CN106967705A - 一种山桃醇腈酶PdHNL2及其编码基因与应用 - Google Patents

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徐晟�
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李宜奎
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Abstract

本发明公开了一种山桃醇腈酶PdHNL2及其编码基因与应用。该山桃醇腈酶PdHNL2，是具有序列表中的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质。其编码基因的开放阅读框具有SEQ ID NO.2所示的DNA序列。PdHNL2可以催化醇腈的降解产生醛或酮。此外，PdHNL2还可以可逆的催化醛或酮生成手性醇腈，例如(R)‑邻氯扁桃腈。

Description

一种山桃醇腈酶PdHNL2及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种山桃醇腈酶PdHNL2及其编码基因与应用。
背景技术
醇腈酶(Hydroxynitrile lyase,HNL；E.C.4.1.2.x)是一种广泛存在于高等植物中的裂解酶，也是植物用来抵御外敌的关键酶，在生理条件下，HNL参与植物的生氰作用或氨基酸的合成代谢。作为一种生物催化剂，HNL还能高度选择性的可逆催化由氢氰酸(hydrogen cyanide,HCN)和醛(或酮)生成R或S型手性氰醇的反应，还可转化成羟基化合物、胺基合成物、羧基化合物等多种重要手性中间体，进而转化成多种手性药物。例如，利用HNL催化产生的邻氯扁桃腈，可以进一步合成(R)-邻氯扁桃酸；(R)-邻氯扁桃酸可以合成新型安全高效的抗血小板聚集药物氯吡格雷(clopidogrel)。氯吡格雷在临床上用于治疗动脉粥状硬化疾病、中风、急性冠状动脉综合征、预防心肌梗塞和血栓性并发症等。
HNL在自然界中是广泛存在的，主要分为两类：R构型和S构型。蔷薇科植物包括杏(Prunus armeniaca)、枇杷(Eriobotrya japonica)和扁桃(Prunus amygdalus)等果实的核仁中HNL的含量丰富，易提纯，已成为工业生物合成的 R型羟腈化合物的主要酶源，而高梁、木薯、三叶胶中的HNL均能立体专一性催化脂肪族、芳香族和杂环族S型羟腈化合物的合成。因此，在不对称合成领域中，HNL已经成为研究的热点。
另一方面，利用生物体系(各种细胞和酶)作催化剂实现有机物的生物转化和生物合成，是当今手性有机合成化学的研究热点(Patel 2002,2003, 2004)。生物催化剂作为手性催化剂进行反应，具有反应条件温和、副反应少、光学纯度高、立体选择性和专一性高以及环境友好等优点，对环境及社会发展，对绿色化工产业的建立都有极其重要的应用意义和前景。其中，通过克隆许多物种的HNL基因，包括三叶胶(HbHNL)、木薯(MeHNL,)、扁桃(PaHNL)、亚麻(LuHNL)和拟南芥(AtHNL)等，分别在大肠杆菌(Escherichia coli)、毕赤酵母(Pichia pastoris)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物宿主菌中进行表达，为利用基因工程菌合成手性羟腈化合物奠定了基础。不过，山桃醇腈酶及其编码基因尚未被分离与克隆因此，本领域有必要开发山桃的醇腈酶。该蛋白及其编码基因可通过植物转基因和异源表达的方式进行手性醇腈的合成。
发明内容
本发明的目的是提供一种山桃醇腈酶PdHNL2及其编码基因与应用。
本发明提供的蛋白质PdHNL2来自山桃(Prunus davidiana)，具有醇腈酶的功能，为如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：
(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺和/或添加且具有醇腈酶功能的由SEQ ID NO.1衍生的序列相似度大于90％的蛋白质；
(c)包括由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白质。
上述蛋白质PdHNL2可人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明的另一目的是提供该山桃醇腈酶PdHNL2蛋白的编码基因，具体的，该蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明通过RT-PCR方法克隆了山桃醇腈酶基因Pdhnl2，其最大开放阅读框序列含有1740bp，编码SEQ ID NO.1所示的579个氨基酸残基。
对于E.coli表达系统，本发明采用E.coli表达系统载体，如pET28a(+)。将山桃醇腈酶基因Pdhnl2插入E.coli表达载体，获得重组表达载体。将获得的重组表达载体，转化E.coli表达系统，如E.coli BL21(DE3)表达载体，获得可表达山桃醇腈酶PdHNL2的E.coli重组表达菌株。本发明优选质粒为pET28a(+)，优选表达宿主为E.coli BL21(DE3)。
对于P.pastoris表达系统，本发明采用P.pastoris表达系统载体，如 pPICZαA。将本发明的山桃醇腈酶基因Pdhnl2插入至表达载体相应的限制性内切酶的酶切位点，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接，获得重组表达载体。作为本发明的一个优选试验方案，优选将山桃醇腈酶基因Pdhnl2插入到表达载体质粒pPICZαA，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，获得可重组P.pastoris表达质粒pPICZαA-Pdhnl2。本发明还提供了包含上述山桃醇腈酶基因Pdhnl2的重组菌株，优选所述表达菌株为P.pastoris X33，优选为重组菌株P.pastoris X33/Pdhnl2。
本发明的又一目的是提供该山桃醇腈酶PdHNL2的应用，用于合成扁桃腈或邻氯扁桃腈。
本发明还提供了一种制备山桃醇腈酶PdHNL2的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得到重组表达菌株；
2)培养重组表达菌株，诱导(如果是诱导型启动子)、过量表达重组山桃醇腈酶PdHNL2。
3)回收并纯化所表达的山桃醇腈酶PdHNL2。
本发明所提供的蛋白质山桃醇腈酶PdHNL2、重组菌及山桃醇腈酶 PdHNL2制备方法为工业化大规模生产山桃醇腈酶提供了有效途径。
附图说明
图1是Pdhnl2基因聚合酶链式反应(PCR)产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2是本发明蛋白质PdHNL2在E.coli BL21(DE3)重组表达菌株中表达后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱。其中：1，蛋白Marker；2，含有空载体pET28a(+)的E.coliBL21(DE3)诱导6h；3，含有重组表达载体 pET28a-PdHNL2的E.coli BL21(DE3)诱导6h；4，含有重组表达载体 pET28a-PdHNL2的E.coli BL21(DE3)诱导12h。
图3是本发明蛋白质PdHNL2在P.pastoris X33重组表达菌株中表达后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱。其中：1，蛋白Marker；2，含有重组表达载体pPICZαA-PdHNL2的P.pastoris X33诱导表达上清液；3，含有pPICZα A空载体的P.pastoris X33诱导表达上清液；4，P.pastoris X33诱导表达上清液。
图4是山桃醇腈酶PdHNL2的体外活性检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例并附图，进一步详细地阐述本发明。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1山桃醇腈酶基因Pdhnl2的克隆
以山桃(Prunus davidiana)幼嫩新鲜叶片为材料，提取RNA，并反转录成cDNA作为模板，利用具有序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的核苷酸引物序列，PCR扩增编码区片段。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。切下目标DNA 条带纯化回收，将回收的DNA片段连接到pMD19-T载体上，转化E.coli DH5α感受态细胞，经氨苄抗性筛选后挑取单克隆子进行菌落PCR验证。阳性克隆子经测序利用Blast软件进行比对分析，结果发现插入的片段与桃(Prunus persica) 醇腈酶基因一致性高达99％。
Pdhnl2编码基因具有序列表中SEQ ID NO.2的核苷酸序列。自SEQ ID NO.2的5’-端第1-1740位核苷酸为Pdhnl2的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)，自SEQ ID NO.2的5’-端的第1-3位核苷酸为Pdhnl2编码基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO.2的5’-端的第1738-1740位核苷酸为Pdhnl2编码基因的终止密码子TAG。山桃醇腈酶基因Pdhnl编码一个含有579个氨基酸的蛋白质PdHNL2，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为62.9KDa，等电点pI为4.57。
实施例2山桃醇腈酶Pdhnl2基因在E.coli中的异源表达
一、携带Pdhnl2基因E.coli表达系统重组载体的构建
以山桃cDNA为模板，根据序列SEQ ID No.2设计引物，PCR扩增山桃Pdhnl2基因编码区的DNA序列。引物两端分别引入Nco I和Not I酶切位点和保护碱基；引物序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带纯化回收，将回收的 DNA片段连接到pMD19-T载体上，转化E.coli DH5α感受态细胞，经氨苄抗性筛选，挑取克隆子进行菌落PCR验证后提取质粒测序，得到含有Nco I和Not I 酶切位点及编码Pdhnl2基因的质粒pMD19T-Pdhnl2。
将质粒pMD19T-Pdhnl28和空载体质粒pET28a(+)分别在30℃条件下用 Nco I和Not I双酶切12h后，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收，用T4DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取卡那霉素抗性的单克隆，提取质粒，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6引物进行 PCR鉴定，并将PCR鉴定正确的阳性克隆子进行测序鉴定。将测序正确的含有 SEQ ID NO.1序列并与6×组氨酸(His)融合的重组载体命名为pET28a-Pdhnl2。
二、重组表达载体pET28a-Pdhnl2转化宿主、阳性克隆鉴定
将步骤一中构建的重组表达载体pET28a-Pdhnl2转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞，同时将pET28a空载体E.coli BL21(DE3)，作为对照菌。挑取卡那霉素抗性的单克隆，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6引物进行PCR检测。将菌落PCR验证阳性的阳性克隆克隆子，用于蛋白的诱导表达。
三、Pdhnl2基因的原核表达
将步骤二中鉴定正确的克隆培养过夜，再将细菌100倍稀释于含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养，待菌液生长至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG(终浓度为0.1mM)进行诱导培养，16℃诱导12h，同时将含有 pET28a(+)空载体E.coli BL21(DE3)作为对照菌。取诱导过的菌液1mL，离心收集菌体(4000rpm，10min)，菌体蛋白进行12％SDS-PAGE电泳检测。结果表明，在IPTG诱导下，含有重组表达载体pET28a-Pdhnl2的E.coli BL21(DE3)中成功表达了PdHNL2蛋白，且表达PdHNl2蛋白的表观分子量与理论分子量相近 (图2)。
实施例3山桃醇腈酶Pdhnl2基因在P.pastoris中的异源表达
一、携带Pdhnl2基因P.pastoris表达系统重组载体的构建
以山桃cDNA为模板，根据序列SEQ ID No.2设计引物，PCR扩增山桃Pdhnl2基因编码区的DNA序列。引物两端分别引入Kpn I和Not I酶切位点和保护碱基；引物序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带纯化回收，将回收的 DNA片段连接到pMD19-T载体上，转化E.coli DH5α感受态细胞，经氨苄抗性筛选，挑取克隆子进行菌落PCR验证后提取质粒测序，得到含有Kpn I和Not I 酶切位点及编码Pdhnl2基因的质粒pMD19T-Pdhnl2-1。
将质粒pMD19T-Pdhnl28和空载体质粒pPICZαA分别在30℃条件下用 Kpn I和NotI双酶切12h后，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收，用T4DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取博来霉素抗性的单克隆，提取质粒，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8引物进行PCR鉴定，并将PCR鉴定正确的阳性克隆子进行测序鉴定。将测序正确的含有SEQ ID NO.1序列的重组载体命名为pPICZαA-Pdhnl2。
二、重组表达载体pPICZαA-Pdhnl2转化宿主、阳性克隆鉴定
将步骤一中构建的重组表达载体pPICZαA-Pdhnl2经Dra I酶切线性化后，回收，电转化P.pastoris X33感受态细胞，同时将pPICZαA空载体P.pastoris X33，作为对照菌。挑取博来霉素抗性的单克隆，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8 引物进行PCR检测。将菌落PCR验证阳性的阳性克隆克隆子，用于蛋白的诱导表达。
三、Pdhnl2基因的酵母表达
将步骤二中鉴定正确的克隆培养过夜，再将细菌100倍稀释于BMGY 液体培养基中培养，待菌液生长至OD600为2-6时，加入甲醇(终浓度为1％) 进行诱导培养，30℃诱导96h，同时将含有pPICZαA空载体P.pastoris X33作为对照菌。取诱导过的菌液1mL，离心收集上清液(8000rpm，10min)，菌体蛋白进行12％SDS-PAGE电泳检测。结果表明，在甲醇诱导下，含有重组表达载体pPICZαA-Pdhnl2的P.pastoris X33中成功表达了PdHNL2蛋白，且表达PdHNl2蛋白的表观分子量与理论分子量相近(图3)。
实施例4PdHNL2降解扁桃腈生成苯甲醛活性检测
采用柠檬酸磷酸缓冲液(100mM，pH5.5)进行PdHNL2的3mL酶促反应，底物为扁桃腈(4.2mM)，将实施例2和3的得到的E.coli诱导破碎液和 P.pastoris上清液，加入底物中，反应时间为10min，检测波长为280nm。比活力定义为：在反应条件下，1min内每mg蛋白分解底物生成苯甲醛(消光系数为18.777mLμmol-1cm-1)的摩尔量。结合图4，结果表明，E.coli表达系统PdHNL2 重组蛋白酶活为13.31μmol min-1mg-1protein；P.pastoris表达系统PdHNL2重组蛋白酶活为71.43μmol min-1mg-1protein；而在对照(山桃叶片提取液)中的酶活为14.95μmol min-1mg-1protein。
实施例5PdHNL2合成(R)-邻氯扁桃腈检测
将含有重组PdHNL2蛋白的E.coli BL21(DE3)和P.pastoris X33工程菌进行大量培养，并分别在IPTG和甲醇诱导后，离心收集菌体沉淀和上清液。其中，收集的E.coli BL21(DE3)细胞用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)重悬，并进行超声破碎。待细胞破碎后，10,000g离心，收集上清液。P.pastoris X33则直接收集上清液。
称取4.9g(0.1mol)NaCN加入10ml去离子水和25ml甲基叔丁基醚不断混合的溶液中。低温下(4℃条件下)将这两相充分混合15分钟。之后，缓慢的加入10ml 30％的HCl溶液，同时将混合溶液慢慢的升至室温(25℃，25min)。待溶液分层后，保留水相。
将E.coli BL21(DE3)和P.pastoris X33上清液(20mL)，分别加入足量的HCN水相和1mL 0.5mol/L邻氯苯甲醛。充分混匀并不断的进行搅拌1-2h。分离有机相，并进行高效液相色谱检测(HPLC)。结果表明，E.coli BL21(DE3) 和P.pastoris X33菌重组PdHNL2蛋白催化邻氯苯甲醛生成(R)-邻氯扁桃腈的转化率分别为54.2％和83.5％。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种山桃醇腈酶PdHNL2及其编码基因与应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 579
<212> PRT
<213> 山桃（Prunus davidiana）
<400> 1
Met Val Lys Ser Thr Met Ser Ala Ile Leu Val Ser Val Leu His
5 10 15
Leu Phe Val Leu His Leu Gln Tyr Ser Glu Val His Ser Leu Ala
20 25 30
Asn Thr Ser Ala His Asp Phe Ser Tyr Leu Glu Phe Val Tyr Asp
35 40 45
Ala Asn Asp Thr Glu Leu Glu Gly Thr Tyr Asp Tyr Ile Ile Val
50 55 60
Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Pro Leu Ala Ala Thr Leu Ser Ala
65 70 75
Asn Tyr Ser Val Leu Val Leu Glu Arg Gly Thr Leu Pro Thr Glu
80 85 90
Tyr Pro Asn Leu Leu Thr Ser Asp Gly Phe Ile Tyr Asn Leu Gln
95 100 105
Gln Glu Asp Asp Glu Gln Thr Pro Val Glu Arg Phe Val Ser Gly
110 115 120
Asp Gly Ile Asp Asn Val Arg Gly Arg Val Leu Gly Gly Thr Ser
125 130 135
Met Ile Asn Ala Gly Val Tyr Val Arg Ala Asn Thr Ser Phe Phe
140 145 150
Asn Gln Thr Gly Ile Glu Trp Asp Met Asp Leu Val Asn Lys Thr
155 160 165
Tyr Asp Trp Val Glu Asp Thr Ile Val Phe Lys Pro Asp Phe Gln
170 175 180
Phe Trp Gln Asn Leu Thr Gly Thr Ala Phe Leu Glu Val Gly Ile
185 190 195
Leu Pro Asp Asn Gly Phe Ser Leu Asp His Ile Glu Gly Thr Arg
200 205 210
Leu Thr Gly Ser Thr Phe Asp Asn Asn Gly Thr Arg His Ala Ser
215 220 225
Asp Glu Leu Leu Asn Lys Gly Asp Pro Asn Asn Leu Lys Val Ala
230 235 240
Val His Ala Ala Val Glu Lys Ile Ile Phe Ser Ser Asn Ser Ser
245 250 255
Gly Val Thr Ala Ile Gly Val Ile Tyr Thr Asp Ser Asn Gly Thr
260 265 270
Thr His Gln Ala Phe Val Arg Gly Glu Gly Glu Val Ile Leu Ser
275 280 285
Ala Gly Pro Ile Gly Ser Pro Gln Leu Leu Leu Leu Ser Gly Val
290 295 300
Gly Pro Glu Ser Tyr Leu Thr Ser Leu Asn Ile Ser Val Val Ala
305 310 315
Ser His Pro Tyr Val Gly Gln Tyr Ile Tyr Asp Asn Pro Arg Asn
320 325 330
Phe Ile Asn Ile Leu Pro Pro Asn Pro Ile Glu Pro Ser Thr Val
335 340 345
Thr Val Leu Gly Ile Thr Ser Asp Phe Tyr Gln Cys Ser Leu Ser
350 355 360
Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ala Pro Phe Ser Phe Phe Pro Ile Pro
365 370 375
Thr Tyr Pro Leu Pro Asn Thr Thr Phe Ala His Ile Val Asn Lys
380 385 390
Val Pro Gly Pro Leu Ser His Gly Thr Val Thr Leu Gln Ser Thr
395 400 405
Ser Asp Val Arg Val Ala Pro Asn Val Thr Phe Asn Tyr Tyr Ser
410 415 420
Asn Ser Thr Asp Leu Ala His Cys Val Ser Gly Met Lys Arg Ile
425 430 435
Gly Glu Phe Leu Ser Ser Asp Ala Leu Lys Pro Tyr Lys Val Glu
440 445 450
Asp Leu Pro Gly Ile Glu Gly Phe Asp Ile Leu Gly Ile Pro Leu
455 460 465
Pro Glu Asn Gln Thr Asp Asp Ala Ala Phe Glu Thr Phe Cys Gln
470 475 480
Glu Ala Val Ala Ser Tyr Trp His Tyr His Gly Gly Cys Leu Val
485 490 495
Gly Glu Val Leu Asp Asp Asp Phe Arg Val Thr Gly Ile Asn Ala
500 505 510
Leu Arg Val Val Asp Gly Ser Thr Phe Pro Ser Thr Pro Ala Ser
515 520 525
His Pro Gln Gly Phe Tyr Leu Met Leu Gly Arg Tyr Val Gly Ser
530 535 540
Lys Ile Leu Gln Glu Arg Leu Ala Ser Glu Glu Ala Leu His Lys
545 550 555
Ser Thr Ile Gln Pro Lys Ile Leu Glu Ser Leu Glu Ser Ala Leu
560 565 570
Ser Phe Ala Phe Asp Thr Ala Ala Ala
575
<210> 2
<211> 1740
<212> DNA
<213> 山桃（Prunus davidiana）
<400> 2
atggtgaaat caacaatgtc agctatacta gtatcggtgc tgcacctttt tgttctacat 60
cttcaatatt cagaggttca ttcgcttgcc aatacctctg ctcatgattt tagctacttg 120
gaatttgttt acgatgccaa tgacacagag ttggaaggaa catacgacta cattattgtt 180
ggtggaggaa cagcagggtg tccattggca gcaactttgt cagcaaacta ctcggtgctt 240
gttctggaaa ggggcactct tcctacagaa tatccaaacc tgttgacttc agacgggttt 300
atatataatc tgcagcaaga agatgatgaa cagacaccag tcgaaaggtt cgtgtctgga 360
gatggtattg acaatgtaag agggagggtc ctcggtggca cgagcatgat caatgccggg 420
gtctacgtaa gagctaacac ctcgttcttt aatcaaacag ggattgaatg ggatatggat 480
ctggttaata agacatatga ctgggttgaa gacactattg tgttcaagcc ggatttccaa 540
ttttggcaaa atcttacagg aactgcgttc ttggaggttg gtattcttcc agacaatgga 600
tttagtttgg atcacataga aggaactaga ctcaccggct caactttcga caataacgga 660
accagacatg catctgatga actgcttaat aaaggagacc caaacaactt gaaagttgca 720
gttcatgccg cagtagagaa gatcatcttc tcttccaatt catcaggtgt gacagctata 780
ggagtaatat atactgattc gaacggaacg actcatcagg catttgtacg tggtgaggga 840
gaagttatat tgagtgcagg gccaattggg tcccctcaac ttctactact tagtggtgtt 900
ggcccagagt cttacctaac atctctcaac atttcagttg ttgcttccca tccatacgtc 960
gggcagtata tatatgacaa tcctcgtaat ttcattaaca ttttgccccc aaatccaata 1020
gaaccctcaa ctgtaaccgt tctaggcatt acaagcgact tctaccaatg ttctctatca 1080
agcttgccat tttctattgc accctttagt ttttttccta ttccaactta tcccctgcca 1140
aatacgactt tcgctcacat tgttaacaaa gttccgggac cattatctca cggtactgtc 1200
acgctgcaat caacctctga tgtgagagtc gctccaaatg tcacattcaa ctactattcg 1260
aattcaactg accttgctca ttgtgttagc ggcatgaaga ggattggtga attcttgagc 1320
tcagacgcat taaaaccata taaagtggaa gatttgccgg gcatagaagg ttttgatatt 1380
ttgggaatac ctttgccaga gaaccagaca gatgatgcag ccttcgaaac attttgccaa 1440
gaggcagtag cgtcgtactg gcattaccac ggtggatgcc ttgtcgggga ggtgcttgat 1500
gatgatttcc gtgttacagg gatcaacgca ttgcgtgttg ttgatggctc caccttccct 1560
tccacaccag cgagccatcc acagggcttc tatctgatgt tagggaggta cgtgggctct 1620
aaaattttgc aagaaagatt agcttcagag gaggctcttc ataagtcaac aatccaaccc 1680
aaaatcttgg agtcgcttga gtcagcatta tcctttgcgt ttgatactgc ggccgcttag 1740
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggtgaaat caacaatgtc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agcggccgca gtatcaaac 20
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tagaccatgg tccttgccaa tacctctgct 30
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctaagcggcc gcagtatcaa acgcaaagga t 31
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cggggtacca tggtgaaatc aaca 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cattgcggcc gccagtatca aacgc 25

Claims (7)

1.一种山桃醇腈酶PdHNL2，其特征在于：
1)由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺和/或添加且具有醇腈酶功能的由SEQ ID NO.1衍生的序列相似度大于90％的蛋白质。
2.权利要求1所述的山桃醇腈酶Pdhnl2基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求2所述的山桃醇腈酶Pdhnl2基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述载体可使山桃醇腈酶PdHNL2在大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母(Pichia pastoris)等宿主中进行异源表达。
5.含有权利要求1所述基因或权利要求2所述蛋白的宿主菌。
6.一种制备山桃醇腈酶PdHNL2的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求3的重组表达载体转化宿主细胞大肠杆菌或毕赤酵母，得到重组表达菌株；
2)培养重组表达菌株，实现重组山桃醇腈酶PdHNL2表达；
3)回收并纯化所表达的山桃醇腈酶PdHNL2。
7.权利要求1所述山桃醇腈酶PdHNL2的应用，其主要应用于催化苯甲醛和/或邻氯苯甲醛生成扁桃腈和/或邻氯扁桃腈。
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