CN110272895A - 一种介质固定化酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种介质固定化酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种介质固定化酶及其制备方法和应用，所述介质固定化酶包括基质、固定涂层和酶分子；其中，所述固定涂层的原料包括单宁酸和3‑氨丙基三乙氧基硅烷。本发明提供的固定涂层可以实现固定酶分子的同时涂层不易脱落，稳定性高；本发明提供的介质固定化酶的载酶量较高，并且酶的活性较高。

Description

一种介质固定化酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于固定化酶技术领域，涉及一种介质固定化酶及其制备方法和应用。
背景技术
酶作为一种生物催化剂，对环境敏感且易失活，通过将生物酶固定化到膜或微球等基质的表面可以提高酶的稳定性及重复使用性。常规的酶固定化方法包括物理吸附、包埋、共价键合和化学交联。Srivastava P K等将酸性磷酸酶共价固定在戊二醛活化的壳聚糖珠上(Srivastava P K,Anand A.Immobilization of acid phosphatase from Vignaaconitifolia seeds on chitosan beads and its characterization[J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,64:150-154.)，研究表明固定化酶对pH和温度的耐受性增强，且具有良好的储存稳定性，但是该法用到的戊二醛属于双功能试剂，会发生自聚现象，导致暴露的醛基较少，载酶量不高。另外，可利用静电或疏水吸附和逆向过滤包埋法将酶固定化到膜内(Jochems P,Satyawali Y,Diels L,etal.Enzyme immobilization on/in polymeric membranes:status,challenges andperspectives in biocatalytic membrane reactors(BMRs)[J].Green chemistry,2011,13(7):1609-1623.)，从而最大程度的保持了酶的活性，但这些物理固定化方法稳定性较差，在反应过程中酶易泄漏和流失，且将酶包埋在膜内会增加传质阻力，降低传质效率。
能够实现表面性能调节的表面工程已引起了广泛关注，表面涂层由于其易得且制备方法简单，已成为最常用的表面工程方法之一。涂层的二次反应可使涂层成为不同用途的通用平台，可大大扩展其应用范围。Lee等人报道了一种通过在多巴胺水溶液中简单浸涂物体来形成聚多巴胺涂层的方法(Lee H,Dellatore S M,Miller W M,et al.Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings[J].Science,2007,318(5849):426-430)。薄的聚多巴胺涂层可以涂覆在各种无机和有机材料上，并通过大分子的接枝对其进行功能改性或酶固定化。Zhang等人提出了基于聚多巴胺涂层的生物催化膜的制备方法及酶固定机制的研究平台(Zhang H,Luo J,Li S,et al.Biocatalytic membranebased on polydopamine coating:A platform for studying immobilizationmechanisms[J].Langmuir,2018,34(8):2585-2594)。
虽然聚多巴胺涂层可以扩大固定化酶的应用范围，但是其载酶量较低，因此，期待开发一种新的具有较高载酶量的介质固定化酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种介质固定化酶及其制备方法和应用。本发明提供的介质固定化酶的载酶量较高，并且酶的活性较高。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种介质固定化酶，所述介质固定化酶包括基质、固定涂层和酶分子；
其中，所述固定涂层的原料包括单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷。
本发明的固定涂层的原料中包括单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷，单宁酸上的酚羟基既可以通过多种作用吸附在基质表面，也可以起到固定酶分子的作用；3-氨丙基三乙氧基硅烷主要起到将涂层稳定固定在基质表面的作用，因此，本发明提供的固定涂层既可以固定酶分子，也可以实现涂层不易脱落，稳定性高等优点。
优选地，所述单宁酸以单宁酸Tris-HCl缓冲溶液的形式存在。
优选地，所述单宁酸Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.5-10g/L，例如1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L等。
优选地，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷以3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液的形式存在。
优选地，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液的浓度为2-10g/L，例如3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L等。
优选地，所述单宁酸Tris-HCl缓冲溶液和3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液的体积比为(0.12-8):1，例如0.2:1、0.3:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、6:1、7:1、7.5:1等，优选8:1。
在本发明提供的体积比范围内，固定涂层稳定存在于基质表面且不易脱落，并且载酶量较高，当低于0.12:1时，可能会由于3-氨丙基三乙氧基硅烷添加量过多而导致载酶量下降，当体积比高于8:1时，单宁酸添加量较高，3-氨丙基三乙氧基硅烷添加量过低，可能会导致固定涂层无法稳定存在于基质表面，易脱落。
优选地，所述酶分子包括辣根过氧化物酶、漆酶、胃蛋白酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶或蔗糖酶中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述基质包括微球、纳米颗粒、分离膜、丝网或无纺布中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述微球的直径为1-3mm，例如1.5mm、2mm、2.5mm等。
优选地，所述微球的原料为海藻酸钠、壳聚糖或蒙脱土中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述纳米颗粒的粒径为50-200nm，例如80nm、100nm、120nm、140nm、160nm、180nm等。
优选地，所述纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒和/或二氧化硅纳米颗粒。
优选地，所述分离膜包括微滤膜、超滤膜或纳滤膜。
优选地，所述分离膜的材料为聚丙烯腈、尼龙、聚偏氟乙烯、聚醚砜或芳香聚酰胺中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述丝网的目数为100-1500目，例如200目、400目、500目、800目、1000目、1200目、1400目等。
优选地，所述固定涂层与所述酶分子之间还包括连接臂，所述连接臂与所述固定涂层以化学键的形式连接，所述连接臂用于固定所述酶分子。
本发明既可以利用固定涂层中包括的单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷以共价键的形式固定酶分子，又可以先将部分可以起到连接作用的聚合物接枝到固定涂层上，然后连接臂再通过物理或化学的方法固定酶分子。
优选地，所述连接臂选自聚谷氨酸、聚天冬氨酸或聚乙烯亚胺中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的介质固定化酶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将基质与单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液混合，得到带有固定涂层的基质；
(2)将步骤(1)得到的带有固定涂层的基质与酶分子溶液混合，得到所述介质固定化酶。
优选地，在所述单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，所述单宁酸的浓度为0.5-10g/L，例如1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L等。
优选地，在所述单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为2-10g/L，例如3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L等。
优选地，所述混合溶液由单宁酸Tris-HCl缓冲溶液和3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液混合得到。
优选地，所述单宁酸Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.5-9.5，例如7.8、8、8.2、8.5、8.9等，进一步优选8.5。
优选地，步骤(1)所述混合的时间为1-24h，例如2h、6h、8h、10h、15h、18h、20h、22h等。
优选地，步骤(1)所述混合在搅拌下进行，速率为100-300rpm/min，例如120rpm/min、150rpm/min、200rpm/min、250rpm/min等。
优选地，步骤(2)所述酶分子溶液为酶分子的醋酸缓冲液。
优选地，所述酶分子的醋酸缓冲液的pH为3.0-6.0，例如3.5、4.0、4.5、5.0、5.5等。
优选地，在所述酶分子溶液中，所述酶分子的浓度为0.1-0.5g/L，例如0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L等。
优选地，所述混合的温度为室温，时间为2-8h，例如3h、4h、5h、6h、7h等。
优选地，步骤(2)所述混合在搅拌下进行，速率为100-300rpm/min，例如120rpm/min、150rpm/min、200rpm/min、250rpm/min等。
优选地，将步骤(2)替换为如下步骤：
(2')将步骤(1)得到的带有固定涂层的基质与含有连接臂的溶液混合，然后再与酶分子溶液混合，得到所述介质固定化酶。
优选地，所述连接臂选自聚乙烯亚胺、聚谷氨酸或聚天冬氨酸中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述连接臂为聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸，所述含有连接臂的溶液的制备方法为：
将聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液混合，得到所述含有连接臂的溶液。
优选地，在所述含有连接臂的溶液中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的浓度各自独立的为0.01-0.2mol/L，例如0.03mol/L、0.05mol/L、0.08mol/L、0.1mol/L、0.12mol/L、0.15mol/L、0.18mol/L等。
优选地，所述2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液的浓度为0.01-0.1mol/L，例如0.03mol/L、0.05mol/L、0.08mol/L。
优选地，所述2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液的pH值为4.0-6.0，例如4.5、5.0、5.5等。
优选地，在所述含有连接臂的溶液中，所述聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸的浓度为0.1-4g/L，例如0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L等。
第三方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的介质固定化酶在生物催化剂中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的固定涂层的原料中包括单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷，单宁酸上的酚羟基既可以通过多种作用吸附在基质表面，也可以起到固定酶分子的作用；3-氨丙基三乙氧基硅烷主要起到将涂层稳定固定在基质表面的作用，因此，本发明提供的固定涂层既可以固定酶分子，也可以实现涂层不易脱落，稳定性高等优点。
(2)本发明提供的介质固定化酶还可以通过在固定涂层表面的二次反应引入连接臂，连接臂通过物理或化学的方法实现酶分子的固定。
(3)本发明提供的介质固定化酶的载酶量较高，最高可达到70％以上，并且酶的活性较高，最高可达90 U以上。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的介质固定化酶的结构示意图。
图2是本发明实施例10提供的介质固定化酶的结构示意图。
其中，1-基质；2-固定涂层；3-连接臂；4-酶分子。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供了一种介质固定化酶，如图1所示，由基质1、固定涂层2和酶分子4组成。
其中，基质为平均粒径为1-3mm的海藻酸钠微球、壳聚糖微球和蒙脱土微球，固定涂层的原料包括溶液体积比为5:1的单宁酸缓冲液和3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液，酶分子为辣根过氧化物酶。
制备方法如下：
(1)将单宁酸溶解于25mL10mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)中，得到浓度为2g/L的单宁酸缓冲液，将3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解于无水乙醇(分析纯)中，得到浓度为10g/L的3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液；然后将单宁酸缓冲液与3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液按溶液体积比为5:1混合，得到混合溶液；
(2)将海藻酸钠微球、壳聚糖微球和蒙脱土微球置于步骤(1)的混合溶液中，室温下150rpm/min搅拌1h后用去离子水冲洗，得到带有固定涂层的基质；
(3)将步骤(2)得到的带有固定涂层的基质置于0.15g/L的辣根过氧化物酶溶液中(pH＝5.0 10mM醋酸缓冲溶液)，室温下150rpm/min搅拌2h后用去离子水冲洗，得到介质固定化酶。
实施例2-7
与实施例1的区别在于，在本实施例中，单宁酸缓冲液和3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液的体积比为0.2:1(实施例2)、1:1(实施例3)、2:1(实施例4)、8:1(实施例5)、0.1:1(实施例6)、10:1(实施例7)。
实施例8
本实施例提供了一种介质固定化酶，由基质、固定涂层和酶分子组成。
其中，基质为尼龙膜，固定涂层的原料包括溶液体积比为8:1的单宁酸缓冲液和3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液，酶分子为蔗糖酶。
制备方法如下：
(1)参照实施例1，区别在于单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷的溶液体积比为8:1；
(2)将尼龙膜置于步骤(1)的混合溶液中，室温下150rpm/min搅拌18h后用去离子水冲洗，得到带有固定涂层的基质；
(3)将步骤(2)得到的带有固定涂层的基质置于0.15g/L的蔗糖酶溶液中(pH＝5.010mM醋酸缓冲溶液)，室温下150rpm/min搅拌2h后用去离子水冲洗，得到介质固定化酶。
实施例9
本实施例提供了一种介质固定化酶，由基质、固定涂层和酶分子组成。
其中，基质为尼龙膜，固定涂层的原料包括溶液体积比为5:1的单宁酸缓冲液和3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液，酶分子为辣根过氧化物酶。
制备方法如下：
(1)参照实施例1；
(2)将尼龙膜置于步骤(1)的混合溶液中，室温下150rpm/min搅拌1h后用去离子水冲洗，得到带有固定涂层的基质；
(3)将步骤(2)得到的带有固定涂层的基质置于0.15g/L的辣根过氧化物酶溶液中(pH＝5.0 10mM醋酸缓冲溶液)，室温下150rpm/min搅拌2h后用去离子水冲洗，得到介质固定化酶。
实施例10
本实施例提供了一种介质固定化酶，由基质1、固定涂层2、连接臂3和酶分子4组成。
其中，基质为尼龙膜，固定涂层的原料包括溶液体积比为8:1的单宁酸缓冲液和3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液，连接臂为聚谷氨酸、酶分子为辣根过氧化物酶。
制备方法如下：
(1)-(2)参照实施例2的步骤(1)-(2)进行；
(3)将聚谷氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液混合，得到聚谷氨酸溶液；
(4)将步骤(2)得到的带有固定涂层的基质置于步骤(3)的聚谷氨酸溶液中，使聚谷氨酸接枝在固定涂层上，然后再将其置于0.15g/L的辣根过氧化物酶溶液中(pH＝5.010mM醋酸缓冲溶液)，室温下150rpm/min搅拌2h，用去离子水冲洗，得到介质固定化酶。
实施例11-12
与实施例9的区别在于，在本实施例中，单宁酸缓冲液的浓度为0.5g/L(实施例11)、10g/L(实施例12)。
实施例13-14
与实施例9的区别在于，在本实施例中，3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液的浓度为2g/L(实施例13)、5g/L(实施例14)。
实施例15
与实施例1的区别在于，在本实施例中，室温下150rpm/min搅拌24h后用去离子水冲洗，得到带有固定涂层的基质。
对比例1
本对比例提供了一种介质固定化酶，与实施例9的区别在于，固定涂层为聚多巴胺涂层，制备方法如下：
(1)多巴胺溶解于25mL10mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)中，得到浓度为2g/L的多巴胺缓冲液；
(2)将尼龙膜置于步骤(1)的混合溶液中，室温下150rpm/min搅拌1h后用去离子水冲洗，得到带有聚多巴胺涂层的基质；
(3)将步骤(2)得到的带有聚多巴胺涂层的基质置于0.15g/L的辣根过氧化物酶溶液中(pH＝5.0 10mM醋酸缓冲溶液)，室温下150rpm/min搅拌2h后用去离子水冲洗，得到介质固定化酶。
对比例2
与实施例5的区别在于，在本对比例中，固定涂层不包括单宁酸，即在制备过程中，将基质浸泡于10g/L的3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中，得到带有固定涂层的基质。
对比例3
与实施例1的区别在于，在本对比例中，固定涂层不包括3-氨丙基三乙氧基硅烷，即在制备过程中，将基质浸泡于2g/L的单宁酸溶液中，得到带有固定涂层的基质。
性能测试
对实施例1-14和对比例1-3提供的介质固定化酶进行性能测试，方法如下：
(1)载酶量：
通过质量平衡计算固定化酶的量，并使用Bradford方法用紫外分光光度计在595nm处监测蛋白质浓度。
蛋白质加载量通过质量平衡方程计算：
MI＝CT×VT-CP×VP-CW×VW
其中MI是蛋白质加载量；CT、CP和CW分别是初始酶液、剩余酶液和洗涤液中的蛋白质浓度；VT、Vp和VW分别是初始酶液、剩余酶液和洗涤液的体积。
(2)酶的活性：(以辣根过氧化物酶为例)
使用苯酚，4-氨基安替比林和H2O2的混合物作为底物测量辣根过氧化物酶的催化活性。将苯酚和4-氨基安替比林溶解在醋酸缓冲液(10mM，pH＝5.0)中以制备底物溶液，其中它们的浓度分别为40mM和4mM。随后，在磁力搅拌器的作用下将游离酶或固定化酶加入20mL底物溶液中。随后加入0.5mM H2O2后，记录由苯酚和4-氨基安替比林消耗引起的溶液在505nm处的吸光值的变化。
一个单位的催化活性(U)定义为在测定条件(25℃，pH 5.0)下每分钟消耗1μmolH2O2的酶量。
(3)固定化酶的重复使用性
若介质固定化酶中的酶负载量较低，则测试涂层对酶固定化的重复使用性是没有意义的，因此，本发明选取了实施例9作为测试目标，测试了涂层对酶固定化的重复使用性。
将尼龙膜置于20mL体积比为8:1的单宁酸-3-氨丙基三乙氧基硅烷混合溶液中，室温下搅拌1h对其进行涂层后固定辣根过氧化物酶。将第二张尼龙膜置于剩余的单宁酸-3-氨丙基三乙氧基硅烷混合溶液中，室温下搅拌1h对其进行涂层后固定辣根过氧化物酶。重复循环5次后，分别测固定化酶的载酶量和酶活，探究涂层对固定化酶的重复使用性。
结果发现，对涂层进行重复使用5次后，涂层对辣根过氧化物酶的载酶量仍达初始载酶量的50％以上。
(4)涂层对固定化酶稳定性的影响
若介质固定化酶中的酶负载量较低，则测试涂层对固定化酶稳定性的影响是没有意义的，因此，本发明选取了实施例9和对比例3作为测试目标，测试了涂层对固定化酶稳定性的影响。
将尼龙膜分别置于20mL体积比为8:1的单宁酸-3-氨丙基三乙氧基硅烷混合溶液和仅含有单宁酸的溶液中，室温下搅拌18h对其进行涂层后固定辣根过氧化物酶2h。通过选择性地检测固定化酶在4℃下储存1，2，3，6，9和12天后的残余活性来探究两种涂层对固定化酶的储存稳定性。对于该稳定性实验，固定化酶的初始活性假定为100％，而其他活性则是与初始活性相比的相对值。结果发现，采用单宁酸-3-氨丙基三乙氧基硅烷涂层固定辣根过氧化物酶制备的固定化酶储存10天后仍能保持初始活性的50％以上，而仅采用单宁酸固定辣根过氧化物酶制备的固定化酶储存10天后的活性仅为初始活性的20％左右。
其余测试结果见表1：
表1
由实施例和性能测试可知，本发明提供的介质固定化酶具有较好的载酶量和酶活性，由实施例1-5和实施例6-7的对比可知，本发明优选单宁酸Tris-HCl缓冲溶液和3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液的体积比为(0.12-8):1，此时，本发明的介质固定化酶的载酶量和酶活性较好。由实施例1和对比例1的对比可知，本发明提供的固定涂层具有更高的载酶量同时酶的活性更高。由实施例1和对比例2-3的对比可知，本发明的单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷缺一不可，缺少任意一种均达不到本发明的技术效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的介质固定化酶及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种介质固定化酶，其特征在于，所述介质固定化酶包括基质、固定涂层和酶分子；
其中，所述固定涂层的原料包括单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷。
2.根据权利要求1所述的介质固定化酶，其特征在于，所述单宁酸以单宁酸Tris-HCl缓冲溶液的形式存在；
优选地，所述单宁酸Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.5-10g/L；
优选地，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷以3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液的形式存在；
优选地，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液的浓度为2-10g/L；
优选地，所述单宁酸Tris-HCl缓冲溶液和3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液的体积比为(0.12-8):1，优选8:1。
3.根据权利要求1或2所述的介质固定化酶，其特征在于，所述酶分子包括辣根过氧化物酶、漆酶、胃蛋白酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶或蔗糖酶中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述基质包括微球、纳米颗粒、分离膜、丝网或无纺布中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述微球的直径为1-3mm；
优选地，所述微球的原料为海藻酸钠、壳聚糖或蒙脱土中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述纳米颗粒的粒径为50-200nm；
优选地，所述纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒和/或二氧化硅纳米颗粒；
优选地，所述分离膜包括微滤膜、超滤膜或纳滤膜；
优选地，所述分离膜的材料为聚丙烯腈、尼龙、聚偏氟乙烯、聚醚砜或芳香聚酰胺中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述丝网的目数为100-1500目。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的介质固定化酶，其特征在于，所述固定涂层与所述酶分子之间还包括连接臂，所述连接臂与所述固定涂层以化学键的形式连接，所述连接臂用于固定所述酶分子；
优选地，所述连接臂选自聚谷氨酸、聚天冬氨酸或聚乙烯亚胺中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的介质固定化酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将基质与单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液混合，得到带有固定涂层的基质；
(2)将步骤(1)得到的带有固定涂层的基质与酶分子溶液混合，得到所述介质固定化酶。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，所述单宁酸的浓度为0.5-10g/L；
优选地，在所述单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为2-10g/L；
优选地，所述混合溶液由单宁酸Tris-HCl缓冲溶液和3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液混合得到；
优选地，所述单宁酸Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.5-9.5，进一步优选8.5；
优选地，步骤(1)所述混合的时间为1-24h；
优选地，步骤(1)所述混合在搅拌下进行，速率为100-300rpm/min。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述酶分子溶液为酶分子的醋酸缓冲液；
优选地，所述酶分子的醋酸缓冲液的pH为3.0-6.0；
优选地，在所述酶分子溶液中，所述酶分子的浓度为0.1-0.5g/L；
优选地，所述混合的温度为室温，时间为2-8h；
优选地，步骤(2)所述混合在搅拌下进行，速率为100-300rpm/min。
8.根据权利要求5-7中的任一项所述的制备方法，其特征在于，将步骤(2)替换为如下步骤：
(2')将步骤(1)得到的带有固定涂层的基质与含有连接臂的溶液混合，然后再与酶分子溶液混合，得到所述介质固定化酶；
优选地，所述连接臂选自聚乙烯亚胺、聚谷氨酸或聚天冬氨酸中的任意一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述连接臂为聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸，所述含有连接臂的溶液的制备方法为：
将聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液混合，得到所述含有连接臂的溶液；
优选地，在所述含有连接臂的溶液中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的浓度各自独立的为0.01-0.2mol/L；
优选地，所述2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液的浓度为0.01-0.1mol/L；
优选地，所述2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液的pH值为4.0-6.0；
优选地，在所述含有连接臂的溶液中，所述聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸的浓度为0.1-4g/L。
10.根据权利要求1-4中的任一项所述的介质固定化酶在去除微污染物中的应用。
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