JP2001511784A

JP2001511784A - Modified tumor necrosis factor

Info

Publication number: JP2001511784A
Application number: JP53448898A
Authority: JP
Inventors: クラーク，マイク・エイ
Original assignee: フエニツクス・フアーマコロジクス・インコーポレーテツド
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 2001-08-14
Anticipated expiration: 2018-01-15
Also published as: EP1007082B1; ATE342729T1; CA2277757C; CN1168495C; EP1007082A1; US7785579B2; ES2275300T3; DK1007082T3; AU725133B2; DE69836222T2; CN1243444A; US20060222626A1; EP1007082A4; DE69836222D1; WO1998031383A1; JP4295831B2; CA2277757A1; AU6241098A

Abstract

Modifying TNF with polyethyleneglycol (PEG) having an approximate weight average molecular weight in the range of about 10,000 to about 40,000, preferably in the range of about 20,000 to 30,000, significantly increases the circulating half-life of the TNF while not increasing its toxicity. As a result, lower doses of the TNF may be administered to effectively treat tumors with fewer, accompanying adverse side effects to the patient.

Description

【発明の詳細な説明】改変された腫瘍壊死因子関連出願本出願は１９９７年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／０３５，５２１号の利益を請求する。発明の分野本出願はとりわけ１０，０００ないし４０，０００の範囲の分子量を有するポリエチレングリコールで改変された腫瘍壊死因子及びそのような改変された腫瘍壊死因子を用いて腫瘍を処置するための方法に関する。発明の背景悪性黒色腫（３期）は診断の１年以内に大部分の患者を死亡させる致死的な疾病である。黒色腫の発生は米国において急速に増加しており、豪州のような他の国より高くさえある。黒色腫を患っている患者のための有効な処置が緊急に必要とされている。腎臓癌により現在米国では毎年約１３，０００人が死亡している。この型の癌はしばしばかなり進行するまで検出されない。患者の予後に顕著に影響を与える処置の唯一の形態は冒された臓器の外科的切除である。残念なことに、この型の癌は非常に転移性であるので、全ての転移の完全な除去は不可能でないにしても困難である。結腸癌は癌の最も一般的な型の一つであり、現在米国では毎年約１４０，０００人が死亡している。この疾病を処置するために開発された多数の伝統的な化学療法薬があるが、（５年またはそれより長く生存する患者のパーセンテージとして定義される）長期生存はここ４０年であまり変わっていない。さらに、開発された伝統的な化学療法薬は全て非常に有毒であり、有害なそしてしばしば致命的な副作用を有し、そして費用がかかる。この疾病の治癒的な無毒の処置が緊急に必要とされている。黒色腫、腎臓及び結腸腫瘍の特徴は、これらの腫瘍が伝統的な化学療法に対する抵抗性を急速に持つようになることである。たとえ患者が最初に化学療法処置によい反応を示すことができでも、薬剤抵抗性の腫瘍が急速に発生し、そして結局患者を死亡させる。これらの腫瘍を処置するための代わりの方法は腫瘍に「弱点」を同定し、その標的を選択的に処置する治療を開発することである。１つのそのような可能性のある標的が同定されている。具体的には、これらの型の腫瘍の３つ全ては、癌が成長するために転移の各々の多量の血管新生を必要とすることが認められている。それ故、これらの腫瘍の血管新生を妨げる治療薬はこれらの腫瘍を処置する独特な手段を与える可能性があると予測される。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、免疫刺激活性を有する、白血球及び関連する細胞により産生される一群の多様なタンパク質である多数のサイトカインの１つである。ＴＮＦは元来、腫瘍を壊死させるその能力にちなんで命名された。ＴＮＦが腫瘍を殺すと考えられる少なくとも２つの異なる機構がある。第一のものは腫瘍自体への直接作用による。あるいはまた、ＴＮＦは腫瘍の血管新生を選択的に分断することができる。ＴＮＦを記述する初期の原稿において、Ｃａｒｓｗｅｌｌ及びＯｌｄはＭＥＴＨＡ腫瘍細胞がインビトロでＴＮＦに完全に抵抗性であることを報告した、Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ、７２：３６６６−３６７０（１９７５）。しかしながら、マウスにおけるＭＥＴＨＡ腫瘍はインビボでＴＮＦに非常に感受性であった。これはＴＮＦがこれらの腫瘍の血管新生を選択的に分断したためであると考えられた。今までのところ同定されていないある因子がいくつかの腫瘍により放出され、それにより腫瘍に隣接する正常な血管内皮細胞がＴＮＦに殺されやすくなることが後に示された。簡潔に言えば、腫瘍細胞を直接的に殺すことによるのではなく、むしろ血液、酸素及び生存し成長するために必要な他の栄養物を腫瘍に供給する血管に沿って並ぶ正常な血管内皮細胞を殺すことによりＴＮＦはこれらの腫瘍を殺す。残念なことに、初期の臨床試験はＴＮＦを直接殺腫瘍剤として開発しようと試みた。このように用いられる場合、ＴＮＦは迅速に（２０分未満）血液循環から除かれるので多量のＴＮＦが注入される必要があった。さらに、これらの高投与量のＴＮＦは血圧の急降下を特徴とする「ショック」様症状を引き起こした。ＴＮＦを用いる代わりの方法はそれが血液循環中にとどまるようにそれを配合することである。これを実施することにより、ＴＮＦは腫瘍の血管系と相互作用するためにより多くの時間があり、そして腫瘍への血液供給を分断するために十分な時間がある。いくつかの他の治療タンパク質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と配合されており、その結果、それらはより長く循環し、そして血管系にとどまる。これらのタンパク質はアスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼを含む。例えば、Ｈａｒｒａｓ、Ｊ．Ｍ．「ＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」中、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（１９９２）を参照。日本人研究者のグループはＴＮＦをある種のＰＥＧと配合できたこと及び得られる材料が実質的に増加した循環半減期及びより大きい抗腫瘍活性を有したことを以前に記述している。Ｔｓｕｔｓｕｍｉ、Ｙ．等、Ｊａｐ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、８５：９−１２（１９９４）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ、Ｙ．等、Ｊａｐ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、８５：１１８５−１１８８（１９９４）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ、Ｙ．等、Ｊａｐ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、８７：１０７８−１０８５（１９９７）。これらの研究者はスクシンイミジルスクシネートリンカーでＴＮＦ上の第一級アミンに結合させた５０００の分子量を有するＰＥＧのみを用いた。発明の要約今回、意外にも、約１０，０００ないし約４０，０００の範囲、好ましくは約２０，０００ないし３０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＴＮＦを改変することがＴＮＦの循環半減期を著しく増し、また、ＴＮＦの殺腫瘍活性も高めることが見いだされた。例えば、ＴＮＦの血清半減期はそのような改変により２０分のようなわずかから１５日まで上げられ、そして抗腫瘍ＥＤ５０は１０００−３０００ＩＵのような多量から１０−５０ＩＵのような少量まで下げられている。改変の結果として、患者に対するより少ない随伴する不都合な副作用で、腫瘍を有効に処置するために、より低い投与量のＴＮＦを投与することができる。それ故、本発明は改変されたＴＮＦに関し、その場合、該改変は約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する１個またはそれより多いＰＥＧ分子を、直接的または生体適合性の連結剤を介してのいずれかで、該ＴＮＦに共有結合的に結合することを含んでなる。好ましくは、ＴＮＦは５ないし１２個のＰＥＧ分子、より好ましくは約５ないし９個のＰＥＧ分子で改変される。また、本発明は該改変されたＴＮＦの治療的に有効な量を腫瘍を患っている患者に投与することにより該患者を処置する方法にも関する。本発明はさらに約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子をＴＮＦに共有結合的に結合することにより該ＴＮＦを改変することを含んでなるＴＮＦの循環半減期を増大する方法に関する。本発明はさらに約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子催を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子をＴＮＦに共有結合的に結合することにより該ＴＮＦを改変することを含んでなるＴＮＦの殺腫瘍活性を高める方法に関する。図面の説明図１は天然のＴＮＦ−α（開いた丸）、ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ −α（閉じた丸）及び２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた三角）のマウス血清中の循環半減期を示すグラフである。図２は天然のＴＮＦ−α（開いた丸）、ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ −α（閉じた丸）、ＳＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（閉じた三角）、ＳＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた三角）、ＮＨＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（閉じた四角）及びＮＨＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた四角）のマウス血清中の循環半減期を示すグラフである。発明の詳細な説明本明細書に用いられる「腫瘍壊死因子」または「ＴＮＦ」は、単離されたヒトもしくはマウスＴＮＦタンパク質のような天然に得られるタンパク質、または組み換えネズミＴＮＦ及び組み換えヒトＴＮＦのような組み換え技術を用いて製造されるタンパク質を包含する。ＴＮＦ−αタンパク質が好ましいが、「ＴＮＦ」という用語はＴＮＦ−βタンパク質も包含する。また、その用語は生物学的活性を著しく損なわずにアミノ酸の欠失または改変により突然変異させたＴＮＦタンパク質も包含する（例えば、限定しない例として、アミノ酸２１２−２２０を欠失させるかまたは２４８、５９２，５０８のリシンをアラニンに変える）。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」は一般式Ｈ（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_n ＯＨにより表される、分枝鎖または直鎖の、エチレンオキシド及び水の縮合ポリマーの混合物をさす。「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」はそのおおよその重量平均分子量を示すために数字の接尾辞と組み合わせて用いられる。例えば、ＰＥＧ５，０００は約５，０００のおおよその重量平均分子量を有するポリエチレングリコールをさし；ＰＥＧ１２，０００は約１２，０００のおおよその重量平均分子量を有するポリエチレングリコールをさし；そしてＰＥＧ２０，０００は約２０，０００のおおよその重量平均分子量を有するポリエチレングリコールをさす。そのようなポリエチレングリコールはいくつかの商業的製造業者から入手でき、そして上に示したようにそれらの重量平均分子量により慣例的に呼ばれる。「黒色腫」は口腔、食道、肛門管、膣、脳軟膜及び／または結膜もしくは眼を初めとする、皮膚及び他の器官のメラノサイト系から生じる悪性または良性の腫瘍であってもよい。「黒色腫」という用語は例えば先端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫及び表在拡大型黒色腫を含む。「患者」は動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトをさす。「生体適合性の」は一般に生物学的機能に有害ではなく、そしてアレルギーを起こす及び疾病状態を初めとするいかなる程度の許容できない毒性ももたらさない物質または化合物をさす。「循環半減期」は、患者への改変されたＴＮＦの注入後に、ＴＮＦの量が初めの最大血消レベルの半分のレベルまで取り除かれるまでの期間をさす。ヒトまたはマウスを初めとするあらゆる適切な種において循環半減期を測定することができる。本明細書に用いられる「共有結合的に結合した」は、直接的またはリンカーを介してのいずかで、ＰＥＧ分子にＴＮＦタンパク質を連結する共有結合をさす。本発明により、ＴＮＦを１０，０００ないし４０，０００の範囲、好ましくは２０，０００ないし３０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有するポリエチレングリコールで改変する。通例、３０，０００またはそれより多い分子量を有するポリエチレングリコールは溶解するのが困難であり、配合された生成物の収率を非常に下げる。ポリエチレングリコールは分枝鎖または直鎖であってもよいが、好ましくは直鎖である。生体適合性の連結基を介してポリエチレングリコールをＴＮＦに結合することができる。上に説明したように、「生体適合性の」は化合物または基が無毒であり、そして損傷、疾病、疾患または死を引き起こさずにインビトロまたはインビボでそれを利用できることを示す。ＰＥＧを例えば、エーテル結合、エステル結合、チオール結合またはアミド結合により連結基に結合することができる。適当な生体適合性の連結基は例えば、エステル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、（例えば、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチレート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）もしくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を初めとする）マレイミド基、エポキシド基、（例えば、ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）もしくはトリクロロフェニルカーボネート（ＴＰＣ）を初めとする）オキシカルボニルイミダゾール基、トリシレート（ｔｒｙｓｙｌａｔｅ）基、アルデヒド基、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎｔｅ）基、ビニルスルホン基、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基または第一級アミンを含む。好ましくは、生体適合性の連結基はエステル基及び／またはマレイミド基であり、ＴＮＦタンパク質上の第一級アミンを介してＴＮＦに結合する。より好ましくは、連結基はＳＳ、ＳＰＡ、ＳＣＭ、ＳＳＡまたはＮＨＳであり；ＳＳが最も好ましい。あるいはまた、アミノ基、スルフィドリル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を介して直接的に（すなわち、連結基なしに）ＴＮＦをＰＥＧに結合することができる例えば、引用することにより本明細書に開示が組み込まれるＨａｒｒａｓ、Ｊ．Ｍ．「ＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」中、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（１９９２）中に記述されたように、直接的または生体適合性の連結基を介してＰＥＧにＴＮＦを共有結合的に結合するための方法は当該技術分野で知られている。ＴＮＦタンパク質を５ないし１２個のＰＥＧ分子に共有結合的に結合することが好ましい。タンパク質に結合したＰＥＧ分子の数を測定するための方法は当該技術分野で知られている、例えば、引用することにより本明細書に組み込まれるＨａｂｅｅｂ、Ａ．Ｆ．Ｓ．Ａ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１４：３２８−３３９（１９６６）；Ｈａｒｒａｓ、Ｊ．Ｍ．上記。ＴＮＦに結合するＰＥＧ分子の数は利用する連結基、反応の長さ及び反応に利用するＴＮＦとＰＥＧのモル比により変わる。当業者が認識するように、本発明の改変されたＴＮＦを多数の方法で、例えば、経口的、鼻内、腹腔内、非経口的、静脈内、リンパ管内、腫瘍内、筋肉内、間質（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔａｌｌｙ）、動脈内（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌｌｙ）、皮下、眼内、滑液内（ｉｎｔｒａｓｙｎｏｉａｌｌｙ）、経上皮的及び経皮的に投与することができる。本発明の改変された化合物のいずれかの治療的に有効な量は腫瘍成長を抑制するために有効な量であり、その量は投与の方法により変わる可能性がある。通例、有効な投与量は週１回で約０．００１ないし０．１ｍｇ／ｋｇの範囲であるべきである。当該技術分野で知られているように、改変されたＴＮＦを製薬学的に許容しうる担体及び希釈剤と配合することができる。例えば、静脈内投与のためには、注入前に、改変されたＴＮＦをリン酸緩衝食塩水溶液または当業者に知られているあらゆる他の適切な溶液と混合することができる。改変されたＴＮＦが黒色腫、結腸癌、腎臓癌及び乳癌腫瘍を処置することに特に有効であることが試験から示されている。本発明は以下の実施例においてさらに示され、それらは例示の目的のためであり、本発明の範囲を限定しないと考えられる。以下に記述する実験に用いるＴＮＦはマウス及びヒト起源のものである。ヒトＴＮＨ（全タンパク質）をエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で製造し、ネズミＴＮＦ及びヒトＴＮＦ突然変異体をピチェア・パストリス（Ｐｉｃｈｅａｐａｓｔｏｒｉｓ）で製造した。Ｐｅｎｎｉｃａ、Ｄ．等、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：７２４−７２９（１９８１）；Ｓｔｒｅｅｋｉｓｈｎａ、Ｋ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８：４１１７−４１２５（１９８９）中に記述されたものに類似した方法を用いてエシェリキア・コリまたはピチェアで組み換えＴＮＦを製造した。マウスＴＮＦをエシェリキア・コリ及びピチェアで製造した。実施例１ＴＮＦ−αの比活性ペジレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）前に、以下に記述するようにＬ９２９細胞障害性アッセイを用いて成熟組織壊死因子（ＴＮＦ−α）（ヒト組み換え体）を試験した。ＴＮＦ−αの比活性は１０⁶Ｉ．Ｕ．ユニット／ｍｇであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリーから材料が９９％純粋であることが示された。材料（１６．８ｍｇ／ｍｌで１ｍｌ、ピーターソン修飾（Ｐｅｔｅｒｓｏｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）基準で、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ．Ｍ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２：２４８−２５４（１９７６）の方法により測定された）を３，０００ｋＤａカットオフセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）を用いて約０．１ｍｌに濃縮した。次に、この材料を１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０で４ｍｌに希釈し、０．１ｍｌに再濃縮した。この手順を２回繰り返し、得られた材料を最後に１ｍｌの総容量の同じバッファー中に集めた。次に、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ、上記の方法により測定した。ＢＳＡを基準として用い、約０．６ｍｇのタンパク質を回収した。ペジレーション上に引用したＨａｒｒａｓ、Ｊ．Ｍ．中に記述された一般法を用いてペジレーション反応を実施した。ＴＮＦ（１００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．２−７．５中１ｍｇ／ｍｌ）に、ＳＳ−ＰＥＧまたはＮＨＳ−ＰＥＧを１０ないし５０モル過剰で添加し、室温で１時間混合した。用いた特定のpH及びモル比はＰＥＧの反応性で変わり、実験的に決定しなければならなかった。１００ｋＤａカットオフフィルターを用いて限外濾過によりＰＥＧ−ＴＮＦを未反応のＰＥＧ及びＴＮＦから分離した。この実施例に参照として載せる改変の各々において、ＴＮＦは５ないし９分子のＰＥＧで改変された。ＰＥＧ−ＴＮＦの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、そしてこの方法により改変された第一級アミンのパーセントをＳ．Ｊ．Ｓｔｏｃｋｓ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５４：２３２（１９８６））により記述されたようにフロレスカミン（ｆｌｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）を用いて測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、あるとしても非常にわずかしか天然のＴＮＦ−αがペジレーション後の調製物中に残っていないことが示された。ＰＥＧ−ＴＮＦ−αのインビトロ活性細胞の継代数が分からないことを除いて、以下に記述する方法に従って実施するＬ−９２９細胞障害性アッセイを用いてインビトロ細胞障害性活性に関してＰＥＧ−ＴＮＦ−αを調べた。ＴＮＦ−α出発材料の比活性は１．５ｘ１０⁶ユニット／ｍｇまたは最初の比活性測定の約半分であった。比活性の差は異なるタンパク質測定方法の使用及び未知の細胞継代数に起因すると考えた。ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αの比活性は０．７ｘ１０⁶ユニット／ｍｇまたは天然の材料の比活性の約半分であった。ＳＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αの比活性はＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αに類似した値の０．８ｘ１０⁶ユニット／ｍｇであった。ＰＥＧ−ＴＮＦ−αの致死率スクリーニングとして、２匹のＣ５７ｂｌ６マウス（メス、２０−２５ｇ）に天然のＴＮＦ−αまたはＳＳ−ＰＥＧ−ＴＮＦ−αのいずれかを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注入し、それらの動物の生存を調べた。用いた投与量は１，０００、５，０００及び１０，０００ユニットの活性であった。天然のＴＮＦ−αでは、以下の結果が得られた：１０，０００Ｉ．Ｕ．−両方のマウスは翌朝に死亡した。５，０００Ｉ．Ｕ．−１匹のマウスは翌朝に死亡し；もう１匹のマウスは明らかな苦痛の状態にあり（毛は乱れ、ほとんど動かない）、２日後に死亡した。１，０００Ｉ．Ｕ．−１匹のマウスは翌朝に死亡し；もう１匹のマウスは苦痛の状態にあり（毛は乱れ、ほとんど動かない）、２日後にそのような弱った状態にあり、それを安楽死させた。ＳＳ−ＰＥＧ−ＴＮＦ−αでは、全ての投与量で全てのマウスが注入後２週間優れた健康状態のままであった。食べること及び飲むことであるような、行動は正常であった。毛に変化はなかった（毛は乱れなかった）。全てのマウスを注入後１５日目に安楽死させた。ＰＥＧ−ＴＮＦ−αの血清半減期の測定Ｇｅｎｚｙｍｅから入手したヒトＴＮＦのＥＬＩＳＡアッセイを用いた。製造業者により提示されるようにキットを用いた。ＴＮＦ−αまたはＰＥＧ−α（１００ユニット）のいずれかをマウスにｉ．ｐ．注入し、図１に示す時間で後部眼窩出血から約２５μｌの血清を集めた。各群に全部で５匹のマウス（メス、Ｃ５７ｂｌ６マウス、２０−２５ｇ）であった。天然のＴＮＦ−α（開いた丸）は非常に迅速に取り除かれ、ベースラインより上の唯一のデータ点は注入後３０分であった。ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（閉じた丸）は約４日の半減期であった。２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた三角）の半減期は＞１５日であった。以下に挙げる処置群を用いてこの実験を繰り返し、それらの結果を図２に示す：天然のＴＮＦ−α（開いた丸）；ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（（閉じた丸）、ＳＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αが欠落？）（閉じた三角）；ＳＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた三角）；ＮＨＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（閉じた四角）（及びＮＨＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α（開いた四角）が欠落？）。異なる処置群の血清半減期はＮＨＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α及びＳＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αでは＞１５日；ＳＳ５，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αでは約４日；ＳＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ− αでは約６日；ＮＨＳ１２，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−αでは約８日；そして天然のＴＮＦ−αでは注入後３０分であった。要約すると、各ＰＥＧ−ＴＮＦ −αは天然のＴＮＦ−αよりかなり長い半減期を示したが；しかしながら、ＮＨＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ−ＴＮＦ−α及びＳＳ２０，０００ＭＷＰＥＧ− ＴＮＦ−αはより低い分子量のＰＥＧで改変されたＴＮＦ−αより著しく長い半減期（＞１５日）を有した。ＰＥＧ−ＴＮＦ−αの抗腫瘍活性Ｂ１６黒色腫モデルを用いた。Ｃ５７ｂｌ６マウス（メス、２０−２５ｇ）の横腹に１ｘ１０⁶個のＢ１６細胞をｓ．ｑ．注入した。処置を開始する前に１週間腫瘍を成長させた。各処置群は５匹のマウスからなった。処置群は：リン酸バッファーコントロール（ｐＨ７．５）、リン酸バッファー（ｐＨ７．５）中の天然のＴＮＦ−α（１０Ｉ．Ｕ．及び１００Ｉ．Ｕ．）及びリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中のＳＳ−ＰＥＧ−ＴＮＦ−α（１０Ｉ．Ｕ．、１００Ｉ．Ｕ．及び１０００Ｉ．Ｕ．）を含んだ。７日、１４日及び２１日目に週に１回マウスに０．１ｍｌをｉ．ｐ．注入した。動物の生存を記録した。２週後（最初の処置後１週目）に、コントロール動物における腫瘍は完全に識別できた。ＳＳ−ＰＥＧ−ＴＮＦ−αで処置した動物はいずれも成長する腫瘍がないようであった。２２日目に、表１に示す結果を得た：１８０日後に、表２に示す結果を得た。これらの結果から、ＰＥＧでのＴＮＦの改変がＴＮＦの致死率を下げることだけでなく、約２０，０００の分子量を有するＰＥＧで改変されたＴＮＦが驚くべき増大された循環半減期及び驚くべき著しく高められた抗腫瘍活性を示したことが示される。これらの結果は多くの理由から意外である。高分子量のＰＥＧでＴＮＦを改変することがＴＮＦの循環半減期を増すことを予測することはできなかった。実際、一般にタンパク質のクリアランス速度をそれらの分子量に基づいて予測することはできない。高分子量のＰＥＧでのＴＮＦの改変がＴＮＦの殺腫瘍活性を減らさないだけでなく、実際は高めることは、高分子量の改変物（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）により生み出されると考えられる付加される立体障害を考慮すると意外である。なおさらに、改変されたＴＮＦは、その増大した循環半減期のために、天然のＴＮＦよりさらに有毒であると予測されており、それは事実ではなかった。以下のものはこの実施例において利用する細胞障害性アッセイの説明である。Ａ．材料Ｌ９２９繊維芽細胞ＡＴＣＣ ♯ＣＣＬ１ＮＣＴＣクローン９２９ダルベッコの修正必須培地（ＤＭＥＭ）ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ＃１６０００−０１０）正常食塩水（ＮｏｒｍａｌＳａｌｉｎｅ）中１ＭのＨＥＰＥＳバッファー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．＃１７−７３７Ｅ）ゲンタマイシン硫酸塩（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．、＃１７−５１８Ｚ）トリプシン−ＥＤＴＡ１Ｘ（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳ、＃２５３００−０２１）トリパンブルーステイン（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃１５２５０−０１２）組織培養フラスコ、１５０ｃｍ²、７５ｃｍ²、２５ｃｍ²（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、＃２５１２０、＃２５１１０、＃２５１００）９６ウェル細胞培養プレート、平底（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、＃２５８６１）１２テャンネルピペッター（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）ピペッター用滅菌チップ（ＩｎｔｅｒｍｏｕｎｔａｉｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｒｐ．、Ｂｏｕｎｔｉｆｕｌ、ＵＴ、＃Ｐ−３２５０−８）滅菌試薬容器（ＣｏｓｔａｒＣｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、＃４８７０）組み換えヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（社内で製造した）アルブミン、ウシ、ＩＭＥＭ中１０％（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、＃６５２２３７）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃３１０−４１９０）マイクロタイタープレート読み取り装置（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐ．、ＭｅｎｌｏＰａｒｋ、ＣＡ、Ｅｍａｘ）Ｂ．Ｌ９２９繊維芽細胞の増殖：１．以下のようにＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で毎週２回継代することにより繊維芽細胞を維持する。フラスコから培地を吸引し、付着した細胞を残す。細胞単層を５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡで洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを吸引して除く。３７℃で１ないし２分インキュベートする。１５ｍｌのＤＭＥＭ／ＦＢＳを添加して単層を洗浄し、トリプシンの酵素活性を止める。２．細胞を数え、トリパンブルー排除により生存度を評価する。Ｔ７５フラスコ中の抗生物質を含まない３０ｍｌのＤＭＥＭ／ＦＭＳ（ＦＢＳ？）に１ｘ１０⁶の細胞を接種する。３７℃、５％ＣＯ₂湿度調節（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）インキュベーター中でインキュベートする。３．アッセイのために、Ｔ１５０フラスコ中の６０ｍｌのＤＭＥＭ／ＦＢＳに２ｘ１０⁶の細胞を接種する。細胞が融合するまで（８０−９０％）フラスコを３または４日間インキュベートする。Ｃ．ＴＮＦ−αインビトロ細胞障害性アッセイ１日目：細胞の調製１．細胞をトリプシンで処理し、ＤＭＥＭ／ＦＢＳで１．２２ｘ１０⁶細胞／ｍｌの最終濃度まで希釈する。ゲンタマイシン硫酸塩を５０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加する。２ｘ１０⁶細胞の細胞数が各プレートに必要とされ、そしてＴ１５０フラスコから１．７５−２ｘ１０⁷細胞を期待できる。２．９６ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに１５０μｌの細胞懸濁液を添加することによりＬ９２９繊維芽細胞を平板培養する。３７℃、５％ＣＯ₂湿度調節インキュベーター中で一晩インキュベートする。２日目：サンプルの添加１．続ける前に、倒立顕微鏡を用いて各ウェルの融合性を調べる。各ウェルはアッセイが再現できるために同等に融合していなけらばならない。プレートの外側のウェルはこれらのウェルにおける細胞の不均一な増殖のためにアッセイ計算には用いない。最高感度のためには細胞は７５ないし９０％融合していなけらばならない。細胞の継代数が増すにつれて、細胞の倍加当たりの時間は減少する。従って、適切な融合性を得るために細胞数／ウェルを調整することができる。２．ＴＮＦ−α基準作業溶液を調製する。使用するまで４℃で保管する。３．２及び３列の１番目のウェルに１５０μｌのＴＮＦ作業溶液を添加する。４ないし１０列の１番目のウェルに１５０μｌのサンプルを添加する。１、１１及び１２列にＤＭＥＭ／ＦＢＳ／ゲンタマイシンを添加する。１番目のウェルの中身を混合し、１２チャンネルピペッターを用いて１５０μｌを列の２番目のウェルに移すことにより２倍連続希釈物を作製する。最後に、８番目のウェル（横列Ｈ）の中身を混合し、各ウェルから１５０μｌを廃棄する。この時点で、全てのウェルは１５０μｌを含むはずである。４．プレートを３７℃、５％ＣＯ₂湿度調節インキュベーター中で２０時間インキュベートする。３日目：２０μｌの３［４，５−ジメチノレチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（リン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４中２５ｍｇ／ｍｌ）を培養プレートの各ウェルに添加し、培養物を３７℃で４時間インキュベートすることにより細胞の生存度を測定した。その期間の後に、培養上清を廃棄し、１５０μｌのＤＭＳＯを各ウェルに添加した。各ウェルの５７０ｎｍでの吸光度をマイクロタイタープレート読み取り装置を用いて測定した。コントロールの相加平均の５０％に最も近いＡ₅₄₀を示すウェルは、Ｌ９２９細胞の５０％溶解（１ユニット）を表すとみなされる。Ｄ．溶液ＴＮＦ−α基準（１０μｇ）凍ったＴＮＦ−α基準を氷上で解かす。ねじ蓋クリオチューブ中に２ μｇ／チューブで等分し、−８０℃で保存する。ＴＮＦ−α基準ストック溶液（２５６ｎｇ／ｍｌ）１つのチューブ（２μｇ）のＴＮＦ−α基準に、ＤＰＢＳ／ゲンタマイシン中１％のアルブミン７．８１ｍｌを添加する。１ｍｌチューブに等分し、４℃で保存する。典型的には溶液を６カ月間使用する。ＴＮＦ−α作業溶液（０．８ｎｇ／ｍｌ）２枚のプレートには、３．１２μｌのストック溶液を９９７μｌのＤＭＥＭ／ＦＢＳ／ゲンタマイシンに添加する。（基準溶液は０．４ｎｇ／ｍｌの最終濃度にマルチウェルプレートの１番目のウェル中で１：２に希釈される）。使用するまで４℃で保管する。リン酸緩衝食塩水１Ｌ（ＰＢＳ、１ｘ）０．２ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、８ｇのＮａＣｌ及び１．１４ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄を９００ｍｌの水に溶解する。ＩＬまで適当量、ｐＨを７．４に調整する。オートクレーブする。実施例２（Ｈａｒｒａｓ、上記中に記述された一般法に従って）ＰＥＧで改変されたヒト組み換えＴＮＦのさらなるサンプルを調製し、それらの血清半減期及び比活性の保持に関して試験した。各場合において、ＴＮＦは約５ないし９分子のＰＥＧで改変された。データ（表３）から、意外にも、約１００００ないし４００００、好ましくは約２００００−３００００のおおよその分子量平均を有するＰＥＧで改変されたＴＮＦが高い比活性を保持しながら著しく増大した血清半減期を示すことが示される。Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手したＥＬＩＳＡアッセイを製造業者により提示されるように用いて、ＴＮＦの様々な配合物の血清半減期を測定した。ヘパリンを添加した５０μｌの毛細管を用いて後部眼窩集網叢から血清サンプルを集めた。ＴＮＦまたはＰＥＧ−ＴＮＦ配合物のｉ．ｖ．注入のすぐ前に処置前血液サンプルを集めた。処置後３０分、２４時間並びに３、７、１２及び１５日でさらなる血液サンプルを集めた。サンプルを遠心分離し、得られた上清をアッセイするまで−２０℃で凍結して保存した。実施例３ＰＥＧで改変されたヒト組み換えＴＮＦのさらなるサンプルを調製し、血清半減期及び比活性保持に関して試験した。表４に示すデータから、半減期及び比活性が利用するリンカーにより変わる可能性があることが示される。実施例４異なる種類の腫瘍細胞を注入したマウスに対するＰＥＧで改変された組み換えヒトＴＮＦの効果を評価するためにさらなる試験を実施した。これらの試験に利用するＴＮＦをＨａｒｒａｓ、上記に記述されたような方法に従ってＳＳ−ＰＥＧ２００００で改変した。マウスに１ｘ１０⁶の腫瘍細胞を注入し、２週後に、ＰＥＧ−ＴＮＦを週に１回３週間ｉ．ｐ．注入した。未処置の動物より５倍長く生存する動物のパーセントとして治癒を定義した。結果を表５に示し、それにより、本発明の改変されたＴＮＦが黒色腫、腎臓腫瘍、結腸腫瘍及び乳腫瘍を処置することに有効であることが示される。実施例５ＰＥＧで改変された、様々な起源からのＴＮＦを評価するために試験を実施した。結果を表６に示す。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Modified tumor necrosis factor Related application This application is related to US Provisional Patent Application No. 60/035, filed January 15, 1997. Claim 521 benefits. Field of the invention The present application is directed in particular to polystyrene having a molecular weight in the range of 10,000 to 40,000. Tumor necrosis factor modified with ethylene glycol and such modified tumor A method for treating a tumor with a necrosis factor. Background of the Invention Melanoma (stage 3) is a fatal disease that kills most patients within one year of diagnosis Disease. The incidence of melanoma is rapidly increasing in the United States, and other countries such as Australia There are even higher than the country. Effective treatment urgently needed for patients with melanoma It has been. Currently, about 13,000 people die each year in the United States from kidney cancer. This type of cancer Is often not detected until it has progressed significantly. Significantly affects patient prognosis The only form of treatment is surgical removal of the affected organ. Unfortunately, this type of Cancer is so metastatic that complete removal of all metastases is not possible, if not impossible. Have difficulty. Colon cancer is one of the most common types of cancer, and is currently about 140,000 annually in the United States. 0 people have died. Numerous traditional chemistries developed to treat this disease There are therapeutic agents, but (as percentage of patients surviving 5 years or longer) Long-term survival has not changed much in the last 40 years. Further developed All traditional chemotherapeutic drugs Toxic, has harmful and often fatal side effects, and is costly You. There is an urgent need for a curative, non-toxic treatment for this disease. The characteristics of melanoma, kidney and colon tumors are that these tumors are not compatible with traditional chemotherapy Resistance quickly. Even if the patient is first treated with chemotherapy Although resistant to tumors, drug-resistant tumors develop quickly and Department of patient death. An alternative method for treating these tumors is Identify the "points" and develop therapies that selectively treat that target. One Such potential targets have been identified. Specifically, these types of tumors All three require a large amount of neovascularization of each of the metastases for the cancer to grow. Has been recognized. Therefore, therapeutic agents that prevent the neovascularization of these tumors Is likely to provide a unique means of treating tumors. Tumor necrosis factor (TNF) is a leukocyte and related cells with immunostimulatory activity. Is one of a number of cytokines, a group of diverse proteins produced by You. TNF was originally named for its ability to necrosis tumors. TNF There are at least two different mechanisms that are thought to kill the tumor. The first is a tumor By direct action on itself. Alternatively, TNF selectively differentiates tumor angiogenesis. Can be turned off. In an earlier manuscript describing TNF, Carswell And Old show that METHA tumor cells are completely resistant to TNF in vitro Reported that,J. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 72: 3666-3670 (1975). However, METH A in mice Tumors were very sensitive to TNF in vivo. This is because TNF is Is thought to be due to selective disruption of angiogenesis in Was. A previously unidentified factor is released by some tumors Which makes normal vascular endothelial cells adjacent to the tumor more susceptible to TNF killing. Was shown later. In short, not by killing tumor cells directly. Supplies tumors with blood, oxygen and other nutrients needed to survive and grow TNF kills these tumors by killing the normal vascular endothelial cells that line the growing blood vessels. Kill the ulcer. Unfortunately, early clinical trials attempted to develop TNF as a direct tumoricidal agent. saw. When used in this way, TNF quickly (less than 20 minutes) clears the blood circulation. A large amount of TNF had to be injected to be removed. In addition, these high doses The amount of TNF caused "shock" -like symptoms characterized by a sharp drop in blood pressure. T An alternative way to use NF formulas it so that it stays in the blood circulation That is. By doing this, TNF interacts with the tumor vasculature There is more time, and enough to disrupt the blood supply to the tumor I have time. Some other therapeutic proteins are formulated with polyethylene glycol (PEG) So that they circulate longer and stay in the vasculature. this These proteins are asparaginase, adenosine deaminase and superox. Including sid dismutase. See, for example, Harras, J. et al. M. "Polyethy Lene Glycol Chemistry: Biotechnical a nd Biochemical Applications ", Plenum Press (1992). A group of Japanese researchers has developed TNF The ability to blend with PEG and the resulting material has substantially increased circulating half-life and better It was previously described that it had greater antitumor activity. Tsutsu mi, Y. etc,Jap. J. Cancer Res. 85: 9-12 (199). 4); Tsutsumi, Y .; etc,Jap. J. Cancer Res. , 85 : 1185-1188 (1994); Tsutsumi, Y .; etc,Jap. J. Cancer Res . 87: 1078-1085 (1997). These laboratories Researcher binds primary amine on TNF with succinimidyl succinate linker Only the PEG having a molecular weight of 5000 was used. Summary of the Invention This time, surprisingly, the range of about 10,000 to about 40,000, preferably about PO with an approximate weight average molecular weight in the range of 20,000 to 30,000 Modification of TNF with polyethylene glycol (PEG) is the circulating half-life of TNF And significantly increased the tumoricidal activity of TNF. For example , TNF serum half-life can be as low as 20 minutes to 15 days And the antitumor ED50 is as high as 1000-3000 IU Have been reduced to as small as 10-50 IU. As a result of the modification, To effectively treat tumors with fewer concomitant adverse side effects Lower doses of TNF can be administered. Therefore, the present invention relates to a modified TNF, wherein the modification comprises about 10,000 One having an approximate weight average molecular weight in the range of 0 to about 40,000 or More PEG molecules, either directly or via biocompatible linking agents And covalently binding to the TNF. Preferably, TNF Is 5 to 12 PEG molecules, more preferably about 5 to 9 PEG molecules Be modified. The present invention also provides a therapeutically effective amount of the modified TNF in a patient suffering from a tumor. And treating the patient by administering to the patient. The present invention further provides an approximate weight in the range of about 10,000 to about 40,000. Between about 5 and 12 PEG molecules having an average molecular weight are covalently attached to TNF Modifying the circulating half-life of TNF comprising altering the TNF by binding It relates to a growing method. The present invention further provides an approximate weight in the range of about 10,000 to about 40,000. Between about 5 and 12 PEG molecules having an average molecular weight are covalently attached to TNF Modifying the TNF by binding to the tumoricidal activity of the TNF. How to enhance. Description of the drawings FIG. 1 shows native TNF-α (open circles), SS 5,000 MW PEG-TNF -Α (closed circle) and 20,000 MW PEG-TNF-α (open triangle) It is a graph which shows the circulating half-life in mouse serum. FIG. 2 shows native TNF-α (open circles), SS 5,000 MW PEG-TNF -Α (closed circle), SS 12,000 MW PEG-TNF-α (closed triangle) , SS 20,000 MW PEG-TNF-α (open triangle), NHS 12, 000 MW PEG-TNF-α (closed square) and NHS 20,000 MW FIG. 4 is a graph showing the circulating half-life of PEG-TNF-α (open square) in mouse serum. is there. Detailed description of the invention As used herein, “tumor necrosis factor” or “TNF” refers to an isolated human Or a naturally-occurring protein, such as a mouse TNF protein, or a set Such as recombinant murine TNF and recombinant human TNF Includes proteins produced using recombinant techniques. TNF-α protein Is preferred, but the term "TNF" also encompasses TNF-β protein. Also , The term refers to the deletion or modification of amino acids without significantly impairing biological activity. Also encompasses mutated TNF proteins (for example, but not limited to, Deleting the amino acids 212-220 or adding 248, 592, 508 lysines Change to alanine). “Polyethylene glycol” or “PEG” has the general formula H (OCH_TwoCH_Two)_n A polycondensed, branched or linear ethylene oxide and water represented by OH Refers to a mixture of mers. "Polyethylene glycol" or "PEG" Used in combination with a numerical suffix to indicate the weight average molecular weight. An example For example, PEG 5,000 has an approximate weight average molecular weight of about 5,000 Refers to polyethylene glycol; PEG 12,000 is about 12,000 Polyethylene glycol having a weight average molecular weight of another; and PEG 20,000 is a polyethylene having an approximate weight average molecular weight of about 20,000 Refers to glycol. Such polyethylene glycols are commercially available Available from the manufacturer and, as indicated above, are more conventional due to their weight average molecular weight. Called as an example. "Melanoma" affects the oral cavity, esophagus, anal canal, vagina, buffy coat and / or conjunctiva or eye. Malignant or benign tumors arising from the melanocyte system of the skin and other organs, including It may be a ulcer. The term "melanoma" refers to, for example, apoplexy melanoma, Defective melanoma, benign juvenile melanoma, malignant melanoma, malignant melanoma, nodular melanoma Tumors, subungual melanoma and superficial spreading melanoma. "Patient" refers to an animal, preferably a mammal, and more preferably a human. "Biocompatible" is generally not deleterious to biological function and Cause no unacceptable toxicity, including causing illness and disease states Substance or compound. "Circulation half-life" is defined as the amount of TNF initially after infusion of the modified TNF into a patient. The time it takes until half of the maximum blood loss level has been removed. Human or Can measure circulating half-life in any suitable species, including mice. Wear. As used herein, "covalently attached" refers to a direct or linker. Through the covalent linkage linking the TNF protein to the PEG molecule. According to the present invention, the TNF is in the range of 10,000 to 40,000, preferably PO with an approximate weight average molecular weight in the range of 20,000 to 30,000 Modify with ethylene glycol. Typically 30,000 or more molecules Polyethylene glycol with quantity is difficult to dissolve, Greatly reduces the yield of the product. Polyethylene glycol is branched or linear However, it is preferably straight-chain. Binding polyethylene glycol to TNF via a biocompatible linking group Can be. As explained above, "biocompatible" means that the compound or group is non-toxic. In vitro or in vivo without causing injury, illness, illness or death. Bo indicates that it is available. PEG can be linked to In this case, the thiol bond or the amide bond can bind to the linking group. suitable Examples of biocompatible linking groups For example, ester groups, amide groups, imide groups, carbamate groups, carboxyl groups, Droxyl groups, carbohydrates (eg, succinimidyl succinate (SS), Succinimidyl propionate (SPA), succinimidyl carboxymethy Rate (SCM), succinimidyl succinamide (SSA) or N- Maleimide group, epoxide group including droxysuccinimide (NHS) (For example, nitrophenyl carbonate (NPC) or trichlorophenyl Oxycarbonylimidazole group, including Lysylate group, aldehyde group, isocyanate (iso) cyanate) group, vinyl sulfone group, tyrosine group, cysteine group, histidine Groups or primary amines. Preferably, the biocompatible linking group is an ester group and And / or a maleimide group, which can be activated via a primary amine on the TNF protein. Binds to NF. More preferably, the linking group is SS, SPA, SCM, SSA or Is NHS; SS is most preferred. Alternatively, amino groups, sulfides Directly (i.e., linked via a hydroxyl, hydroxyl or carboxyl group). TNF can be attached to PEG (without groups) See, for example, Harras, J., the disclosure of which is incorporated herein by reference. . M. "Polyethylene Glycol Chemistry: Bi otechnical and Biochemical Applicati ons ", as described in Plenum Press (1992). Covalently attach TNF to PEG via an indirect or biocompatible linking group Methods for this are known in the art. 5 to 12 TNF proteins PEG molecules It is preferred that the bonds are bonded covalently. Count the number of PEG molecules attached to the protein Methods for determining are known in the art, for example, by reference. Habeeb, A. et al., Incorporated herein. F. S. A. ,Anal. Bioc hem . 14: 328-339 (1966); Harras, J. Mol. M. the above. The number of PEG molecules bound to TNF depends on the linking group used, reaction length and reaction It depends on the molar ratio between TNF and PEG. As those skilled in the art will appreciate, the modified TNF of the present invention can be used in a number of ways, including, for example, , Oral, nasal, intraperitoneal, parenteral, intravenous, intralymphatic, intratumoral, intramuscular, Interstially, intraarterially , Subcutaneous, intraocular, intrasynolyally, transepithelial and transdermal Can be administered. Therapeutically Effective Any of the Modified Compounds of the Invention The effective amount is an amount effective to suppress tumor growth, and varies depending on the method of administration. May be disturbed. Typically, an effective dose is about 0.001 to 0.1 m / week g / kg. Modified as is known in the art. The obtained TNF can be combined with a pharmaceutically acceptable carrier and diluent. An example For example, for intravenous administration, modified TNF may be replaced with phosphate buffered saline prior to infusion. Can be mixed with the solution or any other suitable solution known to those skilled in the art. You. Modified TNF for treating melanoma, colon, kidney and breast cancer tumors Tests have shown that it is particularly effective. The invention is further illustrated in the following examples, which are for illustrative purposes. It is not considered to limit the scope of the invention. The TNF used in the experiments described below is of mouse and human origin. Human TNH (total protein)E. FIG. coli) Manufactured in Nezu Mi TNF and human TNF mutants were cloned by Picea pastoris (Picea p astoris ). Pennica, D .; etc,Nature, 312 : 724-729 (1981); Streamishna, K .; etc,Bioch emistry , 28: 4117-4125 (1989). Recombinant TNF production in Escherichia coli or Picea using similar methods Built. Mouse TNF was produced in Escherichia coli and Picea. Example 1Specific activity of TNF-α Before pegylation, L92 as described below Mature Tissue Necrosis Factor (TNF-α) (Human Recombinant) Using a 9 Cytotoxicity Assay Body) was tested. The specific activity of TNF-α is 10⁶I. U. Unit / mg . Densitometry of SDS-PAGE gel shows that the material is 99% pure Indicated. Materials (1 ml at 16.8 mg / ml, Peterson modified (Peterson) modification), bovine serum albumin (BSA) standard, Brad ford, M.C. M. ,Anal. Biochem. , 72: 248-254 (1 976) was determined by a 3,000 kDa cut-off centricon. (Centricon) and concentrated to about 0.1 ml. Next, this material is Dilute to 4 ml with 00 mM phosphate buffer, pH 8.0 and reconcentrate to 0.1 ml did. This procedure was repeated twice, and the resulting material was finally washed with the same batch of 1 ml total volume. Stuffer Collected inside. Next, the protein concentration was measured by Bradford, as described above. BS About 0.6 mg of protein was recovered using A as a reference.Pegylation Harras, J., cited above. M. Pegylet using the general method described in A reaction was performed. TNF (100 mM phosphate buffer, pH 7.2-7 . 5 mg / ml), 10 to 50 SS-PEG or NHS-PEG. Added in molar excess and mixed at room temperature for 1 hour. The specific pH and molar ratio used was PEG And had to be determined experimentally. 100kDa cut PEG-TNF was reacted with unreacted PEG and T by ultrafiltration using an off-filter. Separated from NF. In each of the modifications listed as references in this example, TNF Was modified with 5 to 9 molecules of PEG. The purity of the PEG-TNF was assessed by SDS-PAGE and by this method Percent of the modified primary amine J. Stocks (Anal. B iochem. 154: 232 (1986)). It was measured using floursamine. The conclusion of SDS-PAGE The results show that very little, if any, natural TNF-α It was shown not to remain in the preparation.In vitro activity of PEG-TNF-α Perform the procedure described below, except that the cell passage number is unknown. P-cells for in vitro cytotoxic activity using an L-929 cytotoxicity assay EG-TNF-α was examined. TNF-α starting material ratio 1.5x10 activity⁶Units / mg or about half of the original specific activity measurement . Differences in specific activity are due to use of different protein assays and unknown cell passage numbers I thought. SS 5,000 MW PEG-TNF-α has a specific activity of 0.7 × 10⁶unit / Mg or about half the specific activity of the natural material. SS 20,000MW P The specific activity of EG-TNF-α is similar to SS 5,000 MW PEG-TNF-α 0.8x10⁶Unit / mg. Lethality of PEG-TNF-α As screening, two C57 bl6 mice (female, 20-25 g) Either natural TNF-α or SS-PEG-TNF-α intraperitoneally (i. p. ) And examined the survival of those animals. The doses used were 1,000, 5 The activity was 10,000 and 10,000 units. The following results were obtained with native TNF-α: 10,000I. U. -Both mice died the next morning. 5,000I. U. -1 mouse died the next morning; the other mouse He was in a state of distress (hair was turbulent and hardly moving) and died two days later. 1,000I. U. -1 mouse died the next morning; the other mouse suffered In a state of pain (hair is turbulent and hardly moving), such a weakened state after 2 days In state and euthanized it. For SS-PEG-TNF-α, all mice at all doses were 2 weeks after injection He remained in excellent health. Eating and drinking Behavior was normal. There was no change in hair (hair was not disturbed). all All mice were euthanized 15 days after injection. Measurement of serum half-life of PEG-TNF-α An ELISA assay for human TNF obtained from Genzyme was used. Manufacture The kit was used as suggested by the vendor. TNF-α or PEG-α (1 00 units) to mice. p. Inject the posterior eye at the time shown in FIG. About 25 μl of serum was collected from foveal bleeds. A total of 5 mice (female, C5 7 bl6 mice, 20-25 g). Natural TNF-α (open circles) is removed very quickly and from baseline The only data point above was 30 minutes after injection. SS 5,000 MW PEG-TNF-α (closed circle) has a half life of about 4 days. Was. The half life of 20,000 MW PEG-TNF-α (open triangle) is> 15 It was a day. This experiment was repeated using the treatment groups listed below and the results are shown in FIG. : Natural TNF-α (open circle); SS 5,000 MW PEG-TNF-α ( (Closed circle), missing 12,000 MW PEG-TNF-α? ) (Closed Triangle); SS 20,000 MW PEG-TNF-α (open triangle); NHS1 2,000 MW PEG-TNF-α (closed square) (and NHS 20,000 Is MWPEG-TNF-α (open square) missing? ). Serum half-life of different treatment groups Are NHS 20,000 MW PEG-TNF-α and SS 20,000 MW P > 15 days for EG-TNF-α; for SS 5,000 MW PEG-TNF-α About 4 days; SS 12,000MW PEG-TNF- about 6 days for α; about 8 days for NHS 12,000 MW PEG-TNF-α; 30 minutes after injection with native TNF-α. In summary, each PEG-TNF -Α showed a much longer half-life than native TNF-α; however, NH S 20,000 MW PEG-TNF-α and SS 20,000 MW PEG- TNF-α is a significantly longer half than TNF-α modified with lower molecular weight PEG. Had a shelf life (> 15 days). Antitumor activity of PEG-TNF-α The B16 melanoma model was used. C57 bl6 mouse (female, 20-25g) 1x10 on the side of⁶B16 cells were s. q. Injected. Before starting treatment 1 The tumor was allowed to grow for a week. Each treatment group consisted of 5 mice. Treatment groups were: phosphate buffer control (pH 7.5), phosphate buffer (PH 7.5) in natural TNF-α (10 IU and 100 IU) and SS-PEG-TNF-α (10 IU) in phosphate buffer (pH 7.5). , 100I. U. And 1000I. U. ) Was included. 7, 14 and 21 days Once a week, mice receive 0.1 ml i. p. Injected. Animal survival was recorded. Two weeks later (one week after the first treatment), the tumors in the control animals were completely discerned. I was able to separate. All animals treated with SS-PEG-TNF-α had growing tumors. It did not seem. On day 22, the results shown in Table 1 were obtained: After 180 days, the results shown in Table 2 were obtained. These results indicate that modification of TNF with PEG reduces TNF mortality. Not only is TNF modified with PEG having a molecular weight of about 20,000 surprising Demonstrated increased circulating half-life and surprisingly significantly increased antitumor activity Is shown. These results are surprising for many reasons. Modification of TNF with high molecular weight PEG Could not be expected to increase the circulating half-life of TNF. Actual In general, predicting the clearance rate of proteins based on their molecular weight I can not do such a thing. Modification of TNF with high molecular weight PEG reduces the tumoricidal activity of TNF Not only do they actually increase Is thought to be produced by a high molecular weight modifier It is surprising considering the added steric hindrance. Still further, the modified TNF is Predicted to be more toxic than natural TNF due to its increased circulating half-life Has been and that was not the case. The following is a description of the cytotoxicity assay utilized in this example. A. material L929 fibroblast ATCC @ CCL1 NCTC clone 929 Dulbet Ko's Modified Essential Medium (DMEM) Fetal bovine serum (GIBCO Laboratories, Grand Isla) nd, NY # 16000-010) 1 M HEPES buffer in Normal Saline (Normal Saline) BioWhittaker, Inc. # 17-737E) Gentamicin sulfate (BioWhittaker, Inc., # 17-51) 8Z) Trypsin-EDTA 1X (GIBCO Laboratories S, # 2 5300-021) Trypan Blue Stain (GIBCO Laboratories, # 152) 50-012) Tissue culture flask, 150cm^Two, 75cm^Two, 25cm^Two(Corning, Inc. , Corning, NY, # 25120, # 25110, # 25100 ) 96-well cell culture plate, flat bottom (Corning, Inc., # 2586) 1) 12 Channel Pipetter (Titertek) Sterile tip for pipettor (Intermountain Scientific c Corp. , Bountiful, UT, # P-3250-8) Sterile reagent container (Costar Corp., Cambridge, MA, # 4 870) Recombinant human tumor necrosis factor-α (TNF-α) (manufactured in-house) Albumin, bovine, 10% in IMEM (Boehringer Mannhe im Corp. , Indianapolis, IN, # 652237) Phosphate buffered saline (PBS) Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) (GIBCO Laborat) ories, # 310-4190) Microtiter plate reader (Molecular Device) s Corp. , Menlo Park, CA, Emax) B. Propagation of L929 fibroblasts: 1. By passage twice weekly in DMEM / 10% FBS as follows Maintain fibroblasts. Aspirate media from flask, leaving attached cells. cell The monolayer is washed with 5 ml of trypsin-EDTA and the trypsin-EDTA is aspirated. Remove. Incubate at 37 ° C for 1-2 minutes. 15ml DMEM / FB S is added to wash the monolayer to stop trypsin enzymatic activity. 2. Cells are counted and viability assessed by trypan blue exclusion. T75 hula 30 ml of DMEM / FMS (F BS? ) 1x10⁶Cells are inoculated. 37 ° C, 5% CO_TwoHumidity control (hum Incubate in an incubator. 3. For assay, in 60 ml DMEM / FBS in T150 flask 2x10⁶Cells are inoculated. Until cells are fused (80-90%) Incubate for 3 or 4 days. C. TNF-α in vitro cytotoxicity assay Day 1: Preparation of cells 1. Cells are treated with trypsin and 1.22x10 in DMEM / FBS.⁶cell/ Dilute to a final concentration of ml. Gentamicin sulfate was added to a final concentration of 50 μg / ml. Add to the end. 2x10⁶The cell number of cells is required for each plate and T 1.75-2 × 10 from 150 flasks⁷You can expect cells. 2. Add 150 μl of cell suspension to each well of a 96-well flat bottom tissue culture plate The L929 fibroblasts are plated by addition. 37 ° C, 5% CO_TwoWet Incubate overnight in a controlled incubator. Day 2: Sample addition 1. Before continuing, examine the confluence of each well using an inverted microscope. Each well Must be equally fused for the assay to be reproducible. Outside the plate Side wells are assayed for heterogeneous growth of cells in these wells Not used for For maximum sensitivity cells must be 75-90% confluent No. As the number of cell passages increases, the time per cell doubling decreases. Therefore, the number of cells / well can be adjusted to obtain appropriate fusogenicity. 2. Prepare a TNF-α reference working solution. Store at 4 ° C until use You. 3. Add 150 μl of TNF working solution to the first well of rows 2 and 3. Add 150 μl of sample to the first well of rows 4-10. 1, 11 And add DMEM / FBS / gentamicin to row 12. Of the first well Mix the contents and use a 12 channel pipettor to transfer 150 μl to the second column Make 2-fold serial dilutions by transferring to a well. Finally, the eighth well (side) Mix the contents of column H) and discard 150 μl from each well. At this point, everything Wells should contain 150 μl. 4. Plate at 37 ° C, 5% CO_Two20 hours in a humidity control incubator Incubate. Day 3: 20 μl of 3 [4,5-dimethinolethiazol-2-yl] -2,5-diffee Nyltetrazolium bromide (MTT) (25m in phosphate buffered saline pH 7.4) g / ml) was added to each well of the culture plate and the culture was incubated at 37 ° C. for 4 hours. The viability of the cells was determined by incubation. After that period, the culture supernatant is Discarded and 150 μl of DMSO was added to each well. At 570 nm in each well Was measured using a microtiter plate reader. Control Closest to 50% of the arithmetic mean of the₅₄₀The wells with 50% of L929 cells % Lysis (1 unit). D. solution TNF-α standard (10 μg) Thaw frozen TNF-α standards on ice. 2 in screw cap cryotube Aliquot in μg / tube and store at −80 ° C. TNF-α standard stock solution (256 ng / ml) One tube (2 μg) TNF-α standard in DPBS / gentamicin 7.81 ml of 1% albumin are added. Aliquot into 1 ml tubes and keep at 4 ° C. Exist. Typically, the solution is used for 6 months. TNF-α working solution (0.8 ng / ml) Two plates contain 3.12 μl of the stock solution in 997 μl of DMEM / Add to FBS / gentamicin. (Reference solution is 0.4 ng / ml final concentration Diluted 1: 2 in the first well of the multiwell plate). use Store at 4 ° C until Phosphate buffered saline 1L (PBS, 1x) 0.2 g KCl, 0.2 g KH_TwoPO_Four, 8 g NaCl and 1.14 g Na_TwoHPO_FourIs dissolved in 900 ml of water. Adjust the pH and the appropriate amount to IL Adjust. Autoclave. Example 2 (Harras, according to the general method described above) Further samples of recombinant TNF were prepared and their serum half-life and specific activity Was tested for retention. In each case, TNF contains about 5 to 9 molecules of PEG Modified in From the data (Table 3), surprisingly, about 10,000 to 40,000 PEG having an approximate molecular weight average of preferably about 20,000-30,000 Modified TNF shows significantly increased serum half-life while retaining high specific activity Is shown. ELISA assay obtained from Genzyme (Cambridge, MA) A variety of TNFs, as described by the manufacturer. The serum half-life of the formulation was determined. Using a 50 μl capillary with heparin added Serum samples were collected from the retro-orbital plexus. TNF or PEG-TNF formulations I. v. Pre-treatment blood samples were collected immediately prior to infusion. 30 minutes after treatment, 24:00 Additional blood samples were collected during and between days 3, 7, 12, and 15. The sample Centrifuged and the resulting supernatant was stored frozen at -20 ° C until assayed. Example 3 Preparing a further sample of human recombinant TNF modified with PEG, Tested for serum half-life and specific activity retention. From the data shown in Table 4, the half-life and It is shown that the specific activity and specific activity may vary depending on the linker used.Example 4 PEG-modified recombination for mice injected with different types of tumor cells Further studies were performed to evaluate the effects of human TNF. Useful for these tests The TNF used is Harras, SS-PE according to the method as described above. Modified with G20000. 1x10 for mouse⁶Two weeks later, and two weeks later, PEG-TNF was given once a week for 3 weeks i. p. Injected. 5 times longer than untreated animals Healing was defined as the percentage of surviving animals. Table 5 shows the results. The modified TNF of the present invention treats melanoma, kidney tumor, colon tumor and breast tumor Is shown to be effective. Example 5 Tests were performed to evaluate PEG-modified TNF from various sources Was. Table 6 shows the results.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年１月８日（１９９９．１．８）【補正内容】請求の範囲１．約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子に共有結合的に結合したＴＮＦを含んでなる改変されたＴＮＦ。２．該ＰＥＧが約２０，０００ないし約３０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。３．該ＰＥＧが生体適合性のリンカーを介して該ＴＮＦに共有結合的に結合している請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。４．該リンカーがＮ−ヒドロキシスクシンイミジルスクシネートである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。５．該リンカーがＮ−スクシンイミジルプロピオネートである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。６．該ＴＮＦが約５ないし９個のＰＥＧ分子に共有結合的に結合している請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。７．該ＴＮＦがＴＮＦ上の第一級アミンを介して該ＰＥＧ分子に共有結合的に結合している請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。８．該ＴＮＦがＴＮＦ−αである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。９．該ＴＮＦが単離されたヒトＴＮＦである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。１０．該ＴＮＦが組み換えヒトＴＮＦである請求の範囲１の改変されたＴＮＦ。１１．約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子をＴＮＦに共有結合的に結合することにより該ＴＮＦを改変することを含んでなるＴＮＦの循環半減期を増大する方法。１２．約１０，０００ないし約４０，０００の範囲のおおよその重量平均分子量を有する約５ないし１２個の間のＰＥＧ分子をＴＮＦに共有結合的に結合することにより該ＴＮＦを改変することを含んでなるＴＮＦの殺腫瘍活性を高める方法。１３．請求の範囲１の改変されたＴＮＦの治療的に有効な量を腫瘍を患っている患者に投与することを含んでなる該患者の処置方法。１４．該腫瘍が黒色腫である請求の範囲１３の方法。１５．該腫瘍が結腸癌である請求の範囲１３の方法。１６．該腫瘍が腎臓癌である請求の範囲１３の方法。１７．該腫瘍が乳癌である請求の範囲１３の方法。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Submission date] January 8, 1999 (1999.1.8) [Correction contents] The scope of the claims 1. Approximate weight average molecules in the range of about 10,000 to about 40,000 TNF covalently attached to between about 5 to 12 PEG molecules having an amount A modified TNF comprising the modified TNF. 2. The PEG has an approximate weight in the range of about 20,000 to about 30,000. 2. The modified TNF of claim 1 having a weight average molecular weight. 3. The PEG is covalently attached to the TNF via a biocompatible linker The modified TNF of claim 1 wherein 4. Claims wherein the linker is N-hydroxysuccinimidyl succinate The modified TNF of range 1. 5. 2. The method according to claim 1, wherein said linker is N-succinimidyl propionate. Modified TNF. 6. A method in which the TNF is covalently linked to about 5 to 9 PEG molecules. The modified TNF of claim 1. 7. The TNF is covalently attached to the PEG molecule via a primary amine on the TNF 2. The modified TNF of claim 1, wherein said TNF is bound to: 8. 2. The modified TNF of claim 1, wherein said TNF is TNF-α. 9. 2. The modified TN of claim 1, wherein said TNF is isolated human TNF. F. 10. 2. The modified TN of claim 1, wherein said TNF is recombinant human TNF. F. 11. Approximate weight average in the range of about 10,000 to about 40,000 Between about 5 and 12 PEG molecules having molecular weight covalently attached to TNF Modifying the TNF by modifying the TNF A method for increasing the circulating half-life of NF. 12. Approximate weight average in the range of about 10,000 to about 40,000 Between about 5 to 12 PEG molecules having a molecular weight covalently attached to TNF Increasing the tumoricidal activity of TNF comprising modifying the TNF Method. 13. Claims 1. A therapeutically effective amount of the modified TNF of claim 1 for treating a tumor. A method of treating a patient comprising administering to the patient. 14． 14. The method of claim 13, wherein said tumor is a melanoma. 15. 14. The method of claim 13, wherein said tumor is colon cancer. 16. 14. The method of claim 13, wherein said tumor is a renal cancer. 17． 14. The method of claim 13, wherein said tumor is a breast cancer.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, M W, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY) , KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM , AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, E S, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID , IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, M G, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT , RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN, Y U, ZW

Claims

[Claims] 1. Approximate weight average molecules in the range of about 10,000 to about 40,000 TNF covalently attached to between about 5 to 12 PEG molecules having an amount A modified TNF comprising the modified TNF. 2. The PEG has an approximate weight in the range of about 20,000 to about 30,000. 2. The modified TNF of claim 1 having a weight average molecular weight. 3. The PEG is covalently attached to the TNF via a biocompatible linker The modified TNF of claim 1 wherein 4. Claims wherein the linker is N-hydroxysuccinimidyl succinate The modified TNF of range 1. 5. 2. The method according to claim 1, wherein said linker is N-succinimidyl propionate. Modified TNF. 6. A method in which the TNF is covalently linked to about 5 to 9 PEG molecules. The modified TNF of claim 1. 7. The TNF is covalently attached to the PEG molecule via a primary amine on the TNF 2. The modified TNF of claim 1, wherein said TNF is bound to: 8. 2. The modified TNF of claim 1, wherein said TNF is TNF-α. 9. 2. The modified TN of claim 1, wherein said TNF is isolated human TNF. F. 10. 2. The modified TN of claim 1, wherein said TNF is recombinant human TNF. F. 11. Approximate weight average in the range of about 10,000 to about 40,000 Between about 5 and 12 PEG molecules having molecular weight covalently attached to TNF Modifying the TNF by modifying the TNF A method for increasing the circulating half-life of NF. 12. ---- between about 5 and 12 PEG molecules with approximate ---- Modifying the TNF by covalently binding to the NF A method for increasing the tumoricidal activity of NF. 13. Claims 1. A therapeutically effective amount of the modified TNF of claim 1 in a tumor. A method of treating a patient comprising administering to the patient. 14． 14. The method of claim 13, wherein said tumor is a melanoma. 15. 14. The method of claim 13, wherein said tumor is colon cancer. 16. 14. The method of claim 13, wherein said tumor is a renal cancer. 17． 14. The method of claim 13, wherein said tumor is a breast cancer.