CN101396355B - 银杏内酯b在制备促进神经细胞再生的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及银杏内酯B在制备促进神经细胞再生的药物中的应用，其中：所述神经细胞是脑组织海马、纹状体、侧脑室部位的神经细胞。银杏内酯B能透过血脑屏障，促进大脑皮层、海马等处的神经干细胞增殖和转化为神经元，促使新生细胞数目增多，从而达到修复神经损伤和防治脑卒中疾病的目的。

Description

银杏内酯B在制备促进神经细胞再生的药物中的应用

技术领域

本发明涉及银杏内酯B在制备促进神经细胞再生的药物中的应用，具体地说，本发明涉及银杏内酯B促进脑组织海马、纹状体、侧脑室部位损伤的神经细胞再生，尤其涉及脑缺血、脑卒中所致脑组织海马、纹状体、侧脑室部位损伤的神经细胞再生。

背景技术

长期以来，由于临床上对于由神经系统损伤导致的瘫痪如脑卒中和其它脑缺血疾病所致的神经损伤等常常显得束手无策，因此传统观点普遍认为中枢神经系统(CNS)在损伤后缺乏自身修复的能力。自Reynolds和Weiss在成年脑内分离培养出干细胞，并证明它们能够分化成中枢神经系统的3类主要细胞后，这种传统的观点受到了挑战。近10年来，随着对CNS发育过程和神经干细胞生物学研究的不断深入，大量研究表明CNS存在持续不断的神经发生，主要存在于室下区和齿状回颗粒下层，成年脑组织也具有自我修复能力，只是由于局部微环境的限制而使这种修复不甚明显。许多研究人员摸索采用神经系统细胞移植来促进神经损伤的功能修复，但供者神经系统细胞主要来源于胎脑或其它意外死亡者，来源不足且在临床应用上存在伦理学障碍。还有研究探索胚胎干细胞移植促进神经损伤功能恢复的可能性，观察到胚胎干细胞移植后可以在脑脊髓组织的不同部位分化成不同的组织表型，这表明宿主源性内在的信号在诱导细胞分化过程起到一个非常重要的作用。虽然胚胎组织移植可能对脑卒中、脑脊髓损伤及脑缺血梗塞具有治疗作用，但是由于来源不足、异体免疫排斥、伦理道德争议等问题，它的临床应用受到很大限制。

神经细胞再生、促进神经发生可运用到神经损伤的修复、脑卒中或脑中风的治疗方面。

银杏是地球上最古老的植物之一，具有独特的药理作用和治疗价值，现已证明银杏内酯是银杏叶的主要活性成分之一。1932年furukawa首次从银杏叶中分离得到萜内酯化合物。1967年Maruyama等从银杏的根皮中分离得到了银杏内酯A、B、C和M并确定了它们的化学结构。1987年weinges从银杏叶中分离出银杏内酯J。银杏内酯分子具有独特的十二碳骨架结构，嵌有一个叔丁基和六个五元环，包括一个螺[4，4]壬烷，一个四氢呋喃环和三个内酯环。银杏内酯A、B、C、M和J分别用代号BN52020、BN52021、BN52022、BN52023和BN52024表示，其中BN52021在银杏中的含量为0.2％。

从20世纪80年代，研究发现银杏内酯是血小板活化因子(PAF)的强拮抗剂，对于心脑血管疾病具有显著的疗效，引起国际上银杏研究的高潮，其中的大部分研究是针对银杏内酯进行的。1984年Braquet等证明银杏内酯对血小板活化因子受体有强大的特异性抑制活性，对心脑血管具有独特的药理作用，目前被认为是最有临床应用前景的天然PAF受体拮抗剂，其中以银杏内酯B(BN52021)的活性最强。

银杏内酯B是迄今发现的最强的血小板活化因子拮抗剂，另外还具有清除氧自由基、抑制脂质过氧化等作用，可用于治疗痴呆，阿兹海默症和记忆力提升。银杏内酯B的作用已有很多报道。《银杏内酯B对局灶性脑缺血时星形胶质细胞GFAP表达的影响》[参见2007年四川大学学报(医学版)第38期第2卷第284-286页]报道了脑缺血后星形胶质细胞GFAP表达增强，银杏内酯B可通过减少星形胶质细胞GFAP的表达而起到脑保护的作用。《银杏内酯B注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用》(参见2006《中医药实验研究》第29卷第12期836-839页)报道了银杏内酯B对局灶性脑缺血再灌注大鼠具有保护作用，其保护作用与银杏内酯B减少大鼠脑缺血再灌注后脑组织NO含量、抗自由基损伤以及改善能量代谢有关。

银杏内酯B能否促进脑损伤后脑组织不同部位的神经干细胞增殖和转化为神经元，将为银杏内酯B保护脑组织提供新的作用机制，更为临床通过促进神经发生、阻止神经元凋亡治疗脑缺血、脑卒中疾病提供新的指导。中国专利申请号03114247.8公开了将银杏内酯B作用体内外的神经干细胞，诱导其分化为神经元细胞和星形胶质细胞。但从本发明所公开的实验中，可以看到培养液中除加了银杏内酯B外，还添加了DMEM/F12(含bFGF 20ng/ml，B27μl/ml)培养液和10％胎牛血清，bFGF为碱性成纤维细胞生长因子，能够促进细胞的生长，而胎牛血清也具有促进细胞生长的作用。因此，很难得出本发明中的细胞增殖是银杏内酯B所产生的作用。此外，从所公开的内容中更难以看出银杏内酯B能够促进脑损伤后脑组织不同部位的神经干细胞增殖。

本发明人在研究银杏内酯B对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响时发现银杏内酯B能通过血脑屏障，并能明显促进脑缺血时脑组织海马、纹状体、侧脑室等部位的神经发生，促进神经干细胞增殖和转化为神经元，促使新生细胞数目增多，这一发现给脑卒中或脑缺血疾病的治疗带来了新的希望。

发明内容

本发明的目的在于提供银杏内酯B在制备促进神经细胞再生的药物中的应用，其中：所述神经细胞是脑组织海马、纹状体、侧脑室部位的神经细胞。

本发明中所述神经细胞是脑组织海马、纹状体、侧脑室部位损伤的神经细胞。

上述损伤的神经细胞是脑缺血或脑卒中所造成的。

本发明人发现，脑缺血或脑卒中一周后可以使大鼠海马齿状回颗粒下带、纹状体、前脑室下带和皮层BrdU标记的新生细胞数明显增多，海马齿状回颗粒下带、纹状体的神经细胞数也明显增多，而银杏内酯B可以进一步促进这一过程。

本发明还提供银杏内酯B在制备治疗脑缺血或脑卒中疾病的药物中的应用。

本发明中，比较了银杏内酯B和银杏提取物对大鼠大脑中动脉阻断再灌注脑损伤的改善作用及对大鼠神经发生的影响。本发明人发现，银杏内酯B和银杏提取物在试验剂量下都有明显的抗脑缺血作用，但银杏内酯B1mg/kg就有减少梗塞面积与脑水肿的作用，而银杏总提取物50mg/kg才产生作用，故银杏内酯B的抗脑缺血作用明显优于总提取物。从而可将银杏内酯B作为制备治疗脑缺血或脑卒中疾病的药物的应用。

本发明采用BrdU核酸标记的方法，观察了银杏内酯B对脑缺血以后大脑不同部位神经的影响，结果显示脑缺血可以明显促进脑组织海马、纹状体、侧脑室等部位的神经发生，银杏内酯B可以进一步促进这一过程，促使新生细胞数目增多，从而达到对脑缺血后脑组织的神经损伤修复的目的，并进而防治脑卒中或脑缺血疾病的目的。

本发明中，治疗脑缺血或脑卒中疾病是通过利用有效剂量的可促进神经发生的银杏内酯B来促进神经发生的。多种部位可需要神经发生，这包括但不局限于大脑、CNS、耳或其中含有损伤的神经细胞的部位。

本发明中所述的“促进神经发生”是指促进或增强神经干细胞转化为神经元和其它细胞。它可包括但不局限于，新神经细胞的增长或增强已存在的神经细胞的生长，以及实质细胞和可促进组织可塑性的细胞的增殖和生长。

本发明的有益效果就在于银杏内酯B通过促进神经发生和新生细胞数目增多来促进功能的提高，从而促进在局部缺血性脑损伤或其他神经损伤性疾病中取得改良性的成果。在患有脑卒中、CNS损伤和神经退行性疾病之后，患者会遭受神经和功能性缺陷，但神经损伤后神经系统本身具有修复能力，通过对这些患者施与银杏内酯B来促进神经发生和增加新生细胞数目来促进患者的功能性改进。

附图说明

附图1为银杏内酯B对MCAO大鼠前脑室下带(SVZ)新生细胞数目的影响；

附图2为银杏内酯B对MCAO大鼠皮层(Cortex)新生细胞数目的影响。

具体实施方式

下面的实验例仅为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。

[实验例1]银杏内酯B和银杏提取物对大鼠大脑中动脉阻断再灌注脑损伤的改善作用

1、材料和方法

1.1实验动物：雄性Wistar大鼠，体重280-320克，由卫生部药品生物制品检定所提供。动物自由饮食，试验前在清洁级动物房适应环境一周。

样品：北京鑫利恒医药科技发展有限责任公司研究所提供。

1.2试剂配制及给药：

银杏内酯B，为白色粉末状固体，以蒸馏水配制成，以1、4、10mg/kg(5ml/kg体重)每日灌胃给药，连续5天。

MCAO模型组及假手术组相同时间灌胃给予蒸馏水(5ml/kg体重)。

1.3方法：

大脑中动脉阻断再灌注方法：以水合氯醛麻醉(350mg/kg，ip)，颈部正中切口2cm，在左侧暴露颈总动脉(CCA)及其分支颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。结扎ECA的分支枕动脉，甲状腺上动脉及ECA终末支，分离ICA的颅外分支。夹闭CCA，ICA，将直径0.3mm的尼龙线自ECA插入，将线导入ICA，松开ICA夹，继续将尼龙线插入至其颅内段，插入的尼龙线长度约为2cm，即可阻断大脑中动脉(MCA)。2小时后将线抽出，结扎ECA残端，松开CCA即可。

雄性Wistar大鼠，体重280-320克，动物被随机分为7组：MCAO模型组、MCAO模型+银杏内酯B1mg/kg、MCAO模型+银杏内酯B4mg/kg、MCAO模型+银杏内酯B10mg/kg、MCAO模型+银杏提取物50mg/kg、MCAO模型+银杏提取物100mg/kg、同时设假手术组。

1.4行为学评分：

(1)提鼠尾离地，观察前肢。正常大鼠前肢对称伸向地面。如右肩内旋，右前肢内收者，评为1-4分，否则0分。

(2)将动物置平滑地板，观察动物行走状态。大鼠向一侧旋转爬行者，评为1-4分，否则0分。

(3)将动物置平滑地板，推左肩向对侧移动，根据阻力下降程度的不同，评为1-4分。

(4)将动物置金属网上，轻拿起大鼠，发生右前肢肌张力下降者，根据程度评为1-4分。

以上标准打分，满分16分，分数越高，说明动物的行为障碍越严重。

1.5梗塞面积的测量：

处死动物取出全脑，去除嗅球，小脑和低位脑干后，冠状切成五片，用4％红四氮唑染色，避光，37℃孵育30min。梗塞面积呈白色，分别称量梗塞脑组织与全脑重，以百分比求出梗塞面积。

1.6脑含水率的测定：

脑组织在150℃的条件下，烘干72小时，至恒重。以(脑湿重-脑干重)/脑湿重的比值表示含水率的高低。含水量高，脑水肿严重。

2.实验结果

实验结果采用T检验分析，实验结果见表1。

表1.银杏内酯B和银杏提取物对大鼠大脑中动脉阻断再灌注脑损伤的改善作用

	行为学评分	梗塞面积	含水量
				假手术组(n＝10)	0	0	0.8620±0.0065**
模型组(n＝10)	10.3±3.3	0.204±0.059	0.8824±0.0051
				银杏内酯B1mg/kg(n＝9)	8.3±3.4	0.109±0.075**	0.8796±0.0053
银杏内酯B4mg/kg(n＝8)	7.0±2.3*	0.188±0.098	0.8730±0.0122*
				银杏内酯B10mg/kg(n＝10)	7.3±1.6*	0.108±0.059**	0.8705±0.0048**
银杏提取物50mg/kg(n＝11)	7.7±1.8*	0.129±0.067*	0.8819±0.0061
				银杏提取物100mg/kg(n＝8)	8.1±3.9	0.173±0.130	0.8676±0.0002**

注：各组与模型组比，**P＜0.01，*P＜0.05。

3.结论

银杏内酯B和银杏提取物在试验剂量下都有明显的抗脑缺血作用。但从试验结果来看银杏内酯B1mg/kg就有减少梗塞面积与脑水肿的作用，银杏总提取物50mg/kg才产生作用，故银杏内酯B的抗脑缺血作用明显优于总提取物。

[实验例2]银杏内酯B对大鼠神经发生的影响

(一)线检法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型

1.实验动物

SD大鼠，雄性，体重280-300g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，

合格证号：SCXK(京)2002-2003。

2.实验试剂及药品配制

银杏内酯(EGB)，每100mg银杏内酯滴加1ml DMSO使粉末充分溶解，再将DMSO溶液逐滴加入100ml蒸馏水中，药物的最终浓度1mg/ml(其中DMSO含量小于或等于1％)。

3.实验动物分组

成年雄性SD大鼠，实验起始体重280-300g，随机分为4组，由于本试验中动物死亡率比较高，为保证最终动物9只，开始试验每个组的动物20只。

①假手术组(n＝9)：麻醉和手术，但不进行动脉栓塞操作，假手术以后腹腔注射生理盐水(0.9％NaCl)，体积5ml/kg；

②缺血组(n＝9)：手术后腹腔注射生理盐水(0.9％NaCl)，体积5ml/kg；

③大剂量组(n＝9)：术后腹腔注射银杏内酯5mg/kg，体积5ml/kg；

④小剂量组(n＝9)：术后腹腔注射银杏内酯2mg/kg，体积5ml/kg。

4.动物模型制备：同前

(二)实验样品的制备

1.实验试剂及药品：

5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brmo-2’-deoxyuide，BrdU，Sigma B 5002)粉末，多聚甲醛(北京化学试剂公司)，其它化学试剂均为分析纯。

2.给药

动物于手术后第3d开始腹腔注射BrdU溶液50mg/kg，每天1次，连续4d。最后1次给BrdU后24h处死动物取材，进行各项指标检测。

3.取材方法

大鼠按分组规定的时间取材。麻醉动物(10％水合氯醛约1.2ml)，仰卧固定，剖开胸腔，剪开右心耳，用20ml注射器及6号针头插入左心室，注入5管生理盐水，约150ml，速度为2-3min/管，以肝脏无血色为灌注完全的标准。而后注入5管4％多聚甲醛，约150ml，当尾及肢体僵直时为完全固定。固定后立即断头开颅取脑，每组脑组织标记后迅速用4％多聚甲醛浸泡。24h取固定部位切成约5mm厚的脑片，浸泡于4％多聚甲醛。

(三)BrdU的标记测定新生神经细胞

1.试验试剂及药品：

3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES，ZLI-9001)，0.25％胰蛋白酶(Hyclone，USA)，羊血清工作液(中杉金桥ZLI-9002)，鼠抗尿嘧啶脱氧核苷单克隆抗体(anti-Brdu，中杉金桥ZM-0013)，罗丹明标记山羊抗鼠IgG(中杉金桥ZF-0313)，其它化学试剂均为分析纯。

2.实验仪器

AEG-220电子分析天平(日本Shimadzu公司)，冰冻切片机，免疫组化染色孵育盒，显微镜(Nikon eclipse 80i，日本)。

3.新生神经细胞标记步骤

在临切前24h，将浸入4％多聚甲醛脑片，换入30％蔗糖溶液中浸泡。切片时，将组织放入异戊烷中，在液氮罐中约10S，完全冰冻后取出，用冰冻切片机冠状位连续切片，脑片厚约40μm，每个组织取5张进行BrdU免疫组织化学染色。

4.新生细胞计数

荧光显微镜下(×100)在海马齿状回(SGZ)、皮层(Cortex)、前脑室下带(SVZ)、纹状体(Cpu)固定选取3个视野拍照，用Image-Pro Plus v 5.1软件进行图片处理后计数。

5.统计学处理：阳性细胞个数以平均值±标准误差表示，采用SPSS 11.5软件做统计分析。

(四)实验结果

1.银杏内酯对MCAO大鼠新纹状体(Cpu)新生细胞数目的影响

视野内多为神经细胞和胶质细胞，对总体细胞作计数；而细胞直径≥7μm时多为神经细胞，以此为标准计数为神经细胞作大致数目。结果见表2。

表2.银杏内酯对MCAO大鼠新纹状体(Cpu)新生细胞数目的影响

组别	剂量(mg/kg)	n	总细胞数(个)	神经细胞数(个)
					假手术组	-	9	22.48±8.32	9.59±4.71
模型组	-	9	66.59±36.54<sup>△△</sup>	32.81±12.72<sup>△△</sup>
					大剂量组	5	9	159.41±48.01**	61.85±10.80**
小剂量组	2	9	131.78±29.67**	64.29±14.51**

注：各组与模型组比，**P＜0.01，*P＜0.05；模型组与假手术组比：^△△P＜0.01

2.银杏内酯B对MCAO大鼠海马齿状回颗粒下带(subgranular zone，SGZ)新生细胞数目的影响

视野内多为神经细胞和胶质细胞，对总体细胞作计数；而细胞直径≥7μm时多为神经细胞，以此为标准计数为神经细胞作大致数目。结果见表3。

表3.银杏内酯B对MCAO大鼠海马齿状回颗粒下带(SGZ)新生细胞数目的影响

组别	剂量(mg/kg)	n	总细胞数(个)	神经细胞数(个)
					假手术组	-	9	28.89±16.36	15.85±11.48
模型组	-	9	73.26±38.54<sup>△△</sup>	43.81±18.91<sup>△△</sup>
					大剂量组	5	9	144.48±58.82**	71.67±20.84**
小剂量组	2	9	124.53±57.89**	70.25±35.55**

注：各组与模型组比，**P＜0.01，*P＜0.05；模型组与假手术组比：^△△P＜0.01

3.银杏内酯B对MCAO大鼠前脑室下带(subvent ricular zone，SVZ)新生细胞数目的影响

视野内多为神经细胞和胶质细胞，对总体细胞作计数。结果见附图1。

附图1中，A：空白组  B：模型组  C：大剂量组  D：小剂量组

模型组与假手术组比BrdU阳性细胞即新生细胞数目明显增多(P＜0.01)，银杏内酯B无论大小剂量组的新生细胞数目又比模型组明显增多(P＜0.01)。

4、银杏内酯B对MCAO大鼠皮层(Cortex)新生细胞数目的影响

视野内多为神经细胞和胶质细胞，对总体细胞作计数。结果见附图2。

附图2中，A：空白组  B：模型组  C：大剂量组  D：小剂量组

模型组与假手术组比BrdU阳性细胞即新生细胞数目明显增多(P＜0.01)，银杏内酯B无论大小剂量组的新生细胞数目又比模型组明显增多(P＜0.01)。

(五)结论

本发明中采用BrdU核酸标记的方法，观察了银杏内酯B对脑缺血以后大脑不同部位神经发生的影响，结果显示脑缺血可以明显促进脑组织海马、纹状体、侧脑室等部位的神经发生，银杏内酯B可以进一步促进这一过程，从而达到治疗脑卒中或缺血疾病的目的。

Claims (5)

1.银杏内酯B在制备促进神经细胞再生的药物中的应用，其特征在于：所述神经细胞是脑组织海马、纹状体、侧脑室部位的神经细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述神经细胞是脑组织海马、纹状体、侧脑室部位损伤的神经细胞。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述损伤的神经细胞是脑缺血或脑卒中所造成的。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：银杏内酯B在制备治疗脑缺血或脑卒中疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的应用，其特征在于：所述银杏内酯B的剂量为1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg或5mg/kg。

Images