JP2001511784A

JP2001511784A - 改変された腫瘍壊死因子

Info

Publication number: JP2001511784A
Application number: JP53448898A
Authority: JP
Inventors: クラーク，マイク・エイ
Original assignee: フエニツクス・フアーマコロジクス・インコーポレーテツド
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 2001-08-14
Anticipated expiration: 2018-01-15
Also published as: US20060222626A1; DE69836222T2; DK1007082T3; JP4295831B2; EP1007082B1; AU725133B2; CA2277757A1; DE69836222D1; AU6241098A; EP1007082A4; WO1998031383A1; CN1168495C; CN1243444A; US7785579B2; ES2275300T3; CA2277757C; EP1007082A1; ATE342729T1

Abstract

(57)【要約】約１０，０００ないし約４０，０００の範囲、好ましくは約２０，０００ないし３０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＴＮＦを改変することは、ＴＮＦの循環半減期を著しく増す。その結果として、患者に対するより少ない随伴する不都合な副作用で、腫瘍を有効に処置するために、より低い投与量のＴＮＦを投与することができる。

Description

【発明の詳細な説明】改変された腫瘍壊死因子関連出願本出願は１９９７年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／０３５，５２１号の利益を請求する。発明の分野本出願はとりわけ１０，０００ないし４０，０００の範囲の分子量を有するポリエチレングリコールで改変された腫瘍壊死因子及びそのような改変された腫瘍壊死因子を用いて腫瘍を処置するための方法に関する。発明の背景悪性黒色腫（３期）は診断の１年以内に大部分の患者を死亡させる致死的な疾病である。黒色腫の発生は米国において急速に増加しており、豪州のような他の国より高くさえある。黒色腫を患っている患者のための有効な処置が緊急に必要とされている。腎臓癌により現在米国では毎年約１３，０００人が死亡している。この型の癌はしばしばかなり進行するまで検出されない。患者の予後に顕著に影響を与える処置の唯一の形態は冒された臓器の外科的切除である。残念なことに、この型の癌は非常に転移性であるので、全ての転移の完全な除去は不可能でないにしても困難である。結腸癌は癌の最も一般的な型の一つであり、現在米国では毎年約１４０，０００人が死亡している。この疾病を処置するために開発された多数の伝統的な化学療法薬があるが、（５年またはそれより長く生存する患者のパーセンテージとして定義される）長期生存はここ４０年であまり変わっていない。さらに、開発された伝統的な化学療法薬は全て非常に有毒であり、有害なそしてしばしば致命的な副作用を有し、そして費用がかかる。この疾病の治癒的な無毒の処置が緊急に必要とされている。黒色腫、腎臓及び結腸腫瘍の特徴は、これらの腫瘍が伝統的な化学療法に対する抵抗性を急速に持つようになることである。たとえ患者が最初に化学療法処置によい反応を示すことができでも、薬剤抵抗性の腫瘍が急速に発生し、そして結局患者を死亡させる。これらの腫瘍を処置するための代わりの方法は腫瘍に「弱点」を同定し、その標的を選択的に処置する治療を開発することである。１つのそのような可能性のある標的が同定されている。具体的には、これらの型の腫瘍の３つ全ては、癌が成長するために転移の各々の多量の血管新生を必要とすることが認められている。それ故、これらの腫瘍の血管新生を妨げる治療薬はこれらの腫瘍を処置する独特な手段を与える可能性があると予測される。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、免疫刺激活性を有する、白血球及び関連する細胞により産生される一群の多様なタンパク質である多数のサイトカインの１つである。ＴＮＦは元来、腫瘍を壊死させるその能力にちなんで命名された。ＴＮＦが腫瘍を殺すと考えられる少なくとも２つの異なる機構がある。第一のものは腫瘍自体への直接作用による。あるいはまた、ＴＮＦは腫瘍の血管新生を選択的に分断することができる。ＴＮＦを記述する初期の原稿において、Ｃａｒｓｗｅｌｌ及びＯｌｄはＭＥＴＨＡ腫瘍細胞がインビトロでＴＮＦに完全に抵抗性であることを報告した、Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ、７２：３６６６−３６７０（１９７５）。しかしながら、マウスにおけるＭＥＴＨＡ腫瘍はインビボでＴＮＦに非常に感受性であった。これはＴＮＦがこれらの腫瘍の血管新生を選択的に分断したためであると考えられた。今までのところ同定されていないある因子がいくつかの腫瘍により放出され、それにより腫瘍に隣接する正常な血管内皮細胞がＴＮＦに殺されやすくなることが後に示された。簡潔に言えば、腫瘍細胞を直接的に殺すことによるのではなく、むしろ血液、酸素及び生存し成長するために必要な他の栄養物を腫瘍に供給する血管に沿って並ぶ正常な血管内皮細胞を殺すことによりＴＮＦはこれらの腫瘍を殺す。残念なことに、初期の臨床試験はＴＮＦを直接殺腫瘍剤として開発しようと試みた。このように用いられる場合、ＴＮＦは迅速に（２０分未満）血液循環から除かれるので多量のＴＮＦが注入される必要があった。さらに、これらの高投与量のＴＮＦは血圧の急降下を特徴とする「ショック」様症状を引き起こした。ＴＮＦを用いる代わりの方法はそれが血液循環中にとどまるようにそれを配合することである。これを実施することにより、ＴＮＦは腫瘍の血管系と相互作用するためにより多くの時間があり、そして腫瘍への血液供給を分断するために十分な時間がある。いくつかの他の治療タンパク質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と配合されており、その結果、それらはより長く循環し、そして血管系にとどまる。これらのタンパク質はアスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼを含む。例えば、Ｈａｒｒａｓ、Ｊ．Ｍ．「ＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」中、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（１９９２）を参照。日本人研究者のグループはＴＮＦをある種のＰＥＧと配合できたこと及び得られる材料が実質的に増加した循環半減期及びより大きい抗腫瘍活性を有したことを以前に記述している。Ｔｓｕｔｓｕｍｉ、Ｙ．等、Ｊａｐ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、８５：９−１２（１９９４）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ、Ｙ．等、Ｊａｐ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、８５：１１８５−１１８８（１９９４）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ、Ｙ．等、Ｊａｐ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、８７：１０７８−１０８５（１９９７）。これらの研究者はスクシンイミジルスクシネートリンカーでＴＮＦ上の第一級アミンに結合させた５０００の分子量を有するＰＥＧのみを用いた。発明の要約今回、意外にも、約１０，０００ないし約４０，０００の範囲、好ましくは約２０，０００ないし３０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＴＮＦを改変することがＴＮＦの循環半減期を著しく増し、また、ＴＮＦの殺腫瘍活性も高めることが見いだされた。例えば、ＴＮＦの血清半減期はそのような改変により２０分のようなわずかから１５日まで上げられ、そして抗腫瘍ＥＤ５０は１０００−３０００ＩＵのような多量から１０−５０ＩＵのような少量まで下げられている。改変の結果として、患者に対するより少ない随伴する不都合な副作用で、腫瘍を有効に処置するために、より低い投与量のＴＮＦを投与することができる。それ故、本発明は改変されたＴＮＦに関し、その場合、該改変は約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する１個またはそれより多いＰＥＧ分子を、直接的または生体適合性の連結剤を介してのいずれかで、該ＴＮＦに共有結合的に結合することを含んでなる。好ましくは、ＴＮＦは５ないし１２個のＰＥＧ分子、より好ましくは約５ないし９個のＰＥＧ分子で改変される。また、本発明は該改変されたＴＮＦの治療的に有効な量を腫瘍を患っている患者に投与することにより該患者を処置する方法にも関する。本発明はさらに約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子をＴＮＦに共有結合的に結合することにより該ＴＮＦを改変することを含んでなるＴＮＦの循環半減期を増大する方法に関する。本発明はさらに約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子催を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子をＴＮＦに共有結合的に結合することにより該ＴＮＦを改変することを含んでなるＴＮＦの殺腫瘍活性を高める方法に関する。図面の説明図１は天然のＴＮＦ−α（開いた丸）、ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ −α（閉じた丸）及び２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた三角）のマウス血清中の循環半減期を示すグラフである。図２は天然のＴＮＦ−α（開いた丸）、ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ −α（閉じた丸）、ＳＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（閉じた三角）、ＳＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた三角）、ＮＨＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（閉じた四角）及びＮＨＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた四角）のマウス血清中の循環半減期を示すグラフである。発明の詳細な説明本明細書に用いられる「腫瘍壊死因子」または「ＴＮＦ」は、単離されたヒトもしくはマウスＴＮＦタンパク質のような天然に得られるタンパク質、または組み換えネズミＴＮＦ及び組み換えヒトＴＮＦのような組み換え技術を用いて製造されるタンパク質を包含する。ＴＮＦ−αタンパク質が好ましいが、「ＴＮＦ」という用語はＴＮＦ−βタンパク質も包含する。また、その用語は生物学的活性を著しく損なわずにアミノ酸の欠失または改変により突然変異させたＴＮＦタンパク質も包含する（例えば、限定しない例として、アミノ酸２１２−２２０を欠失させるかまたは２４８、５９２，５０８のリシンをアラニンに変える）。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は一般式Ｈ（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n ＯＨにより表される、分枝鎖または直鎖の、エチレンオキシド及び水の縮合ポリマーの混合物をさす。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」はそのおおよその重量平均分子量を示すために数字の接尾辞と組み合わせて用いられる。例えば、ＰＥＧ５，０００は約５，０００のおおよその重量平均分子量を有するポリエチレングリコールをさし；ＰＥＧ１２，０００は約１２，０００のおおよその重量平均分子量を有するポリエチレングリコールをさし；そしてＰＥＧ２０，０００は約２０，０００のおおよその重量平均分子量を有するポリエチレングリコールをさす。そのようなポリエチレングリコールはいくつかの商業的製造業者から入手でき、そして上に示したようにそれらの重量平均分子量により慣例的に呼ばれる。「黒色腫」は口腔、食道、肛門管、膣、脳軟膜及び／または結膜もしくは眼を初めとする、皮膚及び他の器官のメラノサイト系から生じる悪性または良性の腫瘍であってもよい。「黒色腫」という用語は例えば先端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫及び表在拡大型黒色腫を含む。「患者」は動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトをさす。「生体適合性の」は一般に生物学的機能に有害ではなく、そしてアレルギーを起こす及び疾病状態を初めとするいかなる程度の許容できない毒性ももたらさない物質または化合物をさす。「循環半減期」は、患者への改変されたＴＮＦの注入後に、ＴＮＦの量が初めの最大血消レベルの半分のレベルまで取り除かれるまでの期間をさす。ヒトまたはマウスを初めとするあらゆる適切な種において循環半減期を測定することができる。本明細書に用いられる「共有結合的に結合した」は、直接的またはリンカーを介してのいずかで、ＰＥＧ分子にＴＮＦタンパク質を連結する共有結合をさす。本発明により、ＴＮＦを１０，０００ないし４０，０００の範囲、好ましくは２０，０００ないし３０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで改変する。通例、３０，０００またはそれより多い分子量を有するポリエチレングリコールは溶解するのが困難であり、配合された生成物の収率を非常に下げる。ポリエチレングリコールは分枝鎖または直鎖であってもよいが、好ましくは直鎖である。生体適合性の連結基を介してポリエチレングリコールをＴＮＦに結合することができる。上に説明したように、「生体適合性の」は化合物または基が無毒であり、そして損傷、疾病、疾患または死を引き起こさずにインビトロまたはインビボでそれを利用できることを示す。ＰＥＧを例えば、エーテル結合、エステル結合、チオール結合またはアミド結合により連結基に結合することができる。適当な生体適合性の連結基は例えば、エステル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、（例えば、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）もしくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を初めとする）マレイミド基、エポキシド基、（例えば、ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）もしくはトリクロロフェニルカーボネート（ＴＰＣ）を初めとする）オキシカルボニルイミダゾール基、トリシレート（ｔｒｙｓｙｌａｔｅ）基、アルデヒド基、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎｔｅ）基、ビニルスルホン基、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基または第一級アミンを含む。好ましくは、生体適合性の連結基はエステル基及び／またはマレイミド基であり、ＴＮＦタンパク質上の第一級アミンを介してＴＮＦに結合する。より好ましくは、連結基はＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡまたはＮＨＳであり；ＳＳが最も好ましい。あるいはまた、アミノ基、スルフィドリル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を介して直接的に（すなわち、連結基なしに）ＴＮＦをＰＥＧに結合することができる例えば、引用することにより本明細書に開示が組み込まれるＨａｒｒａｓ、Ｊ．Ｍ．「ＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」中、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（１９９２）中に記述されたように、直接的または生体適合性の連結基を介してＰＥＧにＴＮＦを共有結合的に結合するための方法は当該技術分野で知られている。ＴＮＦタンパク質を５ないし１２個のＰＥＧ分子に共有結合的に結合することが好ましい。タンパク質に結合したＰＥＧ分子の数を測定するための方法は当該技術分野で知られている、例えば、引用することにより本明細書に組み込まれるＨａｂｅｅｂ、Ａ．Ｆ．Ｓ．Ａ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１４：３２８−３３９（１９６６）；Ｈａｒｒａｓ、Ｊ．Ｍ．上記。ＴＮＦに結合するＰＥＧ分子の数は利用する連結基、反応の長さ及び反応に利用するＴＮＦとＰＥＧのモル比により変わる。当業者が認識するように、本発明の改変されたＴＮＦを多数の方法で、例えば、経口的、鼻内、腹腔内、非経口的、静脈内、リンパ管内、腫瘍内、筋肉内、間質（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔａｌｌｙ）、動脈内（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌｌｙ）、皮下、眼内、滑液内（ｉｎｔｒａｓｙｎｏｉａｌｌｙ）、経上皮的及び経皮的に投与することができる。本発明の改変された化合物のいずれかの治療的に有効な量は腫瘍成長を抑制するために有効な量であり、その量は投与の方法により変わる可能性がある。通例、有効な投与量は週１回で約０．００１ないし０．１ｍｇ／ｋｇの範囲であるべきである。当該技術分野で知られているように、改変されたＴＮＦを製薬学的に許容しうる担体及び希釈剤と配合することができる。例えば、静脈内投与のためには、注入前に、改変されたＴＮＦをリン酸緩衝食塩水溶液または当業者に知られているあらゆる他の適切な溶液と混合することができる。改変されたＴＮＦが黒色腫、結腸癌、腎臓癌及び乳癌腫瘍を処置することに特に有効であることが試験から示されている。本発明は以下の実施例においてさらに示され、それらは例示の目的のためであり、本発明の範囲を限定しないと考えられる。以下に記述する実験に用いるＴＮＦはマウス及びヒト起源のものである。ヒトＴＮＨ（全タンパク質）をエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で製造し、ネズミＴＮＦ及びヒトＴＮＦ突然変異体をピチェア・パストリス（Ｐｉｃｈｅａｐａｓｔｏｒｉｓ）で製造した。Ｐｅｎｎｉｃａ、Ｄ．等、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：７２４−７２９（１９８１）；Ｓｔｒｅｅｋｉｓｈｎａ、Ｋ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８：４１１７−４１２５（１９８９）中に記述されたものに類似した方法を用いてエシェリキア・コリまたはピチェアで組み換えＴＮＦを製造した。マウスＴＮＦをエシェリキア・コリ及びピチェアで製造した。実施例１ＴＮＦ−αの比活性ペジレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）前に、以下に記述するようにＬ９２９細胞障害性アッセイを用いて成熟組織壊死因子（ＴＮＦ−α）（ヒト組み換え体）を試験した。ＴＮＦ−αの比活性は１０⁶Ｉ．Ｕ．ユニット／ｍｇであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリーから材料が９９％純粋であることが示された。材料（１６．８ｍｇ／ｍｌで１ｍｌ、ピーターソン修飾（Ｐｅｔｅｒｓｏｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）基準で、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ．Ｍ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２：２４８−２５４（１９７６）の方法により測定された）を３，０００ｋＤａカットオフセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）を用いて約０．１ｍｌに濃縮した。次に、この材料を１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０で４ｍｌに希釈し、０．１ｍｌに再濃縮した。この手順を２回繰り返し、得られた材料を最後に１ｍｌの総容量の同じバッファー中に集めた。次に、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ、上記の方法により測定した。ＢＳＡを基準として用い、約０．６ｍｇのタンパク質を回収した。ペジレーション上に引用したＨａｒｒａｓ、Ｊ．Ｍ．中に記述された一般法を用いてペジレーション反応を実施した。ＴＮＦ（１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．２−７．５中１ｍｇ／ｍｌ）に、ＳＳ−ＰＥＧまたはＮＨＳ−ＰＥＧを１０ないし５０モル過剰で添加し、室温で１時間混合した。用いた特定のpH及びモル比はＰＥＧの反応性で変わり、実験的に決定しなければならなかった。１００ｋＤａカットオフフィルターを用いて限外濾過によりＰＥＧ−ＴＮＦを未反応のＰＥＧ及びＴＮＦから分離した。この実施例に参照として載せる改変の各々において、ＴＮＦは５ないし９分子のＰＥＧで改変された。ＰＥＧ−ＴＮＦの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、そしてこの方法により改変された第一級アミンのパーセントをＳ．Ｊ．Ｓｔｏｃｋｓ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５４：２３２（１９８６））により記述されたようにフロレスカミン（ｆｌｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）を用いて測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、あるとしても非常にわずかしか天然のＴＮＦ−αがペジレーション後の調製物中に残っていないことが示された。ＰＥＧ−ＴＮＦ−αのインビトロ活性細胞の継代数が分からないことを除いて、以下に記述する方法に従って実施するＬ−９２９細胞障害性アッセイを用いてインビトロ細胞障害性活性に関してＰＥＧ−ＴＮＦ−αを調べた。ＴＮＦ−α出発材料の比活性は１．５ｘ１０⁶ユニット／ｍｇまたは最初の比活性測定の約半分であった。比活性の差は異なるタンパク質測定方法の使用及び未知の細胞継代数に起因すると考えた。ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αの比活性は０．７ｘ１０⁶ユニット／ｍｇまたは天然の材料の比活性の約半分であった。ＳＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αの比活性はＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αに類似した値の０．８ｘ１０⁶ユニット／ｍｇであった。ＰＥＧ−ＴＮＦ−αの致死率スクリーニングとして、２匹のＣ５７ｂｌ６マウス（メス、２０−２５ｇ）に天然のＴＮＦ−αまたはＳＳ−ＰＥＧ−ＴＮＦ−αのいずれかを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入し、それらの動物の生存を調べた。用いた投与量は１，０００、５，０００及び１０，０００ユニットの活性であった。天然のＴＮＦ−αでは、以下の結果が得られた：１０，０００Ｉ．Ｕ．−両方のマウスは翌朝に死亡した。５，０００Ｉ．Ｕ．−１匹のマウスは翌朝に死亡し；もう１匹のマウスは明らかな苦痛の状態にあり（毛は乱れ、ほとんど動かない）、２日後に死亡した。１，０００Ｉ．Ｕ．−１匹のマウスは翌朝に死亡し；もう１匹のマウスは苦痛の状態にあり（毛は乱れ、ほとんど動かない）、２日後にそのような弱った状態にあり、それを安楽死させた。ＳＳ−ＰＥＧ−ＴＮＦ−αでは、全ての投与量で全てのマウスが注入後２週間優れた健康状態のままであった。食べること及び飲むことであるような、行動は正常であった。毛に変化はなかった（毛は乱れなかった）。全てのマウスを注入後１５日目に安楽死させた。ＰＥＧ−ＴＮＦ−αの血清半減期の測定Ｇｅｎｚｙｍｅから入手したヒトＴＮＦのＥＬＩＳＡアッセイを用いた。製造業者により提示されるようにキットを用いた。ＴＮＦ−αまたはＰＥＧ−α（１００ユニット）のいずれかをマウスにｉ．ｐ．注入し、図１に示す時間で後部眼窩出血から約２５μｌの血清を集めた。各群に全部で５匹のマウス（メス、Ｃ５７ｂｌ６マウス、２０−２５ｇ）であった。天然のＴＮＦ−α（開いた丸）は非常に迅速に取り除かれ、ベースラインより上の唯一のデータ点は注入後３０分であった。ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（閉じた丸）は約４日の半減期であった。２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた三角）の半減期は＞１５日であった。以下に挙げる処置群を用いてこの実験を繰り返し、それらの結果を図２に示す：天然のＴＮＦ−α（開いた丸）；ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（（閉じた丸）、ＳＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αが欠落？）（閉じた三角）；ＳＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた三角）；ＮＨＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（閉じた四角）（及びＮＨＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた四角）が欠落？）。異なる処置群の血清半減期はＮＨＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α及びＳＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αでは＞１５日；ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αでは約４日；ＳＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ− αでは約６日；ＮＨＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αでは約８日；そして天然のＴＮＦ−αでは注入後３０分であった。要約すると、各ＰＥＧ−ＴＮＦ −αは天然のＴＮＦ−αよりかなり長い半減期を示したが；しかしながら、ＮＨＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α及びＳＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ− ＴＮＦ−αはより低い分子量のＰＥＧで改変されたＴＮＦ−αより著しく長い半減期（＞１５日）を有した。ＰＥＧ−ＴＮＦ−αの抗腫瘍活性Ｂ１６黒色腫モデルを用いた。Ｃ５７ｂｌ６マウス（メス、２０−２５ｇ）の横腹に１ｘ１０⁶個のＢ１６細胞をｓ．ｑ．注入した。処置を開始する前に１週間腫瘍を成長させた。各処置群は５匹のマウスからなった。処置群は：リン酸バッファーコントロール（ｐＨ７．５）、リン酸バッファー（ｐＨ７．５）中の天然のＴＮＦ−α（１０Ｉ．Ｕ．及び１００Ｉ．Ｕ．）及びリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中のＳＳ−ＰＥＧ−ＴＮＦ−α（１０Ｉ．Ｕ．、１００Ｉ．Ｕ．及び１０００Ｉ．Ｕ．）を含んだ。７日、１４日及び２１日目に週に１回マウスに０．１ｍｌをｉ．ｐ．注入した。動物の生存を記録した。２週後（最初の処置後１週目）に、コントロール動物における腫瘍は完全に識別できた。ＳＳ−ＰＥＧ−ＴＮＦ−αで処置した動物はいずれも成長する腫瘍がないようであった。２２日目に、表１に示す結果を得た：１８０日後に、表２に示す結果を得た。これらの結果から、ＰＥＧでのＴＮＦの改変がＴＮＦの致死率を下げることだけでなく、約２０，０００の分子量を有するＰＥＧで改変されたＴＮＦが驚くべき増大された循環半減期及び驚くべき著しく高められた抗腫瘍活性を示したことが示される。これらの結果は多くの理由から意外である。高分子量のＰＥＧでＴＮＦを改変することがＴＮＦの循環半減期を増すことを予測することはできなかった。実際、一般にタンパク質のクリアランス速度をそれらの分子量に基づいて予測することはできない。高分子量のＰＥＧでのＴＮＦの改変がＴＮＦの殺腫瘍活性を減らさないだけでなく、実際は高めることは、高分子量の改変物（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）により生み出されると考えられる付加される立体障害を考慮すると意外である。なおさらに、改変されたＴＮＦは、その増大した循環半減期のために、天然のＴＮＦよりさらに有毒であると予測されており、それは事実ではなかった。以下のものはこの実施例において利用する細胞障害性アッセイの説明である。Ａ．材料Ｌ９２９繊維芽細胞ＡＴＣＣ ♯ＣＣＬ１ＮＣＴＣクローン９２９ダルベッコの修正必須培地（ＤＭＥＭ）ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ＃１６０００−０１０）正常食塩水（ＮｏｒｍａｌＳａｌｉｎｅ）中１ＭのＨＥＰＥＳバッファー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．＃１７−７３７Ｅ）ゲンタマイシン硫酸塩（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．、＃１７−５１８Ｚ）トリプシン−ＥＤＴＡ１Ｘ（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳ、＃２５３００−０２１）トリパンブルーステイン（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃１５２５０−０１２）組織培養フラスコ、１５０ｃｍ²、７５ｃｍ²、２５ｃｍ²（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、＃２５１２０、＃２５１１０、＃２５１００）９６ウェル細胞培養プレート、平底（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、＃２５８６１）１２テャンネルピペッター（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）ピペッター用滅菌チップ（ＩｎｔｅｒｍｏｕｎｔａｉｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｒｐ．、Ｂｏｕｎｔｉｆｕｌ、ＵＴ、＃Ｐ−３２５０−８）滅菌試薬容器（ＣｏｓｔａｒＣｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、＃４８７０）組み換えヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（社内で製造した）アルブミン、ウシ、ＩＭＥＭ中１０％（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、＃６５２２３７）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃３１０−４１９０）マイクロタイタープレート読み取り装置（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐ．、ＭｅｎｌｏＰａｒｋ、ＣＡ、Ｅｍａｘ）Ｂ．Ｌ９２９繊維芽細胞の増殖：１．以下のようにＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で毎週２回継代することにより繊維芽細胞を維持する。フラスコから培地を吸引し、付着した細胞を残す。細胞単層を５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡで洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを吸引して除く。３７℃で１ないし２分インキュベートする。１５ｍｌのＤＭＥＭ／ＦＢＳを添加して単層を洗浄し、トリプシンの酵素活性を止める。２．細胞を数え、トリパンブルー排除により生存度を評価する。Ｔ７５フラスコ中の抗生物質を含まない３０ｍｌのＤＭＥＭ／ＦＭＳ（ＦＢＳ？）に１ｘ１０⁶の細胞を接種する。３７℃、５％ＣＯ₂湿度調節（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）インキュベーター中でインキュベートする。３．アッセイのために、Ｔ１５０フラスコ中の６０ｍｌのＤＭＥＭ／ＦＢＳに２ｘ１０⁶の細胞を接種する。細胞が融合するまで（８０−９０％）フラスコを３または４日間インキュベートする。Ｃ．ＴＮＦ−αインビトロ細胞障害性アッセイ１日目：細胞の調製１．細胞をトリプシンで処理し、ＤＭＥＭ／ＦＢＳで１．２２ｘ１０⁶細胞／ｍｌの最終濃度まで希釈する。ゲンタマイシン硫酸塩を５０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加する。２ｘ１０⁶細胞の細胞数が各プレートに必要とされ、そしてＴ１５０フラスコから１．７５−２ｘ１０⁷細胞を期待できる。２．９６ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに１５０μｌの細胞懸濁液を添加することによりＬ９２９繊維芽細胞を平板培養する。３７℃、５％ＣＯ₂湿度調節インキュベーター中で一晩インキュベートする。２日目：サンプルの添加１．続ける前に、倒立顕微鏡を用いて各ウェルの融合性を調べる。各ウェルはアッセイが再現できるために同等に融合していなけらばならない。プレートの外側のウェルはこれらのウェルにおける細胞の不均一な増殖のためにアッセイ計算には用いない。最高感度のためには細胞は７５ないし９０％融合していなけらばならない。細胞の継代数が増すにつれて、細胞の倍加当たりの時間は減少する。従って、適切な融合性を得るために細胞数／ウェルを調整することができる。２．ＴＮＦ−α基準作業溶液を調製する。使用するまで４℃で保管する。３．２及び３列の１番目のウェルに１５０μｌのＴＮＦ作業溶液を添加する。４ないし１０列の１番目のウェルに１５０μｌのサンプルを添加する。１、１１及び１２列にＤＭＥＭ／ＦＢＳ／ゲンタマイシンを添加する。１番目のウェルの中身を混合し、１２チャンネルピペッターを用いて１５０μｌを列の２番目のウェルに移すことにより２倍連続希釈物を作製する。最後に、８番目のウェル（横列Ｈ）の中身を混合し、各ウェルから１５０μｌを廃棄する。この時点で、全てのウェルは１５０μｌを含むはずである。４．プレートを３７℃、５％ＣＯ₂湿度調節インキュベーター中で２０時間インキュベートする。３日目：２０μｌの３［４，５−ジメチノレチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４中２５ｍｇ／ｍｌ）を培養プレートの各ウェルに添加し、培養物を３７℃で４時間インキュベートすることにより細胞の生存度を測定した。その期間の後に、培養上清を廃棄し、１５０μｌのＤＭＳＯを各ウェルに添加した。各ウェルの５７０ｎｍでの吸光度をマイクロタイタープレート読み取り装置を用いて測定した。コントロールの相加平均の５０％に最も近いＡ₅₄₀を示すウェルは、Ｌ９２９細胞の５０％溶解（１ユニット）を表すとみなされる。Ｄ．溶液ＴＮＦ−α基準（１０μｇ）凍ったＴＮＦ−α基準を氷上で解かす。ねじ蓋クリオチューブ中に２ μｇ／チューブで等分し、−８０℃で保存する。ＴＮＦ−α基準ストック溶液（２５６ｎｇ／ｍｌ）１つのチューブ（２μｇ）のＴＮＦ−α基準に、ＤＰＢＳ／ゲンタマイシン中１％のアルブミン７．８１ｍｌを添加する。１ｍｌチューブに等分し、４℃で保存する。典型的には溶液を６カ月間使用する。ＴＮＦ−α作業溶液（０．８ｎｇ／ｍｌ）２枚のプレートには、３．１２μｌのストック溶液を９９７μｌのＤＭＥＭ／ＦＢＳ／ゲンタマイシンに添加する。（基準溶液は０．４ｎｇ／ｍｌの最終濃度にマルチウェルプレートの１番目のウェル中で１：２に希釈される）。使用するまで４℃で保管する。リン酸緩衝食塩水１Ｌ（ＰＢＳ、１ｘ）０．２ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、８ｇのＮａＣｌ及び１．１４ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄を９００ｍｌの水に溶解する。ＩＬまで適当量、ｐＨを７．４に調整する。オートクレーブする。実施例２（Ｈａｒｒａｓ、上記中に記述された一般法に従って）ＰＥＧで改変されたヒト組み換えＴＮＦのさらなるサンプルを調製し、それらの血清半減期及び比活性の保持に関して試験した。各場合において、ＴＮＦは約５ないし９分子のＰＥＧで改変された。データ（表３）から、意外にも、約１００００ないし４００００、好ましくは約２００００−３００００のおおよその分子量平均を有するＰＥＧで改変されたＴＮＦが高い比活性を保持しながら著しく増大した血清半減期を示すことが示される。Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手したＥＬＩＳＡアッセイを製造業者により提示されるように用いて、ＴＮＦの様々な配合物の血清半減期を測定した。ヘパリンを添加した５０μｌの毛細管を用いて後部眼窩集網叢から血清サンプルを集めた。ＴＮＦまたはＰＥＧ−ＴＮＦ配合物のｉ．ｖ．注入のすぐ前に処置前血液サンプルを集めた。処置後３０分、２４時間並びに３、７、１２及び１５日でさらなる血液サンプルを集めた。サンプルを遠心分離し、得られた上清をアッセイするまで−２０℃で凍結して保存した。実施例３ＰＥＧで改変されたヒト組み換えＴＮＦのさらなるサンプルを調製し、血清半減期及び比活性保持に関して試験した。表４に示すデータから、半減期及び比活性が利用するリンカーにより変わる可能性があることが示される。実施例４異なる種類の腫瘍細胞を注入したマウスに対するＰＥＧで改変された組み換えヒトＴＮＦの効果を評価するためにさらなる試験を実施した。これらの試験に利用するＴＮＦをＨａｒｒａｓ、上記に記述されたような方法に従ってＳＳ−ＰＥＧ２００００で改変した。マウスに１ｘ１０⁶の腫瘍細胞を注入し、２週後に、ＰＥＧ−ＴＮＦを週に１回３週間ｉ．ｐ．注入した。未処置の動物より５倍長く生存する動物のパーセントとして治癒を定義した。結果を表５に示し、それにより、本発明の改変されたＴＮＦが黒色腫、腎臓腫瘍、結腸腫瘍及び乳腫瘍を処置することに有効であることが示される。実施例５ＰＥＧで改変された、様々な起源からのＴＮＦを評価するために試験を実施した。結果を表６に示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年１月８日（１９９９．１．８）【補正内容】請求の範囲１．約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子に共有結合的に結合したＴＮＦを含んでなる改変されたＴＮＦ。２．該ＰＥＧが約２０，０００ないし約３０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。３．該ＰＥＧが生体適合性のリンカーを介して該ＴＮＦに共有結合的に結合している請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。４．該リンカーがＮ−ヒドロキシスクシンイミジルスクシネートである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。５．該リンカーがＮ−スクシンイミジルプロピオネートである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。６．該ＴＮＦが約５ないし９個のＰＥＧ分子に共有結合的に結合している請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。７．該ＴＮＦがＴＮＦ上の第一級アミンを介して該ＰＥＧ分子に共有結合的に結合している請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。８．該ＴＮＦがＴＮＦ−αである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。９．該ＴＮＦが単離されたヒトＴＮＦである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。１０．該ＴＮＦが組み換えヒトＴＮＦである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。１１．約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子をＴＮＦに共有結合的に結合することにより該ＴＮＦを改変することを含んでなるＴＮＦの循環半減期を増大する方法。１２．約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子をＴＮＦに共有結合的に結合することにより該ＴＮＦを改変することを含んでなるＴＮＦの殺腫瘍活性を高める方法。１３．請求の範囲１の改変されたＴＮＦの治療的に有効な量を腫瘍を患っている患者に投与することを含んでなる該患者の処置方法。１４．該腫瘍が黒色腫である請求の範囲１３の方法。１５．該腫瘍が結腸癌である請求の範囲１３の方法。１６．該腫瘍が腎臓癌である請求の範囲１３の方法。１７．該腫瘍が乳癌である請求の範囲１３の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子に共有結合的に結合したＴＮＦを含んでなる改変されたＴＮＦ。２．該ＰＥＧが約２０，０００ないし約３０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。３．該ＰＥＧが生体適合性のリンカーを介して該ＴＮＦに共有結合的に結合している請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。４．該リンカーがＮ−ヒドロキシスクシンイミジルスクシネートである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。５．該リンカーがＮ−スクシンイミジルプロピオネートである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。６．該ＴＮＦが約５ないし９個のＰＥＧ分子に共有結合的に結合している請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。７．該ＴＮＦがＴＮＦ上の第一級アミンを介して該ＰＥＧ分子に共有結合的に結合している請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。８．該ＴＮＦがＴＮＦ−αである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。９．該ＴＮＦが単離されたヒトＴＮＦである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。１０．該ＴＮＦが組み換えヒトＴＮＦである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。１１．約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子をＴＮＦに共有結合的に結合することにより該ＴＮＦを改変することを含んでなるＴＮＦの循環半減期を増大する方法。１２． ----おおよその----を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子をＴＮＦに共有結合的に結合することにより該ＴＮＦを改変することを含んでなるＴＮＦの殺腫瘍活性を高める方法。１３．請求の範囲１の改変されたＴＮＦの治療的に有効な量を腫瘍を患っている患者に投与することを含んでなる該患者の処置方法。１４．該腫瘍が黒色腫である請求の範囲１３の方法。１５．該腫瘍が結腸癌である請求の範囲１３の方法。１６．該腫瘍が腎臓癌である請求の範囲１３の方法。１７．該腫瘍が乳癌である請求の範囲１３の方法。