CN117904295A - 环状RNA_hsa_circ_0001681及其载体和检测试剂盒 - Google Patents
环状RNA_hsa_circ_0001681及其载体和检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117904295A CN117904295A CN202410065554.3A CN202410065554A CN117904295A CN 117904295 A CN117904295 A CN 117904295A CN 202410065554 A CN202410065554 A CN 202410065554A CN 117904295 A CN117904295 A CN 117904295A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- circ
- hsa
- circular rna
- rna
- glioma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 15
- 201000007983 brain glioma Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 76
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 abstract description 29
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 abstract description 26
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 abstract description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 18
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 15
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 abstract description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 6
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 108090000638 Ribonuclease R Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102200082402 rs751610198 Human genes 0.000 description 3
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 3-[[oxo(pyridin-4-yl)methyl]hydrazo]-N-(phenylmethyl)propanamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNC(=O)CCNNC(=O)C1=CC=NC=C1 NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001042041 Bos taurus Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit beta, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101000960234 Homo sapiens Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 101000599886 Homo sapiens Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000595907 Homo sapiens Procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100039905 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 102100037845 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100035198 Procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2 Human genes 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 208000024055 brain glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 201000011609 brain glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007428 craniotomy Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000309 effect on glioma Effects 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000003721 gunpowder Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229960002275 pentobarbital sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了环状RNA_hsa_circ_0001681在制备用于诊断脑胶质瘤患者恶性进展预后的标记物中应用，所述的环状RNA_hsa_circ_0001681的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种载体，含有所述的环状RNA_hsa_circ_0001681的序列。本发明还提供了上述的载体在制备治疗脑胶质瘤患者的药物中的应用。本发明还提供了一种检测环状RNA_hsa_circ_0001681的试剂在制备诊断脑胶质瘤患者恶性进展预后的试剂盒中的应用。相较于正常人脑胶质细胞而言，该环状RNA在常见胶质瘤细胞系中表达显著下降，并且细胞实验揭示过表达环状RNA_hsa_circ_0001681可降低胶质瘤细胞的恶性增殖。
Description
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种环状RNA，具体来说是一种环状RNA_hsa_circ_0001681及其载体和检测试剂盒。
背景技术：
脑瘤是人体十大常见肿瘤之一，其发病率虽然只排第9～10位，但其致死率却在青壮年中排第2(男性)和第4(女性)位；且在儿童中，脑瘤为第2大常见肿瘤，仅次于白血病。其中，胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的恶性脑肿瘤。因恶性程度极高，浸润性强，和正常脑组织没有明显界线，手术难以彻底切除并对放化疗均不甚敏感，使得其复发率高。因此，尽管GBM的手术率达71.6％，手术后规范化放化疗率为51.4％，GBM患者的五年生存率仅3％左右，中位生存期仅为14.6个月左右，预后极差。究其原因，可能与胶质瘤细胞高度异质性及肿瘤微环境有关。因此，深入了解GBM的生物学机制及新靶点的开发，有助于改善GBM易复发、预后差的临床窘境，从而促进新的或改进的治疗发展。
CircRNA作为一种新型内源性RNA，由于其：高丰度，高度保守，稳定性和时空特异性等特质，在包括胶质瘤的多种肿瘤中参与了疾病的进展。Song等人在对46例胶质瘤样本和正常脑组织样本进行芯片分析结果发现，有476个差异性表达的circRNAs,随后对其中随机选择的27个circRNAs中的24个circRNAs进行了成功的实验验证。这表明circRNAs在胶质瘤中具有差异新表达，并且具有作为肿瘤分子标记物的潜能。同时circRNAs也能通过各种作用机制影响胶质瘤的发生发展。
尽管已有多篇报道明确了circRNA能够参与胶质瘤恶性进展，也揭示了部分调控机制。但由于胶质瘤的高度异质性，目前临床上改善胶质瘤患者恶性进展的治疗缺乏积极有效的治疗药物，仍需进一步研究。
发明内容：
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种环状RNA_hsa_circ_0001681及其载体和检测试剂盒，所述的这种环状RNA_hsa_circ_0001681及其载体和检测试剂盒要解决现有技术中的药物对于治疗脑胶质瘤的效果不佳的技术问题。
本发明提供了环状RNA_hsa_circ_0001681在制备用于诊断脑胶质瘤患者恶性进展预后的标记物中应用，所述的环状RNA_hsa_circ_0001681的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种载体，含有过表达的所述的环状RNA_hsa_circ_0001681的序列，所述的环状RNA_hsa_circ_0001681的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述的载体在制备治疗脑胶质瘤患者的药物中的应用。
本发明还提供了一种检测环状RNA_hsa_circ_0001681的试剂在制备诊断脑胶质瘤患者恶性进展预后的试剂盒中的应用，所述的环状RNA_hsa_circ_0001681的序列如SEQID NO.1所示。
进一步的，检测环状RNA_hsa_circ_0001681的试剂为实时荧光定量检测试剂。
进一步的，所述的实时荧光定量检测试剂中包含用于实时荧光定量检测脑胶质瘤组织中环状RNA_hsa_circ_0001681表达的引物序列：
正向引物：5'-CGTCAGGGCATGAGGATGG-3'，
反向引物：5'-CAGGTCCCTCAGCCGC-3'。
进一步的，试剂盒中还含有：
内参基因GAPDH特异性PCR引物：
正向引物：5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'
反向引物：5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明检测了正常胶质细胞和胶质瘤细胞系U87、U251、A172和T98G中环状RNA_hsa_circ_0001681的表达，并发现胶质瘤细胞系中该种环状RNA表达明显下调，揭示该环状RNA有辅助诊断、治疗疗效剂治疗手段研发的价值及重要的学术意义。
2、本发明细胞还揭示过表达环状RNA_hsa_circ_0001681可促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力，并减少肿瘤体积，延长荷瘤小鼠的生存期。也就是过表达环状RNA_hsa_circ_0001681可抑制脑胶质瘤的恶性进展。
本发明研究和已有靶标相比，其疗效是显著和积极的。本发明所提供的环状RNA_hsa_circ_0001681可用于临床及科研中，可对胶质母细胞瘤患者的发展进行有效的控制干预，对改善胶质瘤患者的预后具有重要意义，具有作为判断脑胶质瘤患者预后的潜能。本发明将在医学治疗领域发挥重要作用，将在肿瘤治疗领域发挥重要作用。
附图说明：
图1通过qRT-PCR检测了正常胶质细胞和胶质瘤细胞系U87、U251、A172和T98G中环状RNA_hsa_circ_0001681的表达。并成功鉴定该环状RNA的首尾连接的环状特性及接头序列。
图2为设计并成功构建过表达环状RNA_hsa_circ_0001681的细胞株，及其对胶质瘤细胞增殖的影响。CCK8和平板克隆实验揭示，过表达环状RNA_hsa_circ_0001681可抑制细胞的增殖。
图3为过表达环状RNA_hsa_circ_0001681的细胞株对胶质瘤细胞侵袭的影响。Transwell和划痕实验揭示，过表达环状RNA_hsa_circ_0001681可抑制细胞的侵袭。
图4动物实验揭示，过表达环状RNA_hsa_circ_0001681可抑制荷瘤小鼠的肿瘤体积，并延长荷瘤小鼠的生存期。
具体实施方式：
实施例1检测正常胶质细胞和胶质瘤细胞系中环状RNA_hsa_circ_0001681的表达，并鉴定环状RNA的首尾接头序列。
具体实施方法为：
1.细胞准备：所有细胞RNA均用Trizol提取。细胞先弃去上清培养基，并用PBS清洗两遍后加入适量Trizol，用枪头或细胞刮刮下细胞，反复吹打细胞使得其充分裂解，并将细胞Trizol混合液吸至1.5ml的EP管中。
2.RNA提取及检测步骤：
将上述的Trizol混合液转移至1.5ml EP管中，常温下静置5分钟；
(1)将0.2ml氯仿加入1.5ml EP管中，剧烈振荡15秒后(注意盖紧EP管，谨防漏液)，置冰上静置10分钟，出现分层；预冷离心机为4℃。
(2)4℃恒温12000rpm离心15分钟；离心过程中准备下一批EP管，做好标记；(3)取水相：高速离心后EP管中溶液分为3层，将转移水相(上层)到另一管EP管一般1mL的Trizol只用取400-600ul水相；避免吸到中间相和下层红色有机相；
(4)异丙醇沉淀：加入等体积的异丙醇(＝所取水相)上下颠倒混匀，冰上静止10min，随后12000rpm，4℃离心10min；出现絮状胶样沉淀；
(5)乙醇清洗：离心后弃上清，加入1mL 75％乙醇洗涤，轻弹底部，涡旋仪混匀，室温静置3-5min，随后12000rpm，4℃离心5min；以75％乙醇清洗离心两遍，可获得的白色絮状物为RNA；
(6)晾干沉淀后溶解：弃上清，短暂离心，尽量吸除上清，将沉淀置于室温干燥5-10分钟，加入30-100μL无菌无酶DEPC水溶解RNA，轻轻吹打致使沉淀消失；
(7)测定RNA提取的浓度：取2μL RNA溶液，置于新的空白EP管中，再加入98μL无菌无酶DEPC水，充分混匀；以无菌无酶DEPC水作空白对照，测OD 260/280值；OD 260/280值在1.8-2.0视为纯度很高；一般浓度在1000ng/ml较准；若样品浓度太高，则要稀释后再测定。记录所提取的RNA浓度和纯度；RNA质量使用变性琼脂糖凝胶电泳测定；
(8)RNase R消化：上述获得的RNA样品，重悬后分为两份，一份用RNase R进行消化，同时剩下另一份做对照。RNase R消化组加3μL 10×RNase R反应buffer，1μL RNase R(20U/μl)，以下条件下37℃ 3U/mg RNase R(Epicentre，cat.#RNR07250)。同时对照组添加DEPC水，排除干扰序列。震荡混匀以终止消化，并且提前预冷离心机，13000×g，4℃离心5分钟。在新EP管中加入前述上清，6μL 4M氯化锂，1μL糖原，90μL预冷无水乙醇颠倒重悬，-80℃沉淀1小时，可以用于下一步实验或保存于-80℃冰箱。对照用于排除干扰序列。
3.基因组DNA提取
(1)在细胞中加入400μl 1％的SDS，8μl的蛋白酶K，其中蛋白酶K的浓度为20mg/ml，充分浸润，摇床上放置5小时左右(100转/分，55℃)；
(2)取出液体，加入6mol/L的NaCl 300μl，氯仿200μl，轻柔正反颠倒，充分乳化，随后放置于4℃离心机13000转/分离心30分钟；
(3)取上述管内上清，加入等体积氯仿抽提，上下温柔颠倒后，继续置入4℃离心机13000转/分离心10分钟；
(4)不同分组加入/不加入RNase A 37℃ 3U/mg RNase R(Epicentre，cat.#RNR07250)；
(5)取上述管内上清，加入等体积异丙醇，温柔混匀后-20℃沉淀10分钟；随后放置于4℃离心机13000转/分离心10分钟；弃上清；
(6)先后用75％及冰冻无水乙醇洗涤1-2次，弃上清，自然晾干。留作后续实验。
4.RNA逆转录及RT-qPCR检测
按照说明书，使用美国Bio-Rad公司的逆转录iScriptTM cDNA合成试剂盒进行RNA逆转录。
(1)逆转录：提取细胞系RNA并逆转录成cDNA；
(2)设计扩增引物：跨越反向剪接位点的引物碱基序列如下表：
引物信息如下表所示：
| Name/基因名称 | Sequence/引物序列，链的合成方向5’～3’ |
| circ-0001681-F(上游引物) | CGTCAGGGCATGAGGATGG(SEQ ID NO.2) |
| circ-0001681-R(下游引物) | CAGGTCCCTCAGCCGC(SEQ ID NO.3) |
| GAPDH-F(上游引物) | GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG(SEQ ID NO.4) |
| GAPDH-R(下游引物) | ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA(SEQ ID NO.5) |
根据基因比对和引物特异性分析，筛选出上述表格中特异性引物。
(2)PCR样品扩增体系
(3)PCR样品反应程序如下：
5.琼脂糖核酸电泳及凝胶成像分析
用1×TAE凝胶缓冲液配制相应浓度的琼脂糖凝胶，然后称量琼脂糖干粉(根据片段IDH1/IDH2大小是402bp/404bp以及相应circPLOD2、PLOD2的大小100-250bp之间)。用加30ml左右的1×TAE电泳缓冲液溶解琼脂糖干粉，并加热融化粉末，并注意溶解过程中液体不能出现气泡，会影响结果判定。随后将凝胶放入水平电泳仪内，加入1×TAE缓冲液没过凝胶。约15分钟后，轻轻缓慢拔掉梳子，谨防导致胶断裂(可适当加电泳缓冲液湿润)。在靠左边的孔中加入DNA Marker，在DNA样品中加入10×的loading buffer，充分混匀后，依次加样，在120V恒压下电泳30分钟；取出凝胶在凝胶成像仪上进行成像，直视下将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下(注意用锐利的刀片，避免胶的边缘粗糙)，放入干净的离心管，使用凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司，DP219-03)进行凝胶DNA回收，利用超微量紫外分光光度计进行溶解度及纯度测定。
6.PCR产物回收
将目的DNA大小的凝胶(100-250bp之间)整齐切下，尽量去除不含片段的胶。放入1.5ml的EP管中。称重切下的凝胶，将吸附柱放置于收集管中，并向吸附柱CA2内加入500μl平衡液BL，12000rpm离.心1分钟，倒掉收集管中的废液。按照之前称重的1：3的比例加入向凝胶EP管中加入3倍体积的PN液，在50℃恒温水浴中孵育，至凝胶融化，一般时间为10分钟左右。将溶液加入吸附柱CA2内，室温下静置1-2分钟，于12000rpm离心30秒。弃收集管内的废液，并向吸附柱CA2加入600μl漂洗液PW，于12000rpm离心45秒。弃废液后，继续12000rpm离心2分钟，尽可能离心干净。常温下静置2分钟，晾干后，向吸附柱中加30μl ddH2O，常温下静置2分钟，继而12000rpm离心2分钟，重复这一步骤2次，收集DNA液。
7.PCR产物测序
对基因的产物跑胶后胶回收后纯化。所有的回收纯化的样本均送至金唯智生物科技有限公司进行基因测序。
图1A检测了正常胶质细胞和胶质瘤细胞系U87、U251、A172和T98G中环状RNA_hsa_circ_0001681的表达，图1C为该环状RNA来源的基因组位置及成环示意图，图1B并成功鉴定该环状RNA的首尾连接的环状特性及接头序列。图1D显示该环状RNA的成熟序列(SEQ IDNO.1)。图1E琼脂糖凝胶电泳等实验证实环状RNA-hsa_circ_0001681能够耐受核酸外切酶的降解，并且不存在于基因组DNA，是在转录过程中产生的。PCR中的同向引物在线性mRNA中能扩增产物，但在RNase-R酶处理后无法扩增。
实验结果表明：环状RNA_hsa_circ_0001681是首尾相连的环状结构，并在胶质瘤细胞系中表达下降。
结论：本发明通过qRT-PCR检测了环状RNA_hsa_circ_0001681在胶质瘤细胞系中的表达下降。并成功鉴定该环状RNA的首尾连接的环状特性及接头序列。实施例2构建过表达环状RNA_hsa_circ_0001681的细胞株，并检测该环状RNA对细胞增殖能力的影响。
1、抽提circ_0001681过表达慢病毒载体及其辅助载体质粒。通过Transgenereagent将构建好的circ_0001681过表达病毒载体及其辅助载体质粒，共转染进工具细胞。转染12h后添加Enhancing buffer，4h后再更换新鲜完全培养基，继续培养48h后，收集并浓缩富含circ_0001681慢病毒的细胞上清液。
2.Circ_0001681过表达稳转细胞株的构建
慢病毒感染靶细胞(U251-MG、U87-MG)
第一天：在六孔板中按35％左右的比例接种目的GBM细胞。
第二天：冰上融化病毒原液，随后用含8μg/mL Polybrene的新鲜完全培养基稀释前述的病毒原液，吸除六孔板中原先的培养基，加含有慢病毒稀释液到GBM细胞中，换液时间可根据细胞状态可适当延长(一般为4h-8h)。
第三天，待细胞长到80％-90％时，按照前述消化传代步骤将细胞消化下来，放置于培养瓶中培养。
第四天，检测感染效率：通过倒置荧光显微镜观察荧光(慢病毒载体携带)，评估慢病毒感染GBM细胞的效率。继而向细胞中加入2μg/mL puromycin，37℃，5％CO2，常规培养24h，用以筛选puromycin抗性的稳转株。收集细胞再通过PCR验证感染效率。
3.CCK-8实验
先用胰酶消化下细胞，低速离心去除细胞碎片。用新鲜培养基重悬，并进行细胞计数。按照3000个(100μL)/孔的细胞铺于96孔板中，每组重复3次，对照孔只添加培养基。37℃、5％CO2的常规培养箱中培养过夜。于特定时间点如24小时，48小时，72小时，96小时等，在每孔中加入10μL CCK8/100μL培养基，37℃孵育2小时后，450nm下测定吸光度OD450。随后统计数据并作图。
4.平板克隆形成实验
细胞准备工作同CCK8实验，胰酶消化重悬计数。根据计算结果按500个细胞/孔的密度铺于六孔板中。注意混匀。每组重复3次。置于培养箱中常规培养。每3-5天根据情况补充少量培养基，10天到14天左右观察细胞。单个克隆集落超过50个细胞即可进行下一步骤。用常温的4％多聚甲醛固定细胞15分钟，PBS清洗3次，并用1％的结晶紫染色1-2小时不等。PBS清洗3次后于显微镜下观察计数。统计作图。
图2成功构建过表达环状RNA_hsa_circ_0001681的细胞株，并检测其对胶质瘤细胞株的增殖影响。图2A，B示成功构建过表达环状RNA_hsa_circ_0001681的细胞株，图2C，2D示通过CCK-8实验证实：与对照组相比，过表达环状RNA-hsa_circ_0001681可以明显降低U87-MG、U251-MG细胞的增殖活性。图2E,2G示通过平板克隆形成实验发现：与对照组相比，过表达环状RNA-hsa_circ_0001681可以明显减少U87-MG、U251-MG细胞的克隆数。图2F、2H示相应的统计数据。
实验结果表明：成功构建过表达环状RNA_hsa_circ_0001681的U87-MG和U251-MG细胞株，并检测发现过表达该环状RNA可以抑制胶质瘤细胞的增殖。
实施例3检测过表达环状RNA_hsa_circ_0001681对胶质瘤细胞侵袭的影响1.划痕实验
先用记号笔在六孔板背后，均匀划横线，穿过孔径中央。将消化下来的细胞计数并重新混匀加入六孔板中，置于培养箱中过夜。隔天待铺满六孔板后开始实验。用枪头尽量垂直于背后的横线划痕，垂直不能倾斜地划线。用PBS清洗划下地细胞碎片。加入含新鲜含血清地培养基。放入培养箱培养过夜。每隔24h拍照。待有细胞融合即可终止实验。
2.Transwell实验准备工作：先准备好基质胶：将Matrigel基质胶置于4℃过夜，变成液态。细胞传代前12小时～24小时，将原有培养液吸出，加入不含FBS的新鲜培养液，37℃，5％CO2，常规培养24小时。
下述步骤均在冰上操作：按用预冷枪头将400μl DMEM培养基稀释50μlMatrigel基质液。向上室中加入50μl基质胶稀释液，置于培养箱中4-5小时，当出现“白色层”时即可加入100μl培养基浸润，后弃除。计数已经消化好的实验细胞，以2×104/100μL的密度加入到上室中，并在下室加入600μL含有10％血清的完全培养基。上层小室轻轻地放在下层小室，避免产生气泡；随后放置于培养箱中培养，48小时后，取出上室，弃除培养基，用PBS洗涤3次。4％多聚甲醛固定细胞15分钟，用PBS清洗3次。而后用结晶紫染色1小时，再用PBS清洗3次。保持细胞湿润，随机选取3-5个视野进行拍照计数。并统计分析。
3.如图3所示，实验结果表明：过表达环状RNA_hsa_circ_0001681可降低胶质瘤细胞的侵袭能力。图3A,3C示通过Transwell实验证实：与对照组相比，过表达环状RNA-hsa_circ_0001681可以明显降低U87-MG、U251-MG细胞的侵袭能力。图3B,3D示相应的统计数据。图3E,3G通过划痕实验证实：与对照组相比，过表达环状RNA-hsa_circ_0001681可以明显降低U87-MG、U251-MG细胞的“伤口愈合”能力。图3F,3H示相应的统计数据。
实施例4检测过表达环状RNA_hsa_circ_0001681对荷瘤小鼠的影响
本实验共构建两组胶质瘤原位模型。我们对12只(周龄为4-5周的裸鼠)进行随机分组。分别为U87-MG-NC和U87-MG-hsa_circ_0001681-OE两组(每组n＝6)
(1)U87-MG细胞：按照细胞消化的步骤消化，并用血球计数板计数，调整U87-MG浓度达到1×106/5μL。放置冰上，带至动物房进行接种。
(2)0.9％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸鼠(0.05ml/10g)，3-5分钟后，确定裸鼠已麻醉好，并置于小动物立体定向仪上，固定好不至于移动。裸鼠底下垫有37℃动物恒温毯上。
(3)用酒精消毒裸鼠头颅皮肤，在头部正中切一条切口，暴露颅骨，注意不能过度用力。注意区别前囟、冠状缝、矢状缝等骨性标志。从前囟点，前移1.0mm，向侧方1.8mm选择开颅点。利用磨钻磨开颅骨，注意力度不能太大。用微量泵吸取细胞5ul。进针3mm开始注射细胞，10分钟左右注射完毕。退出微量注射器，骨蜡封闭颅骨。消毒并缝合头皮，继续消毒3次。
(4)等裸鼠复苏后，放置干净的笼盒中。继续饲养。注意观察裸鼠状态及体重变化。
(5)当裸鼠出现行走不稳、进食减少或体重减轻等症状时，及时将两组小鼠均行头颅MRI扫描(腹腔注射Gd-DTPA(100μl/20g)，5min后行T1增强扫描)。(6)将裸鼠继续置于动物房内饲养，当裸鼠体重明显降低，不进食时，注射过量麻药，实行安乐死，并进行心脏灌注，留取裸鼠脑组织样本，并记录动物死亡时间。
图4与对照组相比，过表达环状RNA_hsa_circ_0001681可延长荷瘤小鼠的生存期。图4A，4B针对裸鼠头颅MRI检查T1增强显示：过表达环状RNA_hsa_circ_0001681组瘤体体积明显小于NC组。图4C示过表达组的小鼠体重明显高于对照组。图4D示过表达环状RNA_hsa_circ_0001681组中位生存时间明显长于对照组。
实验结果表明：过表达环状RNA_hsa_circ_0001681可抑制荷瘤小鼠的肿瘤体积，并延长荷瘤小鼠的生存期。
综上，相较于正常胶质细胞而言，该环状RNA在胶质瘤细胞系中表达显著下降，并且细胞实验揭示过表达环状RNA_hsa_circ_0001681可抑制胶质瘤细胞的增殖侵袭能力，并抑制胶质瘤的恶性进展。因此，该环状RNA具有作为脑胶质瘤患者恶性进展靶标的潜能。
Claims (7)
1.环状RNA_hsa_circ_0001681在制备用于诊断脑胶质瘤患者恶性进展预后的标记物中应用，所述的环状RNA_hsa_circ_0001681的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种载体，其特征在于，含有过表达的所述的环状RNA_hsa_circ_0001681的序列，所述的环状RNA_hsa_circ_0001681的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的载体在制备治疗脑胶质瘤患者的药物中的应用。
4.一种检测环状RNA_hsa_circ_0001681的试剂在制备诊断脑胶质瘤患者恶性进展预后的试剂盒中的应用，所述的环状RNA_hsa_circ_0001681的序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测环状RNA_hsa_circ_0001681的试剂为实时荧光定量检测试剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的实时荧光定量检测试剂中包含用于实时荧光定量检测脑胶质瘤组织中环状RNA_hsa_circ_0001681表达的引物序列：
正向引物：5'-CGTCAGGGCATGAGGATGG-3'，
反向引物：5'-CAGGTCCCTCAGCCGC-3'。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，试剂盒中还含有：
内参基因GAPDH特异性PCR引物：
正向引物：5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'
反向引物：5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410065554.3A CN117904295A (zh) | 2024-01-17 | 2024-01-17 | 环状RNA_hsa_circ_0001681及其载体和检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410065554.3A CN117904295A (zh) | 2024-01-17 | 2024-01-17 | 环状RNA_hsa_circ_0001681及其载体和检测试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117904295A true CN117904295A (zh) | 2024-04-19 |
Family
ID=90683352
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410065554.3A Pending CN117904295A (zh) | 2024-01-17 | 2024-01-17 | 环状RNA_hsa_circ_0001681及其载体和检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117904295A (zh) |
-
2024
- 2024-01-17 CN CN202410065554.3A patent/CN117904295A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105524924B (zh) | 环状RNA circ‑ZKSCAN1的用途 | |
| CN108179194A (zh) | 一种肿瘤分子标志物circBIRC6及其抑制剂和用途 | |
| CN107663539A (zh) | 环状RNA circ‑PTGR1的用途 | |
| CN106701900A (zh) | 长链非编码rna herc2p3基因及其在胃癌中的用途 | |
| CN110123828A (zh) | Pralr的抑制剂在制备治疗耐紫杉醇卵巢癌的药物中的应用 | |
| CN113897358B (zh) | 靶向ensg00000203930基因的反义寡核苷酸及其应用 | |
| CN111172290B (zh) | 肝细胞癌诊断和治疗的miRNA | |
| CN112190712A (zh) | 氢巯基氧化酶1激动剂和索拉菲尼联合在制备治疗肝癌细胞中的应用 | |
| CN112813033A (zh) | 一种胰岛素和白介素-10双基因修饰重编程间充质干细胞及其制备方法与应用 | |
| CN117904295A (zh) | 环状RNA_hsa_circ_0001681及其载体和检测试剂盒 | |
| CN114432332B (zh) | circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物 | |
| CN114457158B (zh) | Hsa_circ_0006867作为食管癌分子靶标在制备药物和试剂盒中的应用 | |
| CN114317539B (zh) | hsa_circ_0001137环状RNA及其在癌症诊断、治疗中的应用 | |
| CN111850047B (zh) | 一种miR-16与miR-30c联合表达载体及其构建方法与应用 | |
| CN114053294A (zh) | miR-150及负载miR-150模拟物的外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用 | |
| CN112877431B (zh) | snoRNA-U41在检测以及治疗胰腺癌中的用途 | |
| CN112891365B (zh) | 一种可释放microRNA核酸药物的3D仿生细胞植入体的制备及其应用 | |
| CN113637763B (zh) | miRNA生物标志物在黑色素瘤早期诊断和治疗中的用途 | |
| CN112961917B (zh) | snoRNA-U35A在检测以及治疗胰腺癌中的用途 | |
| CN114480309B (zh) | 抑制ALKBH1表达的shRNA慢病毒及其制备和应用 | |
| CN112980956B (zh) | 抑制肺癌生长的靶标与诊断标志物uc.336及其应用 | |
| CN112280859B (zh) | 一种乳腺癌标志物及应用 | |
| CN113699234B (zh) | 长链非编码RNA Linc01605在作为胃癌诊断性试剂盒及靶向药物开发中的应用 | |
| CN116637122B (zh) | 环状RNA circ-DCUN1D4在肝癌诊断和治疗中的新用途 | |
| CN113244412B (zh) | 一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |