涉及的疫苗、试剂和/或药物可以各种形式存在，包括但不限于固体、半固体和液体的剂型，例如片剂、丸剂、粉末、溶液、分散液或悬浮液、脂质体、栓剂、注射用及输注用溶液。本领域技术人员能够根据具体的需要选择合适的形式。

适合通过肠胃外途径注射的本发明的疫苗、试剂和/或药物可能含有符合药物制备要求的无菌水或非水溶液、气雾剂、悬浮液或乳剂，可在临用时重悬成可注射的溶液或气雾剂的无菌粉剂。如适合的水性和非水性载体，工具和各种稀释液如水、乙醇、多羟基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙烯二醇、丙三醇及其类似物)，合适的混合物，菜油(如橄榄油)，和可用于注射的有机脂，如乙烷油酸，如使用卵磷脂衣壳维持药物的合适流动性，如使用气雾剂、表面活性剂以维持合适的颗粒尺寸。

本发明所述的疫苗、试剂和/或药物还可含有一些起保护性、保湿、乳化和气雾化的佐剂，也可以含有预防微生物污染的速溶成分，如各种抗细菌试剂、抗真菌试剂，如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸及类似物。也可以包括维持渗透压的试剂，如糖、NaCl及其类似物。还可使用延长吸附的试剂来延长注射用药物成分吸附时间，如单硬脂酸盐和凝胶等。

口服固相剂型包括胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。这些固相剂型中的活性成分至少混有一种传统的惰性药物赋形剂(或载体)如柠檬酸钠、磷酸钙，或(a)填充剂或添加剂如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(c)湿润剂，如甘油；(d)碎裂剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯粉或木薯粉；(e)缓凝剂，如石蜡；(f)促吸收剂，如四氨基混合物；(g)保湿剂，如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，如高岭土和斑脱土；(i)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，硫酸十二烷醇钠，或其上述物质的混合物。在片剂和胶囊剂型中，可能还含有缓冲剂。

固相剂型还可以制成改良释放或脉冲释放剂型，其是通过在上述提到的各种直接释放赋形剂中添加一些能改变药物释放速率的赋形剂而形成，可以包含在上述剂型中也可以做成外衣的形式。速率释放改造剂包括羧丙基甲基纤维素，甲基纤维素，碳甲基纤维素钠，纤维素乙烷，醋酸纤维素，聚乙烯氧化物，黄原胶糖，异丙烯酸氨共聚物，氢化调味油，巴西棕榈蜡，石蜡，邻苯二酸醋酸纤维素，邻苯二甲酸羧丙基甲基纤维素，甲基丙烯酸共聚物或上述物质的混合物。改良释放和脉冲释放剂型可能含有一种或多种具有改良释放速率的赋形剂。

用于口服的液体剂型，包括符合药物要求的乳状剂、溶液、悬浮液、糖浆和西也剂等。除了活性成分，所述液体剂型也可含有本领域常用的一些惰性溶液，如水或其它溶剂，可溶性试剂和乳化剂，如乙烷基醇，异丙基醇，乙烷基碳酸盐，苯基安息香酸盐，丙稀乙二醇，1,3-丁烯乙二醇，油，特别是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄榄油，调味油和芝麻油，甘油，氢糠基醇，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物质的混合物或类似的物质。

除了这些惰性稀释液，所述疫苗、试剂和/或药物也可包括保湿剂、乳化剂、悬浮剂、糖化剂、调味剂和香味剂等佐剂。另外，所述药物组合物还可包括乙氧基化均聚乙醇，聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂，微晶纤维素，间氢氧化铝，膨润土，琼脂聚合物和黄芪胶，或这些物质的混合物之类的悬浮剂。

本发明所述的疫苗、试剂和/或药物也可被制成适合用于兽用预防和/或治疗的疫苗、试剂和/或药物，或符合兽用的溶剂或初成药，并根据普通兽医和兽医从业者的要求制成最适合某种特定动物的给药剂量和途径药物的合适剂型。

本发明所述的疫苗、试剂、药物和/或试剂盒还可以与其他的抗病毒试剂或疗法联合施用，而用于预防或治疗由病毒感染引起的疾病，例如物理或化学疗法。其中，其它抗病毒试剂包含但不限于利巴韦林,金刚烷,羧基脲，IL-2,IL-12和五羧链胞酸。

本领域技术人员可以通过增加或减少持续或间断施用本发明的疫苗、试剂、药物和/或试剂盒的时间、剂量或施用策略等，根据具体的需求和受试者的个体情况，容易地选择合理的施用方案。

下述的优选实施例仅用于阐释本发明的目的，而不以任何方式限制本申请的保护范围。

实施例

材料与方法

小鼠

C57BL/6j小鼠，Rag1^-/-小鼠以及乙型肝炎病毒转基因小鼠(HBV Tg，在本申请中也称为携带者小鼠或携带者)[18]获自模型动物研究中心(中国南京)。所有的小鼠都被保存在中国科学院生物物理所的BSL-2动物实验设施中，其中所述小鼠在特定的无病原体条件下、并且其保存环境中的温度、光线、湿度和营养条件都受到严格控制。按照动物护理机构委员会以及北京实验动物护理协会建立的指南的要求进行所有的实验。

试剂

低内毒素腺相关病毒8/乙型肝炎病毒(AVV8/HBV)1.3病毒(基因型D(血清型ayw))是由北京五加和分子医学研究所有限公司(中国北京)提供的。HBsAg-特异性H2-K^b-受限CTL表位肽VWLSVIWM(ENV¹⁹⁰)和对照肽SIINFEKL(OVA²⁵⁷)是由中国肽有限公司(中国上海)提供的。HBsAg和HBeAg ELISA试剂盒购自科华生物工程股份有限公司(中国上海)。EngerixB购自葛兰素史克生物制品有限公司(新加坡)。2％购自InvivoGen(SanDiego,CA,USA)。表达HBsAg的重组腺病毒是由HEK293细胞产生的并且通过CsCl密度梯度离心纯化。用于测量小鼠IFN-γ分泌性细胞的ELISpots试剂盒购自BD公司(产品目录号：551803)。抗体H，H2，H5，H16和H19，2.4G2,TIB210和GK1.5是在实验室内部制备和纯化的，制备的主要程序如下所述：注射杂交瘤至姥鲛烷预处理过的裸小鼠，在注射后7至14天收获富含特异性抗体的腹水，经过离心，稀释，过滤，最后通过蛋白A或G亲和纯化，溶于PBS，保存于-80℃。EngerixB疫苗购买自葛兰素史克公司，为纯化的酵母来源的乙肝小表面抗原吸附于明矾上而成。CpG由invitrogen公司合成，其磷酸骨架被硫代替换。

乙型肝炎病毒携带者小鼠模型(在本申请中也简称为携带者或携带者模型)

在之前的报道[17]中描述了产生腺相关病毒/乙型肝炎病毒携带者小鼠。通过将不含内毒素的质粒pAAV/HBV1.2流体动力注射(HDI)到5-7周龄的B6雄性小鼠中产生了HDI/乙型肝炎病毒携带者小鼠，如Huang等人所描述的[19]。简要地，将各剂量的pAAV/HBV1.2质粒DNA(通过Qiagen试剂盒提取的)进行稀释，得到的体积等同于小鼠体重的8％，并且在5-8秒内递送全部体积。

中和性抗体的施用

抗体H，H2，H5，H16，H19均为小鼠抗-HBs IgG1单克隆抗体。为了中和循环HBsAg，向HBV携带者小鼠腹膜内注射了1mg的所述抗体，进行所示的时间段，间隔为3天。

测量血清乙型肝炎病毒DNA和氨基转移酶活性

根据制造商的手册(Qiagen,Hilden，德国)，从100μl的小鼠血清中提取了血清乙型肝炎病毒DNA。使用乙型肝炎病毒特异性引物5’-CACATCAGGATTCCTAGGACC-3’(SEQ IDNO:15)和5’-GGTGAGTGATTGGAGGTTG-3’(SEQ ID NO:16)进行了定量实时PCR(Q-RT-PCR)来检测乙型肝炎病毒DNA水平。使用包含质粒的乙肝表面抗原HBs基因来产生标准曲线。使用全自动化生物化学分析仪(中生北控生物科技股份有限公司，中国北京)确定了血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性。

T细胞Elispots测定

在所示的时刻将小鼠处死。分离了引流淋巴结、脾脏和肝脏中的淋巴细胞。在含有DNase I(Roche)的完全培养基中于冰上过夜孵育后，将淋巴细胞稀释为三种细胞浓度并在经抗-IFNγ涂覆的96孔ELISPOT板中一式两份进行培养，其中用HBsAg特异性肽ENV¹⁹⁰或对照肽OVA²⁵⁷作为刺激物。使用ImmunoSpot ELISPOT读取器(ChampSpot III,中国北京)来计数IFNγ分泌细胞(ISCs)/孔的数量并表示为ISC的数量/1x10⁶淋巴细胞。

对HBsAg-特异性T细胞的四聚体染色和Elispots测定

在所示的时刻将小鼠处死，用缀合了PE的四聚体H2-K^b-ENV¹⁹⁰(旷博生物，中国北京)对HBs特异性CD8+T细胞进行了染色，使用2.4G2抗体和7-AAD来分别封闭非特异性结合和排除死亡的细胞。通过FACS Calibur(BD Biosciences,San Jose,CA)检测了病毒特异性CD8+T细胞并且通过FlowJo软件(TreeStar,Ashland,OR)进行了分析。根据制造商的说明(BD Biosciences,San Diego,CA,USA，目录号551083)进行了ELISpots测定。

统计学分析

在GraphPadPrism软件(6.01版本)上进行了统计学分析。使用非配对双尾Student’s t测试来比较两组之间的变量。通过单向ANONA、继以Student’s t测试来分析多组之间的差异。显著性被表示为“*”，P<0.05；“**”，P<0.01；以及“***”，P<0.001。0.05或更低的P值被认为是统计学上显著的。数据代表来自两次独立实验之一的结果，并表示为平均值±SD。

实施例1循环HBsAg诱导的体液免疫耐受依赖于抗原水平

在上文所述的携带者小鼠模型中，HBsAg和HBeAg被持续表达并且血清HBV DNA在这些小鼠中以剂量依赖性的方式为持续阳性，在至少3个月中没有抗HBsAg的抗体并且显示正常的ALT血清水平[17]。在整个研究中使用此新型模型。为了研究循环HBsAg是否以及如何促成由HBV诱导的耐受性，发明人用高剂量(1x10¹¹vg/小鼠)或低剂量(5x10⁹vg/小鼠)的AAV/HBV感染两组雄性B6小鼠。HBsAg的血清水平在感染后第四周分别达到1761.3±165.2ng/ml和41.1±7.2ng/ml。然后，用临床上使用的预防性疫苗HBsAg/明矾(EngerixB疫苗，葛兰素史克公司)对小鼠进行皮下免疫接种。在低抗原血症小鼠中，血清HBsAg在免疫接种后快速减少并且在2周内变得不可检测。同时，产生了含量可观的抗-HBs。相反，在高抗原血症HBV携带者模型中没有显示出针对HBsAg的体液免疫应答。所述HBsAg/明矾免疫接种没有降低血清HBsAg或诱导抗-HBs抗体应答。在未经处理的对照组中，HBsAg以相对稳定的方式持续并且没有产生任何抗-HBs抗体(图1A和1B)。通过流体动力学方式注射包含整个HBV基因组的质粒，这是持续感染和耐受的另一个模型(此模型在本申请中简称为HDI/HBV小鼠模型)[18]。在HDI/HBV小鼠模型中观察到了类似的结果(图1C和1D)。发明人的数据显示出HBV诱导的体液免疫耐受与循环HBsAg的量高度相关。

实施例2HBsAg是慢性乙型肝炎模型中主要的体液免疫耐受原

目前所使用的由重组HBsAg和明矾组成的预防性疫苗(例如EngerixB疫苗)主要诱导的抗体应答伴有很少的CTL应答并产生钝化的Th1炎性细胞因子。虽然此类抗体应答足以预防未来的感染，却完全不能清除先前存在的感染。为了鉴别出HBV诱导的体液免疫耐受中主要的耐受原，当前的发明人用EngerixB(单独使用，或者与TLR9配体CpG混合在一起使用)免疫接种AAV/HBV小鼠。它们在HBsAg的血清水平上均没有显著影响并且在免疫接种之后没有检测到抗-HBs抗体，而在WT小鼠中诱导了显著数量的抗体(图2A和2B)。此结果表明在HBV携带者小鼠中对于HBsAg有严重的耐受性。为了测试在HBV携带者小鼠中是否诱导了系统性耐受，当前的发明人检测了对于无关抗体HCV核心蛋白的抗体应答。在进行一个剂量的皮下免疫接种后，HCV核心在HBV携带者小鼠和WT小鼠中诱导了类似水平的抗HCV-核心抗体(图2C)。当前的发明人还测量了对于另一种HBV抗原-核心抗原(HBc)的抗体应答，因为在某些慢性乙型肝炎患者中可检测到抗-HBc抗体。在高抗原血症HBV携带者小鼠中，在超过一半经AAV/HBV感染的小鼠(7/10)中均可检测到强的抗-HBc抗体，但是没有任何小鼠有抗-HBs应答(图2D)。这些结果表明在慢性HBV携带者模型中，HBsAg是主要的体液免疫耐受原。

实施例3HBsAg的持续时间影响对于HBsAg的耐受的诱导或破除

为了评估HBsAg存在多长时间能够诱导体液耐受，当前的发明人在感染后的一系列时刻(第1天、第1周、第2周和第4周)用EngerixB免疫接种了AAV/HBV小鼠。随时间监测了HBsAg以及抗-HBs的血清水平。当前的发明人发现，在感染后第1天、第1周和第2周进行免疫接种能够使得HBsAg的血清水平快速下降，其在初始免疫接种后4周时变得不可检测，并且在HBsAg消失后可立即检测到抗-HBs抗体。相反，在长时间暴露于HBsAg之后(4周)，小鼠不能响应EngerixB。在初始免疫接种后四周可检测到血清HBsAg，而加强免疫不能产生抗-HBs抗体来清除HBsAg(图3A上部和下部)。这些结果表明建立起免疫耐受需要数周的时间。

为了测试清除循环的HBsAg是否能够减少耐受性且促进常规的疫苗在耐受的免疫细胞中恢复抗体应答，在Rag-/-小鼠中进行了获得性转移测定。将来自HBV携带者小鼠的淋巴细胞转移至Rag-/-小鼠。然后，在获得性转移后的所示时刻处用EngerixB对小鼠进行皮下免疫接种。用相同的经HBsAg包被的板、使用标准ELISA方案监测了一抗和二抗的应答。当前的发明人发现，在具有三周内转移的淋巴细胞的小鼠中，不可检测到对于HBsAg的抗体应答。相反，在转移后第4周经免疫接种的Rag-/-小鼠对于HBsAg具有强的抗体应答。这表示，在无耐受原的环境中，在前几周内仍存在对于HBsAg的体液免疫耐受，但是在无耐受原的微环境中，可在第四周时恢复对于HBsAg免疫接种的应答(图3B)。这些结果表明，需要花费数周而使得病毒抗原诱导和破除耐受。这一发现可为开发从慢性乙型肝炎患者中清除HBV的新疗法提供线索，甚至可用于其它慢性感染疾病。

实施例4通过中和HBsAg来逆转免疫耐受

本发明所提供的数据表明在4周中去除HBsAg可减少对于HBsAg的耐受并且允许宿主响应于常规疫苗，也即由此使得能够将常规疫苗转化成为具有治疗效果的治疗性疫苗。为了进一步测试提供用于在HBV携带者小鼠模型中进行治疗性免疫接种的无抗原窗口以及开发用于治疗慢性乙型肝炎的临床相关方案的可能性和可行性，当前的发明人选择了通过使用中和HBsAg的抗体来提供无抗原的环境。当前的发明人使用了抗体H及其变体(抗体H2、H5、H16或H19，数据未显示)来在免疫接种之前预处理AAV/HBV(ayw)小鼠(图4A)。在施用中和抗体(图4中显示抗体H，标示为NAb)之后，HBsAg的血清水平快速减少并且在1-2个额外的剂量之后达到不可检测的水平。持续的处理可以使得HBsAg被维持为在血清中不可检测，但是一旦停止施用NAb，血清HBsAg立即反弹(图4B，圆圈，蓝色线)。相反，在经NAb预处理、随后用EngerixB进行免疫接种的小鼠中，血清HBsAg从未反弹(图4B，三角形，黑色线)。单独的EngerixB对于HBsAg的血清水平没有影响(图4B，方形，红色线)。与HBsAg的消失相对应，在组合处理组而非用NAb或疫苗处理的单一疗法组中，逐渐可检测到抗-HBs(+)血清转化(图4C)。单一疗法或组合治疗均未诱导显著的肝损伤，如通过ALT测试以及对肝组织的病理学分析所确定的(图4D和4E)。这些数据表明，通过使用NAb来清除循环耐受原可改变免疫耐受状态并在耐受性小鼠模型中帮助疫苗重建体液免疫性而没有可检测的肝损伤。

实施例5通过组合治疗来重建HBsAg-特异性细胞毒性T细胞

当前的发明人然后测试了在通过施用NAb产生的无抗原窗口期中，EngerixB/CpG用于重建HBV特异性CTL的潜能以及在AAV/HBV携带者小鼠中的治疗效果(图5A)。根据IFNγELISPots测定结果，发现与用单独的EngerixB/CpG处理的小鼠相比，在经NAb与EngerixB/CpG的组合处理的小鼠中检测到了T细胞活性的显著增加(图5B)。组合治疗小鼠中的血清HBsAg在停止施用NAb之后的6周之中保持是不可检测的，但是在仅用NAb处理的小鼠中出现反弹。最重要地，在组合治疗组中，甚至血清HBeAg和HBV DNA水平也显著下降了，但是在单一疗法的组中没有此种效果(图5D)。在图5E中显示了治疗的时间进程的图示。在通过施用NAb制造的无抗原窗口中逐渐恢复了HBs-特异性T细胞应答。用NAb处理四周要优于处理两周，因为与通过ELISPots监测的两周时的结果相比，在四周的组中监测到了更多有功能的HBs特异性T细胞(图5F)。综合而言，这些结果表明，通过将NAb的预治疗与而后的免疫接种相组合，可破除耐受并且可恢复HBsAg特异性CTL用以清除细胞内HBV。

实施例6在慢性乙型肝炎模型中重建的免疫性依赖于CD4+T细胞并且可被转移

为了进一步研究此免疫重建的机制，当前的发明人探究了细胞群体中的亚群是否在组合治疗之后参与控制HB表达以及诱导免疫记忆。将来自幼稚小鼠、经EngerixB免疫接种的野生型小鼠、经EngerixB免疫接种的HBV携带者小鼠、以及接受了用NAb及随后的EngerixB疫苗进行的慢性乙型肝炎策略治疗的小鼠的脾细胞分别转移至Rag1^-/-小鼠中。然后，在转移后的次日，用aav8/HBV1.3挑战这些接受者小鼠(图6A)。在注射后的第3、14及28天测量HBsAg的血清水平(图6)。当前的发明人发现，在转移了幼稚脾细胞以及来自经EngerixB免疫接种的携带者小鼠的脾细胞的Rag^-/-小鼠中建立了aav8/HBV1.3感染，但是在转移了来自经EngerixB免疫接种的野生型小鼠以及经所述慢性乙型肝炎策略治疗的小鼠的脾细胞的Rag^-/-小鼠中没有建立所述感染(图6B)。这些结果表明，经组合治疗的HBV携带者小鼠获得了针对HBV的免疫记忆并且此种记忆是可以转移的。

为了进一步分析此免疫记忆的分子机制，进行了耗竭测定，其中在将脾细胞转移至Rag1^-/-小鼠中之前，使用TIB210或GK1.5单克隆抗体。耗竭CD8+T细胞对于来自经组合治疗的慢性乙型肝炎的转移的免疫性没有影响，然而，当耗竭了CD4+T细胞之后，观察到了保护的丧失(图6C)。综合而言，这些数据表明了用病毒的抗原特异性中和抗体以及常规的疫苗顺次治疗慢性感染性疾病能够破除由循环病毒抗原诱导的耐受并且以CD4+T细胞依赖性的方式重建抵抗HBV的体液以及细胞免疫性。

实施例7抗体H的变体同样能够特异性结合乙肝表面抗原并且可用于在体内清除细胞外的循环病毒抗原

在本发明中，发明人制备并鉴别了能够用作中和抗体而清除细胞外循环乙肝表面抗原的抗体H，通过对抗体H的氨基酸序列进行测序表明，抗体H包含重链和轻链，其中重链的可变结构域包含如SEQ ID NO:1中所示的CDR-1序列、如SEQ ID NO:2中所示的CDR-2序列和如SEQ ID NO:3中所示CDR-3序列，并且轻链的可变结构域包含如SEQ ID NO:4中所示的CDR-1的序列、如SEQ ID NO:5中所示的CDR-2序列和如SEQ ID NO:6中所示的CDR-3的序列。

此外，所述抗体H的重链可变区(VH)序列如SEQ ID NO:8所示，而其轻链可变区(VL)序列如SEQ ID NO:7所示。

为了进一步测试对所述抗体H的一个或多个氨基酸进行添加、缺失和/或置换是否能够得到同样可以特异性结合其目标抗原(即乙肝表面抗原)的变体和/或衍生物，发明人对所述抗体H进行了点突变，从而获得了下列抗体H的变体：

1)将对应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第4位的氨基酸由D置换为G，并且将对应于SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的第9位的氨基酸由T置换为S,从而得到了抗体H2；

2)将对应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第8位的氨基酸由F置换为S，从而得到了抗体H5和H19；

3)将对应于SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的第3位的氨基酸由S置换为F，从而得到了抗体H16。

经过与乙肝表面抗原的结合测定，发明人发现，与未经突变的抗体H相似，所获得的变体H2、H5、H16和H19均能够特异性地结合乙肝表面抗原(参见图9a和9b)，并且这些经突变的抗体H的变体也能够用于清除细胞外的循环病毒抗原，从而用于将常规的预防性疫苗转化为有治疗效果的治疗性疫苗。因此，能够通过对抗体H的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的改变，却不改变其对抗原结合的特异性。

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Claims

1.一种试剂盒和/或药物，其包含:

a)一种或多种能够减少细胞外病毒抗原的试剂；

b)针对所述病毒的疫苗；以及

c)任选的使用说明书；

其中，在所述试剂盒和/或药物中，所述a)和b)各自被包含在单独的容器中且彼此不相混合；

其中，

所述病毒抗原为乙肝表面抗原；

所述能够减少细胞外病毒抗原的试剂为中和抗体；

所述疫苗为预防性乙肝疫苗。

2.根据权利要求1所述的试剂盒和/或药物，其还包含：

d)一种或多种针对不同血清亚型的检测抗体，其用于快速诊断受试者体内病毒所属的血清亚型。

3.根据权利要求2所述的试剂盒和/或药物，其中，在所述试剂盒和/或药物中，所述a)、b)和d)各自被包含在单独的容器中且彼此不相混合。

4.能够减少细胞外病毒抗原的试剂和针对所述病毒的疫苗联合用于制备试剂盒和/或药物的用途，其中所述试剂盒和/或药物用于预防和/或治疗受试者中慢性病毒感染引起的疾病，其中，所述疾病为慢性乙型肝炎；

其中，

所述病毒抗原是乙肝表面抗原；

所述能够减少细胞外病毒抗原的试剂为中和抗体；

所述疫苗为预防性乙肝疫苗；

在所述试剂盒和/或药物中，所述能够减少细胞外病毒抗原的试剂和针对所述病毒的疫苗各自被包含在单独的容器中且彼此不相混合。

5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述试剂盒和/或药物在所述受试者中降低耐受性并在免疫接种后产生保护性应答。

6.根据权利要求4所述的用途，其中，所述试剂盒和/或药物在所述受试者中重建所述受试者对于乙型肝炎病毒表面抗原的免疫性。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒和/或药物、或者权利要求4至6中任一项所述的用途，其中，所述乙肝表面抗原选自乙肝表面抗原adr、adw、ayr和ayw亚型。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒和/或药物或者权利要求4至6中任一项所述的用途，

其中，所述中和抗体选自如下的(1)－(4)中的任意一种：

(1)中和抗体，其重链可变区的CDR1－CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区的CDR1－CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

(2)中和抗体，其重链可变区的CDR1－CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:9所示；其轻链可变区的CDR1－CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10所示；

(3)中和抗体，其重链可变区的CDR1－CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:11所示；其轻链可变区的CDR1－CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

(4)中和抗体，其重链可变区的CDR1－CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区的CDR1－CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:6所示。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒和/或药物或者权利要求4至6中任一项所述的用途，其中所述试剂盒和/或药物中包含针对不同血清亚型的检测抗体，并且根据所述检测抗体的检测结果来确定需使用的中和抗体。

10.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒和/或药物、或者权利要求4至6中任一项所述的用途，其中所述试剂盒和/或药物中所包含的能够减少细胞外病毒抗原的试剂的量足以在1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，3周，4周，5周，6周或更长时间内使得受试者中乙肝表面抗原的量持续下降，直至低于常规检测手段的检测阈值。

11.根据权利要求10所述的试剂盒和/或药物、或者用途，其中，所述常规检测手段为ELISA检测。

12.根据权利要求10所述的试剂盒和/或药物、或者用途，其中，所述检测阈值为检测值下限。

13.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒和/或药物或者权利要求4至6中任一项所述的用途，其中，所述疫苗是HBsAg/明矾、HBsAg+CpG、EngerixB或EngerixB+CpG。

14.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒和/或药物或者权利要求4至6中任一项所述的用途，其中所述试剂盒和/或药物中所包含的乙型肝炎疫苗的量足以在受试者中根据本发明的方案产生保护性应答。

15.根据权利要求14所述的试剂盒和/或药物或者用途，其中，所述保护性应答为产生治疗和/或预防有效量的病毒抗体。

16.根据权利要求14所述的试剂盒和/或药物或者用途，其中，所述病毒抗体是抗-HBsAg抗体。

17.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒和/或药物或者权利要求4至6中任一项所述的用途，其中所述试剂盒和/或药物中包含针对不同血清亚型的检测抗体，所述病毒抗原为乙肝表面抗原，所述血清亚型选自adr、adw、ayr和ayw亚型。

18.根据权利要求17所述的试剂盒和/或药物或者用途，其中，所述检测抗体选自如下的(1)－(4)中的任意一种：

19.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒和/或药物或者权利要求4至6中任一项所述的用途，其中所述试剂盒和/或药物中包含使用说明书，所述说明书指示在向受试者施用预防性乙型肝炎疫苗之前施用所述能够减少细胞外病毒抗原的试剂至少1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天，3周，4周，5周，6周或更长时间。

20.根据权利要求19所述的试剂盒和/或药物或者用途，其中，所述说明书中指示首先通过向来自受试者的样品施用所述检测抗体来判断所述受试者体内病毒所属的血清亚型，然后根据所述判断结果来确定需使用的中和抗体。

21.根据权利要求20所述的试剂盒和/或药物或者用途，其中，所述样品为血液样品。