CN101918573A - 鳌合甲醛以稳定乙醇腈转化为乙醇酸时腈水解酶的比活性 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种方法，以改进在水性反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时具有腈水解酶活性的酶催化剂的比活性。加入有效量的至少一种胺保护剂改进了酶催化剂的比活性和催化生产力。

Description

鳌合甲醛以稳定乙醇腈转化为乙醇酸时腈水解酶的比活性
技术领域
本发明涉及有机酸的合成、分子生物学和微生物学领域。更具体地，提供了通过在存在胺保护剂时进行乙醇腈转化为乙醇酸的反应而保护和/或增加包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化剂的比活性的方法。
背景技术
乙醇酸(HOCH2COOH；CAS注册号为79-14-1)是羧酸的α-羟基酸家族的最简单的成员。乙醇酸的性质使其具有理想的广范围的消费和工业应用，包括用于水井复原、皮革工业、油气工业、洗衣和纺织工业、作为单体制备聚乙醇酸(PGA)，以及作为个人护理产品的成分。乙醇酸还是多种工业上的清洁剂(奶制品和食品加工设备清洁剂，家居和机构清洁剂，工业清洁剂[用于运输设备、石工技术、印刷电路板、不锈钢锅炉和处理设备、冷却塔/热交换器]和金属加工[用于金属酸洗、铜的抛光、蚀刻、电镀、电解法抛光])的主要成分。最近有报道指出乙醇酸可作为气体屏障材料(即显示出高度的氧气屏障特性)用于包装食物和碳酸饮料(WO 2005/106005A1)。但是，在制备用于气体屏障材料的聚乙醇酸时，乙醇酸的传统化学合成产生大量的杂质，在使用前必须除去这些杂质。工业界迫切需要商业化生产乙醇酸的新技术，特别是以低成本生产高纯度乙醇酸的新技术。
微生物催化剂能够使用腈水解酶(EC 3.5.5.7)将腈(例如乙醇腈)直接水解为相应的羧酸(例如乙醇酸)，其中不产生相应的酰胺中间体(反应式1)；或者可通过腈水合酶(EC 4.2.1.84)与酰胺酶(EC 3.5.1.4)的组合将腈(例如乙醇腈)水解为相应的羧酸(例如乙醇酸)，其中腈水合酶(NHase)首先将腈转化为酰胺，然后酰胺被酰胺酶转化成相应的羧酸(反应式2)：
Figure BPA00001178557700021
乙醇酸的酶法合成通常需要实质上纯的形式的乙醇腈。以前曾经报道过通过甲醛和氰化氢的水溶液的反应合成乙醇腈的方法(US 2,175,805；US2,890,238；和US 5,187,301；反应式3)。
Figure BPA00001178557700023
但是，这些方法通常产生水性的乙醇腈反应产物，其需要进行深度纯化(例如蒸馏纯化)，因为很多杂质和/或反应的副产物(包括多余的反应物甲醛)可能干扰乙醇腈至乙醇酸的酶法转化，包括抑制催化剂活性(即降低比活性)。特别地，众所周知甲醛能够通过与来自N-末端氨基酸残基和精氨酸、半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸残基的侧链的氨基基团发生反应而在蛋白中产生不想要的修饰(Metz等人，J.Biol.Chem.，279(8)：6235-6243(2004))。催化剂活性的抑制降低催化剂的总体生产力(即每克催化剂形成的乙醇酸的总克数)，这显著增加了总体过程的成本，使得与化学合成相比酶法生产可能在经济上不可行。因此，需要这样的反应条件：其能够保护酶活性以抵抗报道的降低催化剂活性的不想要的杂质。
已经报道了通过在乙醇腈合成反应之前将甲醛进行加热处理从而产生高纯度乙醇腈的方法(US 11/314386和US 11/314905；反应式3)。但是，乙醇腈能够可逆地分解成甲醛和氰化氢。因此，仍然需要保护具有腈水解酶活性的催化剂以抵抗游离甲醛的不良效应。
已知有各种使用作为起始材料的相应的α-羟基腈和作为催化剂的微生物来制备α-羟基酸的方法。产生的α-羟基酸的例子包括：乙醇酸、乳酸、2-羟基异丁酸、2-羟基-2-苯基丙酸、扁桃酸、2-羟基-3-3-二甲基-4-丁内酯和4-甲基硫代丁酸。这些产物是使用微生物合成的，例如属于下列属的微生物：诺卡氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、金杆菌属、假单胞菌属、酪杆菌属、粪产碱菌属、不动杆菌属、肠杆菌属、节杆菌属、埃希氏菌属、微球菌属、链霉菌属、黄杆菌属、产气单胞菌属、支动杆菌属、纤维单胞菌属、欧文氏菌属、假丝酵母属、无芽孢杆菌属、曲霉属、青霉属、旋孢腔菌属、镰刀菌属、红假单胞菌属、红球菌属、棒状杆菌属、微杆菌属、肥杆菌属和戈登菌属(JP A 499495，JP A 499496和JP A 4218385，对应于US 5,223,416；JP A499497，对应于US 5,234,826；JP A 595795，对应于US 5,296,373；JP A 521987；JP A 5192189，对应于US 5,326,702；JP A 6237789，对应于EP A0610048；JP A 6284899，对应于EP A 0610049；JP A 7213296，对应于US5,508,181)。
但是，上述的从相应的α-羟基腈制备α-羟基酸的已知方法多数不能以足够高的满足商业需要的浓度生产并积累产物。这通常是由于在反应的初期酶失活的缘故。US 5,756,306教导“当使用腈水解酶或腈水合酶进行α-羟基腈的酶法水解或水合以产生α-羟基酸或α-羟基酰胺时，会发生短时间内酶被灭活的问题。因此难以获得高浓度和高产率的α-羟基酸或α-羟基酰胺”(第1栏第49-54行)。避免这个问题的一种方法是将反应混合物中醛(通过α-羟基腈分解为醛和氰化氢而形成)的浓度和/或α-羟基腈的浓度维持在特定的范围内。
US 5,508,181考虑到了与酶迅速灭活相关的其它困难。具体地，US5,508,181提及：根据分解平衡，α-羟基腈化合物部分分解为相应的醛。据报道，这些醛通过与蛋白结合而在短时间内将酶灭活，因此难以从α-羟基腈以高生产力获得高浓度的α-羟基酸或α-羟基酰胺(第2栏，第16-29行)。作为防止由于醛的累积而使酶灭活的手段，向反应混合物中加入磷酸盐或次磷酸盐离子。US 5,326,702报道了使用亚硫酸盐、二亚硫酸盐或连二亚硫酸盐离子螯合醛并防止酶灭活，但是其得出结论：即使使用如上所述这样的添加物，所产生和积累的α-羟基酸的浓度也不高。
U.S.6,037,155教导：α-羟基酸产物的低积累与分解的醛的积累造成的短时间内的酶灭活有关。这些发明人提示在氰化氢(在水以及相应的醛或酮中α-羟基腈部分分解产生氰化氢(Mowry，David T.，Chemical Reviews，Vol.42，pages 189-283(1948)))存在时酶活性被抑制(Asano等人，Agricultural Biological Chemistry，Vol.46，pages 1165-1174(1982))。发明人通过使用微生物(其酶活性可以通过向反应混合物中加入氰物质而被改进)解决了醛诱导的酶灭活的问题。氰物质的加入限制了α-羟基腈向醛和氰化氢的分解。
就生产乙醇酸来讲，已知乙醇腈可逆地分解为氰化氢和甲醛，其中任何一个都可能参与降低催化剂的活性。美国专利3,940,316描述了使用具有“腈水解酶的”活性的细菌从相应的腈制备有机酸的方法，并将乙醇腈列为底物。特别地，该专利描述为此目的使用芽孢杆菌属、无芽孢杆菌属、微球菌属和短杆菌属。虽然被描述为具有腈水解酶活性，但是在美国专利3,940,316的所有实施例中仅使用了短杆菌R312。已经知道短杆菌R312具有腈水合酶和酰胺酶活性，但没有腈水解酶活性(Tourneix等人，Antonie van Leeuwenhoek，52：173182(1986))。
在日本专利特开No.Sho 61 56086中公开了使用属于棒状杆菌属的微生物制备乳酸、乙醇酸和2-羟基异丁酸的方法。JP 09028390公开了通过红球菌或戈登菌水解酶的作用从乙醇腈生产乙醇酸的方法。报道的对乙醇酸的选择性几乎为100％，未形成乙醇酸酰胺。美国专利6,037,155公开了从α-羟基腈生产α-羟基酸(包括乙醇酸)的方法的例子。该公开物承认：由于上述的问题，不是所有的微生物催化剂都能产生高浓度的乙醇酸；并且建议必须进行筛选研究从而发现具备工业优势的微生物。美国专利6,037,155特别鉴定出对α-羟基腈或α-羟基酸的抑制效应有抗性的贪噬菌属和节杆菌属微生物，其具有双重活性，可以以高浓度生产需要的产物。
敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的特征在于具有脂肪族腈水解酶(EC3.5.5.7)活性以及腈水合酶(EC 4.2.1.84)和酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性的组合。已经克隆并重组表达了编码敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的基因(WO 01/75077，对应于美国专利6,870,038；和Chauhan等人，Appl Microbiol Biotechnol，61：118-122(2003))。
敏捷食酸菌72W腈水解酶以高产率将α-羟基腈转化为相应的α-羟基羧酸(美国专利6,383,786)，包括乙醇酸(美国专利6,416,980)。WO2006/068110和WO2006/069114(分别对应于美国专利7,198,927和美国专利申请11/314905)公开了使用源自敏捷食酸菌72W腈水解酶的突变体从乙醇腈生产乙醇酸的改进的方法。在同一申请人的和共同拥有的美国专利申请11/314905中公开了改进乙醇酸生产的各种方法，包括(1)使用具有改进的活性的敏捷食酸菌72W突变体，(2)添加至少一种稳定剂(例如硫代硫酸钾、连二亚硫酸钠、过量的HCN)，(3)在不含氧气的条件下进行反应，(4)控制乙醇腈补料速率，和(5)使用高纯度的乙醇腈。虽然这些方法中很多都改进了乙醇酸的生产力，但是随着时间的进行通常仍然会观察到酶活性的下降。这种活性的下降通常部分是由反应混合物中甲醛的存在(虽然是低水平的)造成的。保护在存在甲醛时乙醇腈转化为乙醇酸过程中具有腈水解酶活性的酶催化剂的比活性的方法将显著改进乙醇酸合成的经济情况。
待解决的问题是：提供稳定和/或增加在存在甲醛时乙醇腈转化为乙醇酸过程中的具有腈水解酶活性的酶催化剂的比活性的方法。
发明内容
目前的问题通过提供稳定和/或增加通过酶法将乙醇腈转化为乙醇酸过程中的包含具有腈水解酶活性的多肽的腈水解酶催化剂比活性的方法而获得解决，所述方法包括：
(a)提供反应成分组，其包括：
(i)包含至少0.01ppm甲醛的乙醇腈水溶液；
(ii)包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化剂，其中所述多肽包含SEQ ID NO：1的催化标志(signature)基序；其中所述酶催化剂包含将乙醇腈水解为乙醇酸的比活性；和
(iii)有效量的至少一种胺保护剂，选自：
a)式[R3](1+X)-NH(2-X)的化合物，其中X是0或1，R3独立地是C1-C20烃基基团或取代的烃基基团；其中R3任选地包含一个或多个醚键；条件是(i)取代的基团优选不是能够与酶催化剂反应的氰基基团和(ii)R3不是羰基基团；
b)包含有效数目的游离胺基团的多胺聚合物；和
c)包含有效数目的游离胺基团的胺官能化的材料；
其中所述胺保护剂不是由所述酶催化剂天然产生的；
(b)在合适的水性反应条件下将反应成分组混合，从而产生乙醇酸；其中通过加入所述至少一种胺保护剂而增加了所述比活性；和
(c)回收(b)中产生的乙醇酸或其盐。
附图、序列表和生物保藏说明
可以从附图、序列表、生物保藏和一起构成本申请的详细说明书更全面地理解本发明。
附图
图1中图板A-G是各种腈水解酶序列的CLUSTALW比对(版本1.83，使用缺省参数)。以灰色阴影标出了催化剂半胱氨酸残基周围的保守性催化剂标志序列。用下划线标出了代表催化三元组(triad)(Glu48、Lys130和Cys164；编号基于SEQ ID NO：4的氨基酸序列)的氨基酸。
序列表
以下序列描述和所附序列表符合37C.F.R.§1.821-1.825列出的关于专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则规定。序列描述中对于核苷酸序列符号使用单字母代码，对于氨基酸使用三字母代码，符合IUPAC-IYUB标准(如Nucleic Acids Research 13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(No.2)：345-373(1984)所描述，通过引用并入本文)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37C.F.R.§1.822.列出的规定。
SEQ ID NO：1是包含腈水解酶的必需半胱氨酸残基的催化标志基序的氨基酸序列(式1)。
SEQ ID NO：2是包含腈水解酶的必需半胱氨酸残基的优选催化剂标志基序的氨基酸序列(式2)。
SEQ ID NO：3是敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W腈水解酶编码序列的核苷酸序列，其中包含起始密码子从TTG至ATG的改变以促进在大肠杆菌中的重组表达。
SEQ ID NO：4是敏捷食酸菌72W腈水解酶(ATCC 55746)的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是固氮粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)JM3腈水解酶
Figure BPA00001178557700071
BAA02684.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是紫红红球菌J1腈水解酶(
Figure BPA00001178557700072
Q03217)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是紫红红球菌K22腈水解酶(
Figure BPA00001178557700073
Q02068)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是诺卡氏菌属(Nocardia sp.)C-14-1腈水解酶AAX18182.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)RB50腈水解酶(
Figure BPA00001178557700075
NP_887662.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是拟南芥(Arabidopsis thaliana)腈水解酶(
Figure BPA00001178557700076
AAB60275.1和AAA19627.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942腈水解酶(
Figure BPA00001178557700077
YP_399857.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是细长聚球藻PCC 6301腈水解酶(
Figure BPA00001178557700078
YP_171411.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC 6803腈水解酶NP_442646.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14是嗜虫假单胞菌(Pseudomonas entomophila)L48腈水解酶(
Figure BPA000011785577000710
YP_6090481.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15是运动发酵单胞菌(Zymomonas moblis)腈水解酶的氨基酸序列(YP_162942.1)。
SEQ ID NO：16是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)OxB-1腈水解酶(BAA90460.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17是睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)腈水解酶(
Figure BPA000011785577000713
AAA82085.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18是蓝细菌属(Synechococcus sp.)CC9605腈水解酶(
Figure BPA000011785577000714
YP_381420.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Pf-5腈水解酶(YP_260015.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：20是鼻疽诺卡菌(Nocardia farcinica)IFM 10152腈水解酶YP_119480.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21是固氮粪产碱菌1650腈水解酶(AAY06506.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22是丁香假单胞杆菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)B728a腈水解酶(
Figure BPA00001178557700083
AAY35081.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23是慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)BTAil腈水解酶
Figure BPA00001178557700084
ZP_00859948.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24是紫红红球菌NCIMB 11216腈水解酶(CAC88237)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25是紫红红球菌ATCCTM 39484的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起201位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(L201Q；Leu→Gln)。
SEQ ID NO：27是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：26)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位残基含有单一氨基酸取代(Leu201→Gln)。
SEQ ID NO：28是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起201位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(L201A；Leu→Ala)。
SEQ ID NO：29是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：28)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位残基含有单一氨基酸取代(Leu201→Ala)。
SEQ ID NO：30是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起201位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(L201C；Leu→Cys)。
SEQ ID NO：31是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：30)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位残基含有单一氨基酸取代(Leu201→Cys)。
SEQ ID NO：32是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起201位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(L201T；Leu→Thr)。
SEQ ID NO：33是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：32)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位残基含有单一氨基酸取代(Leu201→Thr)。
SEQ ID NO：34是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起201位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(L201G；Leu→Gly)。
SEQ ID NO：35是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：34)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位残基含有单一氨基酸取代(Leu201→Gly)。
SEQ ID NO：36是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起201位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(L201H；Leu→His)。
SEQ ID NO：37是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：36)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位残基含有单一氨基酸取代(Leu201→His)。
SEQ IDNO：38是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起201位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(L201K；Leu→Lys)。
SEQ ID NO：39是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：38)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位残基含有单一氨基酸取代(Leu201→Lys)。
SEQ ID NO：40是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起201位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(L201N；Leu→Asn)。
SEQ ID NO：41是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：40)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位残基含有单一氨基酸取代(Leu201→Asn)。
SEQ ID NO：42是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起201位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(L201S；Leu→Ser)。
SEQ ID NO：43是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：42)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的201位残基含有单一氨基酸取代(Leu201→Ser)。
SEQ ID NO：44是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起168位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(F168K；Phe→Lys)。
SEQ ID NO：45是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：44)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的168位残基含有单一氨基酸取代(Phe168→Lys)。
SEQ ID NO：46是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起168位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(F168M；Phe→Met)。
SEQ ID NO：47是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：46)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的168位残基含有单一氨基酸取代(Phe168→Met)。
SEQ ID NO：48是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起168位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(F168T；Phe→Thr)。
SEQ ID NO：49是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：48)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的168位残基含有单一氨基酸取代(Phe168→Thr)。
SEQ ID NO：50是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起168位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(F168V；Phe→Val)。
SEQ ID NO：51是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：50)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的168位残基含有单一氨基酸取代(Phe168→Val)。
SEQ ID NO：52是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起168位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(T210A；Thr→Ala)。
SEQ ID NO：53是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：52)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的210位残基含有单一氨基酸取代(Thr210→Ala)。
SEQ ID NO：54是敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其包含引起168位残基上单一氨基酸取代的密码子改变(T210C；Thr→Cys)。
SEQ ID NO：55是突变的腈水解酶(SEQ ID NO：54)的推导氨基酸序列，其在敏捷食酸菌72W腈水解酶的210位残基含有单一氨基酸取代(Thr210→Cys)。
SEQ ID NO：56是在大肠杆菌菌株SS1001(ATCC PTA-1177)中表达的敏捷食酸菌72W腈水解酶的核苷酸序列。
SEQ ID NO：57是在大肠杆菌菌株SS1001(ATCC PTA-1177)中表达的敏捷食酸菌72W腈水解酶的推导氨基酸序列。
生物保藏
Figure BPA00001178557700111
VA 20110 2209，USA的American Type Culture Collection International Depository Authority。“国际保藏机构指定”是ATCC保藏的培养物的编号。
所列的保藏将在指明的国际保藏机构保持至少三十(30)年，在公开这些保藏的专利授权之后公众可以获得这些保藏。保藏的获得不构成实施本发明(损害由政府行为授予的专利权)的许可证。
发明详述
提供了在合适的水性反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时稳定和/或增加具有腈水解酶活性的酶催化剂的比活性的方法，其中反应条件包括有效量的至少一种胺保护剂。
定义
在本公开中使用了一些术语和缩写。除非另有特别指明，否则适用以下定义。
本文所用的术语“包含”意思是存在如权利要求中提到的指明的特征、整体、步骤或成分，但是不排除另外的一个或多个其它特征、整体、步骤、成分或其组合的存在。
本文所用的修饰本发明所用的成分或反应试剂的数量的术语“大约”是指数值量的差异，所述差异可以来自于，例如，在客观世界中配制浓度或使用溶液时的典型的测量和液体操作程序；这些程序中不经意的错误；制备组合物或实施方法时所用的成分的生产商、来源或纯度；等等。
术语“大约”还包括由来自特定的初始混合物的组合物的不同平衡条件所产生的数量上的差异。不论是否以术语“大约”进行修饰，权利要求均包括数量的等同物。在一个实施方式中，术语“大约”意思是在报告的数值的10％以内，优选在报告的数值的5％以内。
本文所用的术语“胺保护剂”、“外源加入的胺保护剂”和“保护剂”相互替换地使用，是指反应混合物中所包括的非天然产生的、分离的或天然为腈水解酶催化剂一部分的化合物，其中胺保护剂包含有效量的至少一个伯胺基团(R-NH2)和/或仲胺基团(R-NH-R2)，其中R和R1可以相同或不同，其中R或R2均不是羰基基团(即伯胺或仲胺基团不是酰胺基团的一部分)。在优选的实施方式中，胺保护剂包含有效数目的伯胺基团。在一个实施方式中，胺保护剂选自多胺聚合物和胺官能化的材料，包括胺官能化的支持材料和胺官能化的聚合物。
本文所用的术语“有效量的胺保护剂”或“有效量的至少一种胺保护剂”是指在乙醇腈转化为乙醇酸(或其铵盐)时改进腈水解酶催化剂的稳定性、比活性和/或催化生产力的胺保护剂的量。在一个实施方式中，“有效量的胺保护剂”是指：与相同反应条件下不存在胺保护剂时相同的催化剂的比活性相比，存在于反应混合物中的引起催化剂的比活性的测定的升高的胺保护剂的量。已知的是：乙醇腈的水溶液通常包含游离甲醛和源自甲醛的杂质(在合成乙醇腈时产生或由于乙醇腈分解产生)。应理解的是：胺保护剂将具有能够与甲醛或源自甲醛的杂质反应的“有效量的游离伯胺和/或仲胺基团”。附加条件是：胺保护剂不包括腈水解酶催化剂中天然产生的或天然存在的化合物(例如，完整细胞催化剂中产生的天然化合物或完整细胞催化剂内的天然化合物或那些在完整细胞提取物中发现的天然化合物)。
本文所用的术语“胺官能化的”或“胺官能化的材料”是指经过化学修饰从而具有一个或多个伯胺和/或仲胺基团的化合物或材料。在一个实施方式中中，胺官能化的材料选自胺官能化的支持材料和胺官能化的聚合物。将化合物进行化学官能化从而使其包含一个或多个胺基团的方法在本领域是熟知的(参见，例如Bickerstaff，G.F.，Immobilization of Enzymes and Cells，Methods in Biotechnology，Volume 1.1997.Humana Press，Totowa，NJ，and Wong，S.S.，Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking，1991.CRC Press，Boca Raton，FL)。
本文所用的术语“胺官能化的支持材料”包括但不限于，无机材料，例如可控孔度玻璃和玻璃珠(例如氨基丙基硅化(aminopropylsilated)玻璃珠)、硅土(silica)、磁石(magnetite)和矾土(alumina)，以及支持材料经常使用的弱碱性阴离子交换树脂以及ω-氨基己基琼脂糖、ω-氨基十二烷基琼脂糖和ω-氨基乙基琼脂糖。在一个实施方式中，胺官能化的材料包含聚乙烯亚胺(即“聚乙烯亚胺官能化的材料”)。
本文所用的术语“胺官能化的聚合物”是指经过修饰从而包括一个或多个伯胺和/或仲胺基团的聚合物。通常，非官能化的聚合物一般不包含有效数目的游离胺基团。
本文所有的术语“游离胺基团”是指胺保护剂上的能够与甲醛反应的伯胺基团(R-NH2)和/或仲胺基团(R-NH-R2)。
本文所有的术语“多胺聚合物”是指包含一个或多个游离胺基团的聚合物。多胺聚合物是从包含至少一个伯胺和/或至少一个仲胺基团的至少一个单体制备的。在一个实施方式中，多胺聚合物包括包含至少一个游离胺基团的共聚物。多胺聚合物的大小范围可以从寡聚物(通常小于1,000道尔顿)至更高分子量的聚合物(1,000道尔顿至10,000,000道尔顿，优选1,000道尔顿至2,000,000道尔顿，更优选1,000道尔顿至1,000,000道尔顿，更优选10,000道尔顿至1,000,000道尔顿)。
本文所用的术语“乙醇腈”缩写为“GLN”，其与羟基乙腈、2-羟基乙腈、羟甲基腈和CAS注册号107-16-4的所有其它同义物是同义的。
本文所用的术语“乙醇酸”缩写为“GLA”，其与羟基乙酸(hydroxyacetic acid)、羟基乙酸(hydroxyethanoic acid)和CAS注册号79-14-1的所有其它同义物是同义的。根据本发明的方法产生的乙醇酸可以是质子化羧酸和/或相应的铵盐的形式。
本文所用的术语“乙醇酸铵”缩写为“NH4GLA”。
本文所用的术语“羟乙酰胺”是氨与乙醇酸反应产生的酰胺，指具有CAS注册号598-42-5的化合物的所有其它同义物。
本文所用的术语“乙交酯”是指CAS注册号502-97-6的化合物。
本文所用的术语“甲醛”缩写为“FA”，其与蚁醛、甲基醛、氧甲烷和CAS注册号50-00-0的所有其它同义物是同义的。商售的甲醛通常包含单体甲醛(“自由甲醛”)和各种甲醛与一些甲醇的寡聚物(通常为大约1wt％至大约15wt％)。
本文所用的术语“氰化氢”与氰酸、氢氰酸和CAS注册号200-821-6的所有其它同义物是同义的。
本文所用的术语“回收”意思是分离、纯化或转移通过本发明的方法形成的产物。从反应混合物中分离和纯化产物的方法在本领域是熟知的，包括但不限于选择性沉淀、结晶、过滤、反应性溶剂提取、离子交换、电渗析、聚合化、蒸馏、热分解、醇解、柱层析及其组合。在一个实施方式中，术语“回收”还可以包括将产物混合物(通常在过滤掉酶催化剂之后)转移至另一个反应以产生一个或多个另外的产物。在优选的实施方式中，使用离子交换来回收乙醇酸。
本文所用的术语“酶催化剂”、“腈水解酶催化剂”或“微生物细胞催化剂”是指这样的催化剂，其特征在于具有将乙醇腈转化为乙醇酸和氨的腈水解酶活性(即包含至少一个具有腈水解酶活性的多肽)。腈水解酶将腈(优选为脂肪族的腈)直接转化为相应的羧酸，不形成相应的作为中间体的酰胺(见反应式1)。腈水解酶具有几个本领域已知的保守性标志结构域，包括在本文中称为“催化标志序列”或“标志序列”的标志结构域。该区域包含必需的半胱氨酸残基(例如SEQ ID NO：4的Cys164)。因此，可以通过是否存在催化结构域标志序列(SEQ ID NO：1)而鉴定具有腈水解酶活性的多肽。在优选的实施方式中，标志序列是SEQ ID NO：2。酶催化剂可以是以下形式：整个微生物细胞，透化的微生物细胞，微生物细胞提取物的一个或多个细胞成分，部分纯化的酶或纯化的酶。酶催化剂可以是游离的(非固定)或固定于可溶或不可溶支持物之内或之上。本文所用的术语“循环使用的酶催化剂”是指在批式反应中作为酶催化剂重新利用的酶催化剂。在优选的实施方式中，酶催化剂是重组表达至少一种具有腈水解酶活性的酶的经转化的微生物宿主细胞，其中所述酶包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的催化标志基序。
本文所用的术语“敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)”和“敏捷食酸菌(A.facilis)”可替换使用，是指保藏于美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(一个国际保藏机构)的保藏号为55746(“ATCC55746”)的敏捷食酸菌72W。以前已经报道了源自敏捷食酸菌72W的突变的腈水解酶，其特征在于将乙醇腈转化为乙醇酸时具有改进的腈水解酶活性(见同一申请人拥有的美国专利7,198,927)。这些源自敏捷食酸菌72W的突变的腈水解酶的例子由SEQ ID NO：27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53和55提供。
本文所用的术语“大肠杆菌(Escherichia coli)”和“大肠杆菌(E.coli)”可替换使用。本文描述了适合用于重组表达的几个大肠杆菌菌株，包括但不限于，国际保藏号为ATCC 47076的大肠杆菌MG1655、国际保藏号为ATCC53911的大肠杆菌FM5、国际保藏号为ATCC 27325的大肠杆菌W3110、国际保藏号为ATCC 35695的大肠杆菌MC4100、国际保藏号为ATCC 12435的大肠杆菌W1485。在一个实施方式中，合适的大肠杆菌菌株包括大肠杆菌FM5(ATCC 53911)和大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)。
本文所用的术语“大肠杆菌SS1001”或“SS1001”是指ATCC保藏号为PTA-1177的表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的转化的大肠杆菌菌株(见美国专利6,870,038，通过引用全文并入本文)。重组表达的大肠杆菌SS1001腈水解酶(SEQ ID NO：57)与野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO：4)相比具有两个微小序列改变。起始密码子从GTG变为ATG以促进重组表达，并且在克隆时引入了引起接近C-末端的单一氨基酸改变(Pro367[CCA]→Ser[TCA])的人造物。
本文所用的术语“合适的水性乙醇腈反应混合物”、“合适的水性反应混合物”和“合适的反应条件”是指实施本方法时的材料和(包括至少一种胺保护剂)和反应条件。本文提供了合适的水性反应混合物的成分，本领域技术人员将认识到适合于本方法的成分变化的范围。
本文所用的术语“水性乙醇酸铵溶液”、“包含乙醇酸铵的水溶液”和“乙醇酸铵的水溶液”用于描述包含乙醇酸铵的水溶液，所述乙醇酸铵在通常的酶反应条件下(即大约6至大约8的pH范围)通过乙醇腈酶法水解产生。乙醇酸铵的水溶液包含浓度为至少大约0.1重量％(wt％)至大约99wt％的乙醇酸铵。在另一个实施方式中，乙醇酸铵的水溶液包含至少大约10wt％至大约75wt％的乙醇酸铵。在另一个实施方式中，乙醇酸铵的水溶液包含至少大约20wt％至大约50wt％的乙醇酸铵。乙醇酸铵的水溶液的pH可以是大约2至大约12，优选为5至大约10，更优选为6至大约8。可以在启动与从乙醇酸铵的水溶液中回收乙醇酸(酸或盐的形式)相关的方法步骤之前根据需要调整pH。
本文所用的术语“催化剂生产力”和“酶催化剂生产力”是指每克催化剂产生的产物的总量。在本方法中，催化剂包含腈水解酶(EC3.5.5.7)，形成的产物是乙醇酸和/或乙醇酸铵(取决于反应的pH)。一般地，本方法在基本上中性pH的条件下进行，从而产生的乙醇酸主要是相应的乙醇酸盐的形式(即乙醇酸铵)。一般地，在具有催化剂循环的批式反应中，催化剂活性随着每个循环反应的进行而降低(酶灭活)。如实施例6所示以及在一个实施方式中，在多个循环反应过程中催化剂的比活性增加，从而引起催化剂生产力的增加。
术语“催化剂比活性”、“比活性”和“腈水解酶比活性”是指：将乙醇腈转化为乙醇酸(或相应的乙醇酸铵)时，每单位质量(例如毫克)的蛋白、干细胞重或珠子重量(固定的催化剂)的酶活性。腈水解酶活性的比较根据干细胞重或珠子重量成比例地测定。由于使用了相同的催化剂和表达系统来比较含有或不含有(即对照)胺保护剂的反应的比活性，所以比较和报告的腈水解酶比活性的改进/增加是相对于干细胞重(dcw)或珠子重量(bw)测定的。本文所用的术语“改进的催化剂比活性”和“改进的比活性”是指观察到的比活性相对于相应的对照的比活性的增加。在相同的反应条件下测定比活性的改进，其中不同之处仅仅在于有或者没有胺保护剂。在一个实施方式中，在多个循环反应中测定比活性的改进。在另一个实施方式中，使用本方法获得的催化剂比活性的改进或增加为至少增加1％，优选至少5％，更优选至少10％，再更优选至少25％。
本文所用的术语“一单位的酶活性”或“一单位的腈水解酶活性”或“U”定义为在指定温度(例如25℃)每分钟生产1μmol的乙醇酸产物所需要的酶活性的数量(GLA U/g干细胞重或珠子重量)。
本文所用的术语“重组生物”、“转化的宿主细胞”、“宿主细胞”、“转化子”、“转基因生物”和“转化的微生物宿主”是指经过异源或外源DNA转化的宿主生物。本发明的重组生物表达外源编码序列或编码活性腈水解酶的基因。“转化”是指将DNA片段转移进入宿主生物。转移的DNA片段可以整合入宿主生物的染色体或以非染色体方式进入宿主生物(即通过载体)。本文所用的术语“转化盒”是指含有一组遗传元件(其进行方便的排列以插入宿主细胞)的特异性DNA片段，通常是作为质粒的一部分。本文所用的术语“表达盒”是指含有一组遗传元件(其方便的排列以插入宿主细胞)的特异性DNA片段，通常是作为质粒的一部分，还允许宿主中增强的基因表达。
本文所用的术语“核酸片段”和“核酸分子”是指可以编码整个基因的DNA分子、编码序列和/或编码序列前面(5’，上游)或后面(3’，下游)的调控序列。在一个方面，本发明的核酸分子编码具有腈水解酶活性的多肽。
本文所用的术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸分子。如本文所用，基因可以包括或不包括编码序列前面的调控序列(5’非编码序列)和编码序列后面的调控序列(3’非编码序列)。“嵌合基因”是指任何不是原态的基因，其包含不一起存在于原态中的调控和编码序列。因此，嵌合基因可以包含来自不同来源的调控序列和编码序列，或来自相同来源但是按照与原态中发现的排列方式不同的方式排列的调控序列和编码序列。“内源基因”是指位于生物基因组的天然位置的原态基因。“外源”基因是指通常不存在于宿主生物中，但是通过基因转移被导入宿主生物中的基因。外源基因可以包含插入非原态生物的原态基因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序被导入基因组的基因。
本文所用的术语“编码序列”是指编码特异氨基酸序列的DNA序列。本文所用的“合适的调控序列”是指位于编码序列上游(5’非编码序列)、编码序列内，或编码序列下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其影响转录、RNA的加工或稳定性，或相连的编码序列的翻译。调控序列可以包括启动子、翻译引导序列、内含子、多腺苷化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。一般地，编码序列位于启动子序列的3’端。启动子可以以完整形式来源于原态基因，或者由源自天然发现的不同启动子的不同元件组成，甚至可以包含合成的DNA片段。在多数细胞类型中在多数时候或多数环境条件下引起基因表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。仅在特定化合物或环境条件存在时引起基因表达的启动子通常被称为“可诱导启动子”。由于在多数情况下调控序列的精确边界已经被完全确定，所以不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。
本文所用的术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上的核酸序列按照一个序列的功能被另一个所影响的方式连接。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即编码序列在启动子的转录控制之下)，启动子与编码序列是可操作地连接。编码序列可以按照正义或反义方向与调控序列可操作地连接。
本文所用的术语“3’非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，包括多腺苷化识别序列(通常限于真核细胞)和其它编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。多腺苷化信号(通常限于真核细胞)的特征通常是影响向mRNA前体的3’末端添加多腺苷酸束。
本领域技术人员完全明白在使用核苷酸密码子指定给定的氨基酸时特异的宿主细胞显示出的“密码子偏向性”。因此，当为了在宿主细胞中改进的表达而合成基因时，需要将该基因设计为其密码子的使用反映宿主细胞中优选的密码子偏向性。对于源自宿主细胞的基因的调查(其中序列信息是可以获得的)可以确定其密码子偏向性。密码子的最优化是本领域熟知的，已经描述了对于各种系统中的密码子的最优化，包括但不限于酵母(Outchkourov等人，Protein Expr Purif，24(1)：18-24(2002))和大肠杆菌(Feng等人，Biochemistry，39(50)：15399-15409(2000))。
腈水解酶催化剂
所有的腈水解酶(EC 3.5.5.7)均具有保守性催化三元组(Glu，Lys和Cys)(Chauhan等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.61：118-122(2003)；Pace，H.and Brenner，C.，Genome Biol.2(1)：reviews0001.1-0001.9(2001))。所有已知的腈水解酶均在酶活性位点具有亲核的半胱氨酸(Cowan等人，Extremophiles，2：207-216(1998)；Pace，H.and Brenner，C.，见上；和Chauhan等人，见上)并且都对巯基反应剂的灭活敏感(1.0mM浓度的氯化铜、硝酸银、醋酸汞或氯化铁每个均引起敏捷食酸菌72W腈水解酶酶活性的大幅下降)。半胱氨酸残基还能够被不可逆地氧化为亚磺酸，导致酶活性的损失。虽然腈水解酶对各种灭活机制有敏感性，但是固定的敏捷食酸菌72W细胞是强壮的(robust)，能够在多个循环反应后保留其大部分腈水解酶活性(US 6,870,038；U.S.7,148,051；U.S.7,198,927；和Chauhan等人，见上)。也已经显示源自敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶催化剂催化α-羟基腈(即乙醇腈)向α-羟基羧酸(即乙醇酸)的转化(参见US 6,383,786；US 6,416,980；和U.S.7,198,927)。
已经报道了敏捷食酸菌72W腈水解酶与其它细菌腈水解酶的序列比较(US 6,870,038；Chauhan等人，见上)。72W腈水解酶具有几个保守性标志结构域，包括靠近氨基末端处的16个氨基酸的区域(SEQ ID NO：4的氨基酸残基40-55)和含有必需的半胱氨酸残基的12个氨基酸的催化区域(SEQ IDNO：4的氨基酸残基160-171)。这个必需的半胱氨酸残基(SEQ ID NO：4的Cys164)以及保守性的谷氨酸(SEQ ID NO：4的Glu48)和赖氨酸残基(SEQID NO：4的Lys130)构成在所有腈水解酶中发现的催化三元组基序(Pace，H.，and Brenner，C.，见上)。
每个催化三元组残基周围的区域是高度保守的，特别是催化性半胱氨酸残基周围的区域。必需的催化性半胱氨酸残基位于被称为“催化标志基序”或“标志基序”的高度保守性区域内。因此，本方法可用于保护包含式1(粗体代表严格保守性氨基酸残基，斜体残基是显示极小可变性的残基[即3个或更少的氨基酸残基的极小变化]，催化性半胱氨酸残基以下划线标出)定义的催化标志基序的任意腈水解酶的酶活性：
式1(SEQ ID NO：1)
Gly-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Cys-Trp-Glu气Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8
其中
Xaa1＝Ala或Gly；
Xaa2＝Leu，Val或Ala；
Xaa3＝Ala，Asn，Ile，Cys，Val或Gln；
Xaa4＝His或Asn；
Xaa5＝Leu，Tyr，Phe，Ala，Met，Lys，Val，Thr或Arg；
Xaa6＝Asn，Gln，Met，Leu或Ser；
Xaa7＝Pro或Thr；和
Xaa8＝Leu或Val。
在优选的实施方式中，式1的腈水解酶标志基序是Xaa1＝Ala或Gly；Xaa2＝Leu；Xaa3＝Ala、Asn、Ile、Cys、Val或Gln；Xaa4＝His；Xaa5＝Leu、Tyr、Phe、Ala、Met、Lys、Val、Thr或Arg；Xaa6＝Ser、Gln、Asn或Met；Xaa7＝Pro；和Xaa8＝Leu；从而产生由下式代表的催化标志基序：
Gly-Xaa1-Leu-Xaa3-Cys-Trp-Glu-His-Xaa5-Xaa6-Pro-Leu(SEQ ID NO：2)。
在表1中提供了腈水解酶的例子，包括相应的催化标志基序序列的序列和位置。
表1.保守性催化性半胱氨酸区域-催化标志基序
Figure BPA00001178557700201
Figure BPA00001178557700211
在一个实施方式中，腈水解酶催化剂包含具有腈水解酶活性的多肽，所述多肽分离自下列属：食酸菌属、红球菌属、诺卡氏菌属、芽孢杆菌属和产碱杆菌属。在一个实施方式中，腈水解酶催化剂包含具有腈水解酶活性的多肽，所述多肽分离自下列属：食酸菌属和红球菌属。
在另一个实施方式中，具有腈水解酶活性的多肽源自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)或者与敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO：4)或源自敏捷食酸菌72W的酶(由SEQ ID NO：51代表)实质上相似的多肽(具有腈水解酶活性)。
在一个实施方式中，腈水解酶催化剂是经过转化以表达至少一个具有腈水解酶活性的多肽的微生物宿主细胞。在一个实施方式中，转化的宿主细胞选自丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、红球菌属(Rhodococcus sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、梭菌属(Clostridium sp.)、克雷伯菌属(Klebsiella sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、酵母菌属(Saccharomyces sp.)、耶氏酵母属(Yarrowia sp.)、接合酵母属(Zygosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)、假丝酵母属(Candida sp.)、汉逊酵母属(Hansenula sp.)、杜氏藻属(Dunaliella sp.)、德巴利酵母属(Debaryomyces sp.)、毛霉属(Mucor sp.)、球拟酵母属(Torulopsis sp.)、甲基杆菌属(Methylobacteria sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、埃希氏菌属(Escherichia sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)和链霉菌属(Streptomyces sp.)。在优选的实施方式中，微生物宿主细胞选自芽孢杆菌属、假单胞菌属和埃希氏菌属。在优选的实施方式中，催化剂是重组表达一个或多个具有腈水解酶活性的多肽的大肠杆菌宿主细胞。
在另一个实施方式中，腈水解酶催化剂包含具有腈水解酶活性的多肽，其中所述具有腈水解酶活性的多肽与SEQ ID NO：51具有至少60％的同一性，优选与SEQ ID NO：51具有至少70％的同一性，更优选与SEQ ID NO：51具有至少80％的同一性，再更优选与SEQ ID NO：51具有至少90％的同一性，最优选与SEQ ID NO：51具有至少95％的同一性。
本文描述了源自各种来源的具有腈水解酶活性的几个催化剂的工作实例，包括源自敏捷食酸菌72W腈水解酶的催化剂。本领域已经报道了源自敏捷食酸菌72W腈水解酶的各种突变体(美国专利7,148,051和美国专利7,198,927)。
在一个实施方式中，具有腈水解酶活性的多肽选自SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55和57。在另一个实施方式中，具有腈水解酶活性的多肽选自4、24、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55和57。在另一个实施方式中，具有腈水解酶活性的多肽选自4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55和57。在另一个实施方式中，具有腈水解酶活性的多肽选自4、24、25和51。在另一个实施方式中，腈水解酶催化剂包含SEQ ID NO：51的多肽。
胺保护剂
胺保护剂是向水性反应混合物中外源添加的任何化合物(例如，不是由酶催化剂天然产生的，不是在酶催化剂中天然发现的，不是从酶催化剂天然分离的)，其包含能够与甲醛反应的至少一个伯胺基团(R-NH2)和/或仲胺基团(R-NH-R2)，其中R和R1可以相同或不同，其中R或R2均不是羰基基团(即不是酰胺基团)。还应理解本发明的酶催化剂水解腈基团，因此，胺保护剂优选不包括能够被腈水解酶催化剂水解的腈基团。在优选的实施方式中，胺保护剂是外源添加至反应混合物中的包含至少一个伯胺基团的化合物或成分。
在本发明的一个实施方式中，向反应混合物中加入有效量的至少一种胺保护剂。本文所用的“有效量的胺保护剂”是引起乙醇腈酶法转化为乙醇酸过程中催化剂的比活性、稳定性或催化生产力的可检测的改进所需的胺保护剂的量。本领域技术人员熟知的是，可以调节水性反应混合物中胺保护剂的量从而达到想要的效应。在一个方面，向反应混合物中加入的胺保护剂的量包含：相对于存在于反应混合物中的甲醛的量来说，摩尔过量的游离胺基团。在一个方面，反应混合物包含至少0.01ppm甲醛。在另一方面，反应混合物中胺保护剂的量包含：游离胺基团(伯胺、仲胺或其组合)相对于存在于反应混合物中的游离甲醛(HCHO)的量的摩尔比为0.001∶1.0至1.0∶0.001，优选为至少0.5∶1.0。
在一个方面，胺保护剂选自：
a)式[R3](1+X)-NH(2-X)的化合物，其中X是0或1，R3独立地是C1-C20烃基基团或取代的烃基基团；其中R3任选地包含一个或多个醚键；条件是(i)取代的基团优选不是能够与腈水解酶催化剂反应的氰基基团和(ii)R3不是羰基基团；
b)包含有效数目的游离胺基团的多胺聚合物；和
c)包含有效数目的游离胺基团的胺官能化的材料；
其中，胺保护剂不是由酶催化剂天然产生的。
烃基基团R3可以是直链、支链、环状、多环状或芳香族的。本文所用的术语“烃基”、“烃基基团”和“烃部分”是指由碳碳单键、双键或三键和/或通过醚键连接的以及相应地以氢原子取代的碳原子的直链、支链或环状排列。这样的烃基基团可以是脂肪族和/或芳香族的。烃基基团的例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、戊基、环戊基、甲基环戊基、己基、环己基、苄基和苯基。在优选的实施方式中，烃部分是由碳碳单键和/或通过醚键连接的以及相应地以氢原子取代的碳原子的直链、支链或环状排列。本文所用的“取代的烃基”是指经过取代并且包含一个或多个取代基团的基团，所述取代基团不引起底物、催化剂或产物在想要的用途或反应中变得不稳定或者不适合于想要的用途或反应。通常有用的取代基团包括醚、酯、卤素、氨基(包括伯胺、仲胺和叔胺基团)、羟基、亚乙烯基或取代的亚乙烯基、甲硅烷基或取代的甲硅烷基、硝基、亚硝基、亚磺酰基、磺酰基、磺酸碱金属盐、硼烷基(boranyl)或取代的硼烷基和硫醚。
在一个实施方式中，胺保护剂是包含有效数目的游离胺基团的多胺聚合物。在另一个实施方式中，多胺聚合物包括包含有效数目的游离胺基团的共聚物。多胺聚合物的大小范围可以从寡聚物(通常小于1,000道尔顿)至更高分子量的聚合物(1,000道尔顿至10,000,000道尔顿，优选1,000道尔顿至2,000,000道尔顿，更优选1,000道尔顿至1,000,000道尔顿，更优选10,000道尔顿至1,000,000道尔顿)。
在一个实施方式中，多胺聚合物选自：2-氨基-2-脱氧-(1→4)-β-D-吡喃葡萄聚糖(glucopyranan)(即壳聚糖)，具有2-10个碳原子的亚烷基部分的聚亚烷基胺聚合物，聚乙烯亚胺，聚烯丙胺，聚乙烯醇/聚乙烯胺共聚物，D-聚赖氨酸，L-聚赖氨酸，D/L聚赖氨酸的混合物，以戊二醛交联的聚乙烯亚胺，及其混合物。在优选的实施方式中，多胺聚合物是聚乙烯亚胺聚合物(直链或支链的)和包含聚乙烯亚胺的共聚物。在另一个优选的实施方式中，多胺聚合物是以戊二醛交联的聚乙烯亚胺。在另一个优选的实施方式中，酶催化剂固定于包含以戊二醛交联的聚乙烯亚胺的颗粒或珠子之中或之上。
胺保护剂在水性反应混合物中可以是可溶的或不可溶的。可以使用本领域熟知的任意数目的分离方法(例如，离子交换或色谱技术)从后续的产物混合物中将可溶性胺保护剂分离出来。取决于可溶性胺保护剂的化学性质，本领域技术人员可以通过调节反应过程之后的条件以从产物混合物中选择性沉淀或吸附一种或多种成分，从而从乙醇酸(或乙醇酸铵)产物中分离胺保护剂。对于某些应用，可能不需要从产物混合物中除掉可溶性胺保护剂，特别是那些不需要高纯度乙醇酸和/或乙醇酸铵的应用。
在优选的实施方式中，胺保护剂在水性反应混合物中是实质上不可溶的。不可溶胺保护剂的使用促进了从得到的水性产物混合物中进行简单的分离/分离(即过滤、离心等)。在另一个优选的实施方式中，胺保护剂是在水性反应混合物中不可溶的多胺聚合物。
在另一个实施方式中，胺保护剂是不可溶的胺官能化的材料，可以包括胺官能化的支持材料和胺官能化的聚合物。对不可溶材料进行化学修饰以使其包括至少一个伯胺基团的方法在本领域是熟知的(例如，参见Bickerstaff，G.F.，Immohilization of Enzymes and Cells，Methods in Biotechnology，Volume1.1997.Humana Press，Totowa，NJ，and Wong，S.S.，Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking，1991.CRC Press，Boca Raton，FL)。
可用于本方法的包含有效数目的游离胺基团(或经过官能化以含有有效数目的游离胺基团)的胺官能化的材料可以包括但不限于，经过化学官能化以含有一个或多个氨基基团的多糖(例如，胺官能化的聚糖、琼脂糖、角叉菜胶、藻酸盐、葡聚糖和纤维素)，甲基丙烯酸酯，聚氨酯，聚酯，尼龙，矾土，硅土，聚苯乙烯，聚乙烯醇，磁石，和可控孔度玻璃。可以使用聚亚烷基胺聚合物(通常具有2-12个碳原子的亚烷基部分)和聚亚烷基胺官能化的支持材料，还可使用可溶的或不可溶的聚乙烯胺聚合物，聚乙烯胺官能化的支持材料，聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺聚合物(直链或支链的)，以戊二醛交联的聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺离子交换树脂，弱碱性阴离子交换树脂(例如，
Figure BPA00001178557700251
弱碱性阴离子交换树脂IRA-95、IRA-96、IRA-67和IRA-92(可从Rohm and Haas，Philadelphia，PA获得)和
Figure BPA00001178557700252
WA20或WA21J(可从Mitsubishi Chemical，Tokyo，Japan获得)，聚乙烯亚胺-纤维素，聚乙烯亚胺-硅土，聚烯丙胺，聚乙烯醇/聚乙烯胺共聚物，聚赖氨酸(D，L，或D/L混合物)，ω-氨基己基琼脂糖、ω-氨基十二烷基琼脂糖和ω-氨基乙基琼脂糖，氨基丙基硅化玻璃珠，及其组合。在优选的实施方式中，胺保护剂不包括能够被腈水解酶催化剂水解的氰基基团。
在一个实施方式中，纤维素、几丁质和其它天然产生的碳水化合物的氨基烷基-，氨基(羟基烷基)-，氨基烷基-醚-，和氨基(羟基烷基)-醚衍生物优选选自：
H2N-(CH2)n-[碳水化合物]，其中n＝1-10，包括烷基异构体；
H2N-(CH2)m-CHOH-(CH2)n-[碳水化合物]，其中m＝0-10且n＝0-10；
H2N-(CH2)n-O-[carbohydrate]，其中n＝1-10；和
H2N-(CH2)m-CHOH-(CH2)n-O-[碳水化合物]，其中m＝0-10且n＝0-10。
在另一个实施方式中，纤维素、几丁质和其它天然产生的碳水化合物的氨基苯基-或氨基苄基衍生物优选选自：
H2N-C6H4-(CH2)n-[碳水化合物]，
H2N-CH2-C6H4-(CH2)n-[碳水化合物]，
H2N-C6H4-(CH2)n-O-[碳水化合物]，其中n＝0-10，和
H2N-C6H4-(CH2)m-CHOH-(CH2)n-O-[碳水化合物]，其中m＝0-10且n＝0-10，包括其对-、邻-和间-苯环氨基异构体、氨基甲基异构体及烷基基团异构体。
胺官能化的材料还可以作为混合的多糖-聚合物衍生物来制备，其中伯胺、氨基烷基(每个烷基基团1-10个碳原子)、氨基羟基烷基(每个烷基基团1-10个碳原子，每个烷基基团1-10个羟基基团)、氨基苯和/或氨基烷基苯(每个烷基基团1-10个碳原子)官能团与基质(例如纤维素或几丁质的表氯醇共聚物)共价结合，其中烃间隔基团可以包括烯基以及烷基基团。
非多糖-聚合物衍生物，其中伯胺、氨基烷基(每个烷基基团1-10个碳原子)、氨基羟基烷基(每个烷基基团1-10个碳原子，每个烷基基团1-10个羟基基团)、氨基苯和/或氨基烷基苯(每个烷基基团1-10个碳原子)官能团与多种合成聚合物(包括聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，聚乙烯醇及其交联衍生物)中的任一种共价结合，其中烃间隔基团可以包括烯基以及烷基基团。
在另一个实施方式中，酶催化剂固定于包含至少一种胺保护剂的基质中。在另一个实施方式中，酶催化剂固定于包含有效数目的游离胺基团的不可溶基质中。在优选的实施方式中，不可溶基质提供有效数目的伯胺基团(即以戊二醛和聚乙烯亚胺交联的角叉菜胶珠子)。
在那些不必从最终产物中除去不可溶胺保护剂添加物的应用中，或者可以容易地从产物混合物中除去所述添加物时(例如通过离子交换或蒸馏)，可以使用可溶性胺保护剂。可溶性胺保护剂的例子包括但不限于上述不可溶聚合物的可溶形式(例如可溶性低分子单体)，包含一个或多个伯胺基团的C1-C12脂肪族、环脂肪族或芳香族化合物，1-氨基-2-乙醇，1-氨基2-丙醇，Tris缓冲液，乙烯二胺和相似的包含至少一个伯胺基团的可溶性胺保护剂。
在优选的实施方式中，胺保护剂是聚乙烯亚胺。在另一个优选的实施方式中，腈水解酶催化剂固定于以戊二醛和聚乙烯亚胺交联的不可溶基质中。
本领域技术人员可以调节反应混合物中胺保护剂的量以达到想要的效果(即腈水解酶活性的改进；本文中也称为“有效量”)。在一个实施方式中，胺保护剂的浓度至少是0.01mg/mL，优选为至少0.1mg/L，更优选为至少1mg/mL，最优选为5mg/mL。
使用腈水解酶催化剂将乙醇腈水解为乙醇酸
乙醇腈向乙醇酸(酸和/或相应的铵盐的形式)的酶法转化这样进行：使用如下所述的合适的酶反应条件组(pH范围，温度，浓度等)将酶催化剂(包含具有腈水解酶活性的多肽)与合适的包含乙醇腈的水性反应混合物接触。在一个实施方式中，可以使用整个重组微生物细胞作为酶催化剂而不经过任何预处理。在另一个实施方式中，可以将微生物细胞催化剂直接加到反应混合物中，或使用中空纤维膜卷或超滤膜相对于大宗(bulk)反应混合物单独保持微生物细胞催化剂。在另一个实施方式中，微生物细胞可以固定于聚合物基质(例如角叉菜胶或聚丙烯酰胺凝胶(PAG)颗粒)中或固定在不可溶固体支持物(例如硅藻土)上以促进酶催化剂的回收和再利用(US6,870,038；通过引用并入本文)。在另一个实施方式中，还可以从整个细胞中分离纯化的或部分纯化的酶并直接用作催化剂，或者酶可以固定于聚合物基质中或固定于不可溶支持物上。已经广泛报道过固定细胞的或用于分离的酶的方法，这些方法对本领域技术人员是熟知的(Methods in Biotechnology，Vol.1：Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997))。以前曾经报道过敏捷食酸菌72W腈水解酶催化剂的固定(US 6,870,038)。
水性反应混合物中的酶催化剂的浓度取决于酶催化剂的比活性并根据想要获得的反应速率来进行选择。水解反应中用作催化剂的微生物细胞的湿细胞重通常介于每毫升总反应体积中有0.001克至0.250克的湿细胞，优选为每毫升0.002克至0.050克的湿细胞。
将乙醇腈水解反应的温度选定为既控制反应速率又控制酶催化剂活性的稳定性。反应的温度可以是：稍微高于反应混合物的凝固点(大约0℃)至大约65℃，优选的反应温度范围是大约5℃至大约35℃。可以通过将细胞悬浮于蒸馏水或缓冲剂的水溶液(其将会把反应的初始pH保持在大约5.0至大约10.0，优选大约5.5至大约8.0，更优选大约5.5至大约7.7，最优选大约6.0至大约7.7)中而制备微生物细胞催化剂悬浮液。随着反应的进行，反应混合物的pH将变化，这是由于从相应的腈官能团形成了羧酸的铵盐。可以将反应进行到完全实现乙醇腈的转化而不控制pH，或者可以随着反应的进程加入合适的酸或碱以保持想要的pH。
发现乙醇腈在25℃时以任意比例与水完全混溶。在反应条件被选定为底物(即α-羟基腈)的溶解性也依赖于溶液的温度和/或水相中盐的浓度(缓冲剂或产物乙醇酸铵盐，也称为乙醇酸铵)的情况下，初始的反应混合物可以由两相组成：含有酶催化剂和溶解的α-羟基腈的水相，和有机相(未溶解的α-羟基腈)。随着反应的进行，α-羟基腈溶解到水相中，最终获得单一相的产物混合物。反应还可以这样进行：以大约等于酶法水解反应速率的速率向反应混合物中加入α-羟基腈，从而保持单一相的水性反应混合物，并避免在高浓度的起始材料时酶的底物抑制的潜在问题。
乙醇酸可以作为质子化羧酸和/或其相应铵盐(取决于产物混合物的pH；乙醇酸的pKa是大约3.83)的混合物存在于产物混合物中，另外可以作为羧酸与产物混合物中可能另外存在的任何缓冲剂的盐而存在。通常，产生的乙醇酸主要是铵盐的形式(乙醇腈水解反应的pH通常为大约5.5至大约7.7)。根据需要，可以以质子化羧酸或羧酸盐的形式将乙醇酸产物从反应混合物中分离出来。
乙醇腈完全转化时产物混合物中乙醇酸的终浓度为0.001M至乙醇酸产物的溶解度上限。在一个实施方式中，乙醇酸的浓度为大约0.10M至大约5.0M。在另一个实施方式中，乙醇酸的浓度为大约0.2M至大约3.0M。
可以使用多种技术(包括但不限于，离子交换、电渗析、反应性溶剂提取、聚合化、热分解、醇解，及其组合)以酸或对应的盐的形式回收乙醇酸(参见同一申请人的美国专利申请公开号2006-0247467)。
微生物表达
腈水解酶催化剂可以在异源宿主细胞中产生，优选在微生物宿主中产生。在本发明中特别有用的是可容易地适用于大规模发酵方法的细胞。这样的生物在工业生物加工领域是熟知的，可以在Recombinant Microbes for Industrial and Agricultural Applications，Murooka等人，eds.，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY(1994)中找到其例子，其中包括可发酵细菌以及酵母和丝状真菌。宿主细胞包括但不限于，丛毛单胞菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、红球菌属、固氮菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母菌属、耶氏酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、杜氏藻属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基杆菌属(Methylobacteria sp.)、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、根瘤菌属和链霉菌属。特别优选的是大肠杆菌。可以表达突变的腈水解酶基因的合适的大肠杆菌宿主细胞的例子包括但不限于本文指明的宿主细胞和MG1655(ATCC 47076)，FM5(ATCC 53911)，W3110(ATCC 27325)，MC4100(ATCC 35695)，W1485(ATCC 12435)，及其衍生物。在另一方面，优选的大肠杆菌宿主菌株是MG1655(ATCC 47076)或FM5(ATCC 53911)。
以前曾经报道过敏捷食酸菌72W腈水解酶的异源表达(Chauhan等人，见上；US 6,870,038；U.S.7,148,051；和U.S.7,198,927)。Chauhan等人报道了表达活性敏捷食酸菌72W腈水解酶的(SEQ ID NO：57)的大肠杆菌菌株(大肠杆菌SS1001(ATCC PTA-1177))。重组表达的(大肠杆菌SS 1001)腈水解酶的编码序列与野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO：3和4)相比具有两个微小序列改变。起始密码子从GTG变为ATG以促进重组表达，并且在克隆时引入了引起接近C-末端的单一氨基酸改变(Pro367[CCA]→Ser[TCA])的人造物。
在适合工业的宿主中进行重组表达有几个优点。第一，用于通常使用的很多生产宿主的遗传工具箱相对于很多微生物(从其中获得目标基因)可获得的遗传工具来说发展较好。这些宿主中的重组表达通常比本体宿主中的表达成本更低。例如，已经表明，当通过发酵生长时，敏捷食酸菌72W细胞在甘油(一种相对昂贵的碳底物)上生长，使用便宜的葡萄糖未能使其成功生长。相反，大肠杆菌转化子可以在葡萄糖上生长，其生长至与敏捷食酸菌72W细胞相同的细胞密度时仅需要其大约一半的时间，这显著降低了生物催化剂生产的成本(US 6,870,038)。
微生物表达系统和含有指导外源蛋白高水平表达的调控序列的表达载体对本领域技术人员是熟知的。这些可用于构建产生基因产物的嵌合基因。然后可以通过转化将这些嵌合基因导入合适的微生物中以提供想要的腈水解酶的高水平表达。
嵌合基因对于改变宿主细胞的性质是有效的。例如，将编码本发明的腈水解酶(在合适的启动子控制下)的嵌合基因的至少一个拷贝导入宿主细胞中引起宿主细胞的将乙醇腈转化为乙醇酸的能力的改进。嵌合基因将包含合适的调控序列以用于驱动本发明的突变的腈水解酶序列的基因表达。合适的调控序列可以包括但不限于启动子、翻译引导序列和核糖体结合位点。优选的是这些序列源自宿主生物；但是，本领域技术人员将认识到也可以使用异源调控序列。
可以通过将嵌合基因克隆进入合适的表达载体而将嵌合基因导入合适的宿主。用于转化合适的宿主细胞的载体或盒在本领域是熟知的。通常，载体或盒包含指导相关基因的转录和翻译的序列、选择性标记物和允许自身复制或染色体整合的序列。合适的载体包含编码序列的5’区域(其具有转录起始控制)和DNA片段的3’区域(其控制转录终止)。最优选的是两个控制区域均源自与宿主细胞同源的基因，虽然这样的控制区域不必源自对于选作生产宿主的特异性物种来说为原态的基因。
在一个实施方式中，调控序列将包括启动子。启动子可以是组成型或可诱导的。可诱导的启动子通常对特异性刺激起反应(例如，IPTG或乳糖诱导的lac启动子)。可诱导启动子可以对多种刺激起反应，包括，仅举几个例子：化学物质、生长周期、温度变化、pH变化和摩尔渗透压浓度变化。
可用于在需要的宿主细胞中驱动腈水解酶表达的起始控制序列或启动子是多种多样的，本领域技术人员对此是熟悉的，包括但不限于，CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于酵母菌属中的表达)；AOX1(可用于毕赤酵母属中的表达)和lac、trp、lPL、lPR、T7、tac、PBAD、npr，以及trc(特别可用于大肠杆菌中的表达)。特别适合用于驱动大肠杆菌中的表达的启动子的其它的例子包括但不限于，大肠杆菌的色氨酸操纵子启动子Ptrp、大肠杆菌的乳糖操纵子启动子Plac、大肠杆菌的Ptac启动子、噬菌体λ右启动子PR、噬菌体λ左启动子PL、T7启动子和来自巴斯德毕赤酵母的GAP基因的启动子，或是分离自以下微生物组的至少一个启动子，所述微生物选自丛毛单胞菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、红球菌属、固氮菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母菌属、毕赤酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、杜氏藻属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、根瘤菌属和链霉菌属。
终止控制区域还可以源自各种对于优选宿主来说为原态的基因。任选地，终止位点可以是不必要的，但是，最优选还是有终止位点。
另外，插入的遗传材料可以包括核糖体结合位点(RBS)。核糖体结合位点可以来自噬菌体λCII基因或选自来自以下生物的基因的核糖体结合位点：丛毛单胞菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、红球菌属、固氮菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母菌属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、杜氏藻属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、根瘤菌属和链霉菌属。
任选地，基因产物优选为转化宿主的分泌产物。想要的蛋白分泌到生长培养基中可以简化纯化程序并降低成本。分泌信号序列经常用于促进可以跨越细胞膜表达的蛋白的活性转运。可以通过将编码分泌信号的DNA序列导入宿主来产生能够分泌的转化宿主。选择合适的信号序列的方法在本领域是熟知的(参见例如EP 546049；WO 93/24631)。分泌信号DNA可以位于控制表达的DNA和该编码序列或编码序列片段之间，并且与后者同处于读码框中。
微生物催化剂的工业生产
当需要进行腈水解酶催化剂的商业生产时，可以使用多种培养方法。可以使用本领域熟知的方法以批式、补料-分批或连续模式进行发酵运行(Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，(1989)；Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.36(3)：227-234(1992))。
经典的批式培养方法是封闭的系统，其中在培养开始时设定培养基的成分，在培养过程中不进行人工改变。因此，在培养过程开始时将需要的生物接种到培养基并允许其生长或产生代谢活性(不向系统中加入任何物质)。但是，通常来讲，“批式”培养是添加碳源意义上的批，经常需要尝试控制一些因素例如pH和氧气浓度。在批式系统中，系统的代谢物和生物质成分持续变化，直至培养结束。在批式培养内，细胞从静态延迟期缓慢到达高速生长对数期，最终到达稳定期，在稳定期生长速率降低或停止。如果不处理的话，处于稳定期的细胞最终将死亡。在一些系统中，处于对数期的细胞通常负责大量生产终产物或中间体。在其它系统中可以在稳定期或指数期之后获得生产。
补料-分批系统是标准批式系统的变体。补料-分批培养过程也适合于本发明，其包含典型的批式系统，只不过随着培养过程的进行逐渐增加底物的投入。当分解代谢物阻遏倾向于抑制细胞的代谢并且需要限制培养基中底物的数量时，补料-分批系统是有用的。补料-分批系统中的实际底物浓度是难以测定的，因此基于可测因素(例如pH、溶解氧和废气(例如CO2)分压)的变化来评估。批式和补料-分批培养方法是常见的也是本领域熟知的，可以在Brock(见上)和Deshpande(见上)中找到例子。
还可以通过连续培养实现具有腈水解酶催化剂的商业生产。连续培养是开放的系统，其中向生物反应器中连续加入确定的培养基，同时为了处理除掉等量的条件化培养基。连续培养通常将细胞保持在恒定的高液相密度，其中细胞主要处于对数生长期。或者，可以以固定的细胞进行连续培养，其中连续加入碳和营养物并且从细胞物质中连续除掉有用的产物、副产物或废弃产物。可以使用多种固体支持物(由天然和/或合成材料组成)进行细胞的固定。
连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终细胞浓度的一个因子或任意数目的因子。例如，一种方法将限制性营养物(例如碳源或氮水平)保持在固定速率并允许所有其它参数变缓。在其它系统中，可以持续改变一些影响生长的因子但保持细胞浓度(根据培养液浑浊度测定)恒定。连续系统努力保持稳定态生长条件，因此在培养物中必须保持由于培养液排除而造成的细胞损失与细胞生长速率之间的平衡。调节连续培养过程的营养物和生长因子的方法以及使细胞的生成速率最大化的技术在工业微生物领域是熟知的，Brock(见上)中详细描述了多种这样的方法。
本发明的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的底物可以包括但不限于：单糖例如葡萄糖和果糖，二糖例如乳糖或蔗糖，多糖例如淀粉或纤维素或其混合物，以及来自可再生原料(例如干酪乳清渗透物、玉米浸泡液、甜菜糖蜜和大麦麦芽)的未纯化的混合物。因此，考虑到本发明中使用的碳源可以包括很多种含碳底物，这将仅由生物体的选择所限定。
申请人特别将所有引用的参考文献的全文内容并入本文。另外，当以范围、优选的范围或优选值的上限和优选值的下限给出数量、浓度或其它数值或参数的时候，应理解为具体公开了任意一对任意范围上限或优选值与任意范围下限或优选值之间形成的所有的范围，不论是否单独公开了这样的范围。除非另有指明，否则当本文中提到数值的范围时，该范围旨在包括其端点值和该范围内的所有整数和分数。当定义一个范围时，其目的不是将本发明的范围限定为具体的数值。
一般性方法
提供了以下实施例以证明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应该认识到，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实施本发明时很好地发挥作用的技术，因此其可以被认为构成本发明实施的优选模式。但是，根据本公开，本领域技术人员应认识到可以不脱离本发明的精神和范围对所公开的特异性实施方式作出很多修改并仍然获得相同或相似的结果。
适合用于维持细菌培养物和细菌培养物生长的材料和方法在本领域是熟知的。可以在以下文献中找到适合用于以下实施例的技术：Manual of  Methods for General Bacteriology(1994)(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg and G.Briggs Phillips，eds.)，American Society for Microbiology，Washington，DC.)或Thomas D.Brock，in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，(1989)Second Edition，(Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA).Methods to immobilize enzymatic catalysts can be found in Bickerstaff，G.F.，见上)。
制备基因组DNA、PCR扩增、通过内切和外切核酸酶修饰DNA以产生想要的DNA克隆的末端、连接和细菌转化所需的程序在本领域中是熟知的。本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是熟知的，见以下描述：Maniatis，上文；和T.J.Silhavy，M.L.Bennan，和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，(1984)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring，NY；以及by Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，(1994-1998)John Wiley & Sons，Inc.，New York。
除非另有指明，否则所有的反应试剂和材料均购自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma/Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)。
说明书中对应于测定单位、技术、性质或化合物的缩写如下：“sec”意思是秒，“min”意思是分钟，“h”或“hr”意思是小时，“d”意思是以g/mL表示的密度，“μL”意思是微升，“mL”意思是毫升，“L”意思是升，“mM”意思是毫摩尔，“M”意思是摩尔，“mw”意思是平均分子量，“mmol”意思是毫摩，“wt”意思是重量，“wt％”意思是重量百分率，“g”意思是克，“μg”意思是微克，“HPLC”意思是高效液相色谱，“O.D.”意思是在指定波长时的光密度，“dcw”意思是干细胞重，“U”意思是腈水解酶活性单位，“EDTA”意思是乙二胺四乙酸，“DTT”意思是二硫苏糖醇，“DI”意思是蒸馏的且去离子的，“NCIMB”意思是National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria，Bucksburn，Aberdeen，Scotland，UK。一单位的腈水解酶活性对应于每分钟水解1μmol的乙醇腈。
分析方法
HPLC分析
除非另有指明，否则使用以下的HPLC方法。通过以下HPLC方法分析反应的产物混合物。向1.50mL水中加入反应混合物的等份(0.01mL)并通过HPLC分析(HPX 87H柱，30cmx7.8mm；0.01N H2SO4移动相；50℃，流速1.0mL/min；10μL注射体积；RI检测器，20分钟分析时间)。使用从Aldrich购买的商售乙醇腈的系列稀释将方法进行针对乙醇腈的校准。
实施例1
未固定的大肠杆菌MG1655/pSW138-168V的腈水解酶比活性对于添加 的聚乙烯亚胺的依赖
在25℃向20-mL的带有磁性搅拌子的玻璃瓶中加入1.0mL 25.0mg(干细胞重)/毫升大肠杆菌MG1655/pSW138-168V(SEQ ID NO：51)悬浮液(处于0.1M KH2PO4缓冲液(pH7.5)中)，以及1.0ml 0.3M KH2PO4缓冲液(pH7.5)或1.0mL 10.2mg/mL的聚乙烯亚胺溶液(BASF
Figure BPA00001178557700351
PS，750,000mw；BASF Aktiengesellschaft，Ludwigshafen，Germany)(处于0.3MKH2PO4缓冲液(pH7.5)中)。在25℃边搅拌边加入2.0mL含有乙醇腈(1.0M)和甲醛(8mM，1mM或0.04mM)(处于去离子蒸馏水中)的水溶液，使用恒温浴将反应混合物保持在25℃。在第5，10，15和30分钟，取出100μl等份的反应混合物并与100μl水，10μl 6.0N HCl和水中的200μl0.25M正丙烷(HPLC外部标准)混合，将混合物离心并通过HPLC分析得到的上清液，从而确定初始反应速率和催化剂比活性(U/g dcw)(表2)。
表2.存在和不存在添加的聚乙烯亚胺(PEI)时生物催化剂的比活性对于甲醛浓度的依赖
  乙醇腈(mM)   甲醛(mM)   PEI(mg/mL)   比活性(U/g dcw)
  500   4.0   0   471
  500   4.0   5.1   1484
  500   0.50   0   1344
  500   0.50   5.1   1726
  500   0.02   0   1742
  500   0.02   5.1   1629
实施例2
共聚(乙烯醇/乙烯胺)的制备
将80mL去离子水中的0.2g十二烷基苯磺酸钠(Sigma-Aldrich商品#289957)和0.2g磷酸二氢钠的溶液置于250-mL、4颈RB烧瓶(带有冷凝器和氮气入口，温度计，滴液漏斗和磁性搅拌子)中。将烧瓶以氮气吹扫并在72℃水浴中搅拌，直至溶液温度达到65℃；然后加入0.1g
Figure BPA00001178557700352
-64(2，2’-偶氮二异丁腈；mw：164.2；Sigma-Aldrich商品#441090)引发剂。将40g醋酸乙烯酯(Sigma-Aldrich商品#V1503，通过碱性矾土过滤以除去抑制剂)、4g N-乙烯基甲酰胺(Sigman-Aldrich商品#447331，不经过进一步纯化直接使用)和0.3g
Figure BPA00001178557700361
64的溶液置于滴液漏斗中，将5mL的该单体溶液加入烧瓶中。将混合物搅拌20分钟并加入另外5mL单体。每20分钟加入5毫升等份的单体直至加入20mL(1小时)；然后将混合物在70℃搅拌1小时。然后以每20分钟加入5mL的速率加入剩余的单体。4个小时的时候完成单体的加入，然后将混合物在70℃搅拌3小时并使其冷却至室温(大约22℃)。以热水将得到的聚合物珠子洗涤几次并将其置于水中持续72小时。然后以二乙醚洗涤珠子并将其置于乙醚中持续15分钟以提取乙烯单体，然后过滤并在真空下以氮气层干燥，然后在具有氮气吹扫的350mmHg真空箱内于70℃干燥过夜，从而产生39.0g聚(醋酸乙烯酯-乙烯基甲酰胺)共聚物。
将聚(醋酸乙烯酯-乙烯基甲酰胺)共聚物(25.1g)在200mL甲醇(含有6mL浓缩的HCl和5mL水)回流中搅拌5小时，产生澄清的溶液，将此澄清的溶液置于室温过夜。溶液变成橡胶态的凝胶；反复以丙酮将此凝胶混合几次以沉淀水解的聚合物HCl盐，然后在氮气下于75℃真空箱中干燥(产量：15g)。1H NMR(DMSO-d6)分析显示大约有20％的乙酸酯保持未被水解，所以在150mL甲醇和5mL浓缩的HCl的混合物中将产物搅拌回流过夜以实现完全水解。将甲醇过滤掉，将橡胶态的不溶于甲醇的产物在90℃100mL DI水中搅拌；将此溶液首先通过筛子过滤以除去少量的凝胶，然后通过Millipore纤维素预过滤器(prefilter)(Millipore Corp.，Bedford，MA)加压过滤。使用10％NaOH将过滤的溶液碱化至pH 9.0，然后在
Figure BPA00001178557700362
3.5K分子量截留透析膜管(Viskase Co.，Willowbrooke，IL)中以去离子(DI)水透析过夜。冻干产生8.7g共聚(乙烯醇/乙烯胺)。
实施例3
未固定的大肠杆菌MG1655/pSW138-168V的腈水解酶比活性对于添加 的胺保护剂的依赖
向20-mL的带有磁性搅拌子的玻璃瓶中加入20mg至400mg胺保护剂(见表2)，然后加入1.825mL去离子水和1.0mL 0.3M KH2PO4缓冲液(pH7.5)。检测得到的混合物的pH并使用6N HCl重新调节至pH 7.5。当得到的混合物的pH稳定在pH7.5时，加入1.0mL约25.0mg(干细胞重)/毫升大肠杆菌MG1655/pSW138-168V(SEQ ID NO：51)悬浮液(处于0.1MKH2PO4缓冲液(pH7.5)中)，然后通过加入0.175mL(0.187g)水性乙醇腈(水中的61wt％GLN，溶液中的2.00mmol乙醇腈，还含有0.80mol％或0.10mol％甲醛(相对于乙醇腈))启动反应，使用恒温浴将反应混合物保持在25℃。在第5，10，15和30分钟，取出100μl等份的反应混合物并与100μl水，10μl 6.0N HCl和水中的200μl 0.25M正丙烷(HPLC外部标准)混合，将混合物离心并通过HPLC分析得到的上清液，从而确定初始反应速率和催化剂比活性(U/g dcw)(表3)。表3中列出的每组实验均以新鲜制备的细胞悬浮液(细胞悬浮液A-G)进行，其中每个细胞悬浮液的对照反应中细胞的比活性差异是由于个体细胞悬浮液的干细胞重量浓度的差异所致。
表3.存在和不存在添加的胺保护剂时生物催化剂的比活性对于甲醛浓
Figure BPA00001178557700371
实施例4
GA/PEI交联的角叉菜胶/大肠杆菌MG1655/pNM18-168V珠子的制备
在50℃，边迅速搅拌边向228g去离子蒸馏水中缓慢加入12g角叉菜胶(FMC GP911；FMC Corp.，Philadelphia，PA)，将得到的混合物加热至80℃直至角叉菜胶完全溶解，将得到的溶液搅拌冷却至52℃。在单独的具有搅拌子的烧杯中，在约25℃，向84.8g 0.35M Na2HPO4(pH7.3)中加入83.2g冷冻的大肠杆菌MG1655/pNM18-168V(SEQ ID NO：51)细胞(25.2％dcw)并混合直至细胞悬浮，然后加入脱氧核糖核酸酶I溶液(10μL12,500U/mL DNase (Sigma-Aldrich)/100mL细胞悬浮液)。将细胞悬浮液连续通过230微米和140微米
Figure BPA00001178557700391
TF strainer(Swagelok Company，Solon，OH)成分过滤膜过滤，并搅拌加热至50℃。在搅拌的同时，将50℃的160.0g大肠杆菌MG1655/pNM18-168V细胞悬浮液加入到52℃的角叉菜胶溶液中，在47℃将得到的细胞/角叉菜胶悬浮液抽入电加热的20G的针头，在约37-38℃在搅拌的同时滴入0.25M KHCO3(pH＝7.3)；通过针头的流速设定为5-8mL/min。使得到的珠子在相同的缓冲液中于室温在搅拌的同时硬化1小时，将其储存于0.25M碳酸氢钾(pH7.3)。
一部分的固定的细胞/角叉菜胶珠子的化学交联这样进行：将水中的1.0g 25％的戊二醛(GA)(Sigma M752-07)加入到悬浮于48mL 0.25M碳酸氢钾(pH7.3)中的20g珠子中，并在室温搅拌1个小时。然后向珠子悬浮液中加入水中的4.0g 12.5wt％的聚乙烯亚胺(PEI，
Figure BPA00001178557700392
PS)，在室温将珠子悬浮液再搅拌18个小时。从悬浮液中回收GA/PEI交联的珠子，在48mL 0.25M碳酸氢钾(pH7.3)中搅拌两次(15分钟)；然后储存于5℃1.0M碳酸氢铵(pH7.3)中。在使用之前，在室温以180mL 0.1M乙醇酸铵(pH7.0)将珠子洗涤两次(15分钟)。
实施例5
生物催化剂的比活性对于表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的戊二醛/聚 乙烯亚胺交联的角叉菜胶固定的大肠杆菌MG1655/pSW138-168V转化子的 依赖
在典型的程序中，在50-mL夹套反应器(具有顶部搅拌装置和温度控制)中加入4.0g GA/PEI交联的大肠杆菌MG1655/pSW138-168V/角叉菜胶珠子(如实施例4所述方法制备，其中含有5％(dcw)的表达敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体F168V(SEQ ID NO：51)的转化子)。然后向容器中加入10.85mL蒸馏水和3.0mL水性乙醇酸铵(4.0M，pH7.0)。在25℃搅拌混合物，同时加入水中的1.75mL 60.8wt％乙醇腈(GLN)(1.876g，20.0mmol GLN，0.160mmol甲醛；以0.7wt％乙醇酸稳定)和0.40mL的水性氢氧化铵(1.875wt％NH3)(最终pH为7.5)。在加入GLN之后预先确定的时间取出四份0.050-mL的反应样品并通过HPLC分析以确定初始反应速率和催化剂的比活性(μmol乙醇酸/min/g dcw生物催化剂)。
表4.固定的生物催化剂的比活性对于戊二醛/聚乙烯亚胺交联的依赖
  乙醇腈(mM)   甲醛(mM)   GA/PEI交联的   比活性(U/g珠子)   比活性(U/g dcw)
  1000   8.0   不是   36.2   723
  1000   8.0   是   68.2   1364
  1000   1.0   不是   58.4   1169
  1000   1.0   是   99.7   1994
  1000   0.04   不是   68.8   1375
  1000   0.04   是   90.1   1801
实施例6
在具有催化剂循环的连续批式反应中，表达敏捷食酸菌72W腈水解酶 的未经过交联的和经过戊二醛/聚乙烯亚胺交联的角叉菜胶固定的大肠杆菌 MG1655/pSW138-168V转化子的生物催化剂比活性的比较
在50-mL夹套反应器(具有顶部搅拌装置和温度控制)中加入8gGA/PEI交联的大肠杆菌MG1655/pSW138-168V/角叉菜胶珠子(如实施例4的方法制备，其中含有5％(dcw)的表达敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体F168V(SEQ ID NO：51)的转化子)。然后向容器中加入14.78mL蒸馏水和6.0mL水性乙醇酸铵(4.0M，pH7.0)，以氮气冲洗反应器。在25℃搅拌混合物，同时使用程序化注射器泵同时加入水中的1.07mL 60wt％乙醇腈(GLN)(12.0mmol GLN，0.084mmol甲醛；Fluka(重蒸馏的，以0.5wt％乙醇酸稳定，可从Sigma-Aldrich获得)和0.150mL的水性氢氧化铵(1.875wt％NH3)；同时每2个小时加入1份等体积的GLN和氢氧化铵溶液以保持GLN的浓度≤400mM并且pH在6.5-7.5的范围内。在最初加入GLN之后预先确定的时间取出四份0.050-mL的反应样品并通过HPLC分析以确定初始反应速率和催化剂的比活性(μmol乙醇酸/min/g dcw生物催化剂)。在反应完成时，100％的GLN被转化以产生乙醇酸(作为铵盐)，产率＞99％。从加入的GLN产生的乙醇酸铵的浓度大约是2.5M(如果包括最终约38.0mL的反应体积中初始的乙醇酸铵缓冲液的话，则为3.1M总乙醇酸铵)。
在第一个反应的末尾，从催化剂中轻轻倒出(在氮气下)水性产物混合物，留下约10.3g固定的细胞催化剂(8.0g)和残余产物混合物(约2.3g)的混合物。然后向反应器中加入20.78mL去离子蒸馏水，通过加入水性GLN和氢氧化铵的等份(如紧接的上一段所述)在25℃进行第二个反应。在表5中列出了具有催化剂循环的连续批式反应中回收的生物催化剂的比活性。为了比较戊二醛/聚乙烯亚胺交联的角叉菜胶固定的细胞对比活性的影响，按照如上所述进行第二个系列的循环反应，不同之处在于大肠杆菌MG1655/pSW138-168V/角叉菜胶珠子不经过戊二醛和聚乙烯亚胺的化学交联(表5)。
表5.在具有催化剂循环的连续批式反应中生物催化剂的比活性对于戊二醛/PEI交联的角叉菜胶固定的微生物催化剂的依赖
Figure BPA00001178557700411
Figure BPA00001178557700421
实施例7
未固定的红球菌属(ATCC 39484 TM )的腈水解酶比活性对于添加的聚乙 烯亚胺的依赖
将红球菌属(ATCC 39484TM)(SEQ ID NO：25)的冻干培养物悬浮于50-mL锥形试管中的5ml营养液(Difco；商品#0003-01-6)中，在30℃60rpm孵育3天使其复活，然后添加甘油(10％v/v)后储存于-80℃。将复活的培养物(1mL)接种至125-mL无阻挡的摇瓶(含有50mL Miller’sLuria-Bertani肉汤(Mediatech，Inc.；46-050-CM；Manassas，VA))中并在30℃和200rpm生长16小时，直至达到600nm处OD值为9.0，然后加入甘油(10％v/v)并将接种体储存于-80℃。在pH为7.0将接种体(2mL)转移至1-L无阻挡的摇瓶(含有200mL的培养基，培养基由下列组成：1g多聚蛋白胨(Becton-Dickinson；商品#11910；Franklin Lakes，NJ)，0.6g麦芽提取物(Difco；0186-02-4)，0.6g酵母提取物(Difco；0127-17)，2g甘油和0.2mL异戊腈(T.Nagasawa，M.Kobayashi，H.Yamada，Archives of Microbiology，(1988)150：89-94))，然后在30℃和200rpm摇动生长。在第50小时和第70小时分别将0.1％(v/v)和0.2％(v/v)异戊腈补充到培养物中。在第96小时通过离心(13,000xg，5℃)收集细胞沉淀并储存于-80℃。
在25℃向20-mL的带有磁性搅拌子的玻璃瓶中加入1.0mL 73.0mg(干细胞重)/毫升红球菌属(ATCC 39484TM)悬浮液(处于0.1M KH2PO4缓冲液(pH7.5)中)，以及1.0ml 0.3M KH2PO4缓冲液(pH7.5)或1.0mL 10.2mg/mL的聚乙烯亚胺溶液(BASF
Figure BPA00001178557700431
PS，750,000mw)(处于0.3MKH2PO4缓冲液(pH7.5)中)。在25℃边搅拌边加入2.0mL含有乙醇腈(1.0M)和甲醛(8mM或0.04mM)(处于去离子蒸馏水中)的水溶液，将反应混合物保持在25℃。在第5，10，15和30分钟，取出100μl等份的反应混合物并与100μl水，10μl 6.0N HCl和水中的200μl 0.25M正丙烷(HPLC外部标准)混合，将混合物离心并通过HPLC分析得到的上清液，从而确定初始反应速率和催化剂比活性(U/g dcw)(表6)。
表6.存在和不存在添加的聚乙烯亚胺(PEI)时红球菌属(ATCC 39484TM)腈水解酶的比活性对于甲醛浓度的依赖
  乙醇腈(mM)   甲醛(mM)   PEI(mg/mL)   比活性(U/g dcw)
  500   4.0   0   598
  500   4.0   5.0   780
实施例8
未固定的紫红红球菌(NCIMB11216)的腈水解酶比活性对于添加的聚 乙烯亚胺的依赖
将保存的培养物悬浮于100μL生理盐水后使紫红红球菌(NCIMB 11216；SEQ ID NO：24)复活，然后将生理盐水细胞悬浮液在含有营养琼脂(Difco商品#0001-01-8)(补充了酵母提取物(2g/L；Difco商品#0127-17)和氯化钠(5g/L))的培养板上划线。已经报道了来自紫红红球菌NCIMB 11216的腈水解酶的序列(美国专利申请公开号2003/0157672和
Figure BPA00001178557700432
登陆No.CAC88237；SEQ ID NO：24)。将培养板在30℃培养48h，将菌落接种于水性E2基础培养基(补充了戊二酸(0.8wt％；碳源)和丙腈(0.2wt％；氮源)并在30℃200rpm摇动培养48小时。E2基础培养基由下列组成：KH2PO4，1.4g/L；NaH2PO4，0.69g/L；柠檬酸钠，0.1g/L；CaCl2·2H2O，0.025g/L；KCl，0.5g/L；NaCl，1.0g/L，MgSO4·7H2O，0.5g/L；FeSO4·7H2O，0.05g/L；CoCl2·6H2O，0.01g/L；MnCl2·4H2O，0.001g/L；ZnCl2，0.0005g/L；NaMoO4·2H2O，0.0025g/L；NiCl2·6H2O，0.01g/L；CuSO4·2H2O，0.005g/L；生物素，0.0002g/L；叶酸，0.0002g/L；维生素B6·HCl，0.001g/L；核黄素，0.0005g/L；硫胺素·HCl，0.00005g/L；烟酸，0.0005g/L；泛酸，0.0005g/L；维生素B12，0.00001g/L，对氨基苯甲酸0.0005g/L。生长48小时后，通过离心(13,000xg)收集1.59g湿细胞沉淀并将得到的细胞沉淀储存于-80℃。
在25℃向20-mL的带有磁性搅拌子的玻璃瓶中加入1.0mL 79.0mg(干细胞重)/毫升紫红红球菌(NCIMB 11216)悬浮液(处于0.1M KH2PO4缓冲液(pH7.5)中)，以及1.0ml 0.3M KH2PO4缓冲液(pH7.5)或1.0mL 10.2mg/mL的聚乙烯亚胺溶液(BASFPS，750,000mw)(处于0.3MKH2PO4缓冲液(pH7.5)中)。在25℃边搅拌边加入2.0mL含有乙醇腈(1.0M)和甲醛(8mM或0.04mM)(处于去离子蒸馏水中)的水溶液，将反应混合物保持在25℃。在第5、10、15和30分钟，取出100μl等份的反应混合物并与100μl水，10μl 6.0N HCl和水中的200μl 0.25M正丙烷(HPLC外部标准)混合，将混合物离心并通过HPLC分析得到的上清液，从而确定初始反应速率和催化剂比活性(U/g dcw)(表7)。
表7.存在和不存在添加的聚乙烯亚胺(PEI)时紫红红球菌(NCIMB11216)腈水解酶的比活性对于甲醛浓度的依赖
  乙醇腈(mM)   甲醛(mM)   PEI(mg/mL)   比活性(U/g dcw)
  500   4.0   0   37.9
  500   4.0   5.0   45.4
序列表
<110>纳幕尔杜邦公司(E.I.duPont de Nemours and Company，Inc.)
<120>鳌合甲醛以稳定乙醇腈转化为乙醇酸时腈水解酶的比活性
<130>CL3584PCT
<160>57
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>催化标志基序
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Ala或Gly
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝Leu，Val或Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(3)
<223>Xaa＝Ala，Asn，Ile，Cys，Val或Gln；
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>Xaa可以是任何天然产生的氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa＝His或Asn；
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝Leu，Tyr，Phe，Ala，Met，Lys，Val，Thr或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝Asn，Gln，Met，Leu或Ser；
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>Xaa＝Pro或Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>Xaa＝Leu或Val
<400>1
Gly Xaa Xaa Xaa Cys Trp Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>2
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>催化序列基序#2
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝Ala或Gly
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝Ala或Gly
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝Leu，Tyr，Phe，Ala，Met，Lys，Val，Thr或Arg
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝Asn，Gln，Met或Ser
<400>2
Gly Xaa Leu Xaa Cys Trp Glu His Xaa Xaa Pro Leu
1               5                   10
<210>3
<211>1110
<212>DNA
<213>敏捷食酸菌72W
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1110)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(3)
<223>起始密码子TTG改变为ATG以促进重组表达
<400>3
atg gtt tcg tat aac agc aag ttc ctc gcg gca acc gtt cag gca gag    48
Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu
1               5                   10                  15
ccg gta tgg ctc gac gca gac gca acg atc gac aag tcg atc ggc atc    96
Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
            20                  25                  30
atc gaa gaa gct gcc caa aag ggc gcg agt ctg atc gct ttc ccg gaa    144
Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
        35                  40                  45
gta ttc att ccg ggc tac ccc tat tgg gcg tgg ctc ggc gac gtg aag    192
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
tac agc cta agc ttt act tca cgc tat cac gag aat tcg ttg gag cta    240
Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
65                  70                  75                  80
ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gcg cgc cgc aac aaa    288
Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
                85                  90                  95
atc gca ctc gtc atg ggc tat tcg gag cgg gaa gcc gga tcg cgc tat    336
Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
            100                 105                 110
ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc gag atc gtt gcc aat cgg    384
Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
        115                 120                 125
cgc aag ctg aag ccc aca cac gtt gag cgt acg atc tac ggc gaa ggc    432
Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
    130                 135                 140
aac gga acc gat ttc ctc acg cac gac ttc gcg ttc gga cgc gtc ggt    480
Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly
145                 150                 155                 160
gga ttg aac tgc tgg gaa cat ttc caa ccg ctc agc aag ttc atg atg    528
Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
                165                 170                 175
tac agc ctc ggt gag cag gtc cac gtt gca tcg tgg ccg gcg atg tcc    576
Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
            180                 185                 190
cct ctt cag ccg gat gtt ttc caa ctg agc atc gaa gcc aac gcg acg    624
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr
        195                 200                 205
gtc acc cgc tcg tac gca atc gaa ggc caa acc ttt gtg ctt tgc tcg    672
Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser
    210                 215                 220
acg cag gtg atc gga cct agc gcg atc gaa acg ttc tgc ctc aac gac    720
Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp
225                 230                 235                 240
gaa cag cgc gca ctg ttg ccg caa gga tgt ggc tgg gcg cgc att tac    768
Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr
                245                 250                 255
ggc ccg gat gga agc gag ctt gcg aag cct ctg gcg gaa gat gct gag    816
Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
            260                 265                 270
ggg atc ttg tac gca gag atc gat ctg gag cag att ctg ctg gcg aag    864
Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
        275                 280                 285
gct gga gcc gat ccg gtc ggg cac tat tcg cgg cct gac gtg ctg tcg    912
Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
    290                 295                 300
gtc cag ttc gac ccg cgc aat cat acg cca gtt cat cgc atc ggc att    960
Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
305                 310                 315                 320
gac ggt cgc ttg gat gtg aat acc cgc agt cgc gtg gag aat ttc cga    1008
Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
                325                 330                 335
ctg cga caa gcg gct gag cag gag cgt cag gca tcc aag cgg ctc gga    1056
Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
            340                 345                 350
acg aaa ctc ttt gaa caa tcc ctt ctg gct gaa gaa ccg gtc cca gca    1104
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala
        355                 360                 365
aag tag                                                            1110
Lys
<210>4
<211>369
<212>PRT
<213>敏捷食酸菌72W
<400>4
Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu
1               5                   10                  15
Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
            20                  25                  30
Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
        35                  40                  45
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
65                  70                  75                  80
Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
                85                  90                  95
Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
            100                 105                 110
Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
        115                 120                 125
Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
    130                 135                 140
Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly
145                 150                 155                 160
Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
                165                 170                 175
Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
            180                 185                 190
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr
        195                 200                 205
Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser
    210                 215                 220
Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp
225                 230                 235                 240
Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr
                245                 250                 255
Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
            260                 265                 270
Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
        275                 280                 285
Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
    290                 295                 300
Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
305                 310                 315                 320
Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
                325                 330                 335
Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
            340                 345                 350
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala
        355                 360                 365
Lys
<210>5
<211>356
<212>PRT
<213>固氮粪产碱菌LM3
<400>5
Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala
            20                  25                  30
Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr
        35                  40                  45
Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp
    50                  55                  60
Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp
65                  70                  75                  80
Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile
                85                  90                  95
Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu
            100                 105                 110
Gly Gln Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Gln Met Leu Trp Ser Arg Arg
        115                 120                 125
Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Phe Gly Glu Gly Tyr
    130                 135                 140
Ala Arg Asp Leu Ile Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala
145                 150                 155                 160
Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr
                165                 170                 175
Ser Gln His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu
            180                 185                 190
Tyr Ser Glu Gln Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Asn Met Ala Ala
        195                 200                 205
Ser Gln Ile Tyr Ser Val Glu Gly Gln Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser
    210                 215                 220
Ser Val Val Thr Gln Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His
225                 230                 235                 240
Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala
                245                 250                 255
Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly
            260                 265                 270
Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala
        275                 280                 285
Ile Asn Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu
    290                 295                 300
Val Leu Asp Leu Gly His Arg Glu Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys
305                 310                 315                 320
Ser Val Ile Gln Glu Glu Ala Pro Glu Pro His Val Gln Ser Thr Ala
                325                 330                 335
Ala Pro Val Ala Val Ser Gln Thr Gln Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val
            340                 345                 350
Gln Glu Pro Ser
        355
<210>6
<211>366
<212>PRT
<213>紫红红球菌J1
<400>6
Met Val Glu Tyr Thr Asn Thr Phe Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Pro Val Trp Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Asp Lys Thr Val Ser Ile
            20                  25                  30
Ile Ala Glu Ala Ala Arg Asn Gly Cys Glu Leu Val Ala Phe Pro Glu
        35                  40                  45
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr His Ile Trp Val Asp Ser Pro Leu
    50                  55                  60
Ala Gly Met Ala Lys Phe Ala Val Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Thr
65                  70                  75                  80
Met Asp Ser Pro His Val Gln Arg Leu Leu Asp Ala Ala Arg Asp His
                85                  90                  95
Asn Ile Ala Val Val Val Gly Ile Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu
            100                 105                 110
Tyr Met Thr Gln Leu Val Ile Asp Ala Asp Gly Gln Leu Val Ala Arg
        115                 120                 125
Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Ser Val Tyr Gly Glu
    130                 135                 140
Gly Asn Gly Ser Asp Ile Ser Val Tyr Asp Met Pro Phe Ala Arg Leu
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Ala
                165                 170                 175
Met Tyr Ser Met His Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Gly Met
            180                 185                 190
Ser Leu Tyr Gln Pro Glu Val Pro Ala Phe Gly Val Asp Ala Gln Leu
        195                 200                 205
Thr Ala Thr Arg Met Tyr Ala Leu Glu Gly Gln Thr Phe Val Val Cys
    210                 215                 220
Thr Thr Gln Val Val Thr Pro Glu Ala His Glu Phe Phe Cys Asp Asn
225                 230                 235                 240
Asp Glu Gln Arg Lys Leu Ile Gly Arg Gly Gly Gly Phe Ala Arg Ile
                245                 250                 255
Ile Gly Pro Asp Gly Arg Asp Leu Ala Thr Pro Leu Ala Glu Asp Glu
            260                 265                 270
Glu Gly Ile Leu Tyr Ala Asp Ile Asp Leu Ser Ala Ile Thr Leu Ala
        275                 280                 285
Lys Gln Ala Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu
    290                 295                 300
Ser Leu Asn Phe Asn Gln Arg His Thr Thr Pro Val Asn Thr Ala Ile
305                 310                 315                 320
Ser Thr Ile His Ala Thr His Thr Leu Val Pro Gln Ser Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Asp Gly Val Arg Glu Leu Asn Gly Ala Asp Glu Gln Arg Ala Leu Pro
            340                 345                 350
Ser Thr His Ser Asp Glu Thr Asp Arg Ala Thr Ala Ser Ile
        355                 360                 365
<210>7
<211>383
<212>PRT
<213>紫红红球菌K22
<400>7
Met Ser Ser Asn Pro Glu Leu Lys Tyr Thr Gly Lys Val Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Thr Val Gln Ala Glu Pro Val Ile Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp
            20                  25                  30
Lys Ala Ile Gly Phe Ile Glu Glu Ala Ala Lys Asn Gly Ala Glu Phe
        35                  40                  45
Leu Ala Phe Pro Glu Val Trp Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp
    50                  55                  60
Ile Gly Asp Val Lys Trp Ala Val Ser Asp Phe Ile Pro Lys Tyr His
65                  70                  75                  80
Glu Asn Ser Leu Thr Leu Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu
                85                  90                  95
Ala Ala Arg Gln Asn Asn Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Lys
            100                 105                 110
Asp Gly Ala Ser Arg Tyr Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Gln Asn Gly
        115                 120                 125
Asp Ile Val Ala Asn Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg
    130                 135                 140
Thr Ile Tyr Gly Glu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe
145                 150                 155                 160
Gly Phe Gly Arg Val Gly Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro
                165                 170                 175
Leu Ser Lys Tyr Met Met Tyr Ser Leu Asn Glu Gln Ile His Val Ala
            180                 185                 190
Ser Trp Pro Ala Met Phe Ala Leu Thr Pro Asp Val His Gln Leu Ser
        195                 200                 205
Val Glu Ala Asn Asp Thr Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln
    210                 215                 220
Thr Phe Val Leu Ala Ser Thr His Val Ile Gly Lys Ala Thr Gln Asp
225                 230                 235                 240
Leu Phe Ala Gly Asp Asp Asp Ala Lys Arg Ala Leu Leu Pro Leu Gly
                245                 250                 255
Gln Gly Trp Ala Arg Ile Tyr Gly Pro Asp Gly Lys Ser Leu Ala Glu
            260                 265                 270
Pro Leu Pro Glu Asp Ala Glu Gly Leu Leu Tyr Ala Glu Leu Asp Leu
        275                 280                 285
Glu Gln Ile Ile Leu Ala Lys Ala Ala Ala Asp Pro Ala Gly His Tyr
    290                 295                 300
Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser Leu Lys Ile Asp Thr Arg Asn His Thr
305                 310                 315                 320
Pro Val Gln Tyr Ile Thr Ala Asp Gly Arg Thr Ser Leu Asn Ser Asn
                325                 330                 335
Ser Arg Val Glu Asn Tyr Arg Leu His Gln Leu Ala Asp Ile Glu Lys
            340                 345                 350
Tyr Glu Asn Ala Glu Ala Ala Thr Leu Pro Leu Asp Ala Pro Ala Pro
        355                 360                 365
Ala Pro Ala Pro Glu Gln Lys Ser Gly Arg Ala Lys Ala Glu Ala
    370                 375                 380
<210>8
<211>381
<212>PRT
<213>诺卡氏菌属C-14-1
<400>8
Met Lys Val Ala Thr Val Gln Ala Glu Pro Val Ile Leu Asp Ala Asp
1               5                   10                  15
Ala Thr Ile Asp Lys Ala Ile Gly Tyr Ile Glu Glu Ala Ser Lys Asn
            20                  25                  30
Gly Ala Glu Phe Ile Ala Phe Pro Glu Val Trp Ile Pro Gly Tyr Pro
        35                  40                  45
Tyr Trp Ala Trp Ile Gly Asp Val Lys Trp Ala Val Ser Glu Phe Ile
    50                  55                  60
Pro Lys Tyr His Glu Asn Ser Leu Thr Leu Gly Asp Asp Arg Met Arg
65                  70                  75                  80
Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Gln His Asn Ile Ala Met Val Val Gly
                85                  90                  95
Tyr Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ser Arg Tyr Leu Ser Gln Val Phe Ile
            100                 105                 110
Asp Gln Asn Gly Asp Ile Val Ala Asn Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr
        115                 120                 125
His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Leu
    130                 135                 140
Thr His Asp Phe Gly Phe Gly Arg Val Gly Gly Leu Asn Cys Trp Glu
145                 150                 155                 160
His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Tyr Met Met Tyr Ser Leu Asn Glu Gln
                165                 170                 175
Ile His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Phe Ala Leu Thr Pro Asp Val
            180                 185                 190
His Gln Leu Ser Val Glu Ala Asn Asp Thr Val Thr Arg Ser Tyr Ala
        195                 200                 205
Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Ala Ala Thr His Val Ile Gly Lys
    210                 215                 220
Ala Thr Gln Asp Leu Phe Ala Gly Asp Asp Glu Ala Lys Arg Ala Leu
225                 230                 235                 240
Leu Pro Leu Gly Gln Gly Trp Ala Arg Ile Tyr Gly Pro Asp Gly Lys
                245                 250                 255
Ser Leu Ala Glu Pro Leu Ala Glu Asn Ala Glu Gly Leu Leu Tyr Ala
            260                 265                 270
Glu Leu Asp Leu Glu Gln Ile Ile Val Ala Lys Ala Ala Ala Asp Pro
        275                 280                 285
Ala Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser Leu Lys Val Asp Thr
    290                 295                 300
Arg Asn His Thr Pro Val Gln Tyr Val Thr Glu Asp Gly Gly Ser Ser
305                 310                 315                 320
Leu Asn Ser Asn Ser Arg Val Glu Asn Tyr Arg Leu Arg Gln Leu Ala
                325                 330                 335
Asp Ile Glu Lys Tyr Glu Asn Ala Asp Ser Ala Thr Val Pro Leu Asp
            340                 345                 350
Val Thr Thr Pro Glu Lys Gln Ser Gly Asp Val Asn Ala Asn Gly Asn
        355                 360                 365
Ala Lys Val Asn Thr Asn Pro Ser Ala Lys Ala Lys Ala
    370                 375                 380
<210>9
<211>310
<212>PRT
<213>支气管败血波氏杆菌RB50
<400>9
Met Thr Thr His Arg Ile Ala Val Ile Gln Asp Gly Pro Val Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Ala Met Ala Thr Ala Glu Lys Met Ser Arg Leu Ala Ala Ser Ala
            20                  25                  30
Lys Ala Gln Gly Ala Arg Leu Ala Leu Phe Pro Glu Ala Phe Val Gly
        35                  40                  45
Gly Tyr Pro Lys Gly Ala Asp Phe His Ile Phe Leu Gly Gly Arg Thr
    50                  55                  60
Pro Gln Gly Arg Ala Gln Tyr Gln Arg Tyr Ala Glu Thr Ala Ile Ala
65                  70                  75                  80
Val Pro Gly Pro Val Thr Glu Arg Ile Gly Gln Ile Ala Ala Glu Gln
                85                  90                  95
Asp Met Phe Ile Val Val Gly Val Ile Glu Arg Asp Gly Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Tyr Cys Thr Ile Leu Phe Phe Ser Pro Glu Gly Glu Leu Leu Gly Lys
        115                 120                 125
His Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Leu Glu Arg Leu Leu Trp Gly Tyr
    130                 135                 140
Gly Asp Gly Ser Thr Phe Pro Val Tyr Asp Thr Pro Leu Gly Lys Leu
145                 150                 155                 160
Gly Ala Val Val Cys Trp Glu Asn Tyr Met Pro Leu Leu Arg Met Ala
                165                 170                 175
Met Tyr Gly Lys Gln Ile Gln Ile Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Asp
            180                 185                 190
Lys Pro Thr Trp Val Ser Thr Met Gln His Val Ala Leu Glu Gly Arg
        195                 200                 205
Cys Phe Val Leu Ser Ala Cys Gln His Leu Arg Gly Lys Asp Phe Pro
    210                 215                 220
Pro Glu Phe His Asn Ala Leu Asp Val Gln Pro Asp Thr Val Leu Met
225                 230                 235                 240
Arg Gly Gly Ser Cys Ile Val Asp Pro Met Gly Gln Leu Leu Ala Gly
                245                 250                 255
Pro Val Tyr Asp Glu Asp Ala Ile Leu Val Ala Asp Ile Asp Leu Asp
            260                 265                 270
Ala Val Thr Arg Gly Lys Met Asp Phe Asp Val Val Gly His Tyr Ala
        275                 280                 285
Arg Pro Asp Ile Phe Ser Leu Thr Val Asp Glu Arg Pro Lys Pro Pro
    290                 295                 300
Val Thr Thr Leu Lys Pro
305                 310
<210>10
<211>339
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>10
Met Ser Thr Ser Glu Asn Thr Pro Phe Asn Gly Val Ala Ser Ser Thr
1               5                   10                  15
Ile Val Arg Ala Thr Ile Val Gln Ala Ser Thr Val Tyr Asn Asp Thr
            20                  25                  30
Pro Ala Thr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Phe Ile Val Glu Ala Ala Ser
        35                  40                  45
Lys Gly Ser Glu Leu Val Val Phe Pro Glu Ala Phe Ile Gly Gly Tyr
    50                  55                  60
Pro Arg Gly Phe Arg Phe Gly Leu Gly Val Gly Val His Asn Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gly Arg Asp Glu Phe Arg Lys Tyr His Ala Ser Ala Ile Lys Val Pro
                85                  90                  95
Gly Pro Glu Val Glu Lys Leu Ala Glu Leu Ala Gly Lys Asn Asn Val
            100                 105                 110
Tyr Leu Val Met Gly Ala Ile Glu Lys Asp Gly Tyr Thr Leu Tyr Cys
        115                 120                 125
Thr Ala Leu Phe Phe Ser Pro Gln Gly Gln Phe Leu Gly Lys His Arg
    130                 135                 140
Lys Leu Met Pro Thr Ser Leu Glu Arg Cys Ile Trp Gly Gln Gly Asp
145                 150                 155                 160
Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Ile Gly Lys Leu Gly Ala
                165                 170                 175
Ala Ile Cys Trp Glu Asn Arg Met Pro Leu Tyr Arg Thr Ala Leu Tyr
            180                 185                 190
Ala Lys Gly Ile Glu Leu Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Gly Ser Lys
        195                 200                 205
Glu Trp Gln Ser Ser Met Leu His Ile Ala Ile Glu Gly Gly Cys Phe
    210                 215                 220
Val Leu Ser Ala Cys Gln Phe Cys Leu Arg Lys Asp Phe Pro Asp His
225                 230                 235                 240
Pro Asp Tyr Leu Phe Thr Asp Trp Tyr Asp Asp Lys Glu Pro Asp Ser
                245                 250                 255
Ile Val Ser Gln Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Leu Gly Gln Val
            260                 265                 270
Leu Ala Gly Pro Asn Phe Glu Ser Glu Gly Leu Ile Thr Ala Asp Leu
        275                 280                 285
Asp Leu Gly Asp Val Ala Arg Ala Lys Leu Tyr Phe Asp Ser Val Gly
    290                 295                 300
His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu His Leu Thr Val Asn Glu His Pro
305                 310                 315                 320
Lys Lys Pro Val Thr Phe Ile Ser Lys Val Glu Lys Ala Glu Asp Asp
                325                 330                 335
Ser Asn Lys
<210>11
<211>334
<212>PRT
<213>细长聚球藻PCC 7942
<400>11
Met Ala Asp Lys Ile Ile Val Ala Ala Ala Gln Ile Arg Pro Val Leu
1               5                   10                  15
Phe Ser Leu Glu Gly Ser Val Ala Arg Val Leu Ala Ala Met Ala Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Ala Ala Gly Val Gln Leu Ile Val Phe Pro Glu Thr Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Tyr Tyr Pro Tyr Phe Ser Phe Val Glu Pro Pro Val Leu Met Gly
    50                  55                  60
Arg Ser His Leu Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Phe Thr Met Thr Gly Pro
65                  70                  75                  80
Glu Leu Gln Gln Ile Ala Arg Ala Ala Arg Gln His Arg Leu Phe Val
                85                  90                  95
Leu Leu Gly Val Asn Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu Tyr Asn Thr Gln
            100                 105                 110
Leu Leu Ile Ser Asp Gln Gly Asp Leu Leu Leu Lys Arg Arg Lys Ile
        115                 120                 125
Thr Pro Thr Tyr His Glu Arg Met Val Trp Gly Gln Gly Gly Gly Ala
    130                 135                 140
Gly Leu Thr Val Val Glu Thr Val Leu Gly Lys Val Gly Ala Leu Ala
145                 150                 155                 160
Cys Trp Glu His Tyr Asn Pro Leu Ala Arg Phe Ser Leu Met Thr Gln
                165                 170                 175
Gly Glu Glu Ile His Cys Ala Gln Phe Pro Gly Ser Leu Val Gly Pro
            180                 185                 190
Ile Phe Ser Glu Gln Thr Ala Val Thr Leu Arg His His Ala Leu Glu
        195                 200                 205
Ala Gly Cys Phe Val Leu Ser Ser Thr Ala Trp Leu Asp Pro Ala Asp
    210                 215                 220
Tyr Asp Thr Ile Thr Pro Asp Arg Ser Leu His Lys Ala Phe Gln Gly
225                 230                 235                 240
Gly Cys His Thr Ala Ile Ile Ser Pro Glu Gly Arg Tyr Leu Ala Gly
                245                 250                 255
Pro Leu Pro Glu Gly Glu Gly Leu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Lys Ser
            260                 265                 270
Leu Ile Thr Lys Arg Lys Arg Met Met Asp Ser Val Gly His Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Pro Asp Leu Leu Ser Leu Arg Ile Asn Arg Ser Pro Ala Thr Gln
    290                 295                 300
Val Gln Ala Ile Gly Ser Ala Ala Ala Leu Pro Glu Leu Pro Asn Leu
305                 310                 315                 320
Glu Ala Ala Pro Ala Glu Thr Ala Glu Asp Tyr Leu His Ala
                325                 330
<210>12
<211>334
<212>PRT
<213>细长聚球藻PCC 6301
<400>12
Met Ala Asp Lys Ile Ile Val Ala Ala Ala Gln Ile Arg Pro Val Leu
1               5                   10                  15
Phe Ser Leu Glu Gly Ser Val Ala Arg Val Leu Ala Ala Met Ala Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Ala Ala Gly Val Gln Leu Ile Val Phe Pro Glu Thr Phe Leu
        35                  40                  45
Pro Tyr Tyr Pro Tyr Phe Ser Phe Val Glu Pro Pro Val Leu Met Gly
    50                  55                  60
Arg Ser His Leu Lys Leu Tyr Glu Gln Ala Phe Thr Met Thr Gly Pro
65                  70                  75                  80
Glu Leu Gln Gln Ile Ala Arg Ala Ala Arg Gln His Arg Leu Phe Val
                85                  90                  95
Leu Leu Gly Val Asn Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu Tyr Asn Thr Gln
            100                 105                 110
Leu Leu Ile Ser Asp Gln Gly Asp Leu Leu Leu Lys Arg Arg Lys Ile
        115                 120                 125
Thr Pro Thr Tyr His Glu Arg Met Val Trp Gly Gln Gly Gly Gly Ala
    130                 135                 140
Gly Leu Thr Val Val Glu Thr Val Leu Gly Lys Val Gly Ala Leu Ala
145                 150                 155                 160
Cys Trp Glu His Tyr Asn Pro Leu Ala Arg Phe Ser Leu Met Thr Gln
                165                 170                 175
Gly Glu Glu Ile His Cys Ala Gln Phe Pro Gly Ser Leu Val Gly Pro
            180                 185                 190
Ile Phe Ser Glu Gln Thr Ala Val Thr Leu Arg His His Ala Leu Glu
        195                 200                 205
Ala Gly Cys Phe Val Leu Ser Ser Thr Ala Trp Leu Asp Pro Ala Asp
    210                 215                 220
Tyr Asp Thr Ile Thr Pro Asp Arg Ser Leu His Lys Ala Phe Gln Gly
225                 230                 235                 240
Gly Cys His Thr Ala Ile Ile Ser Pro Glu Gly Arg Tyr Leu Ala Gly
                245                 250                 255
Pro Leu Pro Glu Gly Glu Gly Leu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Lys Ser
            260                 265                 270
Leu Ile Thr Lys Arg Lys Arg Met Met Asp Ser Val Gly His Tyr Ser
        275                 280                 285
Arg Pro Asp Leu Leu Ser Leu Arg Ile Asn Arg Ser Pro Ala Thr Gln
    290                 295                 300
Val Gln Ala Ile Gly Ser Ala Ala Ala Leu Pro Glu Leu Pro Asn Leu
305                 310                 315                 320
Glu Ala Ala Pro Ala Glu Thr Ala Glu Asp Tyr Leu His Ala
                325                 330
<210>13
<211>346
<212>PRT
<213>集胞藻属PCC 6803
<400>13
Met Leu Gly Lys Ile Met Leu Asn Tyr Thr Lys Asn Ile Arg Ala Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Gln Ile Ser Pro Val Leu Phe Ser Gln Gln Gly Thr Met Glu
            20                  25                  30
Lys Val Leu Asp Ala Ile Ala Asn Ala Ala Lys Lys Gly Val Glu Leu
        35                  40                  45
Ile Val Phe Pro Glu Thr Phe Val Pro Tyr Tyr Pro Tyr Phe Ser Phe
    50                  55                  60
Val Glu Pro Pro Val Leu Met Gly Lys Ser His Leu Lys Leu Tyr Gln
65                  70                  75                  80
Glu Ala Val Thr Val Pro Gly Lys Val Thr Gln Ala Ile Ala Gln Ala
                85                  90                  95
Ala Lys Thr His Gly Met Val Val Val Leu Gly Val Asn Glu Arg Glu
            100                 105                 110
Glu Gly Ser Leu Tyr Asn Thr Gln Leu Ile Phe Asp Ala Asp Gly Ala
        115                 120                 125
Leu Val Leu Lys Arg Arg Lys Ile Thr Pro Thr Tyr His Glu Arg Met
    130                 135                 140
Val Trp Gly Gln Gly Asp Gly Ala Gly Leu Arg Thr Val Asp Thr Thr
145                 150                 155                 160
Val Gly Arg Leu Gly Ala Leu Ala Cys Trp Glu His Tyr Asn Pro Leu
                165                 170                 175
Ala Arg Tyr Ala Leu Met Ala Gln His Glu Gln Ile His Cys Gly Gln
            180                 185                 190
Phe Pro Gly Ser Met Val Gly Gln Ile Phe Ala Asp Gln Met Glu Val
        195                 200                 205
Thr Met Arg His His Ala Leu Glu Ser Gly Cys Phe Val Ile Asn Ala
    210                 215                 220
Thr Gly Trp Leu Thr Ala Glu Gln Lys Leu Gln Ile Thr Thr Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Met His Gln Ala Leu Ser Gly Gly Cys Tyr Thr Ala Ile Ile Ser
                245                 250                 255
Pro Glu Gly Lys His Leu Cys Glu Pro Ile Ala Glu Gly Glu Gly Leu
            260                 265                 270
Ala Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ser Leu Ile Ala Lys Arg Lys Arg Met
        275                 280                 285
Met Asp Ser Val Gly His Tyr Ala Arg Pro Asp Leu Leu Gln Leu Thr
    290                 295                 300
Leu Asn Asn Gln Pro Trp Ser Ala Leu Glu Ala Asn Pro Val Thr Pro
305                 310                 315                 320
Asn Ala Ile Pro Ala Val Ser Asp Pro Glu Leu Thr Glu Thr Ile Glu
                325                 330                 335
Ala Leu Pro Asn Asn Pro Ile Phe Ser His
            340                 345
<210>14
<211>307
<212>PRT
<213>嗜虫假单胞菌L48
<400>14
Met Pro Lys Ser Ile Val Ala Ala Leu Gln Val Gly Ser Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Gly Lys Ala Ala Thr Leu Glu Gln Ile Leu Gly Tyr Glu Gln Ala Ile
            20                  25                  30
Arg Glu Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Met Pro Glu Ala Leu Leu Gly
        35                  40                  45
Gly Tyr Pro Lys Gly Glu Gly Phe Gly Thr Gln Leu Gly Tyr Arg Leu
    50                  55                  60
Pro Glu Gly Arg Glu Ala Phe Ala Arg Tyr Phe Ala Asn Ala Ile Asp
65                  70                  75                  80
Val Pro Gly Ser Glu Thr Ala Ala Leu Ala Gly Leu Ser Ala Arg Thr
                85                  90                  95
Gly Ala Ser Leu Val Leu Gly Val Ile Glu Arg Ser Gly Asn Thr Leu
            100                 105                 110
Tyr Cys Thr Val Leu Phe Phe Glu Pro Glu Gly Gly Leu Val Ala Lys
        115                 120                 125
His Arg Lys Leu Met Pro Thr Gly Thr Glu Arg Leu Ile Trp Gly Lys
    130                 135                 140
Gly Asp Gly Ser Thr Leu Pro Val Val Asp Gly Arg Ala Gly Arg Ile
145                 150                 155                 160
Gly Ala Ala Val Cys Trp Glu Asn Tyr Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala
                165                 170                 175
Met Tyr Ala Lys Gly Val Gln Leu Trp Cys Ala Pro Thr Val Asp Glu
            180                 185                 190
Arg Glu Leu Trp Gln Val Ser Met Arg His Val Ala Ala Glu Gly Arg
        195                 200                 205
Cys Phe Val Ile Ser Ala Cys Gln Val Gln Asp Ser Pro Ala Ala Leu
    210                 215                 220
Gly Met Glu Val Ala Asn Trp Pro Ala Glu Arg Pro Leu Ile Asn Gly
225                 230                 235                 240
Gly Ser Leu Ile Val Gly Pro Leu Gly Asp Val Leu Ala Gly Pro Leu
                245                 250                 255
Leu Gly Ala Arg Gly Leu Val Cys Ala Glu Val Asp Thr Asp Glu Leu
            260                 265                 270
Val Arg Ala Arg Tyr Asp Phe Asp Val Val Gly His Tyr Ala Arg Pro
        275                 280                 285
Asp Val Phe Glu Leu Ser Val Asp Glu Arg Pro Arg Pro Gly Val Arg
    290                 295                 300
Phe Ile Gly
305
<210>15
<211>329
<212>PRT
<213>运动发酵单胞菌运动亚种ZM4
<400>15
Met Ser Cys His Arg Val Ala Val Ile Gln Ala Gly Thr Ser Leu Phe
1               5                   10                  15
Asp Thr Glu Lys Thr Leu Asp Arg Met Glu Ala Leu Cys Arg Gln Ala
            20                  25                  30
Ala Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Val Phe Pro Glu Ala Tyr Ile Gly
        35                  40                  45
Gly Tyr Pro Lys Gly Leu Asp Phe Gly Ala Arg Met Gly Thr Arg Thr
    50                  55                  60
Glu Ala Gly Arg Glu Asp Phe Leu Arg Tyr Trp Lys Ala Ala Ile Asp
65                  70                  75                  80
Val Pro Gly Lys Glu Thr Ala Arg Ile Gly Ser Phe Ala Ala Lys Met
                85                  90                  95
Lys Ala Tyr Leu Val Val Gly Val Ile Glu Arg Ser Glu Ala Thr Leu
            100                 105                 110
Tyr Cys Thr Ala Leu Phe Phe Ala Pro Asp Gly Thr Leu Ile Gly Lys
        115                 120                 125
His Arg Lys Leu Met Pro Thr Ala Thr Glu Arg Leu Val Trp Gly Gln
    130                 135                 140
Gly Asp Gly Ser Thr Ile Glu Ile Leu Asp Thr Ala Val Gly Lys Leu
145                 150                 155                 160
Gly Ala Ala Ile Cys Trp Glu Asn Tyr Met Pro Val Leu Arg Gln Val
                165                 170                 175
Met Tyr Ala Gly Gly Val Asn Ile Trp Cys Ala Pro Thr Val Asp Gln
            180                 185                 190
Arg Glu Ile Trp Gln Val Ser Met Arg His Ile Ala Tyr Glu Gly Arg
        195                 200                 205
Leu Phe Val Leu Ser Ala Cys Gln Tyr Met Thr Arg Ala Asp Ala Pro
    210                 215                 220
Ala Asp Tyr Asp Cys Ile Gln Gly Asn Asp Pro Glu Thr Glu Leu Ile
225                 230                 235                 240
Ala Gly Gly Ser Val Ile Ile Asp Pro Met Gly Asn Ile Leu Ala Gly
                245                 250                 255
Pro Leu Tyr Gly Gln Glu Gly Val Leu Val Ala Asp Ile Asp Leu Ser
            260                 265                 270
Asp Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Asp Leu Asp Val Ser Gly His Tyr Gly
        275                 280                 285
Arg Pro Asp Ile Phe Glu Ile Lys Val Asp Arg Gln Ser His Gln Val
    290                 295                 300
Ile Thr Asp Gln Phe Ser Arg Asp Gln Ala Thr Glu Lys Lys Pro Val
305                 310                 315                 320
Ser Asp Ser Glu Ile Ser Gln Leu Asp
                325
<210>16
<211>339
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属OxB-1
<400>16
Met Ser Asn Tyr Pro Lys Tyr Arg Val Ala Ala Val Gln Ala Ser Pro
1               5                   10                  15
Val Leu Leu Asp Leu Asp Ala Thr Ile Asp Lys Thr Cys Arg Leu Val
            20                  25                  30
Asp Glu Ala Ala Ala Asn Gly Ala Lys Val Ile Ala Phe Pro Glu Ala
        35                  40                  45
Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Trp Trp Ile Trp Leu Gly Asn Ala Asp Tyr
    50                  55                  60
Gly Met Lys Tyr Tyr Ile Gln Leu Tyr Lys Asn Ser Val Glu Ile Pro
65                  70                  75                  80
Ser Leu Ala Val Gln Lys Leu Ser Ser Ala Gly Thr Asn Lys Val Tyr
                85                  90                  95
Phe Cys Val Ser Val Thr Glu Lys Asp Gly Gly Ser Leu Tyr Leu Thr
            100                 105                 110
Gln Leu Trp Phe Asp Pro Asn Gly Asp Leu Ile Gly Lys His Arg Lys
        115                 120                 125
Leu Lys Ala Thr Asn Ala Glu Lys Thr Ile Trp Gly Asp Gly Asp Gly
    130                 135                 140
Ser Met Met Pro Val Phe Glu Thr Glu Phe Gly Asn Leu Gly Gly Leu
145                 150                 155                 160
Gln Cys Trp Glu His Phe Leu Pro Leu Asn Val Ala Ala Met Ala Ser
                165                 170                 175
Met Asn Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ile Gly Met Pro Gln
            180                 185                 190
Glu Gly His Leu Phe Gly Pro Glu Gln Cys Val Thr Ala Thr Lys Tyr
        195                 200                 205
Tyr Ala Ile Ser Asn Gln Val Phe Cys Leu Leu Ser Ser Gln Ile Trp
    210                 215                 220
Thr Glu Glu Gln Arg Asp Lys Ile Cys Glu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
225                 230                 235                 240
Phe Met Lys Val Gly His Gly Phe Ser Lys Ile Ile Ala Pro Asn Gly
                245                 250                 255
Met Glu Ile Gly Asn Lys Leu Ala His Asp Glu Glu Gly Ile Thr Tyr
            260                 265                 270
Ala Asp Ile Asp Leu Glu Gln Ile Ile Pro Gly Lys Phe Leu Ile Asp
        275                 280                 285
Ser Ala Gly His Tyr Ser Thr Pro Gly Phe Leu Ser Leu Ser Phe Asp
    290                 295                 300
Arg Thr Glu Lys Lys Pro Ile Lys His Ile Gly Glu Ser Ala Gln Glu
305                 310                 315                 320
Thr Val Thr Tyr Glu Glu Ile Gln Tyr Gly Asn Lys Ala Asn Val Lys
                325                 330                 335
Val His Ser
<210>17
<211>354
<212>PRT
<213>睾丸酮丛毛单胞菌
<400>17
Met Lys Asn Tyr Pro Thr Val Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Ala Pro
1               5                   10                  15
Val Phe Met Asn Leu Glu Ala Thr Val Asp Lys Thr Cys Lys Leu Ile
            20                  25                  30
Ala Glu Ala Ala Ser Met Gly Ala Lys Val Ile Gly Phe Pro Glu Ala
        35                  40                  45
Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ile Trp Thr Ser Asn Met Asp Phe
    50                  55                  60
Thr Gly Met Met Trp Ala Val Leu Phe Lys Asn Ala Ile Glu Ile Pro
65                  70                  75                  80
Ser Lys Glu Val Gln Gln Ile Ser Asp Ala Ala Lys Lys Asn Gly Val
                85                  90                  95
Tyr Val Cys Val Ser Val Ser Glu Lys Asp Asn Ala Ser Leu Tyr Leu
            100                 105                 110
Thr Gln Leu Trp Phe Asp Pro Asn Gly Asn Leu Ile Gly Lys His Arg
        115                 120                 125
Lys Phe Lys Pro Thr Ser Ser Glu Arg Ala Val Trp Gly Asp Gly Asp
    130                 135                 140
Gly Ser Met Ala Pro Val Phe Lys Thr Glu Tyr Gly Asn Leu Gly Gly
145                 150                 155                 160
Leu Gln Cys Trp Glu His Ala Leu Pro Leu Asn Ile Ala Ala Met Gly
                165                 170                 175
Ser Leu Asn Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Phe Val Pro
            180                 185                 190
Lys Gly Ala Val Ser Ser Arg Val Ser Ser Ser Val Cys Ala Ser Thr
        195                 200                 205
Asn Ala Met His Gln Ile Ile Ser Gln Phe Tyr Ala Ile Ser Asn Gln
    210                 215                 220
Val Tyr Val Ile Met Ser Thr Asn Leu Val Gly Gln Asp Met Ile Asp
225                 230                 235                 240
Met Ile Gly Lys Asp Glu Phe Ser Lys Asn Phe Leu Pro Leu Gly Ser
                245                 250                 255
Gly Asn Thr Ala Ile Ile Ser Asn Thr Gly Glu Ile Leu Ala Ser Ile
            260                 265                 270
Pro Gln Asp Ala Glu Gly Ile Ala Val Ala Glu Ile Asp Leu Asn Gln
        275                 280                 285
Ile Ile Tyr Gly Lys Trp Leu Leu Asp Pro Ala Gly His Tyr Ser Thr
    290                 295                 300
Pro Gly Phe Leu Ser Leu Thr Phe Asp Gln Ser Glu His Val Pro Val
305                 310                 315                 320
Lys Lys Ile Gly Glu Gln Thr Asn His Phe Ile Ser Tyr Glu Asp Leu
                325                 330                 335
His Glu Asp Lys Met Asp Met Leu Thr Ile Pro Pro Arg Arg Val Ala
            340                 345                 350
Thr Ala
<210>18
<211>332
<212>PRT
<213>蓝细菌属CC9605
<400>18
Met Thr Thr Val Lys Val Ala Ala Ala Gln Ile Arg Pro Val Leu Phe
1               5                   10                  15
Ser Leu Asp Gly Ser Leu Gln Lys Val Leu Asp Ala Met Ala Glu Ala
            20                  25                  30
Ala Ala Gln Gly Val Glu Leu Ile Val Phe Pro Glu Thr Phe Leu Pro
        35                  40                  45
Tyr Tyr Pro Tyr Phe Ser Phe Val Glu Pro Pro Val Leu Met Gly Arg
    50                  55                  60
Ser His Leu Ala Leu Tyr Glu Gln Ala Val Val Val Pro Gly Pro Val
65                  70                  75                  80
Thr Asp Ala Val Ala Ala Ala Ala Ser Gln Tyr Gly Met Gln Val Leu
                85                  90                  95
Leu Gly Val Asn Glu Arg Asp Gly Gly Thr Leu Tyr Asn Thr Gln Leu
            100                 105                 110
Leu Phe Asn Ser Cys Gly Glu Leu Val Leu Lys Arg Arg Lys Ile Thr
        115                 120                 125
Pro Thr Tyr His Glu Arg Met Val Trp Gly Gln Gly Asp Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Leu Lys Val Val Gln Thr Pro Leu Ala Arg Val Gly Ala Leu Ala Cys
145                 150                 155                 160
Trp Glu His Tyr Asn Pro Leu Ala Arg Tyr Ala Leu Met Ala Gln Gly
                165                 170                 175
Glu Glu Ile His Cys Ala Gln Phe Pro Gly Ser Leu Val Gly Pro Ile
            180                 185                 190
Phe Thr Glu Gln Thr Ala Val Thr Met Arg His His Ala Leu Glu Ala
        195                 200                 205
Gly Cys Phe Val Ile Cys Ser Thr Gly Trp Leu His Pro Asp Asp Tyr
    210                 215                 220
Ala Ser Ile Thr Ser Glu Ser Gly Leu His Lys Ala Phe Gln Gly Gly
225                 230                 235                 240
Cys His Thr Ala Val Ile Ser Pro Glu Gly Arg Tyr Leu Ala Gly Pro
                245                 250                 255
Leu Pro Asp Gly Glu Gly Leu Ala Ile Ala Asp Leu Asp Leu Ala Leu
            260                 265                 270
Ile Thr Lys Arg Lys Arg Met Met Asp Ser Val Gly His Tyr Ser Arg
        275                 280                 285
Pro Glu Leu Leu Ser Leu Gln Ile Asn Ser Ser Pro Ala Val Pro Val
    290                 295                 300
Gln Asn Met Ser Thr Ala Ser Val Pro Leu Glu Pro Ala Thr Ala Thr
305                 310                 315                 320
Asp Ala Leu Ser Ser Met Glu Ala Leu Asn His Val
                325                 330
<210>19
<211>306
<212>PRT
<213>荧光假单胞菌Pf-5
<400>19
Met Pro Lys Ser Val Val Ala Ala Leu Gln Ile Gly Ala Leu Pro Glu
1               5                   10                  15
Gly Lys Ala Ala Thr Leu Glu Gln Ile Leu Ser Tyr Glu Ala Ala Ile
            20                  25                  30
Ile Glu Ala Gly Ala Gln Leu Val Val Met Pro Glu Ala Leu Leu Gly
        35                  40                  45
Gly Tyr Pro Lys Gly Glu Gly Phe Gly Thr Gln Leu Gly Tyr Arg Leu
    50                  55                  60
Pro Glu Gly Arg Glu Ala Phe Ala Arg Tyr Phe Ala Asn Ala Ile Glu
65                  70                  75                  80
Val Pro Gly Val Glu Thr Asp Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ala Arg Thr
                85                  90                  95
Gly Ala Asn Leu Val Leu Gly Val Ile Glu Arg Ser Gly Ser Thr Leu
            100                 105                 110
Tyr Cys Thr Ala Leu Tyr Phe Asp Pro Gln Gln Gly Leu Ser Gly Lys
        115                 120                 125
His Arg Lys Leu Met Pro Thr Gly Thr Glu Arg Leu Ile Trp Gly Lys
    130                 135                 140
Gly Asp Gly Ser Thr Leu Pro Val Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Val
145                 150                 155                 160
Gly Ala Val Ile Cys Trp Glu Asn Met Met Pro Leu Leu Arg Thr Ala
                165                 170                 175
Met Tyr Ala Gln Gly Ile Glu Val Trp Cys Ala Pro Thr Val Asp Glu
            180                 185                 190
Arg Glu Met Trp Gln Val Ser Met Arg His Ile Ala His Glu Gly Arg
        195                 200                 205
Cys Phe Val Val Ser Ala Cys Gln Val Gln Ala Ser Pro Glu Glu Leu
    210                 215                 220
Gly Leu Glu Ile Ala Asn Trp Pro Ala Gln Arg Pro Leu Ile Ala Gly
225                 230                 235                 240
Gly Ser Val Ile Val Gly Pro Met Gly Asp Val Leu Ala Gly Pro Leu
                245                 250                 255
Val Gly Arg Ala Gly Leu Ile Ser Ala Gln Ile Asp Thr Ala Asp Leu
            260                 265                 270
Val Arg Ala Arg Tyr Asp Tyr Asp Val Val Gly His Tyr Ala Arg Pro
        275                 280                 285
Asp Val Phe Glu Leu Thr Val Asp Gln Arg Pro Arg Pro Gly Val Arg
    290                 295                 300
Phe Thr
305
<210>20
<211>336
<212>PRT
<213>鼻疽诺卡菌IFM 10152]
<400>20
Met Ser Gln Arg Asp Ser Phe Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Pro
1               5                   10                  15
Val Trp Leu Asp Gly Ala Ala Thr Val Asp Lys Cys Val Ala Leu Ile
            20                  25                  30
Glu Glu Ala Ala Asp Asn Gly Ala Ala Leu Ile Ala Phe Pro Glu Thr
        35                  40                  45
Phe Val Pro Gly Tyr Pro Trp Trp Leu Trp Leu Asp Ser Pro Ala Trp
    50                  55                  60
Gly Met Gln Phe Val Ala Arg Tyr Phe Asp Asn Ser Leu Ala Leu Asp
65                  70                  75                  80
Gly Pro Leu Phe Ala Arg Leu Arg Glu Ala Ala Arg Arg Ser Ala Ile
                85                  90                  95
Thr Val Val Thr Gly His Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu Tyr Met
            100                 105                 110
Gly Gln Ala Ile Ile Gly Ala Asp Gly Glu Val Leu Ala Ala Arg Arg
        115                 120                 125
Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Phe Gly Glu Ser Asp
    130                 135                 140
Gly Ser Asn Leu Thr Val Val Asp Thr Glu Leu Gly Arg Leu Gly Ala
145                 150                 155                 160
Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Gln Pro Leu Thr Lys Tyr Ala Met Tyr
                165                 170                 175
Ser Gln His Glu Gln Ile His Val Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Val
            180                 185                 190
Tyr Arg Gly Ala Ala Tyr Ala Leu Gly Pro Glu Val Asn Thr Gly Ala
        195                 200                 205
Ala Arg Gln Tyr Ala Val Glu Gly Gln Cys Phe Val Leu Ser Pro Cys
    210                 215                 220
Ala Val Ile Asp Glu Ala Gly Val Glu Leu Phe Cys Asp Thr Pro Ala
225                 230                 235                 240
Lys Arg Glu Leu Leu Leu Pro Gly Gly Gly Phe Ala Gln Ile Tyr Gly
                245                 250                 255
Pro Asp Gly Arg Glu Leu Gly Thr Ala Leu Pro Glu Thr Glu Glu Gly
            260                 265                 270
Leu Val Tyr Ala Asp Leu Glu Ala Ser Ala Val Ala Val Ala Lys Ser
        275                 280                 285
Ala Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Gln Leu
    290                 295                 300
Leu Trp Asp Pro Arg Pro Arg Ser Val Val Arg Gln Val Ala Leu Ser
305                 310                 315                 320
Val Ala Ser Pro Ala Glu Ser Ala Asp Asp Ala Glu Pro Ala Val Arg
                325                 330                 335
<210>21
<211>356
<212>PRT
<213>固氮粪产碱菌1650
<400>21
Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala
            20                  25                  30
Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr
        35                  40                  45
Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp
    50                  55                  60
Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp
65                  70                  75                  80
Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile
                85                  90                  95
Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu
            100                 105                 110
Gly Gln Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg
        115                 120                 125
Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Phe Gly Glu Gly Tyr
    130                 135                 140
Ala Arg Asp Leu Ile Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala
145                 150                 155                 160
Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr
                165                 170                 175
Ser Gln His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu
            180                 185                 190
Tyr Ser Glu Gln Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Asn Met Ala Ala
        195                 200                 205
Ser Gln Ile Tyr Ser Val Glu Gly Gln Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser
    210                 215                 220
Ser Val Val Thr Gln Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His
225                 230                 235                 240
Asn Ala Pro Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala
                245                 250                 255
Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly
            260                 265                 270
Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala
        275                 280                 285
Ile Asn Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu
    290                 295                 300
Val Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys
305                 310                 315                 320
Ser Val Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile
                325                 330                 335
Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val
            340                 345                 350
Gln Glu Pro Ser
        355
<210>22
<211>336
<212>PRT
<213>丁香假单胞杆菌丁香致病变种B728a
<400>22
Met Lys Glu Pro Leu Lys Val Ala Cys Val Gln Ala Ala Pro Val Phe
1               5                   10                  15
Leu Asp Leu Asp Ala Thr Val Asp Lys Thr Ile Thr Leu Met Glu Gln
            20                  25                  30
Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ile Ala Phe Pro Glu Thr Trp Ile
        35                  40                  45
Pro Gly Tyr Pro Trp Phe Leu Trp Leu Asp Ala Pro Ala Trp Asn Met
    50                  55                  60
Pro Leu Val Gln Arg Tyr His Gln Gln Ser Leu Val Leu Asp Ser Val
65                  70                  75                  80
Gln Ala Arg Arg Ile Ser Asp Ala Ala Arg His Leu Gly Leu Tyr Val
                85                  90                  95
Val Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Asn Lys Ala Ser Leu Tyr Ile Gly Gln
            100                 105                 110
Trp Ile Ile Asp Asp His Gly Glu Thr Val Gly Val Arg Arg Lys Leu
        115                 120                 125
Lys Ala Thr His Val Glu Arg Thr Met Phe Gly Glu Gly Asp Gly Ala
    130                 135                 140
Ser Leu Arg Thr Phe Glu Thr Pro Val Gly Val Leu Gly Ala Leu Cys
145                 150                 155                 160
Cys Trp Glu His Leu Gln Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Met Tyr Ala Gln
                165                 170                 175
Asn Glu Gln Ile His Val Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu Tyr Arg
            180                 185                 190
Asn Ala Thr Ser Ala Leu Gly Pro Glu Val Asn Thr Ala Ala Ser Arg
        195                 200                 205
Val Tyr Ala Ala Glu Gly Gln Cys Phe Val Leu Ala Pro Cys Ala Ile
    210                 215                 220
Val Ser Pro Glu Met Ile Glu Met Leu Cys Asp Ser Asp Ala Lys Arg
225                 230                 235                 240
Ser Leu Leu Gln Ala Gly Gly Gly His Ala Arg Ile Phe Gly Pro Asp
                245                 250                 255
Gly Ser Asp Leu Ala Thr Pro Leu Gly Glu His Glu Glu Gly Leu Leu
            260                 265                 270
Tyr Ala Thr Leu Asp Pro Ala Ala Leu Thr Leu Ala Lys Val Ala Ala
        275                 280                 285
Asp Pro Ala Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Thr Arg Leu Met Phe
    290                 295                 300
Asn Pro Asn Pro Thr Pro Cys Val Val Asp Leu Pro Asp Leu Pro Ile
305                 310                 315                 320
Ser Ser Glu Ser Ile Glu Leu Leu Arg Pro Asp Ile Ala Leu Glu Val
                325                 330                 335
<210>23
<211>345
<212>PRT
<213>慢生根瘤菌属BTAi1
<400>23
Met Gly Leu Ala His Pro Lys Tyr Lys Val Ala Val Val Gln Ala Ala
1               5                   10                  15
Pro Ala Trp Leu Asp Leu Asp Ala Ser Ile Lys Lys Thr Ile Ala Leu
            20                  25                  30
Ile Glu Glu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Lys Leu Ile Ala Phe Pro Glu
        35                  40                  45
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Trp His Ile Trp Met Asp Ser Pro Ala
    50                  55                  60
Trp Cys Ile Gly Arg Gly Phe Val Gln Arg Tyr Phe Asp Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Asp Ser Pro Gln Ala Glu Ala Leu Arg Ala Ala Val Arg Lys
                85                  90                  95
Ala Gln Leu Thr Ala Val Leu Gly Leu Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser
            100                  105                  110
Leu Tyr Ile Ala Gln Trp Leu Ile Gly Ala Asp Gly Glu Thr Ile Ala
        115                  120                  125
Lys Arg Arg Lys Leu Arg Pro Thr His Ala Glu Arg Thr Val Tyr Gly
    130                 135                 140
Glu Gly Asp Gly Ser Asp Leu Ala Val His Glu Arg Pro Asp Ile Gly
145                 150                 155                 160
Arg Ile Gly Ala Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Gln Pro Leu Ser Lys
                165                 170                 175
Tyr Ala Met Tyr Ala Gln Asn Glu Gln Val His Val Ala Ala Trp Pro
            180                 185                 190
Ser Phe Ser Leu Tyr Asp Pro Phe Ala Pro Ala Leu Gly Ala Glu Val
        195                 200                 205
Asn Asn Ala Ala Ser Arg Val Tyr Ala Val Glu Gly Ser Cys Phe Val
    210                 215                 220
Leu Ala Pro Cys Ala Thr Val Ser Gln Ala Met Ile Asp Glu Leu Cys
225                 230                 235                 240
Asp Arg Pro Asp Lys His Ala Leu Leu His Ala Gly Gly Gly His Ala
                245                 250                 255
Ala Ile Phe Gly Pro Asp Gly Ser Ala Leu Ala Ala Gln Leu Pro Pro
            260                 265                 270
Asp Gln Glu Gly Leu Leu Ile Ala Glu Ile Asp Leu Gly Met Ile Gly
        275                 280                 285
Ile Ala Lys Asn Ala Ala Asp Pro Ala Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp
    290                 295                 300
Val Thr Arg Leu Leu Leu Asn Lys Lys Pro Leu Asn Arg Val Glu His
305                 310                 315                 320
Phe Ser Leu Pro Val Asp Ser Ala Ala Ala Ala Leu Pro Gly Glu Ala
                325                 330                 335
Ala Val Ala Arg Pro Asp Gln Ser Ile
            340                 345
<210>24
<211>366
<212>PRT
<213>紫红红球菌NCIMB 11216
<400>24
Met Val Glu Tyr Thr Asn Thr Phe Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Pro Val Trp Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Asp Lys Thr Val Ser Ile
            20                  25                  30
Ile Ala Glu Ala Ala Arg Asn Gly Cys Glu Leu Val Ala Phe Pro Glu
        35                  40                  45
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr His Ile Trp Val Asp Ser Pro Leu
    50                  55                  60
Ala Gly Met Ala Lys Phe Ala Val Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Thr
65                  70                  75                  80
Met Asp Ser Pro His Val Gln Arg Leu Leu Asp Ala Ala Arg Asp His
                85                  90                  95
Asn Ile Ala Val Val Val Gly Ile Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu
            100                 105                 110
Tyr Met Thr Gln Leu Ile Ile Asp Ala Asp Gly Gln Leu Val Ala Arg
        115                 120                 125
Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Ser Val Tyr Gly Glu
    130                 135                 140
Gly Asn Gly Ser Asp Ile Ser Val Tyr Asp Met Pro Phe Ala Arg Leu
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Ala
                165                 170                 175
Met Tyr Ser Met His Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Gly Met
            180                 185                 190
Ser Leu Tyr Gln Pro Glu Val Pro Ala Phe Gly Val Asp Ala Gln Leu
        195                 200                 205
Thr Ala Thr Arg Met Tyr Ala Leu Glu Gly Gln Thr Phe Val Val Cys
    210                 215                 220
Thr Thr Gln Val Val Thr Pro Glu Ala His Glu Phe Phe Cys Glu Asn
225                 230                 235                 240
Glu Glu Gln Arg Lys Leu Ile Gly Arg Gly Gly Gly Phe Ala Arg Ile
                245                 250                 255
Ile Gly Pro Asp Gly Arg Asp Leu Ala Thr Pro Leu Ala Glu Asp Glu
            260                 265                 270
Glu Gly Ile Leu Tyr Ala Asp Ile Asp Leu Ser Ala Ile Thr Leu Ala
        275                 280                 285
Lys Gln Ala Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu
    290                 295                 300
Ser Leu Asn Phe Asn Gln Arg Arg Thr Thr Pro Val Asn Thr Pro Leu
305                 310                 315                 320
Ser Thr Ile His Ala Thr His Thr Phe Val Pro Gln Phe Gly Ala Leu
                325                 330                 335
Asp Gly Val Arg Glu Leu Asn Gly Ala Asp Glu Gln Arg Ala Leu Pro
            340                 345                 350
Ser Thr His Ser Asp Glu Thr Asp Arg Ala Thr Ala Thr Leu
        355                 360                 365
<210>25
<211>366
<212>PRT
<213>紫红红球菌ATCC 39484
<400>25
Met Val Glu Tyr Thr Asn Thr Phe Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Gln
1               5                   10                  15
Pro Val Trp Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Asp Lys Thr Val Ser Ile
            20                  25                  30
Ile Ala Glu Ala Ala Arg Asn Gly Cys Glu Leu Val Ala Phe Pro Glu
        35                  40                  45
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr His Ile Trp Val Asp Ser Pro Leu
    50                  55                  60
Ala Gly Met Ala Lys Phe Ala Val Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Thr
65                  70                  75                  80
Met Asp Ser Pro His Val Gln Arg Leu Leu Asp Ala Ala Arg Asp His
                85                  90                  95
Asn Ile Ala Val Val Val Gly Ile Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu
            100                 105                 110
Tyr Met Thr Gln Leu Ile Ile Asp Ala Asp Gly Gln Leu Val Ala Arg
        115                 120                 125
Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Ser Val Tyr Gly Glu
    130                 135                 140
Gly Asn Gly Ser Asp Ile Ser Val Tyr Asp Met Pro Phe Ala Arg Leu
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Ala
                165                 170                 175
Met Tyr Ser Met His Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Gly Met
            180                 185                 190
Ser Leu Tyr Gln Pro Glu Val Pro Ala Phe Gly Val Asp Ala Gln Leu
        195                 200                 205
Thr Ala Thr Arg Met Tyr Ala Leu Glu Gly Gln Thr Phe Val Val Cys
    210                 215                 220
Thr Thr Gln Val Val Thr Pro Glu Ala His Glu Phe Phe Cys Glu Asn
225                 230                 235                 240
Glu Glu Gln Arg Met Leu Ile Gly Arg Gly Gly Gly Phe Ala Arg Ile
                245                 250                 255
Ile Gly Pro Asp Gly Arg Asp Leu Ala Thr Pro Leu Ala Glu Asp Glu
            260                 265                 270
Glu Gly Ile Leu Tyr Ala Asp Ile Asp Leu Ser Ala Ile Thr Leu Ala
        275                 280                 285
Lys Gln Ala Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu
    290                 295                 300
Ser Leu Asn Phe Asn Gln Arg Arg Thr Thr Pro Val Asn Thr Pro Leu
305                 310                 315                 320
Ser Thr Ile His Ala Thr His Thr Phe Val Pro Gln Phe Gly Ala Leu
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Asp Gly Val Arg Glu Leu Asn Gly Ala Asp Glu Gln Arg Ala Leu Pro
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Ser Thr His Ser Asp Glu Thr Asp Arg Ala Thr Ala Thr Leu
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<210>26
<211>1110
<212>DNA
<213>敏捷食酸菌72W
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1110)
<400>26
atg gtt tcg tat aac agc aag ttc ctc gcg gca acc gtt cag gca gag    48
Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu
1               5                   10                  15
ccg gta tgg ctc gac gca gac gca acg atc gac aag tcg atc ggc atc    96
Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
            20                  25                  30
atc gaa gaa gct gcc caa aag ggc gcg agt ctg atc gct ttc ccg gaa    144
Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
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gta ttc att ccg ggc tac ccc tat tgg gcg tgg ctc ggc gac gtg aag    192
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
tac agc cta agc ttt act tca cgc tat cac gag aat tcg ttg gag cta    240
Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
65                  70                  75                  80
ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gcg cgc cgc aac aaa    288
Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
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atc gca ctc gtc atg ggc tat tcg gag cgg gaa gcc gga tcg cgc tat    336
Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
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ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc gag atc gtt gcc aat cgg    384
Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
        115                 120                 125
cgc aag ctg aag ccc aca cac gtt gag cgt acg atc tac ggc gaa ggc    432
Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
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Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
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cct ctt cag ccg gat gtt ttc caa cag agc atc gaa gcc aac gcg acg    624
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Gln Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr
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Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
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Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
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Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
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Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
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Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
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Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
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Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
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Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
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Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
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Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
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Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
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Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
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Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
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ValThr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser
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Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
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Lys
<210>28
<211>1110
<212>DNA
<213>敏捷食酸菌72W
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1110)
<400>28
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Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu
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Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
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Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
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Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
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Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
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Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
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Lys
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Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
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Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
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Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
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Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
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atg gtt tcg tat aac agc aag ttc ctc gcg gca acc gtt cag gca gag    48
Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu
1               5                   10                  15
ccg gta tgg ctc gac gca gac gca acg atc gac aag tcg atc ggc atc    96
Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
            20                  25                  30
atc gaa gaa gct gcc caa aag ggc gcg agt ctg atc gct ttc ccg gaa    144
Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
        35                  40                  45
gta ttc att ccg ggc tac ccc tat tgg gcg tgg ctc ggc gac gtg aag    192
Val PheIle Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
tac agc cta agc ttt act tca cgc tat cac gag aat tcg ttg gag cta    240
Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
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ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gcg cgc cgc aac aaa    288
Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
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atc gca ctc gtc atg ggc tat tcg gag cgg gaa gcc gga tcg cgc tat    336
Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
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ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc gag atc gtt gcc aat cgg    384
Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
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Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
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Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
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Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
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Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
tac agc cta agc ttt act tca cgc tat cac gag aat tcg ttg gag cta    240
Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
65                  70                  75                  80
ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gcg cgc cgc aac aaa    288
Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
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atc gca ctc gtc atg ggc tat tcg gag cgg gaa gcc gga tcg cgc tat    336
Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
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ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc gag atc gtt gcc aat cgg    384
Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
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cgc aag ctg aag ccc aca cac gtt gag cgt acg atc tac ggc gaa ggc    432
Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
    130                 135                 140
aac gga acc gat ttc ctc acg cac gac ttc gcg ttc gga cgc gtc ggt    480
Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly
145                 150                 155                 160
gga ttg aac tgc tgg gaa cat ttc caa ccg ctc agc aag ttc atg atg    528
Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
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tac agc ctc ggt gag cag gtc cac gtt gca tcg tgg ccg gcg atg tcc    576
Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
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cct ctt cag ccg gat gtt ttc caa tct agc atc gaa gcc aac gcg acg    624
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Ser Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr
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Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp
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gaa cag cgc gca ctg ttg ccg caa gga tgt ggc tgg gcg cgc att tac    768
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Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
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Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
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Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
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Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
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Lys
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<213>敏捷食酸菌72W
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Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
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Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
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Lys
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atc gaa gaa gct gcc caa aag ggc gcg agt ctg atc gct ttc ccg gaa    144
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Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
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Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
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ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc gag atc gtt gcc aat cgg    384
Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
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Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
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Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Met Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
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Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
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Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly
145                 150                 155                 160
gga ttg aac tgc tgg gaa cat gtg caa ccg ctc agc aag ttc atg atg    528
Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Val Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
                165                 170                 175
tac agc ctc ggt gag cag gtc cac gtt gca tcg tgg ccg gcg atg tcc    576
Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
            180                 185                 190
cct ctt cag ccg gat gtt ttc caa ctg agc atc gaa gcc aac gcg acg    624
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr
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gtc acc cgc tcg tac gca atc gaa ggc caa acc ttt gtg ctt tgc tcg    672
Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser
    210                 215                 220
acg cag gtg atc gga cct agc gcg atc gaa acg ttc tgc ctc aac gac    720
Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp
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gaa cag cgc gca ctg ttg ccg caa gga tgt ggc tgg gcg cgc att tac    768
Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr
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ggc ccg gat gga agc gag ctt gcg aag cct ctg gcg gaa gat gct gag    816
Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
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ggg atc ttg tac gca gag atc gat ctg gag cag att ctg ctg gcg aag    864
Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
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gct gga gcc gat ccg gtc ggg cac tat tcg cgg cct gac gtg ctg tcg    912
Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
    290                 295                 300
gtc cag ttc gac ccg cgc aat cat acg cca gtt cat cgc atc ggc att    960
Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
305                 310                 315                 320
gac ggt cgc ttg gat gtg aat acc cgc agt cgc gtg gag aat ttc cga    1008
Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
                325                 330                 335
ctg cga caa gcg gct gag cag gag cgt cag gca tcc aag cgg ctc gga    1056
Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
            340                 345                 350
acg aaa ctc ttt gaa caa tcc ctt ctg gct gaa gaa ccg gtc cca gca    1104
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala
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aag tag                                                            1110
Lys
<210>51
<211>369
<212>PRT
<213>敏捷食酸菌72W
<400>51
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Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
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Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
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Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
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Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
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Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
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Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
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Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
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Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Val Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
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Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
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Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr
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Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
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Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
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Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
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Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
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Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
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Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
            340                 345                 350
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala
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Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu
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ccg gta tgg ctc gac gca gac gca acg atc gac aag tcg atc ggc atc    96
Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
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atc gaa gaa gct gcc caa aag ggc gcg agt ctg atc gct ttc ccg gaa    144
Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
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gta ttc att ccg ggc tac ccc tat tgg gcg tgg ctc ggc gac gtg aag    192
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
tac agc cta agc ttt act tca cgc tat cac gag aat tcg ttg gag cta    240
Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
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ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gcg cgc cgc aac aaa    288
Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
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atc gca ctc gtc atg ggc tat tcg gag cgg gaa gcc gga tcg cgc tat    336
Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
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ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc gag atc gtt gcc aat cgg    384
Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
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cgc aag ctg aag ccc aca cac gtt gag cgt acg atc tac ggc gaa ggc    432
Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
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aac gga acc gat ttc ctc acg cac gac ttc gcg ttc gga cgc gtc ggt    480
Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly
145                 150                 155                 160
gga ttg aac tgc tgg gaa cat ttc caa ccg ctc agc aag ttc atg atg    528
Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
                165                 170                 175
tac agc ctc ggt gag cag gtc cac gtt gca tcg tgg ccg gcg atg tcc    576
Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
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cct ctt cag ccg gat gtt ttc caa ctg agc atc gaa gcc aac gcg acg    624
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr
        195                 200                 205
gtc gcc cgc tcg tac gca atc gaa ggc caa acc ttt gtg ctt tgc tcg    672
Val Ala Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser
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Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
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Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
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Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
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Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
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Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
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acg aaa ctc ttt gaa caa tcc ctt ctg gct gaa gaa ccg gtc cca gca    1104
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala
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Lys
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<400>53
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Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
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Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
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Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
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    290                 295                 300
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Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
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Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
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Lys
<210>54
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<400>54
atg gtt tcg tat aac agc aag ttc ctc gcg gca acc gtt cag gca gag    48
Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu
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ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gcg cgc cgc aac aaa    288
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            180                 185                 190
cct ctt cag ccg gat gtt ttc caa ctg agc atc gaa gcc aac gcg acg    624
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr
        195                 200                 205
gtc tgc cgc tcg tac gca atc gaa ggc caa acc ttt gtg ctt tgc tcg    672
Val Cys Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser
    210                 215                 220
acg cag gtg atc gga cct agc gcg atc gaa acg ttc tgc ctc aac gac    720
Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp
225                 230                 235                 240
gaa cag cgc gca ctg ttg ccg caa gga tgt ggc tgg gcg cgc att tac    768
Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr
                245                 250                 255
ggc ccg gat gga agc gag ctt gcg aag cct ctg gcg gaa gat gct gag    816
Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
            260                 265                 270
ggg atc ttg tac gca gag atc gat ctg gag cag att ctg ctg gcg aag    864
Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
        275                 280                 285
gct gga gcc gat ccg gtc ggg cac tat tcg cgg cct gac gtg ctg tcg    912
Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
    290                 295                 300
gtc cag ttc gac ccg cgc aat cat acg cca gtt cat cgc atc ggc att    960
Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
305                 310                 315                 320
gac ggt cgc ttg gat gtg aat acc cgc agt cgc gtg gag aat ttc cga    1008
Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
                325                 330                 335
ctg cga caa gcg gct gag cag gag cgt cag gca tcc aag cgg ctc gga    1056
Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
            340                 345                 350
acg aaa ctc ttt gaa caa tcc ctt ctg gct gaa gaa ccg gtc cca gca    1104
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala
        355                 360                 365
aag tag                                                            1110
Lys
<210>55
<211>369
<212>PRT
<213>敏捷食酸菌72W
<400>55
Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu
1               5                   10                  15
Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
            20                  25                  30
Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
        35                  40                  45
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
65                  70                  75                  80
Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
                85                  90                  95
Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
            100                 105                 110
Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
        115                 120                 125
Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
    130                 135                 140
Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly
145                 150                 155                 160
Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
                165                 170                 175
Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
            180                 185                 190
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr
        195                 200                 205
Val Cys Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser
    210                 215                 220
Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp
225                 230                 235                 240
Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr
                245                 250                 255
Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
            260                 265                 270
Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
        275                 280                 285
Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
    290                 295                 300
Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
305                 310                 315                 320
Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
                325                 330                 335
Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
            340                 345                 350
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Pro Ala
        355                 360                 365
Lys
<210>56
<211>1110
<212>DNA
<213>大肠杆菌SS1001
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1110)
<400>56
atg gtt tcg tat aac agc aag ttc ctc gcg gca acc gtt cag gca gag       48
Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu
1               5                   10                  15
ccg gta tgg ctc gac gca gac gca acg atc gac aag tcg atc ggc atc    96
Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
            20                  25                  30
atc gaa gaa gct gcc caa aag ggc gcg agt ctg atc gct ttc ccg gaa    144
Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
        35                  40                  45
gta ttc att ccg ggc tac ccc tat tgg gcg tgg ctc ggc gac gtg aag    192
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
tac agc cta agc ttt act tca cgc tat cac gag aat tcg ttg gag cta    240
Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
65                  70                  75                  80
ggt gac gac cgt atg cgt cgc ctc cag ctg gcc gcg cgc cgc aac aaa    288
Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
                85                  90                  95
atc gca ctc gtc atg ggc tat tcg gag cgg gaa gcc gga tcg cgc tat    336
Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
            100                 105                 110
ctg agc cag gtg ttc atc gac gag cgt ggc gag atc gtt gcc aat cgg    384
Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
        115                 120                 125
cgc aag ctg aag ccc aca cac gtt gag cgt acg atc tac ggc gaa ggc    432
Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
    130                 135                 140
aac gga acc gat ttc ctc acg cac gac ttc gcg ttc gga cgc gtc ggt    480
Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly
145                 150                 155                 160
gga ttg aac tgc tgg gaa cat ttc caa ccg ctc agc aag ttc atg atg    528
Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
                165                 170                 175
tac agc ctc ggt gag cag gtc cac gtt gca tcg tgg ccg gcg atg tcc    576
Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
            180                 185                 190
cct ctt cag ccg gat gtt ttc caa ctg agc atc gaa gcc aac gcg acg    624
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr
        195                 200                 205
gtc acc cgc tcg tac gca atc gaa ggc caa acc ttt gtg ctt tgc tcg    672
Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser
    210                 215                 220
acg cag gtg atc gga cct agc gcg atc gaa acg ttc tgc ctc aac gac    720
Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp
225                 230                 235                 240
gaa cag cgc gca ctg ttg ccg caa gga tgt ggc tgg gcg cgc att tac    768
Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr
                245                 250                 255
ggc ccg gat gga agc gag ctt gcg aag cct ctg gcg gaa gat gct gag    816
Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
            260                 265                 270
ggg atc ttg tac gca gag atc gat ctg gag cag att ctg ctg gcg aag    864
Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
        275                 280                 285
gct gga gcc gat ccg gtc ggg cac tat tcg cgg cct gac gtg ctg tcg    912
Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
    290                 295                 300
gtc cag ttc gac ccg cgc aat cat acg cca gtt cat cgc atc ggc att    960
Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
305                 310                 315                 320
gac ggt cgc ttg gat gtg aat acc cgc agt cgc gtg gag aat ttc cga    1008
Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
                325                 330                 335
ctg cga caa gcg gct gag cag gag cgt cag gca tcc aag cgg ctc gga    1056
Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
            340                 345                 350
acg aaa ctc ttt gaa caa tcc ctt ctg gct gaa gaa ccg gtc tca gca    1104
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Ser Ala
        355                 360                 365
aag tag                                                       1110
Lys
<210>57
<211>369
<212>PRT
<213>大肠杆菌SS1001
<400>57
Met Val Ser Tyr Asn Ser Lys Phe Leu Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu
1               5                   10                  15
Pro Val Trp Leu Asp Ala Asp Ala Thr Ile Asp Lys Ser Ile Gly Ile
            20                  25                  30
Ile Glu Glu Ala Ala Gln Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Glu
        35                  40                  45
Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr Trp Ala Trp Leu Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
Tyr Ser Leu Ser Phe Thr Ser Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Glu Leu
65                  70                  75                  80
Gly Asp Asp Arg Met Arg Arg Leu Gln Leu Ala Ala Arg Arg Asn Lys
                85                  90                  95
Ile Ala Leu Val Met Gly Tyr Ser Glu Arg Glu Ala Gly Ser Arg Tyr
            100                 105                 110
Leu Ser Gln Val Phe Ile Asp Glu Arg Gly Glu Ile Val Ala Asn Arg
        115                 120                 125
Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Gly
    130                 135                 140
Asn Gly Thr Asp Phe Leu Thr His Asp Phe Ala Phe Gly Arg Val Gly
145                 150                 155                 160
Gly Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Pro Leu Ser Lys Phe Met Met
                165                 170                 175
Tyr Ser Leu Gly Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Ala Met Ser
            180                 185                 190
Pro Leu Gln Pro Asp Val Phe Gln Leu Ser Ile Glu Ala Asn Ala Thr
        195                 200                 205
Val Thr Arg Ser Tyr Ala Ile Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys Ser
    210                 215                 220
Thr Gln Val Ile Gly Pro Ser Ala Ile Glu Thr Phe Cys Leu Asn Asp
225                 230                 235                 240
Glu Gln Arg Ala Leu Leu Pro Gln Gly Cys Gly Trp Ala Arg Ile Tyr
                245                 250                 255
Gly Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Lys Pro Leu Ala Glu Asp Ala Glu
            260                 265                 270
Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Glu Gln Ile Leu Leu Ala Lys
        275                 280                 285
Ala Gly Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser
    290                 295                 300
Val Gln Phe Asp Pro Arg Asn His Thr Pro Val His Arg Ile Gly Ile
305                 310                 315                 320
Asp Gly Arg Leu Asp Val Asn Thr Arg Ser Arg Val Glu Asn Phe Arg
                325                 330                 335
Leu Arg Gln Ala Ala Glu Gln Glu Arg Gln Ala Ser Lys Arg Leu Gly
            340                 345                 350
Thr Lys Leu Phe Glu Gln Ser Leu Leu Ala Glu Glu Pro Val Ser Ala
        355                 360                 365
Lys

Claims (25)

1.一种改进乙醇腈酶法转化为乙醇酸过程中酶催化剂比活性的方法，所述方法包括：
(a)提供反应成分组，其包括：
(i)包含至少0.01ppm甲醛的乙醇腈水溶液；
(ii)包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化剂，其中所述多肽包含SEQ ID NO：1的催化标志基序；其中所述酶催化剂包含将乙醇腈水解为乙醇酸的比活性；和
(iii)有效量的至少一种胺保护剂，选自：
a)式[R3](1+X)-NH(2-X)的化合物，其中X是0或1，R3独立地是C1-C20烃基基团或取代的烃基基团，其中R3任选地包含一个或多个醚键；条件是(i)取代的基团优选不是能够与酶催化剂反应的氰基基团和(ii)R3不是羰基基团；
b)包含有效数目的游离胺基团的多胺聚合物；和
c)包含有效数目的游离胺基团的胺官能化的材料；
其中所述胺保护剂不是由所述酶催化剂天然产生的；
(b)在合适的水性反应条件下将所述反应成分组混合，从而产生乙醇酸；其中通过加入所述至少一种胺保护剂而增加了所述比活性；和
(c)回收(b)中产生的乙醇酸或其盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中具有腈水解酶活性的多肽包含SEQID NO：2的催化标志基序。
3.根据权利要求1所述的方法，其中胺保护剂在所述合适的水性反应条件下是可溶的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中胺保护剂在所述合适的水性反应条件下是不可溶的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中酶催化剂不是固定于包含所述胺保护剂的基质中。
6.根据权利要求4所述的方法，其中酶催化剂固定于包含所述胺保护剂的不可溶基质中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中酶催化剂固定于包含聚乙烯亚胺的不可溶基质之中或之上。
8.根据权利要求7所述的方法，其中酶催化剂固定于戊二醛-聚乙烯亚胺交联的角叉菜胶颗粒或珠子之中或之上。
9.根据权利要求1所述的方法，其中多胺聚合物选自：2-氨基-2-脱氧-(1→4)-β-D-吡喃葡萄聚糖、具有2-12个碳原子的亚烷基部分的聚亚烷基胺聚合物、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、聚乙烯醇/聚乙烯胺共聚物、D-聚赖氨酸、L-聚赖氨酸、D/L聚赖氨酸的混合物、以戊二醛交联的聚乙烯亚胺、及其混合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中多胺聚合物的平均分子量介于1,000道尔顿至2,000,000道尔顿。
11.根据权利要求1所述的方法，其中胺官能化的材料选自胺官能化的聚合物和胺官能化的支持材料。
12.根据权利要求11所述的方法，其中胺官能化的聚合物选自胺官能化的多糖、胺官能化的聚糖、胺官能化的琼脂糖、胺官能化的角叉菜胶、胺官能化的藻酸盐、胺官能化的葡聚糖、胺官能化的纤维素、胺官能化的甲基丙烯酸酯、胺官能化的聚氨酯、胺官能化的聚酯、胺官能化的尼龙、胺官能化的聚苯乙烯和胺官能化的聚乙烯醇。
13.根据权利要求11所述的方法，其中胺官能化的支持材料选自胺官能化的矾土、胺官能化的硅土、胺官能化的磁石、胺官能化的可控孔度玻璃、包含一个或多个伯胺或仲胺基团的弱碱性阴离子交换树脂、氨基丙基硅化的玻璃珠、ω-氨基己基琼脂糖、ω-氨基十二烷基琼脂糖和ω-氨基乙基琼脂糖。
14.根据权利要求13所述的方法，其中胺官能化的支持材料以聚乙烯亚胺进行官能化。
15.根据权利要求14所述的方法，其中胺官能化的支持材料选自聚乙烯亚胺官能化的硅土和聚乙烯亚胺官能化的聚苯乙烯。
16.根据权利要求1所述的方法，其中具有腈水解酶活性的多肽源自选自以下属的宿主细胞：食酸菌属、红球菌属、诺卡氏菌属、芽孢杆菌属和产碱杆菌属。
17.根据权利要求1所述的方法，其中酶催化剂是以下形式：整个微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一个或多个细胞成分、部分纯化的酶、或纯化的酶。
18.根据权利要求17所述的方法，其中酶催化剂是选自以下属的经转化的微生物宿主细胞：丛毛单胞菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、红球菌属、固氮菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母菌属、耶氏酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、杜氏藻属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、根瘤菌属和链霉菌属。
19.根据权利要求18所述的方法，其中经转化的微生物宿主细胞选自芽孢杆菌属、假单胞菌属和埃希氏菌属。
20.根据权利要求19所述的方法，其中经转化的微生物宿主细胞是大肠杆菌。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽与SEQ ID NO：51具有至少95％的氨基酸同一性。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有腈水解酶活性的多肽选自SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55和57。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述具有腈水解酶活性的多肽选自SEQ ID NO：4、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55和57。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述具有腈水解酶活性的多肽选自SEQ ID NO：4、24、25和51。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述具有腈水解酶活性的多肽是SEQ ID NO：51。
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