JP2013150590A - セロビオースデヒドロゲナーゼ様グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アスペルギルス・ニガー由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ様タンパク質からなるグルコースデヒドロゲナーゼ及びそれを用いたフルコース測定法などが提供される。
【選択図】なし
Description
[1]アスペルギルス・ニガー由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ様タンパク質からなるグルコースデヒドロゲナーゼ。
[2]以下の特性を備える、[1]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ:
(1)作用: 電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する;
(2)基質特異性: D−グルコース選択的に作用する;
(3)補欠分子: FADとヘムを有する;
(4)構造: モノマー構造である。
[3]以下の特性を更に備える、[2]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ:
(5)分子量: 約16万Da(ゲルろ過による)、約12万Da(SDS-PAGEによる);
(6)至適pH: 8付近;
(7)至適温度: 45℃付近;
(8)pH安定性: pH4〜7の範囲で安定;
(9)温度安定性: 40℃以下で安定。
[4]配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、[1]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[5]配列番号1〜5のいずれかのアミノ酸配列からなる、[1]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[6][1]〜[5]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用組成物。
[7][1]〜[5]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。
[8][7]に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
[9][1]〜[5]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
[10]以下のステップ(1)及び(2)を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法:
(1)[1]〜[5]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を保有する微生物を培養するステップ;
(2)培養後の培養液及び/又は菌体より、グルコースデヒドロゲナーゼを回収するステップ。
[11][1]〜[5]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするDNAを含む、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。本発明の酵素(GDH)に関して使用する場合の「単離された」とは、本発明の酵素が天然材料に由来する場合、当該天然材料の中で当該酵素以外の成分を実質的に含まない(特に夾雑タンパク質を実質的に含まない)状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約20%未満、好ましくは約10%未満、更に好ましくは約5%未満、より一層好ましくは約1%未満である。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「グルコースデヒドロゲナーゼ」と記載した場合は「単離された状態のグルコースデヒドロゲナーゼ」を意味する。グルコースデヒドロゲナーゼの略号GDHについても同様である。
本発明の第1の局面はGDH及びその生産菌を提供する。本発明のGDH(以下、「本酵素」ともいう)は以下の特性を備える。まず、本酵素は次の反応、即ち、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。一方、本酵素は基質特異性に優れ、D-グルコース選択的に作用する。例えば、本酵素のマルトースに対する反応性は極めて低い。また、D-ガラクトース、D-フルクトースなどに対する反応性も非常に低い。好ましい態様では、D-グルコースに対する反応性を100%としたときの、D-マルトースに対する反応性は1%以下又は実質的に認められない。D-ガラクトース及びD-フルクトースに対する反応性についても1%以下又は実質的に認められない。基質特異性に優れる本酵素は、様々な用途に適用可能であること、即ち汎用性が高いともいえる。尚、本酵素の反応性及び基質特異性は、後述の実施例に示す方法で測定・評価することができる。
(1)作用: 電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する
(2)基質特異性: D−グルコースに特異的に反応するマルトースに対する反応性が低い
(3)補欠分子: FADとヘムを有する
(4)構造: モノマー構造である
(5)分子量: 約16万Da(ゲルろ過による)、約12万Da(SDS-PAGEによる);
(6)至適pH: 8付近;
(7)至適温度: 45℃付近;
(8)pH安定性: pH4〜7の範囲で安定;
(9)温度安定性: 40℃以下で安定。
本発明は更に、本酵素をコードする遺伝子、即ち新規なGDH遺伝子を提供する。本発明の遺伝子は本酵素のアミノ酸配列をコードするDNAを含む。本発明の遺伝子を規定するDNAの具体例を配列番号6〜22に示す。これらの各配列の詳細は以下の通りである。
配列番号6のDNA:配列番号1に対応する配列であり、イントロン1(配列番号26)とイントロン2(配列番号27)を含む。
配列番号7のDNA:配列番号1に対応する配列であり、イントロン1を含むが、イントロン2を含まない。
配列番号8のDNA:配列番号1に対応する配列であり、イントロン1を含まず、イントロン2を含む。
配列番号9のDNA:配列番号1に対応する配列であり、イントロン1もイントロン2も含まない。
配列番号10のDNA:配列番号2に対応する配列であり、イントロン1とイントロン2を含む。
配列番号11のDNA:配列番号2に対応する配列であり、イントロン1を含むが、イントロン2を含まない。
配列番号12のDNA:配列番号2に対応する配列であり、イントロン1を含まず、イントロン2を含む。
配列番号13のDNA:配列番号2に対応する配列であり、イントロン1もイントロン2も含まない。
配列番号14のDNA:配列番号3に対応する配列であり、イントロン1とイントロン2を含む。
配列番号15のDNA:配列番号3に対応する配列であり、イントロン1を含むが、イントロン2を含まない。
配列番号16のDNA:配列番号3に対応する配列であり、イントロン1を含まず、イントロン2を含む。
配列番号17のDNA:配列番号3に対応する配列であり、イントロン1もイントロン2も含まない。
配列番号18のDNA:配列番号4に対応する配列であり、イントロン1とイントロン2を含む。
配列番号19のDNA:配列番号4に対応する配列であり、イントロン1を含むが、イントロン2を含まない。
配列番号20のDNA:配列番号4に対応する配列であり、イントロン1を含まず、イントロン2を含む。
配列番号21のDNA:配列番号4に対応する配列であり、イントロン1もイントロン2も含まない。
配列番号22のDNA:配列番号5に対応する配列であり、イントロン1とイントロン2を含む。
本発明の更なる局面はGDHの製造法を提供する。本発明の製造法では、本酵素をコードする遺伝子を保有する微生物を培養するステップ(ステップ(1))及び培養後の培養液及び/又は菌体より、GDHを回収するステップ(ステップ(2))を行う。
本発明の更なる局面は本酵素の用途に関する。この局面ではまず、本酵素を含むグルコース測定用組成物が提供される。グルコース測定用組成物の形態は特に限定されない。例えば液状又は固体状(凍結品、凍結乾燥品など)で提供される。本発明のグルコース測定用組成物は、例えば、グルコース測定用試薬として、又はグルコース測定用試薬の有効成分として用いられる。一態様では、本発明のグルコース測定用組成物は電極に固定化されている。電極の材質は例えば金(Au)、カーボン(C)、白金(Pt)、チタン(Ti)、パラジウム(Pd)である。本発明のグルコース測定用組成物が固定化された電極は、例えば、グルコースセンサとして利用可能である。このような固定化電極は常法で作製することができる。例えば、絶縁性基板の上にスクリーン印刷等の方法で作用極と対極を含む電極系(好ましくは参照極も含む)を形成し、当該電極系の上に本発明のグルコース測定用組成物を含む酵素反応層を形成する。典型的には、酵素反応層に電子メディエータも含有させる。
グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)は、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。GDH活性の検出は下記の反応系で行った。
(1)GDH遺伝子の取得
遺伝子データベースより、同一ペプチド鎖内に触媒部位の他に酸化還元部位を有する酵素として知られているファネロケイト・クリソスポリウム由来のセロビオースデヒドロゲナーゼと同様の機能構造を有する酵素遺伝子を探索した結果、セロビオースデヒドロゲナーゼと同定されている遺伝子が多数検出されたが、GDHと同定されている遺伝子は検出されなかった。しかし、それらの配列を詳細に解析した結果、セロビオースデヒドロゲナーゼと同定されていたA.ニガー由来の配列は、他の多数のセロビオースデヒドロゲナーゼと同定されていた配列と比較し、特に触媒部位付近に異なる配列があることを見出した。そこで、A.ニガー由来のセロビオースデヒドロゲナーゼと同定されていた遺伝子を以下の手順でpYES2プラスミド(インビトロジェン株式会社製)にクローニングし、S. cerevisiae Direct transformation Kit Wako(和光純薬工業製)を用いて、サッカロマイセス・セレビジェに形質転換した。
<プライマー>
フォワード
CCTGGGTACCAAAATGGATGCCTACAACACCTCCG(配列番号28)
リバース
CGGTCTAGATTAAGAGGTGGCGCTGGTG(配列番号29)
形質転換後のS.セレビジェの培養を、SCミニマルブロスマイナスウラシル培地(TEKNOVA製)を用いて行った。まず、当該液体培地50mLを300mL三角フラスコに分注し、121℃、0.12MPaで20分間殺菌後、形質転換後のS.セレビジェを接種し、30℃、200rpmで1日間培養した。培養終了後の培養液から遠心分離により菌体を回収し、その菌体破砕液をサンプルとして上記活性測定法に供し、GDH活性を確認した。
S.セレビジェの菌体破砕液を、遠心分離、限外ろ過濃縮後、陰イオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーに供した。その結果得られた精製酵素を以下の実験に使用した。
精製酵素をサンプルとして、以下の方法でアミノ酸配列を解析した。
精製酵素サンプルを適当な濃度に希釈し、Super SepTM Ace 7.5% ゲル(和光純薬工業株式会社)を用いてSDS−PAGEを行った。次に、泳動したゲルをsequi-BlotTM PVDF Membrane for Plotein Sequencing (0.2μm)(Bio-Rad社製)に転写し、推定分子量付近のバンドを切り出して、島津サイエンス(京都)にN末端アミノ酸配列解析を依頼した。解析の結果、A.ニガーNBRC 6428株由来GDHの推定アミノ酸配列(全長配列。シグナルペプチドを含む)が決定された。当該推定アミノ酸配列を配列番号5に示す。尚、上記の形質転換体が発現するGDHはシグナル配列及びC末端STDリッチ配列を含まず、そのアミノ酸配列は配列番号1に示す通りとなる。
(4)で得られた推定アミノ酸配列(配列番号5)と、A.ニガー由来セロビオースデヒドロゲナーゼとして公共のデータベースに登録されているアミノ酸配列とを比較した。比較対象として、NCBIデータベースに登録されたA.ニガー ATCC 1015株由来セロビオースデヒドロゲナーゼ(Accession No. EHA22215.1)、JGI(DOE Joint Genome Institute)データベースに登録されたA.ニガー ATCC 1015株由来セロビオースデヒドロゲナーゼ(Accession No. e_gw1.16.561.1)、及びNCBIデータベースに登録されたA.niger CBS 513.88株由来セロビオースデヒドロゲナーゼ(Accession No. XP_001402432.1)を用いた。比較結果を図4に示す。推定アミノ酸配列(nigerGDH)は、NCBIデータベースに登録されたA.ニガー ATCC 1015株由来セロビオースデヒドロゲナーゼ(NCBI1015。配列番号23)との間では、イントロンに対応する部分とC末端STDリッチ配列を別にして、1アミノ酸が相違する。また、JGIデータベースに登録されたA.ニガー ATCC 1015株由来セロビオースデヒドロゲナーゼ(JGI1015。配列番号24)との間では、イントロンに対応する部分を別にして、1アミノ酸が相違する。一方、NCBIデータベースに登録されたA.ニガー CBS 513.88株由来セロビオースデヒドロゲナーゼ(CBS513.88。配列番号25)との間では2アミノ酸が相違する。
(1)基質特異性
0.5%(w/v)トリトンX-100を含む50mM PIPES-NaOHバッファーpH6.5 2.6mL、1M 基質(D-グルコース、マルトース、D-キシロース又はD-ガラクトース)溶液0.1mL、3mM PMS溶液0.2mL、及び6.6mM NTB溶液0.1mLを混合し、37℃で5分間保温後、酵素サンプル0.1mLを添加し、反応を開始した。酵素反応によって生成するDiformazanを570nmの吸光度で測定し、1分間当たりのDiformazanの生成量を測定することにより酵素活性を測定した。D-グルコースに対する活性を100%とした各基質に対する相対活性を算出した(表1)。その結果、マルトースやガラクトースには反応せず、血糖測定に適した性質を有していることを確認した。
0.5%(w/v)トリトンX-100を含む100mM Mcllvaineバッファー(pH4.5、pH5.0、pH6.0、pH7.0、又はpH8.0に調整)2.6mL、1M D-グルコース溶液0.1mL、3mM PMS溶液0.2mL、及び6.6mM NTB溶液0.1mLを混合し、37℃で5分間保温後、酵素サンプル0.1mLを添加し、反応を開始した。酵素反応によって生成するDiformazanを570nmの吸光度で測定し、1分間当たりのDiformazanの生成量を測定することにより酵素活性を測定した。A.ニガー由来GDHの至適pHは8.0であった(図5)。
0.5%(w/v)トリトンX-100を含む50mM PIPES-NaOHバッファーpH6.5 2.6mL、1M D-グルコース溶液0.1mL、3mM PMS溶液0.2mL、及び6.6mM NTB溶液0.1mLを混合し、25、40、50、55又は60℃で5分間保温後、酵素サンプル0.1mLを添加し、25、40、50、55又は60℃で反応を開始した。酵素反応によって生成するDiformazanを570nmの吸光度で測定し、1分間当たりのDiformazanの生成量を測定することにより酵素活性を測定した。A.ニガー由来GDHの至適温度は約45℃であった(図6)。
酵素サンプル80μLを0.1M酢酸バッファー(pH3、pH4)、0.1M Mcllvaineバッファー(pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0)、又は0.1M Na2CO3-NaHCO3バッファー(pH9.0)80μLで希釈し、各pHにおいて37℃で30分間処理した。各処理液を0.5M KH2PO4-NaOHバッファーpH6.5で適宜希釈し、上記の方法で酵素活性を測定した。その結果、A.ニガー由来GDHは、少なくともpH4.0〜7.0の範囲で80%以上の活性を維持しており、pH4.0〜7.0の範囲で安定であることが示された(図7)。
酵素サンプル50μLを各指定温度(20、30、40、50、又は60℃)で20分間処理した。氷中で冷却後、上記の方法で酵素活性を測定した。コントロールとして、熱処理していない酵素サンプルの酵素活性も測定した。その結果、A.ニガー由来GDHは40℃以下で90%以上の活性を維持した。即ち、40℃以下で安定であることが示された(図8)。
HPLC(ゲルろ過 東ソー製 TSK-GEL G3000SW カラムを使用)により分子量を測定した。その結果、A.ニガー由来GDHの分子量は約16万Daであった。
一般的なGO測定系(PO-4AA-phenor系)で酵素サンプルの活性を調べた。その結果、活性は認められず、酵素サンプル中の酵素がGOではなく、GDHであることが確認された。一方、透析により活性は低下せず、補酵素結合型のGDHであることを確認した。
そのアミノ酸配列から、本酵素はFAD結合ドメインとシトクロムドメイン(ヘム結合ドメイン)を有すると判断できたが、定法通り吸収スペクトル解析による確認も行った。その結果、FAD結合ドメインとシトクロムドメインの存在を確認できた。また、本酵素はCon-Aセファロースに強く吸着し、マンノースで溶出されることから、マンノースを含む糖鎖を含有する糖蛋白であることを確認した。
Claims (11)
- アスペルギルス・ニガー由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ様タンパク質からなるグルコースデヒドロゲナーゼ。
- 以下の特性を備える、請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ:
(1)作用: 電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する;
(2)基質特異性: D−グルコース選択的に作用する;
(3)補欠分子: FADとヘムを有する;
(4)構造: モノマー構造である。 - 以下の特性を更に備える、請求項2に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ:
(5)分子量: 約16万Da(ゲルろ過による)、約12万Da(SDS-PAGEによる);
(6)至適pH: 8付近;
(7)至適温度: 45℃付近;
(8)pH安定性: pH4〜7の範囲で安定;
(9)温度安定性: 40℃以下で安定。 - 配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
- 配列番号1〜5のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用組成物。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。
- 請求項7に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
- 以下のステップ(1)及び(2)を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法:
(1)請求項1〜5のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を保有する微生物を培養するステップ;
(2)培養後の培養液及び/又は菌体より、グルコースデヒドロゲナーゼを回収するステップ。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするDNAを含む、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
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