JP2001508300A

JP2001508300A - 結晶性アスパラギン酸の製造方法

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Publication number: JP2001508300A
Application number: JP53107498A
Authority: JP
Inventors: メイヤーイヤル，アハロン; ビトナー，アシャー; カミ，ピエール; ジャンセン，ロバート; ジャリー，ブルーノ; ルコント，ディディエール; スコット，ジャン; シャタワイ，トーマス; ランケル，フランクバン
Original assignee: アミリュームベルギーナームロゼフェンノートシャップ; エー．イー．ステイレーマニュファクチャリングカンパニー
Priority date: 1997-01-09
Filing date: 1998-01-08
Publication date: 2001-06-26
Also published as: IL119986A0; AU5817798A; EP0966539A1; WO1998030712A1; IL119986A

Abstract

(57)【要約】本発明は、（ａ）フマル酸ジアンモニウム１モル当たり約２モルのアンモニア源を使用してフマル酸ジアンモニウムを含む水溶液を形成するステップであって、前記アンモニア源の一部がこの方法の１つのステップから再循環されるステップ；（ｂ）この方法の１つのステップを通じて得られるフマル酸ジアンモニウムを含む水溶液の組成を調節して約０．５Ｍ〜約２Ｍのフマル酸アンモニウム濃度及び約７〜約９のｐＨを有する溶液を形成するステップ；（ｃ）前記調節された水溶液中のフマル酸ジアンモニウムをアスパラギン酸モノアンモニウムに酵素変換するステップ；（ｄ）前記アスパラギン酸モノアンモニウムを含む溶液を、少なくとも５０℃の高温で、少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体に接触させることにより酸性化するステップであって、アンモニウムイオンが前記溶液から前記カチオン交換体に移行するとともにプロトンが前記カチオン交換体から前記溶液に移行することにより前記溶液中にアスパラギン酸が形成されるステップ；（ｅ）前記アスパラギン酸を含む水溶液を前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体から分離するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）で形成された前記水溶液から周知の方法により前記アスパラギン酸を分離するステップ；（ｇ）アンモニア源を形成する方法で、前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体を少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体に再生するステップ；（ｈ）前記変換されたカチオン交換体を分離し、ステップ（ｄ）で再使用するステップ；及び（ｉ）前記アンモニア源を分離し、ステップ（ａ）で再使用するステップを含むアスパラギン酸の製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】結晶性アスパラギン酸の製造方法本発明は結晶性アスパラギン酸の製造方法に関する。アスパラギン酸は、分子式：ＨＯＯＣＣＨ₂ＣＨ（ＮＨ₃）ＣＯＯで表される酸性アミノ酸である。アスパラギン酸は、アスパルテーム（aspartame）甘味料のような製品及び生分解性ポリマーであるポリアスパラギン酸（ＰＡＡ）の形成に使用される。後者は洗浄剤中のコビルダーとして又は金属イオン封鎖剤として、他の用途で超吸収性ポリマーとして使用されているものである。ＰＡＡの生分解性は非常に魅力のあるものであり、潜在的市場規模は大きい。しかしながら、それは、安価なアスパラギン酸の入手可能性及びアスパラギン酸の汚染を生じない製造方法への利用可能性に強く依存する。アスパラギン酸は、例えば米国特許第３，１９８，７１２号明細書及び対応する英国特許第１，００４，２１８号明細書に開示されているように、フマル酸ジアンモニウムの酵素変換によって通常生産される。英国特許第１，００４，２１８号明細書には、シュードモナストリフォリ（Pseudomonas trifolii）をフマル酸及びフマレートからなる群から選ばれるフマル酸化合物とアンモニア及びアンモニウム塩からなる群から選ばれるアンモニア化合物と混合し、その結果得られた混合物をほぼ中性の条件に保つことによりＬ−アスパラギン酸を形成し、前記混合物からＬ−アスパラギン酸を回収することを含むＬ−アスパラギン酸の製造方法が記載されているとともにクレームされている。フマル酸ジアンモニウムは、通常、アンモニアとフマル酸を反応させて得られる生成物である。フマル酸はマレイン酸を変換して得られる生成物であり、マレイン酸は石油化学製品である。米国特許第３，３９１，０５９号明細書には、マレイン酸アンモニウムをアスパラギン酸（又はその塩）に直接変換することができる微生物を単離する方法が記載されている。米国特許第４，０１３，５０８号明細書には、２種の異なる微生物を利用する方法が記載されている。一方の微生物により炭化水素をフマル酸に変換し、そのフマル酸を次に他方の微生物によりアスパラギン酸に変換する。形成されるアスパラギン酸アンモニウムは、酵素、使用される栄養素、前記反応の生成物等に由来する種々の不純物を含む。現在のところ、化学量論的量の無機酸、例えば硫酸を添加することによりアスパラギン酸のほぼ等電点の範囲内のｐＨになるように酸性化して精製される。アスパラギン酸イオンは、両性イオン型のアスパラギン酸に変換され、両性イオン型のアスパラギン酸は溶液から沈澱する。この溶液は主構成成分として硫酸アンモニウムを含む。硫酸塩の存在によって、汚染物が共沈するために、沈澱生成物の純度が減少する。汚染物の共沈は高いイオン強度によって誘発される。また、硫酸塩の存在によって、溶液中のアスパラギン酸の溶解度が増加し、収率が減少する。この方法のもう１つの欠点は、アンモニア及び硫酸の消費と低級肥料としてのみ使用できる塩の形成（ほとんどの場合に、溶液からアスパラギン酸を晶出させるためにエネルギ一及び設備に関係する追加の費用がかかる）にある。 W.R．Graceに譲渡された米国特許第４，５６０，６５３号明細書及びMitsubis hiに譲渡された国際公開第ＷＯ９６１７９５０号公報には、フマレートイオンを含む基質をアスパルターゼの存在下で反応させるＬ−アスパラギン酸の製造方法であって、無水マレイン酸、マレイン酸又はその塩の添加によってフマレートイオンを含む基質を前記アスパルターゼ又はアスパルターゼを生産する微生物に接触させることから生じる水溶液のｐＨを約３〜４に減少させ、上澄み相にマレイン酸をとどめたままＬ−アスパラギン酸を不溶性にすること、不溶性Ｌ−アスパラギン酸を除去すること、上澄み相中のマレイン酸をフマル酸に異性化させること、上澄み相のｐＨを約８〜９に調節すること、及び上澄み相をアスパルターゼ又はアスパルターゼを生産する微生物に接触させることを改良点とする方法がクレームされている。この思想にさらに改良を加えたものが米国特許第５，５４１，０９０号明細書に提案されている。アスパラギン酸アンモニウム溶液の酸性化において形成されるマレイン酸アンモニウムはアスパラギン酸アンモニウムに直接的に生物学的に変換される。すなわち、前記特許明細書には、（１）（Ａ）マレエートイソメラーゼ活性及びアスパルターゼ活性を有する酵素含有物質又は（Ｂ）マレエートイソメラーゼ活性を有する酵素含有物質及びアスパルターゼ活性を有する酵素含有物質と、マレイン酸及びアンモニア及び／又はマレイン酸アンモニウムを含む基質含有溶液とを接触させてＬ−アスパラギン酸を形成するステップ；及び（２）無水マレイン酸及び／又はマレイン酸を反応溶液に加えてＬ−アスパラギン酸を結晶化させることを特徴とする、反応溶液からＬ−アスパラギン酸を回収するステップ；並びに（３）アンモニアを添加することにより基質溶液として母液を回収するステップを含むＬ−アスパラギン酸の製造方法が記載及びクレームされている。米国特許第４，５６０，６５３号及び第５，５４１，０９０号明細書並びに国際公開第ＷＯ９６１７９５０号公報に記載されている方法は、マレイン酸による酸性化を通じて、アンモニアと硫酸の消費に関わる問題及び硫酸アンモニウムのはけ口を見いだすことに関わる問題を解消するものであるが、他の欠点がある。アスパラギン酸は依然としてイオン強度が高い溶液から沈澱し、その純度に悪影響を及ぼす。結晶中にマレイン酸も存在することが確認されている。アスパラギン酸は母液中に残留する。そのような酸性化の際に母液中で形成されたマレイン酸アンモニウムがフマル酸アンモニウムに完全に変換されないかぎりマレイン酸はなくならず再循環される。しかしながら、この場合には、フマレートのアスパルテートへの生物学的変換から生じる不純物のためのはけ口がないために、マレエート及び他の供給源からフマレートへの化学変換を行うことができない。それらの不純物の排除は、母液からの著しいブリードは避けがたく、生成物及び試薬の損失を伴う。さらに、アスパラギン酸を著しく高い濃度で含む溶液の再循環は、フマレートのアスパルテートへの生物学的変換を阻害しうる。他の特許明細書、例えばヨーロッパ特許出願公開第５８８，６７４号明細書及び米国特許第５，４８８，１５５号明細書には、フマル酸によりアスパラギン酸アンモニウム溶液を酸性化してアスパラギン酸を沈澱させ、フマル酸アンモニウムを形成させることが提案されている。より最近の特許、すなわち米国特許第５，５３０，１６０号では、フマル酸がアルコール溶液で加えられる。すなわち、この特許明細書には、加えられるフマル酸と存在するアスパラギン酸アンモニウムのモル比が０．０５〜０．８程度になるようにフマル酸のアルコール溶液を使用してアスパラギン酸アンモニウムを処理することを含むＬ−アスパラギン酸の製造方法が記載及びクレームされている。前記アルコール溶液はその重量の１〜１５重量％程度のフマル酸を含む。アスパラギン酸アンモニウム溶液にマレイン酸の代わりにフマル酸を加えることによって、費用を抑え、溶液中でマレエートをフマレートに変換することに関係する汚染が回避される。その溶液はフマレートのアスパルテートへの変換にかけられる。しかしながら、生成物の純度、損失に関係する他の難題及び再循環されたアスパラギン酸による生物学的変換の減速に関係する他の難題は全く解決されない。これらの難題に加え、これらの特許発明には共通の欠点がある。効率的であるためには、これらの特許発明は酸性型にあり且つ比較的純粋な形態にあるフマル酸又はマレイン酸の使用を必要とする。この必要性は、これらの酸が石油化学プロセスに由来するものである限り問題にならないが、発酵ルートでは実際的に不可能である。フマル酸は過去に発酵により生産された。カルシウム塩基、たいてい炭酸カルシウムが発酵において中和剤として使用された（フマル酸カルシウムが生じる）。硫酸を用いる酸性化により石膏及びフマル酸を形成させて前記塩からフマル酸が回収される。この方法には多くの難題がある。それらのうちの幾つかは、中和剤、発酵生成物、フマル酸カルシウム、最終生成物、フマル酸及び副生成物である石膏は全て水への溶解度が低く、その低い溶解度が試薬、生成物及び副生成物の分離並びにそれらとバイオマスとの分離を妨げるということに由来する。もう１つの問題は石灰と硫酸の消費及び処理されるべき石膏の形成に由来する。これら及び他の重大な欠点、例えば発酵における比較的低い収率及び比較的低い生産性は、発酵により生産されるフマル酸を、石油化学的に生産されるフマル酸よりも高価なものにする。発酵ルートは４０年代に廃れた。さらに、発酵ルートには不純物に関係する重大な問題がある。フマル酸は、従来技術によると、発酵において形成される酸のわずかに約８０％を構成する。典型的には、発酵において、リンゴ酸、コハク酸及びα−ケトグルタル酸並びにグリセロールも形成される。さらに、発酵において形成される液体は利用されなかった炭水化物、加えられた栄養素に由来する無機アニオン及びカチオン、アミノ酸、タンパク質、バイオマス等を含む。この発酵において、前述の通りの試薬及び生成物の低い溶解度に関係する難題を考慮すると、これらの不純物の多くがフマレートの酵素変換（生物学的変換とも呼ばれる）及び最終的にアスパラギン酸アンモニウムなるまで同伴することが予測されるであろう。これらは、生物学的変換により形成されたアスパラギン酸アンモニウムからのアスパラギン酸の結晶化に関係する困難性をよりいっそう増加させる。この現在の技術水準に留意すると、無機酸を消費せず、アンモニア有用物の実質的な減少なしに、そして副生成物の塩が著しい量で形成することなく、純粋な形態のアスパラギン酸を高収率で回収できることを発見したのは驚くべきことである。さらに、フマレート有用物が炭水化物の発酵から生成する方法でそれを達成できることを驚くべきことに発見した。すなわち、本発明によると、（ａ）フマル酸ジアンモニウム１モル当たり約２モルのアンモニア源を使用してフマル酸ジアンモニウムを含む水溶液を形成するステップであって、前記アンモニア源の一部がこの方法の１つのステップから再循環されるステップ；（ｂ）この方法の１つのステップを通じて得られるフマル酸ジアンモニウムを含む水溶液の組成を調節して約０．５Ｍ〜約２Ｍのフマル酸アンモニウム濃度及び約７〜約９のｐＨを有する溶液を形成するステップ；（ｃ）前記調節された水溶液中のフマル酸ジアンモニウムをアスパラギン酸モノアンモニウムに酵素変換するステップ；（ｄ）前記アスパラギン酸モノアンモニウムを含む溶液を、少なくとも５０℃の高温で、少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体に接触させることにより酸性化するステップであって、アンモニウムイオンが前記溶液から前記カチオン交換体に移行するとともにプロトンが前記カチオン交換体から前記溶液に移行することにより前記溶液中にアスパラギン酸が形成されるステップ；（ｅ）前記アスパラギン酸を含む水溶液を前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体から分離するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）で形成された前記水溶液から周知の方法により前記アスパラギン酸を分離するステップ；（ｇ）アンモニア源を形成する方法で、前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体を少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体に再生するステップ；（ｈ）前記変換されたカチオン交換体を分離し、ステップ（ｄ）で再使用するステップ；及び（ｉ）前記アンモニア源を分離し、ステップ（ａ）で再使用するステップを含むアスパラギン酸の製造方法が提供される。好ましくは前記アンモニア源はアンモニア、炭酸アンモニウム及び炭酸水素アンモニウムからなる群から選ばれる。本発明の好ましい態様において、フマル酸ジアンモニウムを含む前記水溶液は発酵により形成され、ステップ（ａ）における前記形成用の原料は前記フマル酸ジアンモニウムを製造するための原料として使用される炭化水素である。最初のステップにおいて、炭水化物を含む媒体がフマル酸を生産する微生物により発酵される。炭水化物の前記発酵は典型的にはムコラレス（Mucorales）、特にリゾプスアリッツァス（Rhizopus arrhizus）、リゾプスオリザック（Rhizopus oryz ac）、リゾプスニグリカンス（Rhizopus nigricans）又は他の関連する属に属する微生物を使用する。カンジダ（Candida）のような他の微生物が代わりに使用されてもよい。発酵媒体は、炭水化物に加えて窒素源及び無機物のような栄養素を含む場合がある。適切な窒素源には、尿素、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、アスパラギン酸加水分解物及びタンパク質加水分解物が包含される。これらの中で、尿素及び硫酸アンモニウムが好ましい。培地に加えられる無機塩には、ホスフェート、硫黄、鉄、マグネシウム及び亜鉛の供給源が包含される。ホスフェートの適切な供給源には、一塩基性若しくは二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性若しくは二塩基性リン酸カリウム、リン酸水素アンモニウム、又はこれらの混合物が包含される。発酵に使用される適切な無機塩には、硫酸亜鉛、酒石酸鉄（III）若しくは塩化鉄（III）のような鉄塩、及び硫酸マグネシウムが包含される。ビタミン供給源としてトウモロコシ抽出液又はビオチンを加えてよい。発酵は約２５℃〜約３５℃、好ましくは約３３℃〜約３５℃の温度で行われる。本発明の特に好ましい態様において、（ａ）フマル酸を生産する微生物により炭水化物を含む媒体を発酵させることによってフマレート含有発酵液を形成するステップ；（ｂ）この方法の１つのステップを通じて得られるフマル酸ジアンモニウムを含む水溶液の組成を調節して約０．５Ｍ〜約２Ｍのフマル酸アンモニウム濃度及び約７〜約９のｐＨを有する溶液を形成するステップ；（ｃ）フマル酸ジアンモニウムをアスパラギン酸モノアンモニウムに酵素変換するステップ；（ｄ）前記アスパラギン酸モノアンモニウムを含む溶液を、少なくとも５０℃の高温で、少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体に接触させることにより酸性化するステップであって、アンモニウムアニオンが前記溶液から前記カチオン交換体に移行するとともにプロトンが前記カチオン交換体から前記溶液に移行することにより前記溶液中にアスパラギン酸が形成されるステップ；（ｅ）前記アスパラギン酸を含む水溶液を前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体から分離するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）で形成された前記水溶液から周知の方法により前記アスパラギン酸を分離するステップ；（ｇ）この方法の１つのステップを通じて得られるフマル酸モノアンモニウム、フマル酸又はそれらの混合物の水溶液により前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体を再生するステップであって、プロトンが前記溶液から前記カチオン交換体に移行するとともにアンモニウムイオンが前記カチオン交換体から前記溶液に移行して前記溶液中にフマル酸ジアンモニウムが形成されるステップ；（ｈ）少なくとも部分的にその酸性型にあるステップ（ｇ）から得られる前記カチオン交換体を分離してステップ（ｄ）で再使用するステップ；及び（ｉ）ステップ（ｇ）から得られる前記フマル酸ジアンモニウムを分解させてフマル酸モノアンモニウム、フマル酸又はそれらの混合物を形成するとともにアンモニア源を形成し、前記分解生成物を再使用するステップ；を含む先に規定したような方法が提供される。菌類は酸性条件中で十分に成長する。しかしながら、発酵媒体中でのフマル酸の形成が発酵に負の影響を及ぼすために、発酵は典型的にはｐＨがおよそ４〜７のわずかに酸性のｐＨで行われる。典型的には、中和剤として塩基が直接加えられ、フマル酸塩が形成される。酸性塩というよりもむしろフマル酸の中性塩が形成される。アンモニア並びにアンモニウム、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩又は炭酸水素塩からなる群から前記中和剤を選ぶことができる。中和剤として炭酸カルシウムが使用され、フマル酸カルシウムが形成されることが最も好ましい。本発明の好ましい態様において、炭水化物は、低級小麦スターチフラクション及び糖蜜等の、デキストロース、好ましくはシリアルスターチから生産されたデキストロースから選ばれる。代わりに、フマル酸は、例えば水に不混和性の液体又は固体塩基性抽出剤若しくは吸着剤への結合により、発酵媒体から連続的に除去される。その目的のために、塩基性抽出剤、例えば長鎖アミンを含む種類の塩基性抽出剤、又は非第４級アミン官能基を有するアニオン交換体又はピリジン系樹脂のような塩基性樹脂を使用することができる。アニオン交換体が比較的強いものであることが好ましく、５よりも大きいｐＫａを有するものであることが最も好ましい。フマル酸は、塩基を消費してフマル酸塩を形成する塩基性溶液との接触により前記抽出剤又は吸着剤から回収することができる。この塩基の使用は、以下で間接的中和と呼ぶ。これは塩基を前記発酵において中和剤として直接的又は間接的に使用できることから理解されるであろう。その目的のための塩基は、アンモニア並びにアンモニウム、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩及び炭酸水素塩から選ばれることが好ましい。この塩基がアンモニアであることが最も好ましい。フマル酸アンモニウムはアスパラギン酸アンモニウムに酵素変換される。通常、この変換はフマル酸ジアンモニウムが基質であるためにわずかに酸性の媒体中で行われる。発酵において形成されるフマル酸アンモニウムは前記酵素変換に送られる（フマル酸アンモニウムなる用語は、ここで使用する場合に、特に断らない限り、フマル酸モノアンモニウム、フマル酸ジアンモニウム、又はこれらの組み合わせを意味する）。炭酸カルシウムが中和剤であり且つフマル酸カルシウムが生成物である好ましい態様の場合におけるように発酵によって他のフマル酸塩が生成する場合において、この塩はフマル酸アンモニウムに変換される。これは、アンモニア、炭酸アンモニウム又は炭酸水素アンモニウムを用いる直接反応又は間接反応により実施されることが好ましい。最も好ましい態様はイスラエル国特許第１１６，８４９号明細書に記載されており、その教示は引用によりここに含まれていることにする。発酵において沈澱したフマル酸カルシウムは発酵液から分離され、洗浄され、水に懸濁されるか又は前のステップからの水溶液に懸濁され、高温で溶解される。フマル酸カルシウム溶液は、必要であれば、膜濾過、イオン交換、活性炭処理、溶剤抽出等のような方法により精製することができる。次に、フマル酸カルシウムが再結晶化されることが好ましい。再結晶化の後、フマル酸カルシウムを、アンモニアとＣＯ₂又は炭酸アンモニウム若しくは炭酸水素アンモニウム又はそれらの混合物と反応させる。反応媒体のｐＨがまず約１０〜１１に調節されることが好ましい。高温及び高いＣＯ₂圧力は必要ではない。反応においてフマル酸カルシウムはフマル酸アンモニウムに変換される。その反応における水の量は、形成されるフマル酸アンモニウムが十分に、好ましくは１０％よりも高い濃度に、さらに好ましくは１３％よりも高い濃度に濃縮されるように調節される。炭酸カルシウムは副生成物として形成され、フマル酸アンモニウム溶液から分離され、炭水化物のフマル酸への発酵において中和剤として再使用される。炭酸カルシウムを発酵への再循環前に焼成してその中に残留したバイオマスを除去することが好ましい。最も好ましい態様において、焼成されたカルシウム塩基は水中でクエンチされ、再使用するまでそのまま水に懸濁させておく。この水への懸濁は、バイオマスを燃焼することによって生じる灰及び先の発酵ステップからの残留する他の灰を除去することに役立つ。好ましい態様において、発酵において直接形成されたフマル酸アンモニウム又は発酵においてその他のフマル酸塩の変換を通じて間接的に形成されたフマル酸アンモニウムはアスパラギン酸アンモニウムへの酵素変換前に精製される。精製は、再結晶化、膜濾過、イオン交換、活性炭処理、溶剤抽出等のような周知の方法で実施することができる。もう１つの好ましい態様において、フマル酸アンモニウムは、フマル酸カルシウムを形成するカルシウム化合物との反応を通じて精製される。所望であれば、前記フマル酸カルシウムは、他の周知の手段により再結晶化及び精製される。次に、フマル酸カルシウムは前述の手段によりフマル酸アンモニウムに変換される。さらに好ましい態様において、前記カルシウム化合物は、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム及び炭酸水素カルシウムからなる群から選ばれるカルシウム塩基である。最も好ましい態様において、前記カルシウム塩基は、フマル酸カルシウムのフマル酸アンモニムへの変換から再循環された炭酸カルシウムから得られるものである。前述のように、フマル酸アンモニウムは酵素的に触媒される反応でアスパラギン酸アンモニウムに変換される。典型的には、アスパラギン酸アンモニウムのほとんどはアスパラギン酸モノアンモニウムであるが、少量のフラクションがアスパラギン酸ジアンモニウムの形態をとる場合がある。アスパラギン酸アンモニウムなる用語は、ここで使用する場合に、特に断らない限り、アスパラギン酸モノアンモニウム及びそれとアスパラギン酸ジアンモニウムとの混合物の両方を意味する。酵素反応は酵素アスパルターゼにより触媒される。この酵素は、適切な培地で培養された多くの微生物、例えば大腸菌（E.coli）、ブレビバクテリウム属の菌種（Brevibacterium sp）、シュードモナス属の菌種（Pseudomonas sp）から生産することができる。アスパラギン酸アンモニウムの形成は、フマル酸アンモニウム溶液を細菌培養液又は透過性冗進細胞、細胞粗抽出液若しくは精製されたアスパルターゼに直接接触させることにより得ることができる。細菌培養液を直接使用する場合には、フランス特許出願公開第２，１９７，９７９号明細書（１９７２年）に記載されている方法を用いることができる。細胞培養液、細胞、細胞抽出物又は酵素自体を直接使用するか又は固定化された調製物として使用できる。固定化された調製物の例は、細胞、細胞抽出物又は酵素を支持体、担体又は塩基、例えばポリアクリルアミドゲル、硫黄含有多糖（例えばカラゲーナン、フルセララン等）、ゲル、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ポリビニルアルコールゲル、寒天ゲル、樹脂等に固定化することにより得られる。変換に送られる供給物中のフマル酸アンモニウム濃度は典型的には約０．５Ｍ〜約２Ｍである。酵素の安定性を向上させるために、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、ストロンチウムイオン等のような二価金属イオンを加えることが通常好ましい。二価金属イオンの量は約０．１〜１０ｍＭである。反応は約２０℃〜６０℃の温度及び好ましくは７〜９の間のｐＨで実施される。変換の収率は典型的には９０％〜１００％である。アスパラギン酸のｐＫａは１．８８、３．６５及び９．６０であり、その等電点（ｐＩ）は２．７７である。変換で得られるアスパルテート含有溶液はほぼ中性であるか又はほんのわずかに塩基性である。これらの条件では、両方のカルボン酸官能基が負電荷を帯びる。それらのうちの１つは正電荷を帯びたアンモニウム基で釣り合いがとれ、もう一方はほとんどの場合にカチオンであるアンモニウムにより釣り合いがとれる。カチオン交換体との接触を通じて溶液は酸性化され、それらの官能基は少なくとも部分的にブロトン型をとる。接触によりカチオン交換が起こり、溶液に由来するカチオンが吸着され、プロトンがカチオン交換体から溶液に移行し、そのｐＨが低下する。これらのプロトンはアスパルテート上のカルボン酸基のうちの少なくとも１つと反応し（３．６５のｐＫａに関係するほうの反応）、両性イオンを形成する。両性イオンの形態にあるアスパラギン酸の溶解度は低く、カチオン交換体でのその再結晶化は樹脂を損傷しその作用を妨害する場合がある。温度を上昇させることが常にこの問題を解決するとは限らない。第１に、樹脂の熱安定性により限界があり、第２に、樹脂の細孔内の条件は独立した溶液中の条件と異なる。従って、特開平６−１７３４６号公報によると、グルタミン酸を含む溶液をカチオン交換樹脂に接触させる場合には、そのような結晶化を妨げるために尿素を加える。本発明に係る方法の場合には、樹脂中でのアスパラギン酸の結晶化から著しい問題を生じさせずに、カチオン交換体による酸性化を実施することができる。酸性化された溶液を、アンモニウムイオンを有するカチオン交換体から分離し、カチオン交換体を酸性溶液との接触で再生する。分離は、酸性化ステップの温度よりもかなり低い温度に溶液を冷却することなく実施されることが好ましい。アスパラギン酸は、周知の方法によりカチオン交換体との接触で形成されたアスパラギン酸含有水溶液から分離される。好ましくは、この分離は結晶化により、例えば冷却及び／又は水の蒸発又は溶剤の添加により実施される。本発明の方法は、追加のステップによって、母液からアスパラギン酸を高い収率で回収する可能性を与える。この母液を強酸カチオン交換体に接触させる際に、アスパラギン酸はカチオン交換体から新たにプロトンを得て、カチオン型に変換する。そのようにしてアスパラギン酸は母液から出る。従って、好ましい態様において、その酸性型にある強酸カチオン交換体をアスパラギン酸結晶化の母液に接触させる。母液中に含まれるアスパラギン酸は吸着される。このステップから得られるアスパラギン酸を有するカチオン交換体を、変換ステップで得られたアスパラギン酸塩の溶液に接触させる。その結果、アスパラギン酸塩のカチオンが樹脂に結合し、次いで、吸着されたアスパラギン酸は溶液中に遊離する。遊離したアスパラギン酸は分離され、アスパラギン酸結晶化又はさらなる酸性化に送られ、カチオン交換体は再生用酸性溶液により再生される。前記酸性溶液は、フマル酸、フマル酸モノアンモニウム及びそれらの混合物からなる群から選ばれる溶質を好ましくは含む。より好ましくは、前記溶液は本発明の方法の他のステップで得られる。現在の工業的方法におけるような損失又は米国特許第４，５６０，６５３号、第５，５４１，０９０号、第５，４８８，１５５号及び第５，５３０，１６０号明細書；ヨーロッパ特許出願公開第５８８，６７４号明細書並びに国際出願公開第９６１７９５０号公報に示唆されているようなアスパラギン酸の変換反応への望ましくない再循環が避けされる。その結果、結晶化における条件を無理に最大収率になるようにする必要はない。生成物の収率が最大になるように条件を調節することができる。さらに、媒体中での酵素のより高い安定性及び／又は反応性が好ましい場合には、全体的回収率を低下させることなく、必要であれば、生体変換ステップを比較的低い塩濃度でおこなってもよい。弱酸カチオン交換体と強酸カチオン交換体を順次使用することがある状況において好ましい場合がある。その場合に、生物学的変換反応において得られたアスパラギン酸塩を含む水溶液をまず弱酸カチオン交換体に接触させ、母液との接触により生じた溶液を強酸カチオン交換体に接触させる。その接触において得られる水溶液はアスパラギン酸結晶化に送られる。樹脂の再生は次の順序で行われる：再生用酸性溶液をまず強酸カチオン交換体に接触させ、次に弱酸カチオン交換体に接触させる。この手法では、過剰の再生用の酸性溶液は必要でない。得られる独立した母液は、種々の供給源に由来する不純物の大部分を含む。母液は実質的にアスパラギン酸を含まないために、アスパラギン酸を（直接的又は間接的に）酵素変換に再循環させる必要はない。従って、系中での不純物の再循環及びそれらの形成が妨げられる。アスパラギン酸アンモニウムの酸性化ステップにおいて形成されたアンモニウムイオンを有するカチオン交換体は、再使用のためにその少なくとも部分的にその酸性型に再生される。その方法ではアンモニア源が形成される。アンモニア源は、アンモニア、炭酸アンモニウム及び炭酸水素アンモニウムからなる群から選ばれる。無機酸の酸性又は中性アンモニウム塩を形成する再生方法が好ましいことに回避される。従って、硫酸のような強い無機酸による処理で、前記酸の中性アンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウムが形成される。発酵における少量は別として、硫酸アンモニウムは望ましくなく、避けられるか又は制限されるべきである。好ましい態様において、アンモニウムイオンを有するカチオン交換体は試薬としてのＣＯ₂により好ましくは加圧下で処理される。炭酸アンモニウム若しくは炭酸水素アンモニウム又はそれらの混合物の溶液を再使用のためのアンモニア源として形成する。そのような溶液はそのままで再使用されるか又は濃縮若しくは蒸留のような処理の後に再使用される。前記蒸留によって、アンモニア又はＣＯ₂ とのアンモニア混合物が形成され、場合によっては水蒸気も発生する。これらは次にアンモニア源として使用される。アスパラギン酸アンモニウムを酸性化するために使用されるカチオン交換体は好ましくは弱酸性であるか又は中間の酸性を有する。強酸カチオン交換体、例えばスルホネート型の強酸カチオン交換体は、変換されてそれらの部分的酸性形態に戻ることが比較的強い酸を必要とするため、避けられることが好ましい。また、本発明の好ましい態様のうちの１つの態様によると、フマル酸が形成される。この目的のため及び母液の結晶化からアスパラギン酸を回収するために使用される強酸カチオンの再生のためにこのフマル酸を使用することができる。代わりに、カチオン交換体を再生するための試薬としてのＣＯ₂の使用に対して、フマル酸モノアンモニウム、フマル酸又はそれらの混合物を含む溶液を使用することによってプロトンを前記溶液からカチオン交換体に移行させるとともにアンモニウムイオンを前記カチオン交換体から前記溶液に移行させてその溶液中にフマル酸ジアンモニウムを形成することができる。前記アンモニウムを有するカチオン交換体の再生用のフマル酸モノアンモニウム、フマル酸又はそれらの混合物は、アンモニア塩基も形成する方法でフマル酸ジアンモニウムを分解させることにより得られる。好ましい態様によると、発酵により得られるフマル酸ジアンモニウムを分解させる。もう１つの好ましい態様によると、前記再生ステップで形成されるフマル酸ジアンモニウムを分解させる。１つの好ましい態様によると、発酵により得られるフマル酸ジアンモニウムを、調節した後、酵素変換に送る。もう１つの好ましい態様によると、前記再生ステップで形成されるフマル酸ジアンモニウムを、調節した後に、酵素変換に送る。前記調節は、濃度及びｐＨ並びに必要な場合に添加される成分、例えば二価金属塩を酵素変換ステップで調節するようなステップからなる。そのような調節は、再結晶化、膜濾過、膜透析又は電気透析、イオン交換、活性炭処理、溶剤抽出等のような周知の方法による生成ステップからなっていてもよい。好ましい態様において、フマル酸モノアンモニウム及びアンモニウム塩への前記分解は精製手段としての役割を果たす。フマル酸モノアンモニウムはかなり純粋な形態で溶液から晶出する。このフマル酸モノアンモニウムは、必要であれば、例えば再結晶化によりさらに精製される。さらに好ましい態様において、この精製されたフマル酸モノアンモニウムはアンモニウムイオンを有するカチオン交換体との接触によりフマル酸ジアンモニウムに変換される。例えば、フマル酸ジアンモニウムはアスパラギン酸アンモニウムの酸性化により形成され、洗浄後、形成されたフマル酸ジアンモニウム溶液は、調節後に、酵素変換に送られる。もう１つの好ましい態様において、フマル酸アンモニウムはカルシウム化合物との反応を通じて精製される。その反応でフマル酸カルシウムが生成する。前記フマル酸カルシウムは結晶化され、所望であれば、周知の方法で再結晶化及び精製される。次に、前記フマル酸カルシウムは、前述の手段により変換されてフマル酸アンモニウムに戻る。さらに好ましい態様において、カルシウム化合物は、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム及び炭酸水素カルシウムからなる群から選ばれるカルシウム塩基である。最も好ましい態様において、前記カルシウム塩基は、フマル酸アンモニウムへのフマル酸カルシウムの変換から再循環された炭酸カルシウムから得られるものである。フマル酸ジアンモニウムの前記分解は、（Ｉ）電気透析による水の分割；（II）ＣＯ₂圧力下で抽出剤に接触させることによりフマル酸を抽出する方法；（III）少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体との接触による酸性化によって、アンモニウムイオンを前記溶液から前記カチオン交換体に移行させてアンモニウムイオンを有するカチオン交換体を形成させるとともにプロトンを前記カチオン交換体から前記溶液に移行させてフマル酸モノアンモニウムをその溶液中で形成させる方法；及び（IV）熱分解；からなる群から選ばれる少なくとも１つの方法により実施されることが好ましい。電気透析による水の分割は、バイポーラ膜（bipolar membranes）等の帯電膜を含む装置及び駆動力として電気的エネルギーを利用することにより達成される。フマル酸ジアンモニウムはアンモニア及びフマル酸及び／又はフマル酸モノアンモニウムに分割されうる。アンモニアは比較的濃縮された溶液として得られ、そのままで又は蒸留後にアンモニア源として使用することができる。ほとんどの場合において、フマル酸モノアンモニウムは、その高い溶解度に帰因してバイポーラ膜の動作を阻害する結晶が発生する恐れがないために、他の生成物としては好ましいものである。ＣＯ₂加圧下でフマル酸ジアンモニウム水溶液を適切な水に不混和性の塩基に接触させることによって、前記塩基へのフマル酸の結合形成が起こり、炭酸アンモニウム又は炭酸水素アンモニウムが形成される。そのような水に不混和性の塩基は、抽出剤及び塩基性固体吸着剤からなる群から選ばれる。適切な抽出剤は、全炭素数が少なくとも１８である高分子量アミンを含む。脂肪族の第２級又は第３級アミンであるものが好ましい。アミンは溶剤又は溶剤混合物に溶解される。そのような溶剤が抽出促進剤として作用するアルカノールを含むことが好ましい。塩基性固体吸着剤は、非第４級アミン基を有するアニオン交換体又はピリジン系樹脂である。結合したフマル酸は、高温、好ましくはほぼ１００ ℃又は１００℃よりも高い温度での水洗によりストリップすることができる。比較的強い水に不混和性の塩基の場合には、結合した酸の完全なストリッピングは大容量の水を必要とし、結局、稀フマル酸溶液となる。代わりに、フマル酸を担持した塩基をフマル酸ジアンモニウム水溶液でストリップする。フマル酸は前記溶液に移行してその中でフマル酸モノアンモニウムを形成する。好ましい態様において、フマル酸モノアンモニウムは形成された溶液から晶出し、残りの溶液を再使用してフマル酸ジアンモニウムを含むストリッピング溶液を形成する。もう１つの好ましい態様において、ＣＯ₂中での接触並びに水及び／又はフマル酸ジアンモニウム水溶液によるストリッピングは向流モードで実施される。さらに好ましい態様において、結合したフマル酸の一部は水によりストリップされ、次に結合したフマル酸の他の一部がフマル酸ジアンモニウム水溶液によりストリップされる。代わりに、フマル酸ジアンモニウム水溶液を、少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体に接触させることにより酸性化する。アンモニウムイオンは前記水溶液からカチオン交換体に移行し、プロトンは前記カチオン交換体から溶液に移行してその中でフマル酸モノアンモニウムを形成する。アンモニウムイオンを有するカチオン交換体から溶液が分離され、カチオン交換体は、好ましくはまず水又は水溶液で洗浄した後に、少なくとも部分的に酸性型に変換される。好ましくはこの再生はＣＯ₂加圧下にある水により達成される。炭酸水素アンモニウム、炭酸アンモニウム又はそれらの混合物を含む水溶液を形成し、次にアンモニア源として使用する。好ましい態様において、前記分離された水溶液は、それからフマル酸モノアンモニウムを調製するために好ましくは結晶化により処理される。残りの溶液はアンモニア源及びフマル酸アンモニウム又はフマル酸へのさらなる分解のためにフマル酸ジアンモニウム水溶液を再構成することに好ましくは使用される。もう１つの代替手法において、フマル酸ジアンモニウムはアンモニア及びフマル酸ジアンモニウムに熱分解される。固体フマル酸ジアンモニウム又はその溶液の１００℃より高い温度、より好ましくは１５０℃より高い温度への加熱によって、アンモニアが気相に移行し、フマル酸ジアンモニウムの少なくとも一部がフマル酸モノアンモニウムに変換される。前記アンモニアは回収され、アンモニア源として使用される。好ましい態様において、前記フマル酸モノアンモニウムは分解生成物から好ましくは結晶化により分離される。分解生成物の残りは、アンモニア源及びフマル酸モノアンモニウム又はフマル酸へのさらなる分解のためのフマル酸ジアンモニウム供給物を再構成するために使用されることが好ましい。フマル酸ジアンモニウムを酸性化するために使用されるカチオン交換体は、弱酸又は中間の酸強度を示すカチオン交換体からなる群から選ばれる。アスパラギン酸アンモニウムの酸性化に使用されるものと同じカチオン交換体であっても同様な酸性度を有するカチオン交換体であってもよい。フマル酸ジアンモニウムを酸性化するために使用されるカチオン交換体は酸性度が若干低いほうが好ましい。好ましい態様において、フマル酸ジアンモニウムの分解により形成されたフマル酸モノアンモニウムを含む水溶液を、適切な水に不混和性の塩基に接触させる。この接触によって、フマル酸が水に不混和性の塩基に結合するためにフマル酸ジアンモニウムの不均化が起こり、フマル酸モノアンモニウムはフマル酸ジアンモニウムに変換される。そのような水に不混和性の塩基は抽出剤及び塩基性固体吸着剤からなる群から選ばれる。適切な抽出剤は、全炭素数が少なくとも１８である高分子量アミンを含む。脂肪族の第２級又は第１級アミンであるものが好ましい。アミンが溶剤又は溶剤混合物に溶解される。そのような溶剤が抽出促進剤として作用するアルカノールを含むことが好ましい。塩基性固体吸着剤は、非第４級アミン基を有するアニオン交換体又はピリジン系樹脂である。水に不混和性の塩基はＣＯ₂加圧下でのフマル酸ジアンモニウムの分解に使用されるものと同様なものであっても同様な塩基性を有するものであってもよい。塩基性が若干低いものが好ましい。結合したフマル酸は、高温、好ましくはほぼ１００℃又は１００℃よりも高い温度での水洗によりストリップすることができる。代わりに、前述のような水によるストリッピングとフマル酸ジアンモニウム溶液によるストリッピングの組み合わせを行うことができる。好ましい態様において、フマル酸モノアンモニウムとの接触及び水によるストリッピングは向流モードで実施される。従って、電気透析による水の分割、ＣＯ₂加圧下での水に不混和性の塩基との接触、熱分解、及び少なくとも部分的に酸性型にあるカチオン交換体との接触による酸性化は、フマル酸ジアンモニウムのアンモニウム源、フマル酸、フマル酸モノアンモニウム又はそれらの組み合わせへの分解をもたらす。前記アンモニウム源はアンモニア、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム又はそれらの組み合わせである。アンモニア源は発酵において中和剤として又は前記発酵において形成されるフマレートをフマル酸アンモニウムに変換させるために使用される。フマル酸アンモニウム又はフマル酸は、アスパラギン酸アンモニウムの酸性化において形成されるアンモニウムイオンを有するカチオン交換体を再生するために又はアスパラギン酸を結晶化させる再に形成される母液からアスパラギン酸を回収するために使用される。フマル酸モノアンモニウムが形成されるこれらの場合において、フマル酸モノアンモニウムを含む溶液からそれを晶出させることが好ましく、精製のために再結晶化させることがより好ましい。本発明の特徴がより完全に理解されその真価が認められるように以下の例において特定の好ましい態様に関連して本発明を説明するが、これらの特定の態様に本発明を限定することを意図したものではない。それどころか、請求の範囲により規定されるような本発明の範囲に含まれるであろう全ての代替態様、変更及び等価物を包含することを意図したものである。従って、好ましい態様を含む以下の例は、本発明の実施化を例示することに役立つであろうし、示されている詳細はたんに例示のため及び本発明の好ましい態様の例示的説明のためのものであって、本発明の系統的手順並びに原理及び概念的性質を説明するのに最も有用であり容易に理解されるであろうと考えられることを示すためのものである。例１５ｋｇの発酵培養液を分析し、３２９ｇ（２．８４モル）のフマレート、３９．５ｇ（０．２９モル）のマレエート、２４ｇ（０．２０モル）のスクシネート、２０．５ｇ（０．１４モル）のα−ケトグルタレート及び７６．５ｇ（0．８３モル）のグリセロールが含まれることを確認した。培養液を濾過し、固形物を水で洗浄すると、２８３ｇ（２．４４モル）のフマレート、４．２ｇ（０．０３１モル）のマレエート、８．８ｇ（０．０７４モル）のスクシネート、９ｇ未満（０．０６２モル未満）のα−ケトグルタレート及び３ｇ未満（０．０３２モル未満）のグリセロールを含む１．４２ｋｇのウェットケークが形成された。この１．４２ｋｇのウェットケークを３０℃の脱イオン水１．５ｋｇに懸濁させ、３３％アンモニア溶液３４４ｇを加えた。ｐＨが８．７になるまでこの懸濁液にガス状ＣＯ₂をバブリングした。周囲温度に冷却後、懸濁液を濾過し、ケークを１．２ｋｇの水で洗浄した。洗浄水を濾液と混ぜ合わせた。混ぜ合わせた溶液の組成は、フマレートが２５７ｇ（２．２１モル)(変換率＞９０％）、マレエート２．２ｇ（０．０１６モル）、スクシネート８．２ｇ（０．０６９モル）、 α−ケトグルタレート０．４ｇ（０．００３モル）、カルシウム０．１８ｇ（０．００４５モル）及びアンモニア９０ｇ（５モル）であった。これらの結果は、フマレートの実質的な精製を伴って高変換率を達成できることを示すものである。全発酵生成物におけるフマレートの割合は６７％から、培養液では生成物であるフマル酸アンモニウムの形態で９６％に増加した。例２１．７４Ｍの（ＮＨ₄）₂Ｆｕを含む水溶液２１．８ｇを１．３７ｇの弱酸カチオン交換体(WACE)HP336（酸性型にあるもの）と８５℃で３時間震盪した。樹脂を分離し、残った水溶液を分析した。もとの（ＮＨ₄）₂Ｆｕの２０％がＮＨ₄ＨＦｕに変換されていた。この交換におけるWACEの有効イオン交換容量は乾燥樹脂１ｇ当たり約５．５equであった。例３（ａ）耐圧溶液内で２７atmのＣＯ₂加圧下、７０ｇの抽出剤を７０ｇの水性相に接触させた。有機相の組成は、ケロシン中に１．２ＭのAlamine 336（Henkel ）及び２０％のオクタノールを含むものであった。水性相は２５．５％（ＮＨ₄ ）₂Ｆｕ溶液であった。一晩混合後、両方の相を分離し、分析した。有機相は、抽出剤中のアミン１モル当たり０．２４equのフマル酸を含んでいた。（ｂ）ケロシン中に０．６Ｍの同じアミン、３．４５のオクタノール及び４３％のイソプロパノールを含む抽出剤を使用して（ａ）の実験を繰り返した。水性相は２０％（ＮＨ₄）₂Ｆｕ溶液であった。接触させて相を分離させた後、有機相は、抽出剤中のアミン１モル当たり０．４１equのフマル酸を含んでいた。（ｃ）（ｂ）に記載のものと同じ構成の抽出剤と６．６％のＮＨ₄ＨＦｕを含む水溶液を使用して（ａ）の実験を繰り返した。接触させて相を分離させた後、有機相は、抽出剤中のアミン１モル当たり０．９８equのフマル酸を含んでいた。（ｄ）（ｂ）に記載のものと同じ構成の抽出剤と１１．２％のＮＨ₄ＨＦｕを含む水溶液を使用して（ａ）の実験を繰り返した。接触させて相を分離させた後、有機相は、抽出剤中のアミン１モル当たり１．４５equのフマル酸を含んでいた。例４１２５ｇのオクタノールをビーカーに入れ、１７０℃に加熱した。２．５Ｍの（ＮＨ₄）₂Ｆｕを含む水溶液４０ｇを熱オクタノールに２時間にわたって滴下添加した。加熱をさらに４５分間続け、停止した。形成された結晶を分離し、エタノールで洗浄し、乾燥させた。０．５ｇの乾燥結晶を１０ｇの水に溶解させた。溶液のｐＨは、同じ濃度のＮＨ₄ＨＦｕ溶液のｐＨよりも僅かに低い３．４５であった。例５ケロシン中にある４０％のAlamine 336及び６％のオクタノールと１．４Ｎのフマル酸を含む抽出剤を、６段階の向流モードで９５℃の水で洗浄した。実際に、全てのフマル酸を溶解させて０．１Ｎの水溶液を形成した。この溶液を２５℃に冷却することによって、フマル酸が晶出した。例６２．７５eq/gのフマル酸を有する５０ｇのReillex樹脂を、１４．１％の（ＮＨ₄）₂Ｆｕを含む水溶液５０ｇと７５℃で混合した。３時間後に水性相を分析した。その（ＮＨ₄）₂ＦｕはＮＨ₄ＨＦｕに変換され、樹脂の対応部位がそのフマル酸を有する形態から遊離塩基形態に変換されていた。例７４．２％のＮＨ₄ＨＦｕ及び１２．７％の（ＮＨ₄）₂Ｆｕを含む７５℃の水溶液を徐冷した。形成されたＮＨ₄ＨＦｕ結晶を濾過し、冷水で洗浄し、７０℃のオーブン内で乾燥させ秤量した。求められたフマル酸モノアンモニウム結晶の収率は９６％であった。例８１２７０ｇのデキストロース、１７．５ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、４ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、３ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、０．５ｇのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．１ｇのＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、５ｇのトウモロコシ抽出液、及び９６０ｇのＣａＣＯ₃を含む懸濁状態にある無菌溶液１０リットルを、リゾプスアリッツァス(Rhizopus arrhizus)の株NRRL 1526を使用して３４℃で発酵させた。５４時間の発酵後、８００ｇのフマル酸がカルシウム塩として生成した。培養液を濾過すると菌糸体及びフマル酸カルシウムのケークが得られ、それを２リットルの冷水で洗浄した。洗浄したケークは７２０ｇのフマル酸をそのカルシウム塩として含んでいた。ケークを１２リットルの沸騰水に１時間攪拌しながら懸濁させ、９５℃で濾過するとフマル酸カルシウム溶液が得られた。濾液を１０℃で２時間冷却することによりフマル酸カルシウムを結晶化させた。フマル酸カルシウムを濾過し、１リットルの冷水で洗浄し、乾燥させると、純度９０％よりも高いフマル酸カルシウム８５０ｇが得られた。このフマル酸カルシウム７９０ｇを１８０ｇのアンモニアを含む４．５リットルの水溶液に懸濁させ、ｐＨが８．５に達するまでＣＯ₂をバブリングした。炭酸カルシウム沈澱物を濾過し、冷水で洗浄した。５４０ｇのフマル酸を含むフマル酸ジアンモニウム溶液４．５リットルが得られた。この溶液を７５℃に加熱したものを、先のステップにおいて得た５リットルカチオン交換カラムでパーコレートさせることにより酸性化した。このカラムを次に３リットルの水で洗浄し、カラムＡと名付けた。カラムＡを１０barのＣＯ₂加圧下で水で処理した。酸性化ステップでカラムＡに結合したアンモニウムイオンの５０％以上が、ＣＯ₂含有水中で得られた。主としてフマル酸モノアンモニウムとして５００ｇのフマル酸を含む酸性化された溶出液５リットルを減圧下７０℃で濃縮し、２リットルの濃縮物を得た。２時間を要して１０℃に冷却した後、フマル酸モノアンモニウムは純度９９％で結晶化した。結晶を濾過により分離し７５℃で水に溶解させた。この溶液を、先のステップから得られたアンモニウムイオンを有するカチオン交換体を含む２リットルカラムにパーコレートさせた。フマル酸ジアンモニウムの形態にあるフマル酸１８０ｇを含む１．５リットルの溶液が形成された。カチオン交換体を実際的に完全にその酸性型に再生した。フマル酸ジアンモニウム溶液のｐＨを８に調節した。細菌シュードモナスフルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）の株ATCC 21973によって、５８℃でそれは９５％よりも高い分子収率でアスパラギン酸モノアンモニウム溶液に変換された。アスパラギン酸モノアンモニウムの溶液を７５℃に加熱し、カラムＢでパーコレートさせることにより酸性化した。溶出液を１０℃に冷却することによって、そのアスパラギン酸含有物の８５％以上が純粋なアスパラギン酸として結晶化した。本発明が前述の説明のための例の詳細に限定されないこと及び本発明が本発明の本質的属性から離れることなしに他の特定の形態で本発明を実施できることは当業者に明らかであろう。従って、本明細書に記載の態様及び例はすべての点で例示のためのものであって限定を意図したものではなく、上記記載よりもむしろ請求の範囲が参照されるべきであり、請求の範囲に記載のものと意味及び範囲の点で等価になるあらゆる変更が請求の範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ビトナー，アシャーイスラエル国，96750 イェルサレム，スターンストリート 31／13 (72)発明者カミ，ピエールフランス国，エフ―80190 ラングボワサン，ルートドゥモイエンクール (72)発明者ジャンセン，ロバートベルギー国，ベー―1800 ビルボード，サンアナラーン 132ベー (72)発明者ジャリー，ブルーノフランス国，エフ―75018 パリ，リュサンバンサン，11 (72)発明者ルコント，ディディエールフランス国，エフ―02300 ショニー，リュドゥフラブレース，30 (72)発明者スコット，ジャンフランス国，エフ―80700 ロイエ，リュドゥジャンジョーレ，19 (72)発明者シャタワイ，トーマスベルギー国，ベー―1410 ワーテルロー, ドレブドゥムーラン 45アー (72)発明者バンランケル，フランクベルギー国，ベー―9040 サン―アマンドベルグ，ワテルストラート 160

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）フマル酸ジアンモニウム１モル当たり約２モルのアンモニア源を使用してフマル酸ジアンモニウムを含む水溶液を形成するステップであって、前記アンモニア源の一部がこの方法の１つのステップから再循環されるステップ；（ｂ）この方法の１つのステップを通じて得られるフマル酸ジアンモニウムを含む水溶液の組成を調節して約０．５Ｍ〜約２Ｍのフマル酸アンモニウム濃度及び約７〜約９のｐＨを有する溶液を形成するステップ；（ｃ）前記調節された水溶液中のフマル酸ジアンモニウムをアスパラギン酸モノアンモニウムに酵素変換するステップ；（ｄ）前記アスパラギン酸モノアンモニウムを含む溶液を、少なくとも５０℃ の高温で、少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体に接触させることにより酸性化するステップであって、アンモニウムイオンが前記溶液から前記カチオン交換体に移行するとともにプロトンが前記カチオン交換体から前記溶液に移行することにより前記溶液中にアスパラギン酸が形成されるステップ；（ｅ）前記アスパラギン酸を含む水溶液を前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体から分離するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）で形成された前記水溶液から周知の方法により前記アスパラギン酸を分離するステップ；（ｇ）アンモニア源を形成する方法で、前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体を少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体に再生するステップ；（ｈ）前記変換されたカチオン交換体を分離し、ステップ（ｄ）で再使用するステップ；及び（ｉ）前記アンモニア源を分離し、ステップ（ａ）で再使用するステップ；を含むアスパラギン酸の製造方法。２．前記アンモニア源が、アンモニア、炭酸アンモニウム及び炭酸水素アンモニウムからなる群から選ばれる請求項１記載の方法。３．ステップ（ａ）での形成用の原料が炭水化物であり、前記炭水化物を含む媒体がフマル酸を生産する微生物により発酵されることによってフマレート含有発酵液が形成される請求項１記載の方法。４．ステップ（ｇ）での前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体の前記再生が試薬としてＣＯ₂を使用する請求項１記載の方法。５．（ａ）フマル酸を生産する微生物により炭水化物を含む媒体を発酵させることによってフマレート含有発酵液を形成するステップ；（ｂ）この方法の１つのステップを通じて得られるフマル酸ジアンモニウムを含む水溶液の組成を調節して約０．５Ｍ〜約２Ｍのフマル酸アンモニウム濃度及び約７〜約９のｐＨを有する溶液を形成するステップ；（ｃ）フマル酸ジアンモニウムをアスパラギン酸モノアンモニウムに酵素変換するステップ；（ｄ）前記アスパラギン酸モノアンモニウムを含む溶液を、少なくとも５０℃ の高温で、少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体に接触させることにより酸性化するステップであって、アンモニウムアニオンが前記溶液から前記カチオン交換体に移行するとともにプロトンが前記カチオン交換体から前記溶液に移行することにより前記溶液中にアスパラギン酸が形成されるステップ；（ｅ）前記アスパラギン酸を含む水溶液を前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体から分離するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）で形成された前記水溶液から周知の方法により前記アスパラギン酸を分離するステップ；（ｇ）この方法の１つのステップを通じて得られるフマル酸モノアンモニウム、フマル酸又はそれらの混合物の水溶液により、前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体を再生するステップであって、プロトンが前記溶液から前記カチオン交換体に移行するとともにアンモニウムイオンが前記カチオン交換体から前記溶液に移行して前記溶液中にフマル酸ジアンモニウムが形成されるステップ；（ｈ）少なくとも部分的にその酸性型にあるステップ（ｇ）から得られる前記カチオン交換体を分離してステップ（ｄ）で再使用するステップ；及び（ｉ）ステップ（ｇ）から得られる前記フマル酸ジアンモニウムを分解させてフマル酸モノアンモニウム、フマル酸又はそれらの混合物を形成するとともにアンモニア源を形成し、これらの分解生成物を再使用するステップ；を含む請求項１記載の方法。６．前記発酵において中和剤として塩基が使用される請求項５記載の方法。７．前記塩基がアンモニア並びにアンモニウム、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩及び炭酸水素塩からなる群から選ばれる請求項６記載の方法。８．アンモニア源がステップ（ｂ）における前記調節で試薬として使用される請求項５記載の方法。９．ステップ（ｂ）から得られる前記フマル酸ジアンモニウムがステップ（ｉ）で分解され、前記フマル酸モノアンモニウム、フマル酸及び／又はそれらの混合物がステップ（ｇ）において再使用される請求項５記載の方法。１０．ステップ（ｂ）から得られるフマル酸ジアンモニウムがステップ（ｃ）においてアスパラギン酸モノアンモニウムに酵素変換される請求項５記載の方法。１１．ステップ（ｇ）において形成される前記フマル酸ジアンモニウムがステップ（ｉ）において分解され、前記フマル酸モノアンモニウム、フマル酸又はそれらの混合物がステップ（ｇ）において再使用される請求項５記載の方法。１２．ステップ（ｇ）において形成される前記フマル酸ジアンモニウムがステップ（ｃ）においてアスパラギン酸モノアンモニウムに酵素変換される請求項５記載の方法。１３．アルカリ土類金属の塩基が前記発酵において中和剤として使用され、前記アルカリ土類金属のフマル酸塩が形成され、ステップ（ｂ）において前記アルカリ金属土類金属のフマル酸塩が、試薬としてアンモニア源を使用するとともに中和剤としての再使用のためにアルカリ土類金属の塩基を再生する方法でフマル酸アンモニウムに変換される請求項５記載の方法。１４．前記アルカリ土類金属がカルシウムであり、アルカリ土類金属の前記フマル酸塩がフマル酸カルシウムであり、アルカリ土類金属の前記塩基が炭酸カルシウムである請求項１３記載の方法。１５．前記フマル酸カルシウムがステップ（ｂ）におけるフマル酸アンモニウムへの変換前に精製される請求項１４記載の方法。１６．ステップ（ｉ）におけるフマル酸ジアンモニウムの前記分解が、（Ｉ）電気透析による水の分割；（II）ＣＯ₂圧力下で抽出剤に接触させることによりフマル酸を抽出すること；（III）少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体との接触による酸性化によって、アンモニウムイオンを前記溶液から前記カチオン交換体に移行させてアンモニウムイオンを有するカチオン交換体を形成させるとともにプロトンを前記カチオン交換体から前記溶液に移行させてフマル酸モノアンモニウムをその溶液中で形成させること；及び（IV）熱分解；からなる群から選ばれる少なくとも１つの方法により行われる請求項５記載の方法。１７．前記フマル酸モノアンモニウムが周知の方法により分離される請求項５記載の方法。１８．前記フマル酸モノアンモニウムが結晶化により分離される請求項１７記載の方法。１９．前記フマル酸モノアンモニウムが再使用前に精製される請求項５記載の方法。２０．前記アンモニウムイオンを有するカチオン交換体が、少なくとも部分的にその酸性型にあるカチオン交換体に再生され再使用される請求項１６（III）記載の方法。２１．前記再生が試薬としてＣＯ₂を使用するものであって、アンモニア、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム及びそれらの混合物から選ばれる生成物が形成され、分離され、アンモニア源として再使用される請求項２０記載の方法。２２．フマル酸がフマル酸モノアンモニウム溶液から抽出される請求項１記載の方法。２３．ステップ（ｅ）におけるアスパラギン酸の前記分離が結晶化により行われ、結晶性アスパラギン酸が母液から分離される請求項１記載の方法。２４．前記母液中に残るアスパラギン酸が強酸カチオン交換体への吸着により回収される請求項２３記載の方法。２５．前記アスパラギン酸を有するカチオン交換体をアスパラギン酸塩の溶液に接触させて前記塩のカチオンを吸着させ、アスパラギン酸を前記溶液中に遊離させる請求項２４記載の方法。２６．前記アスパラギン酸塩のカチオンを有する前記強酸カチオン交換体を反応物である酸の溶液に接触させることにより、プロトンを前記溶液から前記カチオン交換体に吸着させ、前記カチオンを前記溶液中に遊離させる請求項２５記載の方法。２７．前記反応物である酸がフマル酸であり、前記カチオンの少なくとも８０％がアンモニウムイオンである請求項２６記載の方法。