JPS6363395A - Ｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、Ｄ−１Ｌ−およびＤＬ−Ｎ−カルバミルフェ
ニルアラニンを微生物が成虫ずる酵素の作用により加水
分解し、Ｌ−フェニルアラニンを有利に製造する方法に
関する。

光学活性のし一アミノ酸は、一般に直接発酵法で製造さ
れるか、有機合成化学的に製造されたＤＬ−アミノ酸を
光学分割する方法で製造されている。

Ｌ−フェニルアラニンの場合、工業的には直接発酵法ま
たは化学合成されたＤＬ−フェニルアラニンをＮ−アセ
チル化し、アシラーゼ酵素によりＬ−Ｎ−アセチルフェ
ニルアラニンのみを選択的に加水分解することにより製
造されている。

最近、Ｌ−フェニルアラニンは人工甘味料アスパルテー
ム製造のための主原料として重要な化合物となってきて
おり、その製造法に関し、発酵法と共に、化学合成によ
り得られる前駆物質を酵素により転換させるいわゆるケ
ミコ・エンザイマチック（Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｅｎｚｙｍ
ａｔｉｃ）な方法が数多く提案されている。すなわち、
上記のアシラーゼ法のほかに例工ば、桂皮酸にフェニル
アラニンアンモニアリアーゼを作用させる方法（Ａｐｐ
ｌ　、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ−ｏｌ、　４２
７７３　（１９８１）　）　、５−ベンジルヒダントイ
ンにフラボバクテリウム・アミノゲネスを作用させる方
法（特公昭５４−２２７４号公報）、フェニルピルビン
酸にトランスアミナーゼを作用させる方法（特開昭６０
−１６４４９３号公報）、バチルス属、バクテリジウム
属、ミクロコツカス属、ブレビバクテリウム属の微生物
が有する酵素し一アミダーゼを用いる方法（公表昭５６
−５００３１９号公報）、あるいはＬ−１−ベンジルア
ミノアセトアミドにロドスポリジウム・トルロイトスを
作用させる方法（特開昭５９−１５９７８９号公報）、
などが知られている。しかしながら、これらの方法はＬ
−フェニルアラニンの蓄積量が少なかったり、反応系が
複雑でありたり、反応条件が苛酷であったり、また原料
が高価なものがある、などの問題点があり工業的になお
改善の余地がある。

また、微生物酵素による各種Ｌ−α−アミノ酸のＮ−力
ルバミル誘導体からし一α−アミノ酸を生成する反応は
、メチオニンについて（特公昭５５−２９６７８号公報
）およびフェニルアラニン、トリプトファン、バリン、
チロシンなどについて（特開昭６Ｏ−３４１９Ｌ号、特
開昭６１−９２９２号各公報）が知られている。

さらにまた、Ｄ−１Ｌ−およびＤＬ−Ｎ〜カルバミルフ
ェニルアラニンからのＬ−フェニルアラニンへの転換反
応としてはアルスロバクタ−属の細菌によるフェニルア
ラニン、トリプトファン、チロシンのＮ−カルバミル体
に対しての方法（特開昭６１−９２９３号公報）がある
、しかるに該方法ではＤ−Ｎ−カルバミル体に対する分
解活性がＬ−Ｎ−カルバミル体に対する分解活性に比し
低く実用工種々の問題点を有する。

１］艶□□□」しえ かかる状況から、本発明者らはＬ−フェニルアラニンの
ケミコーエンザイマチフタな方法による、より有利な工
業的製造法を開発すべく鋭意研究を行った結果、全く意
外にも、アルカリゲネス（１’ｌｌ−ｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）属の微生物に、化学合成で容易かつ安価に製造でき
るＤＬ−Ｎ−カルバミルフェニルアラニンを全てＬ−フ
ェニルアラニンに転換させる能力のあることを見出し、
本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉ−
ｇｅｎｅｓ）属に属し、Ｄ−１Ｌ−およびＤＬ−Ｎ−カ
ルバミルフェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンを
生成する能力を有する微生物もしくは該微生物菌体の処
理物を、Ｄ−１Ｌ−およびＤＬ−Ｎ−カルバミルフェニ
ルアラニンのいずれか１つ又は２つ以上に作用させ、Ｌ
−フェニルアラニンに変換せしめることを特徴とするＬ
−フェニルアラニンの製造法を要旨とするものである。

Ｈの具体・ｉ′日 本発明の方法は、弐： （Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）　　　　　　　　　　　　　（１体
）で示される反応に基づくものである。

本発明のアルカリ土類金属の微生物はＤ−３し一１ＤＬ
−のいずれのＮ−カルバミルフェニルアラニンからもＬ
−フェニルアラニンを生成する能力を有するものであり
、反応条件を適宜選ぶことにより、いずれのＮ−カルバ
ミルフェニルアラニンからもＬ−フェニルアラニンのみ
を１００２生成することができ、特に、Ｄ−Ｎ−カルバ
ミルフェニルアラニンから強い活性でＬ−フェニルアラ
ニンを生成するという特徴をもっている。従って、本発
明によれば、化学合成で容易かつ安価に製造できるＤＬ
−Ｎ−カルバミルフェニルアラニンを何ら苛酷な反応条
件を与えずに全てＬ−フェニルアラニンに良好な収率で
転換し得ることができる。

本発明において使用される微生物は、例えば、本発明者
らにより新たに分離されたアルカリ土類金属に属する新
菌株Ｎ−３９７２であり、この苗株は微工研菌寄第８８
２０号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８８２０）として工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されており、その菌学的性質
は以下の通りである。

Ｎ−３９７２の東学・性質 １）形　態　　　　：桿菌 ２）ダラム染色性　：陰性 ３）芽　胞　　　　　認めず ４）鞭　毛　　　　：周毛 ５）運動性　　　　：　＋ ６）　０／Ｆテスト　　：アルカリ化 ７）オキシダーゼ　：　＋ ８）カタラーゼ　　；　＋ １０）アルギニンジ　二　− ヒドロラーゼ １１）脱窒反応　　　：　− １２）硫化水素産生　：　− １３）　インドール産生：　− １５）尿素分解　　　二　− １６）クエン酸塩利用：　＋ １７）色素産生　　　二　− １８）デンプン分解　： １９）ゼラチン分解　二　− 以上の諸性質をＢｅｒｇｙ”ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ−ｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ（第８版、１９７４）およびＨ，ＧＳｃｈｌｅｇｅ
ｌらのＴｈｅ　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ（１９８１）を
参照して検索すると、Ｎ−３９７２菌はダラム陰性、桿
菌で運動性があり、周鞭毛を有しオキシダーゼ（＋）、
カタラーゼ（＋）等よりアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅ−ｎｅｓ）属に属する細菌と考えられる。

また、種について検索したところ本国はアルカリゲネス
・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌ
ｔｓ）と極めてよく一致していた。従って、本面をアル
カリゲネス・フェカリスと同定した。

上記微生物を培養して本発明に使用する酵素を生成せし
めるには、炭素源、窒素源、無機塩および有機栄養源を
含有する通常の培地を用い通気攪拌下に該微生物を培養
して得ることができる。この際、高い酵素活性を誘導さ
せるためＤＬ−Ｎ−カルバミルフェニルアラニン、ＤＬ
−Ｎ−カルバミルアスパラギン酸などを少量添加するこ
とが効果的である。培養はｐＨ５〜１０、温度２０〜４
０℃の範囲から選んだ条件で１〜５日間好気的に行われ
る。

このように培養して得た微生物は、微生物の培養液、分
離生苫体、または菌体処理物（例えば菌体破砕物、菌体
抽出物（酵素）など）として加水分解反応に使用される
。勿論、常法に従って菌体または菌体処理物をポリアク
リルアミド、カラギーナンなどで固定化して使用するこ
ともできる。

本発明の方法で原料として用いられるＤ−１Ｌ−および
ＤＬ−Ｎ−カルバミルフェニルアラニンは、それぞれＤ
−１Ｌ−およびＤＬ−フェニルアラニンにシアン酸カリ
ウムを反応させて合成して得られるが、現在、工業的に
製造されているＤＬ−フェニルアラニン合成中間体とし
て得られるＤＬ−５−ベンジルヒダントインを適当な条
件で加水分解すればＤＬ−Ｎ−カルバミルフェニルアラ
ニンが容易かつ安価に得られるので、原料としてはＤＬ
−Ｎ−カルバミルフェニルアラニンを用いることが好ま
しい。

Ｄ−２Ｌ−オヨヒＤＬ−Ｎ−カルバミルフェニルアラニ
ンはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩など塩
の形で用いることができる。さらに、ＤＬ−Ｎ−カルバ
ミルフェニルアラニンまたはその塩については、十分に
精製されたもののほか、製造工程途中で得られる反応液
などの不純物を含むものであっても、特に反応を阻害し
ない限り使用することができる。

加水分解反応は、Ｄ−２Ｌ−１ＤＬ−Ｎ−カルバミルフ
ェニルアラニン濃度０．１〜５０重四％（反応基質溶液
がスラリー上であっても可）、微生物等の使用量は乾燥
菌体として反応液当り０．０１〜１０重景％、反応温度
２０〜６０℃、ｐＨ６〜１１、反応時間５〜１００時間
の範囲で行われる。

なお、本発明を実施するに際しては、本発明の微生物が
特にＤ−Ｎ−カルバミルフェニルアラニンに対する活性
が強いことから、基質としてＤＬ−Ｎ−力ルバミルフェ
ニルアラニンを使用する場合には従来公知のＬ−Ｎ−カ
ルバミルフェニルアラニン加水分解菌との併用が好まし
い、また、反応を生菌体で行う場合には、反応液中に界
面活性剤（例ニジオクチルアンモニウムクロリド、商品
名スヮノールＣＡ３０８０　（日光ケミカルス）など）
を少ｆｉ　（０，０５重量％以下）添加すると反応時間
の短縮あるいはＬ−フェニルアラニン蓄積量の増加がは
かれる場合があり好ましい。

かくして、反応液中に生成、蓄積したＬ−フェニルアラ
ニンはイオン交換法、その他公知の方法を組合せて分離
、精製し取得することができる。

ｌ豆豆 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらの例のみに限定されるものテハナい、各実
施例中、Ｌ−フェニルアラニンの確認、定量はｙｉＮク
ロマトグラフィーによるニンヒドリン発色位置、高速液
体クロマトグラフィーにより行った。

実施例１゜ グリセロール５ｇ／　１　、酵母エキス５ｇ／　ｌ　、
肉エキス５ｇ／　ｔｌ　、ＫＨ，ＰＯｔ２ｇ／　１　、
Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈｚ０１ｇ／　ｌ、ＣａＣ１ｔ　４０ｍ
ｇ／　１２　、、Ｆｅ５Ｏａ　・７ＨｚＯ２０＋ａｇ／
　１　、Ｍｎ５Ｏａ・４Ｈｚ０２０ｍｇ／　１を含む培
地（ｐＨ７，０）を５００１１１容フラスコに１００ｍ
　Ｉｒ入れ、１２０℃で１５分間滅回した。

これに別滅菌したＤＬ−Ｎ−カルバミルフェニルアラニ
ンを最終濃度が０．２重量％になるように加えた後、　
アルカリゲネス・フェカリスＮ−３９７２菌を接種し、
３０℃で２４時間振盪培養した。この培養液より菌体を
遠心分離して集め、培養液と同量の０．０５Ｍリン酸塩
緩衝液（ｐ）Ｉ　７．５）で２回洗浄後、ＤＬ−Ｎ−カ
ルバミルフェニルアラニン１０．４ｍｇ／ｖａ　ｌおよ
び界面活性剤（Ｓ讐ＡＮＯＬ　ＣＡ　３０８０、日光ケ
ミカルズ製）０．０５重量％を含む０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ＰＨ８，０）１０ｍｌ中に懸濁させ、３０℃で
６時間反応させた。

生成したＬ−フェニルアラニンを高速液体クロマトグラ
フィーにより定量したところ６．８ｍｇ／ｍ　ｌ　（収
率８３％）であった。

実施例２゜ 実施例１と同様の方法で培養（１０ａ＋βスケール）し
て得たアルカリゲネス・フェカリスＮ−３９７２洗浄菌
体について、これを１０ｍｊｌの０．ＩＭのリン酸塩復
衝液に懸濁した。この菌体懸濁液にＤ−またはｌ−％−
カルバミルフェニルアラニン４．１６ｍｇ／ｍ　Ｉｌお
よび５ＩＪＡＮＯＬＣＡ　３０８００．１重量％を含む
０．１Ｍリン酸塩緩衝液１０ｍ１を加え３０℃で２４時
間反応させ、生成したＬ−フェニルアラニンを高速液体
クロマトグラフィーにより定量し活性を求めた。結果を
表−１に示す。

表−１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属し、
   Ｄ−、Ｌ−およびＤＬ−Ｎ−カルバミルフェニルアラニ
   ンからＬ−フェニルアラニンを生成する能力を有する微
   生物もしくは該微生物菌体の処理物をＤ−、Ｌ−および
   ＤＬ−Ｎ−カルバミルフェニルアラニンのいずれか１つ
   又は２つ以上に作用させ、Ｌ−フェニルアラニンに変換
   せしめることを特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造
   法。