CN113416717A

CN113416717A - 适用于工业生产用的7β羟基类固醇脱氢酶突变体

Info

Publication number: CN113416717A
Application number: CN202110792563.9A
Authority: CN
Inventors: 傅荣昭; 熊建伟; 宋鹏; 陈琳
Original assignee: Jiangxi Bontac Green Biocatalysis Ecoindustrial Park Co ltd
Current assignee: Jiangxi Bontac Green Biocatalysis Ecoindustrial Park Co ltd
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2041-07-14
Also published as: CN113416717B

Abstract

本发明设计羟基类固醇脱氢酶，具体涉及7β羟基类固醇脱氢酶突变体。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，是将野生型7β羟基类固醇脱氢酶的第181位缬氨酸、189位苏氨酸、207位的缬氨酸分别替换为半胱氨酸、缬氨酸、半胱氨酸。突变体的酶活是野生型的2.59倍，热稳定性是野生型的5倍，且酶催化的转化率能够达到99.9％，作为酶法制备熊去氧胆酸的关键酶，表现了极具工业化应用价值的特性。

Description

适用于工业生产用的7β羟基类固醇脱氢酶突变体

技术领域

本发明涉及一种改造的7β羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)酶突变体及其应用，属于生物酶工程技术领域。

背景技术

熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)作为我国名贵中药熊胆的主要有效成分，在临床上广泛用于治疗各种肝胆疾病，包括胆结石、病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化等。至今为止，熊去氧胆酸是唯一由美国FDA批准的可用于治疗原发性胆汁性肝硬化的药物。

目前UDCA的制备方法有三种。首先，最传统的方式是从熊胆汁中提取；其次是化学合成制备UDCA，以来源于牛、猪、鸡、鸭等动物胆汁中的胆酸(Cholic acid， CA)、猪去氧胆酸(Hyodeoxycholic acid，HDCA)、鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)为原料合成得到，该方法广泛用于工业生产，但是化学法合成UDCA 往往过程复杂，污染大，并且涉及高温高压等危险步骤，显然这种方法已经不适合我国高质量绿色发展的方向；最后，经过最近几十年的研究，人们发现以CDCA 为原料，酶法制备UDCA，利用生物酶的选择性催化特性，使得底物的特定位点产生化学反应的性质，完成氧化和还原两步反应，生成熊去氧胆酸，不仅工艺简单、反应条件温和，而且效率高、杂质少，是未来大规模工业化生产UDCA的方向。

但是，酶法合成UDCA的方法受限于酶的性质，尤其是7β-HSDH，诸如酶活性低、稳定性差、底物抑制等缺陷，开发高活性和高稳定性的7β-HSDH，对于大规模工业化生产UDCA显得尤为关键。

目前，已报道的7β-HSDH十分有限，不超过10种，而几乎所有的7β-HSDH 都是NADPH型，仅有1-2种报道的7β-HSDH为NAD型，但是其序列号未知。他们的微生物来源有活泼瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)、扭链瘤胃球菌 (RuminococcustorquesATCC35915)、产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)、撒丁岛梭菌(Clostridiumabsonum)及黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)等。其中，研究最多的是撒丁岛梭菌和扭链瘤胃球菌，但是酶活性低，以及酶稳定性差，是他们的典型缺陷。针对这两大不足，我们利用酶的定向进化技术，对撒丁岛梭菌来源的7β-HSDH进行改造，得到了比野生型高2.47倍的突变体(详见中国专利202010967922.5)。

本发明的研究对象为扭链瘤胃球菌来源的7β-HSDH。

发明内容

本发明提供一种7β-HSDH突变体，是在野生型7β-HSDH的基础上(氨基酸序列为SEQID NO:1)，进行多点突变得到高活性及高稳定性的7β-HSDH，具有 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

所述的7β-HSDH突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7β-HSDH 的第181位的缬氨酸、189位的苏氨酸和207位缬氨酸分别替换为半胱氨酸、缬氨酸和半胱氨酸的SEQID NO:2。

本发明利用多轮定点突变技术，依次对野生型7β-HSDH基因(SEQ ID NO:3) 进行V181、T189、V207氨基酸替换，获得突变体7β-HSDH基因序列(SEQ ID NO:4)，将基因克隆到表达载体pET28a，重组质粒导入

大肠杆菌BL21(DE3)，通过乳糖操纵子诱导表达，获得了突变体蛋白，命名为7β-HSDH_Rt V3。

所述的SEQ ID NO:2氨基酸序列，其特征在于：编码的基因序列如SEQ ID NO:4 所述的SEQ ID NO:4基因序列的重组质粒、表达菌株。

所述的突变体催化反应制备熊去氧胆酸的应用。

本发明的有益效果

(1)突变体7β-HSDH_Rt V3相比于野生型，在同等测试条件下其酶活为野生型的2.3-2.8倍，稳定性为野生型的5倍以上；同时，测试了相同条件下的酶催化反应，突变体7β-HSDH_Rt V3在更短的时间内得到了更高的转化率，催化结果见表3。

(2)后续优化工艺中，突变体7β-HSDH_Rt V3能够得到转化率＞99.9％的酶催化效果，这为我们的工业化生成提供了强有力的技术支持，本发明尤其强调突变体7β-HSDH_Rt V3对酶催化制备熊去氧胆酸的工业应用。

附图说明

图1.五个7β-HSDH蛋白序列比对；

图2.突变体7β-HSDH_Rt V3蛋白SDS-PAGE检测；

图3.野生型和突变体7β-HSDH_Rt V3酶活检测结果；(注：其中的207C为我们的突变体7β-HSDHRt V3，酶活为57.3U/ml,是野生型(22.1U/ml)的2.59倍，207A 和207S为我们突变体库的另外两个突变体，这里与野生型一起作为对照，检测3 次的平均值结果)；

图4.突变体7β-HSDH_Rt V3酶的稳定性；

图5.不同pH条件下突变体7β-HSDH_Rt V3酶活力。

具体实施方式

以下实施例及其说明用于解释本发明，但并不构成对本发明的不当限定。本申请中下述实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译。第 4版，北京科学出版社，2017)中所述的方法进行。同时，本发明中的氨基酸无特别说明外均用其缩写或代号标明。

若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为实验室常规生化试剂。

实施例1.突变体7β-HSDH_Rt V3蛋白的制备

1.突变体7β-HSDH_Rt V3工程菌获得

表1：野生型与突变体序列位点对比

根据相关文献报道以及我们前期生物信息学方法模拟论证，扭链瘤胃球菌来源的7β-HSDH的酶催化活性中心位于蛋白质的C端区域的α螺旋二级结构区域 (179AA-197AA，206AA-209AA，214AA-225AA)。将该7β-HSDH与其他已报道4 个7β-HSDH进行序列比对(见图1)，从高度同源的十几个氨基酸中找到了R基团相似的181位缬氨酸、189位苏氨酸和207位缬氨酸三个关键氨基酸位点。然后，我们对三个位点中的任何一个进行饱和突变(19个突变体)，从每一轮饱和突变中，我们选择了最优的突变体进行下一轮饱和突变。最终我们从19+19+19 共57种突变体库中筛选得到了最优的突变体7β-HSDH_Rt V3，它的突变位点分别是181、189、207，由原来的缬氨酸、苏氨酸、缬氨酸突变为半胱氨酸、缬氨酸、半胱氨酸。

首先将野生型7β-HSDH克隆到载体pET28a上，引入的酶切位点为BamHI (GGATCC)/XhoI(CTCGAG)，克隆菌株为DH5α，使用的PCR引物为WT-F/WT-R，见表2。

1.1突变体7β-HSDH_Rt V3重组载体的获得

(1)野生型7β-HSDH重组质粒的提取

-80℃保藏菌种三区划线法接种LB卡那平板(kan30)，37℃倒置过夜培养，挑单克隆转接LB试管(2ml/12ml)液体培养基，37℃过夜培养，天根试剂盒提质粒(最后用100ul无菌水洗脱)

(2)PCR反应扩增突变体质粒V1(V181C)

PCR反应设置

反应物	体积
		WT质粒模板(10倍稀释)	0.5ul
V1-F/R(10uM)	2ul/2ul
		Takaraprimerstarmix	25ul
ddH2O	20.5ul

总体积：50ul

PCR反应程序

预变性95℃	2min
		94℃	20s
55℃	10s
		68℃	2.5min
2-4循环次数	18
		68℃	5min
12℃	∞

注：热盖温度105℃，反应体系50ul

取2ul样品，设置110V，用1％琼脂糖凝胶电泳30min进行电泳验证

(3)DpnI消化PCR产物

设置Dpn I酶解反应(25ul体系)

PCR产物	21.5ul
		10xbuffer	2.5ul
DpnI(10U/ul)	1ul

37℃金属浴反应1h，70℃热处理15min进行灭活

(4)化转克隆菌株Top10

2ul Dpn I消化产物，加入50ul Top10感受态细胞，轻轻混匀冰浴，静止 30min→42℃热激90s，冰浴2min→加入LB 700ul无抗LB培养基，37℃，180rpm 孵育1h→取100ul菌液涂平板→37℃倒置培养16-20h。

(5)筛选阳性菌株

平板挑取2个单克隆，接菌至2ml/12ml一次性试管，37℃过夜培养；天根试剂盒提质粒，80ul 55℃金属浴的无菌水洗脱，质粒送华大基因测序。

(6)V2、V3重组载体及V3工程菌的获得

依次将引物换成V2-F/R、V3-F/R,其余操作步骤同(1)-(5)，最后的重组质粒经过测序验证正确后转化表达菌株BL21(DE3)，转化步骤同(4)

表2：基因合成引物

引物名称	引物序列(5’→3’)
		WT-F	GGATCCATGAACCTGCGT
WT-R	CTCGAGTTAGTTGTTGCTAT
		V1-F	ACCAACGTGGACTGTGAAGTGATCACCCTG
V1-R	ACAGTCCACGTTGGTGCTTTCGCACTCC
		V2-F	ACCCTGGGTGTCACCATTACCCCGAGCCTG
V2-R	GACACCCAGGGTGATCACTTCAACGTCC
		V3-F	GCGGGTGAAGCGTGTATGAAGACCGCGATG
V3-R	ACACGCTTCACCCGCCGGGCCACCCGGC

2.突变体7β-HSDH_Rt V3蛋白表达

(1)菌种复苏及转接试管

-80℃冰箱保存的突变体7β-HSDH_Rt V3菌株，三线划区法接种含有30ug/ml 的卡那霉素，37℃恒温培养16-20h，长出单克隆菌落后，转接2ml的LB培养基， 37℃、220rpm培养10-12h

(2)摇瓶培养及诱导表达

1：100转接50ml的LB培养基/250ml的三角瓶，37℃、220rpm培养3-4h， OD600＝0.5左右，加入IPTG至终浓度0.5mM，30℃诱导4h，此时的OD600＝2.0-2.5

(3)细胞破碎及粗酶液制备

8000rpm、4℃离心10min收集上一步培养的菌体，称重，加入5-10ml左右的PBS缓冲液(pH8.0)重悬，再加入10％的溶菌酶(2％)混匀，35℃孵育裂解 1h后，12000rpm、4℃离心10min收集上清酶液。

实施例2.突变体7β-HSDH_Rt V3酶功能研究

1、酶活检测

在3ml的比色皿中，加入30℃孵育的1.948ml浓度为10mM的7KLCA(pH8.0，含有50mM的PBS)，再加入50ul浓度为5mg/ml的辅酶NADPH,混合均匀后，加入 2ul制备的野生型或突变体酶液，1000ml的移液枪吹打混匀，读取2min吸光值的变化。酶活计算方式如下：

酶活(U/mL)＝△OD/min*Vt*df/(6.22*1.0*Vs)

Vt:反应总体积2.00mL

Df:：稀释倍数

6.22：NADPH在340nm波长的消光系数

1.0：测量光程

Vs：酶液体积(0.002mL)

结果如图3

2、酶稳定性研究

(1)温度对突变体7β-HSDHRt V3酶稳定性

低温稳定性：新制备的野生型或突变体酶液1ml(2ml离心管)各3支，封口膜封好口，在-20℃/4℃保存半个月(15天)后，取出后按上述1的检测方法，测定酶液剩余酶活。

热稳定性：新制备的野生型或突变体酶液1ml(2ml离心管)各3支，封口膜封好口，在45℃条件下孵育15min，取出后按上述1的检测方法，测定酶液剩余酶活。

结果如图4。

(2)pH对突变体7β-HSDHRt V3酶活力的影响

配制好pH分别为7.0、7.2、7.5、8.0的浓度为10mM的7KLCA底物，用新制备的突变体7β-HSDH_Rt V3酶液检测各个pH条件下对应的酶活，最适pH在7.2 左右。结果如图5。

3、酶催化反应制备熊去氧胆酸

5g的7-酮基石胆酸，溶解在100ml的50mM PBS缓冲液反应体系中，再加入 5g的D-葡萄糖和5ml的无水乙醇搅拌混匀后，再加入葡萄糖脱氢酶至100U/ml, 野生型或突变体7β-HSDH_Rt V3酶至20U/ml,设置反应温度为30℃，搅拌转速为 150转/分钟，每隔一段时间取样进行HPLC检测，计算7-酮基石胆酸的残留百分比及UDCA的转化百分比。最终利用突变体7β-HSDH_Rt V3转化7-酮基石胆酸，转化率达到99.922％，据我们所知，这是目前已报道的相关资料中，转化率最高的酶催化结果，具体酶催化反应结果如表3。

表3

1-WT/2-突变体7β-HSDH<sub>Rt</sub>V3	UDCA(％)	7K-LCA(％)
			1-1h	86.216	13.784
2-1h	97.470	2.530
			1-3h	93.163	6.837
2-3h	98.673	1.327
			1-5h	95.192	4.808
2-5h	99.082	0.918
			1-7h	96.125	3.875
2-7h	99.922	0.078

序列表

<110> 江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司

<120> 适用于工业生产用的7β羟基类固醇脱氢酶突变体

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> 扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)

<400> 1

Met Asn Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala

1 5 10 15

Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Ala Glu Lys Ile Ala Ser Glu Gly

20 25 30

Met Ser Val Val Leu Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Gln Glu Leu

35 40 45

Gly Lys Ser Ile Ser Glu Thr Tyr Gly Val Asp His Met Val Ile Arg

50 55 60

Ala Asp Phe Ala Gln Ser Asp Cys Thr Asp Lys Ile Phe Glu Ala Thr

65 70 75 80

Lys Asp Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Phe His Thr

85 90 95

Phe Gly Lys Leu Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Gln Met Ile

100 105 110

Asn Val Asn Val Met Thr Phe Leu Lys Cys Phe Tyr His Tyr Met Gly

115 120 125

Ile Phe Ala Lys Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser Leu

130 135 140

Thr Ala Ile Ser Ser Ser Pro Tyr Asn Ala Gln Tyr Gly Ala Gly Lys

145 150 155 160

Ser Tyr Ile Lys Lys Leu Thr Glu Ala Val Ala Ala Glu Cys Glu Ser

165 170 175

Thr Asn Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Ile Thr Pro

180 185 190

Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Ala Gly Glu Ala Val Met

195 200 205

Lys Thr Ala Met Thr Pro Glu Ala Cys Val Glu Glu Ala Phe Asp Asn

210 215 220

Leu Gly Lys Ser Leu Ser Val Ile Ala Gly Glu His Asn Lys Ala Asn

225 230 235 240

Val His Asn Trp Gln Ala Asn Lys Thr Asp Asp Glu Tyr Ile Arg Tyr

245 250 255

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260

<210> 2

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<212> PRT

<213> 扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)

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1 5 10 15

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Met Ser Val Val Leu Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Gln Glu Leu

35 40 45

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165 170 175

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Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Ala Gly Glu Ala Cys Met

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<210> 3

<211> 795

<212> DNA

<213> 扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)

<400> 3

atgaacctgc gtgagaagta cggtgaatgg ggcatcattc tgggtgcgac cgagggtgtt 60

ggcaaggcgt ttgcggagaa aatcgcgagc gagggtatga gcgtggttct ggtgggccgt 120

cgtgaggaaa agctgcagga gctgggtaaa agcatcagcg aaacctacgg cgttgaccac 180

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<212> DNA

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gtgcacaact ggcaggcgaa caaaaccgac gatgaataca ttcgttatat gggtagcttc 780

tatagcaaca actaa 795

Claims

1.适用于工业生产用的7β羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述7β羟基类固醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7β-HSDH的第181位的缬氨酸、189位的苏氨酸和207位缬氨酸分别替换为半胱氨酸、缬氨酸和半胱氨酸，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

2.根据权利要求1所述的SEQ ID NO:2氨基酸序列，其特征在于：编码的基因序列如SEQID NO:4所示。

3.权利要求所述的SEQ ID NO:4基因序列的重组质粒、表达菌株。

4.权利要求1所述的突变体催化反应制备熊去氧胆酸的应用。