CN108484717A - 一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法 - Google Patents

一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法，包括如下步骤：初步提取：取壶瓶碎米荠新鲜叶片200g，加入预冷的800ml样品提取液，用高速组织匀浆机匀浆(间歇，保持低温)，温度保持在4℃，转速为6000r/min离心30min，取上清，准确量取体积；盐析：在缓慢搅拌下，向上清液中慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到35％饱和度，而后保持4℃静置60min，采用高速组织匀浆机匀浆6000r/min离心30min，弃沉淀。本发明能够实现提取植物硒蛋白的目的，具有工艺简单，提高提取效率的特点，方便科研人员利用壶瓶碎米荠中的植物硒蛋白，解决了现有提取技术不仅工序复杂，而且无法有效的提取壶瓶碎米荠中的植物硒蛋白，不利于科研人员开发和利用植物有机硒的问题。

Description

一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法
技术领域
本发明涉及碎米荠加工技术领域，具体为一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法。
背景技术
壶瓶碎米荠，十字花科植物，1983年首次在湖南壶瓶山上发现，因此得名。壶瓶碎米荠为多年生草本，地下茎明显.茎起立或弯曲。上部常有分枝，高20～2500cm，全株光滑无毛。单叶互生，纸质，长4～325cm，宽5～14cm，肾形或近心形，掌状脉，边缘具锯齿，基生叶偶有1～4对小叶：叶柄长2.5～3.0cm，具不明显的翅。基本扩大呈叶耳状，不抱茎。总状花序顶生或腋生，无苞片。花萼卵形，长5～6mm，宽3～4mm；花瓣白色，具网状脉。宽倒卵形。长8～10mm，宽5～8mm，顶端钝圆，基部楔形；雄蕊6枚，近等长，花丝基部稍扩大.中部4枚长5mm，侧生2枚长4mm，花药长卵形.长约2mm；雌蕊柱状，柱头明显，光滑无毛，长5～6mm。长角果，线形，长2～100px，粗约2mm。果梗长1～2cm，直立或斜展。种子椭圆形，褐色或黄色。长约1.5mm。无翅。
硒是一种化学元素，化学符号是Se，在化学元素周期表中位于第四周期VI A族，是一种非金属。可以用作光敏材料、电解锰行业催化剂、动物体必需的营养元素和植物有益的营养元素等。硒在自然界的存在方式分为两种：无机硒和植物活性硒。无机硒一般指亚硒酸钠和硒酸钠，从金属矿藏的副产品中获得；后者是硒通过生物转化与氨基酸结合而成，一般以硒蛋氨酸的形式存在。现有提取技术不仅工序复杂，而且无法有效的提取壶瓶碎米荠中的植物硒蛋白，不利于科研人员开发和利用植物有机硒，为此，我们提出一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)初步提取：取壶瓶碎米荠新鲜叶片200g，加入预冷的800ml样品提取液，用高速组织匀浆机匀浆(间歇，保持低温)，温度保持在4℃，转速为6000r/min离心30min，取上清，准确量取体积；
(2)盐析：在缓慢搅拌下，向上清液中慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到35％饱和度，而后保持4℃静置60min，采用高速组织匀浆机匀浆6000r/min离心30min，弃沉淀，准确量取上清液体积，在上清液中缓慢搅拌，慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到55％饱和度，保持4℃静置1h，再于4℃，6000r/min离心30min，弃上清；
(3)脱盐：用柱平衡缓冲液溶解沉淀，上SephadexG-25柱用柱平衡缓冲液洗脱，流速1.5mL/min，收集蛋白质，收集液用聚乙二醇浓缩，冷冻干燥，得到植物硒蛋白。
优选的，所述步骤(1)中样品提取液的组成成分为20mmol/L PH7.8 Tris-HCL 缓冲液，1mmol/L EDTA，10mmol/L MgCL2，10mmol/L NaHCO3，10mmol/L β-巯基乙醇，1％PVP。
优选的，所述步骤(2)在盐析过程中均保持PH7.8，用氨水或硫酸调节PH值。
优选的，所述步骤(3)中柱平衡缓冲液组成成分为：50mmol/L Tris-HCL缓冲液，PH7.8，1mmol/L EDTA-NA，10mmol/L MgCL2，5mmol/L β-巯基乙醇。
优选的，所述步骤(3)中提取植物硒蛋白后采用氢化物发生-原子荧光分光光度法对硒进行测定。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明先对壶瓶碎米荠的植物进行简单提取，然后通过盐析法，高浓度的强电解质破坏蛋白质分子表面的水化膜，同时电解质离子中和了蛋白质所带的电荷，蛋白质的稳定因素被消除，使蛋白质分子相互碰撞而凝聚沉淀，从而得到植物硒蛋白，然后通过柱平衡缓冲液溶解沉淀并洗脱，达到脱盐的目的，最后通过氢化物发生-原子荧光分光光度法对硒进行测定，从而实现提取植物硒蛋白的目的，具有工艺简单，提高提取效率的特点，方便科研人员利用壶瓶碎米荠中的植物硒蛋白，解决了现有提取技术不仅工序复杂，而且无法有效的提取壶瓶碎米荠中的植物硒蛋白，不利于科研人员开发和利用植物有机硒的问题。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法，包括如下步骤：
(1)初步提取：取壶瓶碎米荠新鲜叶片200g，加入预冷的800ml样品提取液，用高速组织匀浆机匀浆(间歇，保持低温)，温度保持在4℃，转速为6000r/min离心30min，取上清，准确量取体积；
(2)盐析：在缓慢搅拌下，向上清液中慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到35％饱和度，而后保持4℃静置60min，采用高速组织匀浆机匀浆6000r/min离心30min，弃沉淀，准确量取上清液体积，在上清液中缓慢搅拌，慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到55％饱和度，保持4℃静置1h，再于4℃，6000r/min离心30min，弃上清；
(3)脱盐：用柱平衡缓冲液溶解沉淀，上SephadexG-25柱用柱平衡缓冲液洗脱，流速1.5mL/min，收集蛋白质，收集液用聚乙二醇浓缩，冷冻干燥，得到植物硒蛋白。
实施例一：
首先进行初步提取：取壶瓶碎米荠新鲜叶片200g，加入预冷的800ml样品提取液，用高速组织匀浆机匀浆(间歇，保持低温)，温度保持在4℃，转速为6000r/min离心30min，取上清，准确量取体积；然后盐析：在缓慢搅拌下，向上清液中慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到35％饱和度，而后保持4℃静置60min，采用高速组织匀浆机匀浆6000r/min离心30min，弃沉淀，准确量取上清液体积，在上清液中缓慢搅拌，慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到55％饱和度，保持4℃静置1h，再于4℃，6000r/min离心30min，弃上清；最后脱盐：用柱平衡缓冲液溶解沉淀，上SephadexG-25柱用柱平衡缓冲液洗脱，流速1.5mL/min，收集蛋白质，收集液用聚乙二醇浓缩，冷冻干燥，得到植物硒蛋白。
实施例二：
在实施例一中，再加上下述工序：
步骤(1)中样品提取液的组成成分为20mmol/L PH7.8 Tris-HCL缓冲液，1mmol/LEDTA，10mmol/L MgCL2，10mmol/L NaHCO3，10mmol/L β-巯基乙醇，1％PVP。
首先进行初步提取：取壶瓶碎米荠新鲜叶片200g，加入预冷的800ml样品提取液，用高速组织匀浆机匀浆(间歇，保持低温)，温度保持在4℃，转速为6000r/min离心30min，取上清，准确量取体积，其中样品提取液的组成成分为20mmol/L PH7.8 Tris-HCL缓冲液，1mmol/L EDTA，10mmol/L MgCL2，10mmol/L NaHCO3，10mmol/L β-巯基乙醇，1％PVP；然后盐析：在缓慢搅拌下，向上清液中慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到35％饱和度，而后保持4℃静置60min，采用高速组织匀浆机匀浆6000r/min离心30min，弃沉淀，准确量取上清液体积，在上清液中缓慢搅拌，慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到55％饱和度，保持4℃静置1h，再于4℃，6000r/min离心30min，弃上清；最后脱盐：用柱平衡缓冲液溶解沉淀，上SephadexG-25柱用柱平衡缓冲液洗脱，流速1.5mL/min，收集蛋白质，收集液用聚乙二醇浓缩，冷冻干燥，得到植物硒蛋白。
实施例三：
在实施例二中，再加上下述工序：
步骤(2)在盐析过程中均保持PH7.8，用氨水或硫酸调节PH值。
首先进行初步提取：取壶瓶碎米荠新鲜叶片200g，加入预冷的800ml样品提取液，用高速组织匀浆机匀浆(间歇，保持低温)，温度保持在4℃，转速为6000r/min离心30min，取上清，准确量取体积，其中样品提取液的组成成分为20mmol/L PH7.8 Tris-HCL缓冲液，1mmol/L EDTA，10mmol/L MgCL2，10mmol/L NaHCO3，10mmol/L β-巯基乙醇，1％PVP；然后盐析：在缓慢搅拌下，向上清液中慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到35％饱和度，而后保持4℃静置60min，采用高速组织匀浆机匀浆6000r/min离心30min，弃沉淀，准确量取上清液体积，在上清液中缓慢搅拌，慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到55％饱和度，保持4℃静置1h，再于4℃，6000r/min离心30min，弃上清，盐析过程中均保持PH7.8，用氨水或硫酸调节PH值；最后脱盐：用柱平衡缓冲液溶解沉淀，上SephadexG-25柱用柱平衡缓冲液洗脱，流速1.5mL/min，收集蛋白质，收集液用聚乙二醇浓缩，冷冻干燥，得到植物硒蛋白。
实施例四：
在实施例三中，再加上下述工序：
步骤(3)中柱平衡缓冲液组成成分为：50mmol/L Tris-HCL缓冲液，PH7.8，1mmol/LEDTA-NA，10mmol/L MgCL2，5mmol/L β-巯基乙醇。
首先进行初步提取：取壶瓶碎米荠新鲜叶片200g，加入预冷的800ml样品提取液，用高速组织匀浆机匀浆(间歇，保持低温)，温度保持在4℃，转速为6000r/min离心30min，取上清，准确量取体积，其中样品提取液的组成成分为20mmol/L PH7.8 Tris-HCL缓冲液，1mmol/L EDTA，10mmol/L MgCL2，10mmol/L NaHCO3，10mmol/L β-巯基乙醇，1％PVP；然后盐析：在缓慢搅拌下，向上清液中慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到35％饱和度，而后保持4℃静置60min，采用高速组织匀浆机匀浆6000r/min离心30min，弃沉淀，准确量取上清液体积，在上清液中缓慢搅拌，慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到55％饱和度，保持4℃静置1h，再于4℃，6000r/min离心30min，弃上清，盐析过程中均保持PH7.8，用氨水或硫酸调节PH值；最后脱盐：用柱平衡缓冲液溶解沉淀，上SephadexG-25柱用柱平衡缓冲液洗脱，流速1.5mL/min，收集蛋白质，收集液用聚乙二醇浓缩，冷冻干燥，得到植物硒蛋白，其中柱平衡缓冲液组成成分为：50mmol/L Tris-HCL缓冲液，PH7.8，1mmol/L EDTA-NA，10mmol/L MgCL2，5mmol/L β-巯基乙醇。
实施例五：
在实施例四中，再加上下述工序：
步骤(3)中提取植物硒蛋白后采用氢化物发生-原子荧光分光光度法对硒进行测定。
首先进行初步提取：取壶瓶碎米荠新鲜叶片200g，加入预冷的800ml样品提取液，用高速组织匀浆机匀浆(间歇，保持低温)，温度保持在4℃，转速为6000r/min离心30min，取上清，准确量取体积，其中样品提取液的组成成分为20mmol/L PH7.8 Tris-HCL缓冲液，1mmol/L EDTA，10mmol/L MgCL2，10mmol/L NaHCO3，10mmol/L β-巯基乙醇，1％PVP；然后盐析：在缓慢搅拌下，向上清液中慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到35％饱和度，而后保持4℃静置60min，采用高速组织匀浆机匀浆6000r/min离心30min，弃沉淀，准确量取上清液体积，在上清液中缓慢搅拌，慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到55％饱和度，保持4℃静置1h，再于4℃，6000r/min离心30min，弃上清，盐析过程中均保持PH7.8，用氨水或硫酸调节PH值；最后脱盐：用柱平衡缓冲液溶解沉淀，上SephadexG-25柱用柱平衡缓冲液洗脱，流速1.5mL/min，收集蛋白质，收集液用聚乙二醇浓缩，冷冻干燥，得到植物硒蛋白，提取植物硒蛋白后采用氢化物发生-原子荧光分光光度法对硒进行测定，其中柱平衡缓冲液组成成分为：50mmol/LTris-HCL缓冲液，PH7.8，1mmol/L EDTA-NA，10mmol/L MgCL2，5mmol/L β-巯基乙醇。
本发明先对壶瓶碎米荠的植物进行简单提取，然后通过盐析法，高浓度的强电解质破坏蛋白质分子表面的水化膜，同时电解质离子中和了蛋白质所带的电荷，蛋白质的稳定因素被消除，使蛋白质分子相互碰撞而凝聚沉淀，从而得到植物硒蛋白，然后通过柱平衡缓冲液溶解沉淀并洗脱，达到脱盐的目的，最后通过氢化物发生-原子荧光分光光度法对硒进行测定，从而实现提取植物硒蛋白的目的，具有工艺简单，提高提取效率的特点，方便科研人员利用壶瓶碎米荠中的植物硒蛋白，解决了现有提取技术不仅工序复杂，而且无法有效的提取壶瓶碎米荠中的植物硒蛋白，不利于科研人员开发和利用植物有机硒的问题。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)初步提取：取壶瓶碎米荠新鲜叶片200g，加入预冷的800ml样品提取液，用高速组织匀浆机匀浆(间歇，保持低温)，温度保持在4℃，转速为6000r/min离心30min，取上清，准确量取体积；
(2)盐析：在缓慢搅拌下，向上清液中慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到35％饱和度，而后保持4℃静置60min，采用高速组织匀浆机匀浆6000r/min离心30min，弃沉淀，准确量取上清液体积，在上清液中缓慢搅拌，慢慢加入(NH4)2SO4，使其达到55％饱和度，保持4℃静置1h，再于4℃，6000r/min离心30min，弃上清；
(3)脱盐：用柱平衡缓冲液溶解沉淀，上SephadexG-25柱用柱平衡缓冲液洗脱，流速1.5mL/min，收集蛋白质，收集液用聚乙二醇浓缩，冷冻干燥，得到植物硒蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中样品提取液的组成成分为20mmol/L PH7.8 Tris-HCL缓冲液，1mmol/L EDTA，10mmol/L MgCL2，10mmol/L NaHCO3，10mmol/Lβ-巯基乙醇，1％PVP。
3.根据权利要求1所述的一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)在盐析过程中均保持PH7.8，用氨水或硫酸调节PH值。
4.根据权利要求1所述的一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法，其特征在于：所述步骤(3)中柱平衡缓冲液组成成分为：50mmol/L Tris-HCL缓冲液，PH7.8，1mmol/L EDTA-NA，10mmol/L MgCL2，5mmol/Lβ-巯基乙醇。
5.根据权利要求1所述的一种碎米荠植物硒蛋白的提取方法，其特征在于：所述步骤(3)中提取植物硒蛋白后采用氢化物发生-原子荧光分光光度法对硒进行测定。
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