CN108754871A - 一种复合纳米纤维膜的制备方法、复合纳米纤维膜及其在酶固定化上的应用及固定化酶 - Google Patents

一种复合纳米纤维膜的制备方法、复合纳米纤维膜及其在酶固定化上的应用及固定化酶 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米纤维膜领域，特别是一种复合纳米纤维膜的制备方法、复合纳米纤维膜及其在酶固定化上的应用及固定化酶，本发明采用含壳聚糖的静电纺丝液制备纳米纤维膜，该膜具有良好的成膜性和酶固定功效，同时，采用多肽纳米纤维加载在该膜上，进一步改善膜的性能，提高膜的酶固定性能。

Description

一种复合纳米纤维膜的制备方法、复合纳米纤维膜及其在酶 固定化上的应用及固定化酶
技术领域
本发明属于纳米纤维膜领域，特别是一种复合纳米纤维膜的制备方法、复合纳米纤维膜及其在酶固定化上的应用及固定化酶。
背景技术
近年来纳米纤维作为载体固定化酶是国内外的一大研究热点。它主要具备以下几个优点：(1)载酶量较大；(2)可以与产物分开，简化了提纯工艺，提高了酶的重复使用次数，降低了酶的成本；(3)可以根据载体的要求，制备相应的纳米纤维；(4)减少了酶催化时底物的扩散阻力，制备性能优异的酶载体是酶固定化技术的研究热点，静电纺丝制备纳米纤维具有良好的性能，但是其直径的数量级受限于所采用的静电纺丝设备，通常是几百纳米，在酶固定化时该直径的纳米纤维表面刚度过多，影响酶的固定效率。
环氧基具有较好的反应活性，环氧基团可以与脂肪酶分子中的氨基发生共价结合来实现酶的固定化，含环氧基团的载体可以在较温和的条件下通过与酶分子发生共价结合的方式来实现酶的固定化。
多肽纳米纤维作为一种新的纳米材料，直径尺寸通常只有几纳米，纳米效应明显，具有良好的吸附性能和良好的生物相容性，但是多肽纳米纤维通常长度只有几纳米，并不利于成膜，单纯的采用多肽纳米纤维制备酶固定用的膜有一定难度，是会影响酶的固定效率的。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合纳米纤维膜的制备方法、复合纳米纤维膜及其在酶固定化上的应用及固定化酶，以解决现有技术中的不足，它提供能够解决静电纺丝纳米纤维固定酶的不足，提高酶的固定效率。
本发明采用的技术方案如下：
一种包含多肽纳米纤维的复合纳米纤维膜的制备方法，其中，包括以下步骤：
(1)将端部氨基酸为负电荷的Ac-A6D-OH多肽和端部氨基酸为正电荷的 Ac-A6K-NH2多肽，按照摩尔比1:1，溶于三氟乙醇配成1mg/mL溶液，得多肽混合液，在-20℃下储存备用；将多肽混合液稀释到50ng.uL-1，与乙醇4：1 混合，在常温下下培养6-10天，得到包含多肽纳米纤维的混合液备用；其中，多肽纳米纤维的直径数量级为十nm；
(2)以偶氮二异丁腈为引发剂，称取一定质量的甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸甲酯于100mL的N-N二甲基甲酰胺溶剂中，配成甲基丙烯酸缩水甘油酯质量浓度为25％、丙烯酸甲酯质量浓度为25％、引发剂浓度0.6％的混合液，将该混合液在N2的保护下于水浴振荡器中进行聚合反应，制备得到含环氧基团的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸甲酯)的二元共聚物的溶液；
(3)将步骤(2)得到的二元共聚物的溶液用蒸馏水洗涤，除去小分子的单体和杂质，用乙醚/丙酮体积比为7:3的混合溶剂洗涤以除去均聚物，再用上述溶剂交替洗涤两次、过滤、冷冻干燥，得到纯化之后二元共聚物；
(4)以N-N二甲基甲酰胺为溶剂，将步骤(3)得到的纯化的二元共聚物溶解在N-N二甲基甲酰胺为溶剂中，配置呈浓度15％的纺丝溶液，并加入壳聚糖，磁力搅拌器充分搅拌24h至均匀，得纺丝溶液待用；
(5)将制备好的纺丝液转移到容量为5mL、针头内径0.7mm的注射器中，水平放置于推进器上，调节纺丝电压18kV，注射器推进速度0.1mL/h，针头距离接收板的距离0.18m，纺丝过程在环境气温20℃，空气湿度为25％下进行静电纺丝，得到静电纺丝纳米纤维；
(6)将步骤(1)得到的包含多肽纳米纤维的混合液浇注到步骤(5)得到的静电纺丝纳米纤维上，并浸泡步骤(5)得到的静电纺丝纳米纤维膜，辐射处理1-3h,形成复合纳米纤维膜，然后放置与真空干燥箱中干燥至可以从接收板上揭起所述复合纳米纤维膜。
如上所述的复合纳米纤维膜的制备方法，其中，优选的是，所述步骤(1) 的多肽纳米纤维的直径为14nm；所述步骤(5)的静电纺丝纳米纤维的直径的数量级为百nm。
如上所述的复合纳米纤维膜的制备方法，其中，优选的是，所述多肽纳米纤维的质量占所述静电纺丝纳米纤维质量的10-12％。
如上所述的复合纳米纤维膜的制备方法，其中，优选的是，所述步骤(4) 中加入的所述壳聚糖的质量占所述二元共聚物的质量的5-10％。
一种复合纳米纤维膜，其中，所述复合纳米纤维膜采用如上所述制备方法制得。
如上所述的复合纳米纤维膜，其中，优选的是，所述复合纳米纤维膜包括直径的数量级为百nm的静电纺丝纳米纤维和直径的数量级为十nm的多肽纳米纤维，所述多肽纳米纤维接枝在所述静电纺丝纳米纤维上。
一种复合纳米纤维膜在酶固定化上的应用，其中，所述复合纳米纤维膜为以上所述的复合纳米纤维膜，所述应用包括以下步骤：
(1)采用活化剂对复合纳米纤维膜进行活化处理：将复合纳米纤维膜浸泡到浓度0.3％的戊二醛溶液中震荡处理2-3h，震荡速度60-80r/min，取出后用蒸馏水冲洗，之后，在浸入5mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羧基琥珀酸酰亚胺的磷酸盐缓冲液中震荡活化2-3h，震荡速度 60-80r/min；取出后在中心的磷酸盐缓冲液中反复冲洗，得到活化后的复合纳米纤维膜；其中：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔：N- 羧基琥珀酸酰亚胺的摩尔为1:5-6；
(2)将步骤(1)活化处理之后的复合纳米纤维膜浸泡到浓度为 1.5-2.5mg/mL的酶的磷酸盐缓冲液中，在室温下间隔震荡处理3-5次，每次处理30-40min，之后取出用磷酸盐缓冲液反复冲洗，即可。
一种固定化酶，其中，所述固定化酶采以上所述的应用制得。
如上所述的固定化酶，其中，优选的是，所述酶为脂肪酶、蛋白酶、漆酶之一。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用端部氨基酸为负电荷的Ac-A6D-OH多肽和端部氨基酸为正电荷的Ac-A6K-NH2多肽，按照摩尔比1:1，溶于三氟乙醇配成1mg/mL溶液，得多肽混合液，在-20℃下储存备用；将多肽混合液稀释到50ng.uL-1，与乙醇4：1混合，在常温下下培养6-10天，得到包含多肽纳米纤维的混合液备用，其中，多肽纳米纤维的直径数量级为十nm；采用端部氨基酸为负电荷的Ac-A6D-OH 多肽和端部氨基酸为正电荷的Ac-A6K-NH2多肽在乙醇环境下的自组装形成直径数量级为十nm的多肽纳米纤维，该纳米纤维的直径越小，比表面积越大，具有更大的化学活性，吸附效果更好，能提高酶的加载量。
同时，采用的甲基丙烯酸缩水甘油酯是一种含有多官能团的丙烯酸酯衍生物，分子结构中的不饱和双键易于发生共聚反应，活性较强的环氧基团很容易与羧基、羟基、胺基等官能团发生开环加成反应，采用的壳聚糖是甲壳素脱乙酰作用后的产物，作为一种天然的有机高分子，其分子链中存在着大量的氨基和羟基，这种结构特性使其具有良好的生物相容性、成膜性和吸附性。本发明采用甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸甲酯的共聚反应制备含环氧基的二元共聚物、壳聚糖一起采用静电纺丝技术制备纳米纤维膜，该纳米纤维膜的纳米纤维的直径为几百纳米，同时该膜具环氧基、氨基和羟基等大量的官能团，具有良好的酶固定效果，实现了膜的化学改性；
在静电纺丝制备的纳米纤维素膜上加载直径数量级为十纳米的多肽纳米纤维，提高了该膜整体的纳米效应，所以，该复合纳米纤维膜相比单一的大直径纳米纤维膜，通过设置两个不同纳米纤维直径，进一步提高了复合膜的表面积比和吸附效果，使得膜整体具有更好的酶加载能力，这一点是属于对膜的微观尺寸进行物理改善带来的效果；同时，静电纺丝纳米纤维上具有大量的官能团，这些官能团能够与多肽纳米纤维相互作用，形成性能更佳的膜整体，这一点是属于对膜的进行化学改善带来的效果；
对膜的物理改性和化学改性以及二者相结合，使得本发明提供了一种具有高表面积、多吸附点、多官能团的结构性能较好的复合纳米纤维膜。
具体实施方式
下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
本发明的实施例提供了一种包含多肽纳米纤维的复合纳米纤维膜的制备方法，其中，包括以下步骤：
(1)将130g端部氨基酸为负电荷的Ac-A6D-OH多肽和135g端部氨基酸为正电荷的Ac-A6K-NH2多肽，优选按照摩尔比1:1，溶于三氟乙醇配成1mg/ mL溶液，得多肽混合液，在-20℃温度下储存备用，在实施的时候，将多肽混合液稀释到50ng.uL-1，与乙醇4：1混合，在常温下下培养6-10天，优选8 天，得到包含多肽纳米纤维的混合液备用，其中，多肽纳米纤维的直径数量级为十nm；
(2)以3.6g偶氮二异丁腈为引发剂，称取150g甲基丙烯酸缩水甘油酯、 150g丙烯酸甲酯于296.4g的N-N二甲基甲酰胺溶剂中，配成甲基丙烯酸缩水甘油酯质量浓度为25％、丙烯酸甲酯质量浓度为25％、引发剂浓度0.6％的混合液，将该混合液在N2的保护下于水浴振荡器中进行聚合反应，制备得到含环氧基团的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸甲酯)的二元共聚物的溶液；
(3)将步骤(2)得到的二元共聚物的溶液用20g蒸馏水洗涤，除去小分子的单体和杂质，用50g乙醚/丙酮体积比为7:3的混合溶剂洗涤以除去均聚物，再用上述溶剂交替洗涤两次、过滤、冷冻干燥，得到纯化之后二元共聚物；
(4)以N-N二甲基甲酰胺为溶剂，将步骤(3)得到的纯化的二元共聚物溶解在N-N二甲基甲酰胺为溶剂中，配置呈浓度15％的纺丝溶液，并加入壳聚糖，磁力搅拌器充分搅拌24h至均匀，得纺丝溶液待用；
(5)将制备好的纺丝液转移到容量为5mL、针头内径0.7mm的注射器中，水平放置于推进器上，调节纺丝电压18kV，注射器推进速度0.1mL/h，针头距离接收板的距离0.18m，纺丝过程在环境气温20℃，空气湿度为25％下进行静电纺丝，得到静电纺丝纳米纤维；
(6)将步骤(1)得到的包含多肽纳米纤维的混合液浇注到步骤(5)得到的静电纺丝纳米纤维上，并浸泡步骤(5)得到的静电纺丝纳米纤维膜，辐射处理1-3h,具体可以处理2h，形成复合纳米纤维膜，然后放置与真空干燥箱中干燥至可以从接收板上揭起所述复合纳米纤维膜。
本发明采用的甲基丙烯酸缩水甘油酯是一种含有多官能团的丙烯酸酯衍生物，分子结构中的不饱和双键易于发生共聚反应，活性较强的环氧集团很融通易与羧基、羟基、胺基等官能团发生开环加成反应，采用的壳聚糖是甲壳素脱乙酰作用后的产物，作为一种天然的有机高分子，其分子链中存在着大量的氨基和羟基，这种结构特性使其具有良好的生物相容性、成纤成膜性和吸附性。
本发明采用甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸甲酯的共聚反应制备含环氧基的二元共聚物和壳聚糖一起采用静电纺丝技术制备纳米纤维膜，虽然该纳米纤维膜的纳米纤维的直径为几百纳米，但是该膜具环氧基、氨基和羟基等大量的官能团，可以具有良好的酶固定效果，是属于膜的化学改性；同时，在静电纺丝制备的纳米纤维素膜上加载直径只有几纳米的多肽纳米纤维，提高了该膜的纳米效应，进一步提高了复合膜的表面积比和吸附效果，是属于对膜的微观尺寸的改性；同时，对膜的化学改性时，引入的大量的官能团，能够与多肽纳米纤维相互作用，形成性能更加的膜整体，再者，多肽纳米纤维是采用多肽的自组装形成的，直径通常是几十纳米的，同时，多肽纳米纤维具有氨基、羟基等官能团，能够有壳聚糖的官能团发生聚合反应，接枝在壳聚糖上，增加膜结构稳定性；对膜的物理改性和化学改性以及二者相结合，提供了一种具有高表面积比、多吸附点、多官能团的复合纳米纤维膜。
如上所述的复合纳米纤维膜的制备方法，其中，优选的是，所述步骤(1) 的多肽纳米纤维的直径为14nm；所述步骤(5)的静电纺丝纳米纤维的直径的数量级为百nm。尺寸不同的多肽纳米纤维和静电纺丝纳米纤维相互填充，改善了膜的结构，同时较小尺寸的多肽纳米纤维具有良好的生物相容性，在尺寸较大的静电纺丝纳米纤维上加载该多肽纳米纤维，能够起到改善提高静电纺丝纳米纤维的吸附性能的功效。
如上所述的复合纳米纤维膜的制备方法，其中，优选的是，所述多肽纳米纤维的质量占所述静电纺丝纳米纤维质量的10-12％，具体可以设置为11％。
如上所述的复合纳米纤维膜的制备方法，其中，优选的是，所述步骤(4) 中加入的所述壳聚糖的质量占所述二元共聚物的质量的5-10％，具体可以设置为8％。
本发明的又一实施例提供了一种复合纳米纤维膜，其中，所述复合纳米纤维膜采用如上所述制备方法制得。
如上所述的复合纳米纤维膜，其中，优选的是，所述复合纳米纤维膜包括直径的数量级为百nm的静电纺丝纳米纤维和直径小于10nm的多肽纳米纤维，所述多肽纳米纤维接枝在所述静电纺丝纳米纤维上。
采用10张膜进行测试，经测量，该膜的平均厚度为0.13mm，膜的断裂强裂的平均拉力为1535.6cN。
本发明的再一实施例提供了一种复合纳米纤维膜在酶固定化上的应用，其中，所述复合纳米纤维膜为以上所述的复合纳米纤维膜，所述应用包括以下步骤：
(1)采用活化剂对复合纳米纤维膜进行活化处理；在实施例的时候，选择戊二醛为活化剂，将复合纳米纤维膜浸泡到浓度0.3％的戊二醛溶液中震荡处理2-3h，震荡速度60-80r/min，具体可以设置震荡处理时间为2.5h，震荡速度70r/min，取出后用蒸馏水冲洗，之后，在浸入5mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羧基琥珀酸酰亚胺的磷酸盐缓冲液中震荡活化2-3h，震荡速度60-80r/min，具体可以设置震荡处理时间为2.5h，震荡速度70r/min，；取出后在中心的磷酸盐缓冲液中反复冲洗，得到活化后的复合纳米纤维膜；其中：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔： N-羧基琥珀酸酰亚胺的摩尔为1:5-6，该值具体可以设置为1:5.5。
(2)将步骤(1)活化处理之后的复合纳米纤维膜浸泡到浓度为 1.5-2.5mg/mL的酶的磷酸盐缓冲液中,设置的时候酶的浓度可以设置为 2.0mg/mL，在室温下间隔震荡处理3-5次，每次处理30-40min，之后取出，在实施例的时候，可以设置震荡4次，每次间隔30min，每次处理时间为35min，震荡速度70r/min，并用磷酸盐缓冲液反复冲洗，即可。
为了测试该膜酶加载能力，选取丙烯酸甲酯采用静电纺丝制备的纳米纤维膜(简称第一膜)、甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸甲酯共聚反应生成的二元共聚物经静电纺丝制备的纳米纤维膜(简称第二膜)、甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸甲酯共聚反应生成的二元共聚物结合壳聚糖经静电纺丝制备的纳米纤维膜(简称第三膜)、本申请制备的复合纳米纤维膜(简称第四膜)，本实施例中选用脂肪酶进行测试，配置四份浓度均为2mg/mL的脂肪酶的磷酸缓冲液，将准确称过质量的第一膜、第二膜、第三膜、第四膜分别浸泡到四份脂肪酶的磷酸缓冲液，在30℃下固定6h，然后去除加载过酶之后的各膜，并分别反复冲洗，之后干燥，可以采用冷冻或者烤箱干燥等，为保证干燥条件的一至，将四者放在一起干燥，最后在称重，计算加载酶之后的膜重量和加载酶之前的膜的重量比，得到膜的酶加载能力，结果如下：
第二膜由于具有环氧基，所以酶加载能力大大提高，这是因为环氧基具有较好的活性；第三膜添加了壳聚糖，进一步提高了酶的加载能力，第四膜在由于纳米尺寸效应导致表面积比的增加，酶加载能力进一步提高，且提升幅度较大，这是因为多肽纳米纤维不仅改善了膜的表面性质，同时，多肽纳米纤维具有可以固定酶的官能团，增加了膜的酶固定点。
同时，为了研究本实施例得到的复合纳米纤维膜加载酶的稳定性，将本实施例的100g复合纳米纤维膜上加载100mg脂肪酶之后，进行多次水洗，每次水洗干燥之后，称重，以每100g膜里面加载的剩余的酶的重量表示膜加载酶的稳定性，结果如下：
由此可见，刚开始的时候，每次水洗酶损失的较大，这可能是因为强力水冲洗，导致物理吸附的酶脱落，所以脱落较快；随着冲洗次数的增加，酶损失量减小，可能是因为官能团和酶之间时化学固定，稳定性较高的原因。
本发明的再一实施例还提供了一种固定化酶，其中，所述固定化酶采用以上所述的应用制得。
如上所述的固定化酶，其中，优选的是，所述酶为脂肪酶、蛋白酶、漆酶之一。

Claims (9)

1.一种包含多肽纳米纤维的复合纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将端部氨基酸为负电荷的Ac-A6D-OH多肽和端部氨基酸为正电荷的Ac-A6K-NH2多肽，按照摩尔比1:1，溶于三氟乙醇配成1mg/mL溶液，得多肽混合液，在-20℃下储存备用；将多肽混合液稀释到50ng.uL-1，与乙醇4：1混合，在常温下下培养6-10天，得到包含多肽纳米纤维的混合液备用，其中，多肽纳米纤维的直径数量级为十nm；
(2)以偶氮二异丁腈为引发剂，称取一定质量的甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸甲酯于100mL的N-N二甲基甲酰胺溶剂中，配成甲基丙烯酸缩水甘油酯质量浓度为25％、丙烯酸甲酯质量浓度为25％、引发剂浓度0.6％的混合液，将该混合液在N2的保护下于水浴振荡器中进行聚合反应，制备得到含环氧基团的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-丙烯酸甲酯)的二元共聚物的溶液；
(3)将步骤(2)得到的二元共聚物的溶液用蒸馏水洗涤，除去小分子的单体和杂质，用乙醚/丙酮体积比为7:3的混合溶剂洗涤以除去均聚物，再用上述溶剂交替洗涤两次、过滤、冷冻干燥，得到纯化之后二元共聚物；
(4)以N-N二甲基甲酰胺为溶剂，将步骤(3)得到的纯化的二元共聚物溶解在N-N二甲基甲酰胺为溶剂中，配置呈浓度15％的纺丝溶液，并加入壳聚糖，磁力搅拌器充分搅拌24h至均匀，得纺丝溶液待用；
(5)将制备好的纺丝液转移到容量为5mL、针头内径0.7mm的注射器中，水平放置于推进器上，调节纺丝电压18kV，注射器推进速度0.1mL/h，针头距离接收板的距离0.18m，纺丝过程在环境气温20℃，空气湿度为25％下进行静电纺丝，得到静电纺丝纳米纤维；
(6)将步骤(1)得到的包含多肽纳米纤维的混合液浇注到步骤(5)得到的静电纺丝纳米纤维上，并浸泡步骤(5)得到的静电纺丝纳米纤维膜，辐射处理1-3h，形成复合纳米纤维膜，然后放置到真空干燥箱中干燥至可以从接收板上揭起所述复合纳米纤维膜。
2.根据权利要求1所述的复合纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的多肽纳米纤维的直径为14nm；所述步骤(5)的静电纺丝纳米纤维的直径的数量级为百nm。
3.根据权利要求1所述的复合纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述多肽纳米纤维的质量占所述静电纺丝纳米纤维质量的10-12％。
4.根据权利要求1所述的复合纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中加入的所述壳聚糖的质量占所述二元共聚物的质量的5-10％。
5.一种复合纳米纤维膜，其特征在于，所述复合纳米纤维膜采用权利要求1-4任一项所述的制备方法制得。
6.根据权利要求5所述的复合纳米纤维膜，其特征在于，所述复合纳米纤维膜包括直径的数量级为百nm的静电纺丝纳米纤维和直径的数量级为十nm的多肽纳米纤维，所述多肽纳米纤维接枝在所述静电纺丝纳米纤维上。
7.一种复合纳米纤维膜在酶固定化上的应用，其特征在于，所述复合纳米纤维膜为权利要求5-6任一项所述的复合纳米纤维膜，所述应用包括以下步骤：
(1)将复合纳米纤维膜浸泡到浓度0.3％的戊二醛溶液中震荡处理2-3h，震荡速度60-80r/min，取出后用蒸馏水冲洗，之后，浸入5mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羧基琥珀酸酰亚胺的磷酸盐缓冲液中震荡活化2-3h，震荡速度60-80r/min；取出后在中心的磷酸盐缓冲液中反复冲洗，得到活化后的复合纳米纤维膜；其中：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔：N-羧基琥珀酸酰亚胺的摩尔为1:5-6；
(2)将步骤(1)活化处理之后的复合纳米纤维膜浸泡到浓度为1.5-2.5mg/mL的酶的磷酸盐缓冲液中，在室温下间隔震荡处理3-5次，每次处理30-40min，之后取出用磷酸盐缓冲液反复冲洗，即可。
8.一种固定化酶，其特征在于，所述固定化酶采用权利要求7所述的应用制得。
9.根据权利要求8所述的固定化酶，其特征在于：所述酶为脂肪酶、蛋白酶、漆酶之一。
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