CN105802950A - 一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌及其制备方法。所述的纳米纤维由静电纺纺丝聚合物或大分子、溶剂和酵母菌组成，所配制混合液置于注射器后通过静电纺丝仪纺制而成，利用酵母菌在纺丝液的分散从而在纳米纤维中引入了微生物，结合了纳米纤维具有的比表面积大、孔隙率高、长径比大和疏松多孔等优点，实现了对酵母菌细胞的原位固定化，获得了活性有机/微生物复合材料，起到类似多酶生物反应器的功能。本发明产物和制备方法具有处理效率高、反应迅速、易于控制、抗污染能力强、可连续重复使用、产物易于分离等优点。本发明的串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌可应用于生物催化、过滤吸附、药物输送和组织工程等领域。

Description

一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物材料学，特别是酵母菌的固定化领域，特别涉及一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌及其制备方法。

背景技术

酵母菌作为一种细胞微生物，体内有着完整的酶催化体系，具有催化速度快、催化效率高、专一性强等特点，在日常生产实践活动中起着非常重要的作用，如发酵酿酒、生物催化、过滤吸附以及药物输送等。但在实际生产实践过程中由于所处的环境条件恶劣，使得酵母活性受到极大的影响，限制了酵母菌的实际应用。20世纪50年代兴起的固定化技术有效改善了上述出现的问题，使得酵母菌可以保持较高的活性，降低了生产成本，可以进行连续化生产等，所以固定化技术为酵母菌的应用开辟了新的道路。

所谓的固定化技术就是采用物理或者化学的手段方法使游离的酶或细胞能够定位于限定的空间区域，使其保持较高的生物活性并且能够得到反复使用。目前固定化的方法很多，但主要包括四种：吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。但这些方法都或多或少的存在问题，比如吸附法缺点是酶或细胞易脱落，导致活性降低；共价结合法的缺点是操作复杂，反应难以控制；交联法在整个交联过程中，酶或细胞间发生的化学反应较为激烈，对活力影响很大；包埋法由于载体中的孔隙大小会直接阻碍大分子底物之间的扩散，只有小分子物质才能够通过高分子凝胶的微孔。

固定化技术的关键在于所采用的固定化方法和所使用的载体材料。静电纺丝是一种将高分子聚合物溶液通过静电力的作用进行牵伸，然后溶剂在牵伸过程中挥发，最终在接收装置上得到一种类似于无纺布的纳米纤维膜。静电纺制备得到的纳米纤维膜具有比表面积大、孔隙率高、机械稳点性好等优点，使用静电纺纳米纤维膜作为酵母菌固定化载体，不但有利于载体与酵母菌充分接触，还能够增加酵母菌的使用稳定性与有效利用率，因而静电纺纳米纤维膜被认为是一种理想的固定化载体材料。目前，利用静电纺固定化酶或细胞的方法主要有两种，分别是表面担载法和包埋法。表面担载法是一种先制备纳米纤维膜后固定的方法，这种方法的缺点是酶或细胞的载量受到严重限制，并且在使用过程中活性会受到较大影响；而包埋法则是一种将酶或细胞直接与聚合物溶液直接混合进行纺丝的方法，该方法弥补了表面担载法的缺陷，大大提高了纤维膜对酶或细胞的载量以及酶活性。

传统游离酵母在发酵工艺过程中会出现产品难以分离、容易损失、产品质量不高等问题，为解决该问题，本发明利用静电纺丝技术，将微生物---酵母菌引入到纺丝液中，对酵母菌进行固定化，形成了一种活性的纳米微生物复合材料。酵母微生物细胞被固定后，酵母细胞内的完整的酶系统能够得以保存下来，相当于一个多酶生物反应器。而同游离酵母相比，固定化酵母除了可以克服以上缺点，还具有生长速度快、处理效率高、反应迅速、易于控制、抗污染能力强、可连续使用、产物易于分离等优点。静电纺固定化酵母为酵母菌的应用开辟了新的思路，同时也为制备有机/微生物复合纤维开辟了新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过静电纺丝技术将酵母菌引入到纺丝液中从而电纺出类似于串珠状的纳米纤维，并将酵母菌固定在纳米纤维中，实现酵母微生物细胞的原位固定化。本发明的制备方法简单、易于操作、生产成本低，同时纳米纤维所固定的酵母菌活性及催化活性高，可以多次重复使用。这种将酵母微生物细胞固定在纳米纤维中的方法，在复合材料领域具有创新性，为其提供了新的思想，实现了活性微生物与纳米纤维的有机复合，获得了具有特殊结构的纳米纤维，在生物催化、过滤吸附、药物输送和组织工程等方面具有较大的应用潜力。

为实现本发明的目的，提供以下方案：

本发明的串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌由静电纺纺丝聚合物或大分子、溶剂和酵母菌组成，所配制混合液置于注射器后通过静电纺丝仪纺制而成，其中，静电纺纺丝液为合成/天然高分子的有机溶液、水溶液或混合溶液，酵母菌直径为1-5μm，酵母菌用量为静电纺纺丝液质量的1-30％。

所述的静电纺纺丝聚合物或大分子可自行聚合或直接购买，具体为聚丙烯腈、聚四氟乙烯、聚烷基丙烯酰胺、聚丙烯酸及其衍生物、水溶性淀粉、环糊精、瓜儿胶、聚乳酸、聚苯并咪唑、聚已内酯、聚碳酸亚丙酯、聚氨酯、聚羟基丁酸戊酸酯、海藻酸钠、羧甲基壳聚糖、聚氧化乙烯、聚环氧乙烷、聚丙烯、聚酰胺、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯腈、聚对苯二甲酸对苯二胺、聚苯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇吡咯烷酮、乙基氰乙基纤维素、氨基甲酸酯、重组蛋白质、弹性多肽、缩氨酸中的任意一种，以及其混合物。

所述的酵母菌为淡黄色颗粒状粉末，细胞形态为球形、香肠状或卵圆形，在有氧气或者没有氧气的情况下进行呼吸作用；在无氧的情况下，酵母菌则可对葡萄糖进行糖酵解，将葡萄糖分解成为CO₂和酒精；在有氧条件下，酵母菌可对葡萄糖进行发酵，将糖类转化为水和CO₂。

所述的纳米纤维在自制或购买的静电纺丝仪器上通过改变工艺参数：5-30kV纺丝电压、10-30cm接收距离、0.3-2.0mL/h注射器推进速度，纺制而得。

本发明的一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌的制备方法具体如下：

1)静电纺纺丝聚合物或大分子混合溶液的配制：由天平称取静电纺纺丝聚合物和大分子，氮气保护下，缓慢加入溶剂，磁力搅拌5-300min，控制温度为25-100℃使其混合均匀，形成均一溶液，最终配置成质量浓度为8-15wt％静电纺纺丝聚合物或大分子混合溶液；

2)含酵母菌的静电纺纺丝液的配制：称取酵母菌固体颗粒，加入步骤1中的混合溶液中，磁力搅拌15-35min，以使酵母菌细胞充分分散在混合溶液中，最终获得含酵母菌的静电纺纺丝液；

3)静电纺纳米纤维固定化酵母菌的纺制：将步骤2中的静电纺纺丝液缓慢装入注射器中，利用自制或购买的静电纺丝装置，调节纺丝参数如纺丝电压、接收距离、进液速率等进行纺丝，避免针头处有大量纺丝液溢出；

4)样品收集和纯化：在收集板上收集电纺纤维膜，纺丝时间为30-200min，以便形成厚度为10-100μm的纤维膜，然后置于真空干燥箱中干燥30-300min，以便除去残留在纤维膜中的溶剂等杂质，即得到所述的串珠状结构的静电纺纳米纤维固定化酵母，干燥保存备用。

所述的有机溶剂为甲醇、乙二醇、石油醚、聚乙二醇辛基苯基醚、丙醇、丙二醇、丙三醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、吡咯烷酮、吡啶、哌啶、四氢呋喃、二氧六环、二甲基亚砜中的任意一种，若为与水、乙醇的相容性混合溶剂，则二者的体积比为3∶7-6∶1。

所述的注射器为塑料或金属材质，容量为5-20mL。

所述的收集板为圆筒型或平板型，接收介质为铝箔纸、无纺布布料、塑料薄膜或动植物表面中的任意一种。

所述的串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母，通过改变pH值、反应温度、静电纺纺丝参数、纺丝模具，可形成竹节状、花瓣状、雪花状、花生状的纳米纤维。

所述的静电纺纳米纤维固定化酵母应用于生物催化、过滤吸附、药物输送和组织工程领域。

本发明的有益效果和技术优势如下：

1.本发明是将酵母菌直接引入到聚合物纺丝液中进行混合，而后利用静电纺丝技术对酵母菌进行一种原位固定，实验操作简单易行，降低生产成本，并且固载效率高，防止纳米纤维表面有残留的酵母菌，减少了酵母菌的损失；

2.静电纺丝固定化法相比较传统的凝胶包埋法等优势明显，基于纳米纤维具有比表面积大、孔隙率高、长径比大、疏松多孔等优点，因而是一种理想的、良好的固定化载体；

3.作为包埋酵母菌的纳米纤维可以保证固定化的酵母菌具有多次重复使用性，提高酵母菌的有效利用率；

4.酵母作为一种单细胞微生物，其体内包含了一系列复杂的酶催化系统，固定化后的酵母菌，其体内的完整的酶系统能够保存下来，相当于一个多酶生物反应器，在实际应用中具有生长速度快、处理效率高、反应迅速、易于控制等优点；

5.酵母菌本身含有丰富的蛋白质，可作为生物蛋白表达系统应用于生物基因遗传方面，同时这种将微生物细胞固定在纳米纤维中的活性复合材料在复合材料领域具有开创性，在生物催化、过滤吸附、药物输送和组织工程等领域应用广泛。

附图说明

图1为本发明制备得到的串珠状聚丙烯酰胺纳米纤维固定化酵母菌的环境扫描电子显微镜图(左)和场发射扫描电子显微镜图(右)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，其他的任何未违背本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1)静电纺纺丝聚合物或大分子混合溶液的配制：由天平称取聚丙烯酰胺，氮气保护下，缓慢加入混合溶剂乙醇/水体积比为5∶7，磁力搅拌20min，控制温度为40℃使其混合均匀，形成均一溶液，最终配置成质量浓度为10wt％的聚丙烯酰胺混合溶液；

2)含酵母菌的静电纺纺丝液的配制：称取0.2g酵母菌固体颗粒，加入步骤1中的混合溶液中，磁力搅拌20min，以使酵母菌细胞充分分散在混合溶液中，最终获得含酵母菌的聚丙烯酰胺静电纺纺丝液；

3)静电纺纳米纤维固定化酵母菌的纺制：将步骤2中的静电纺纺丝液缓慢装入塑料注射器中，容量为10mL，利用自制的静电纺丝装置，调节纺丝参数如纺丝电压10kV、接收距离20cm、进液速率1.3ml/h等进行纺丝，避免针头处有大量纺丝液溢出；

4)样品收集和纯化：在平板收集板上用铝箔收集电纺纤维膜，纺丝时间为60min，以便形成厚度为20μm的纤维膜，然后置于真空干燥箱中干燥60min，以便除去残留在纤维膜中的溶剂等杂质，即得到所述的串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母，干燥保存备用。

实施例2

1)静电纺纺丝聚合物或大分子混合溶液的配制：由天平称取聚乙烯醇，氮气保护下，缓慢加入溶剂水，磁力搅拌30min，控制温度为100℃使其混合均匀，形成均一溶液，最终配置成质量浓度为8wt％的聚乙烯醇混合溶液；

2)含酵母菌的静电纺纺丝液的配制：称取0.1g酵母菌固体颗粒，加入步骤1中的混合溶液中，磁力搅拌15min，以使酵母菌细胞充分分散在混合溶液中，最终获得含酵母菌的聚乙烯醇静电纺纺丝液；

3)静电纺纳米纤维固定化酵母菌的纺制：将步骤2中的静电纺纺丝液缓慢装入金属注射器中，容量为5mL，利用购买的静电纺丝装置，调节纺丝参数如纺丝电压17kV、接收距离15cm、进液速率0.50ml/h等进行纺丝，避免针头处有大量纺丝液溢出；

4)样品收集和纯化：在平板收集板上用无纺布收集电纺纤维膜，纺丝时间为120min，以便形成厚度为40μm的纤维膜，然后置于真空干燥箱中干燥120min，以便除去残留在纤维膜中的溶剂等杂质，即得到所述的串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母，干燥保存备用。

实施例3

1)静电纺纺丝聚合物或大分子混合溶液的配制：由天平称取聚乳酸，氮气保护下，缓慢加入溶剂二甲基亚砜，磁力搅拌300min，控制温度为45℃使其混合均匀，形成均一溶液，最终配置成质量浓度为11wt％的聚乳酸混合溶液；

2)含酵母菌的静电纺纺丝液的配制：称取0.3g酵母菌固体颗粒，加入步骤1中的混合溶液中，磁力搅拌35min，最终获得含酵母菌的静电纺纺丝液；

3)静电纺纳米纤维固定化酵母菌的纺制：将步骤2中的静电纺纺丝液缓慢装入金属注射器中，容量为20mL，利用自制的静电纺丝装置，调节纺丝参数如纺丝电压12kV、接收距离18cm、进液速率0.5ml/h等进行纺丝，避免针头处有大量纺丝液溢出；

4)样品收集和纯化：在平板收集板上用PVC塑料膜收集电纺纤维膜，纺丝时间为120min，以便形成厚度为40μm的纤维膜，然后置于真空干燥箱中干燥120min，以便除去残留在纤维膜中的溶剂等杂质，即得到所述的串珠形状的静电纺纳米纤维固定化酵母，干燥保存备用。

实施例4

1)静电纺纺丝聚合物或大分子混合溶液的配制：由天平称取聚丙烯腈，氮气保护下，缓慢加入溶剂N，N二甲基甲酰胺，磁力搅拌10min，控制温度为25℃使其混合均匀，形成均一溶液，最终配置成质量浓度为10wt％静电纺纺丝聚合物或大分子混合溶液；

2)含酵母菌的静电纺纺丝液的配制：称取0.2g酵母菌固体颗粒，加入步骤1中的混合溶液中，磁力搅拌20min，最终获得含酵母菌的静电纺纺丝液；

3)静电纺纳米纤维固定化酵母菌的纺制：将步骤2中的静电纺纺丝液缓慢装入金属注射器中，容量为10mL，利用购买的静电纺丝装置，调节纺丝参数如纺丝电压20kV、接收距离15cm、进液速率1.2ml/h等进行纺丝，避免针头处有大量纺丝液溢出；

4)样品收集和纯化：在平板收集板上用芭蕉扇叶收集电纺纤维膜，纺丝时间为180min，以便形成厚度为60μm的纤维膜，然后置于真空干燥箱中干燥180min，以便除去残留在纤维膜中的溶剂等杂质，即得到所述的串珠形状的静电纺纳米纤维固定化酵母，干燥保存备用。

实施例5

1)静电纺纺丝聚合物或大分子混合溶液的配制：由天平称取聚氨酯，氮气保护下，缓慢加入混合溶剂四氢呋喃/N，N二甲基甲酰胺体积比为1∶2，磁力搅拌60min，控制温度为25℃使其混合均匀，形成均一溶液，最终配置成质量浓度为12wt％静电纺纺丝聚合物或大分子混合溶液；

2)含酵母菌的静电纺纺丝液的配制：称取0.1g酵母菌固体颗粒，加入步骤1中的混合溶液中，磁力搅拌15min，最终获得含酵母菌的静电纺纺丝液；

3)静电纺纳米纤维固定化酵母菌的纺制：将步骤2中的静电纺纺丝液缓慢装入金属注射器中，容量为10mL，利用购买的静电纺丝装置，调节纺丝参数如纺丝电压20kV、接收距离12cm、进液速率1.2ml/h等进行纺丝，避免针头处有大量纺丝液溢出；

4)样品收集和纯化：在圆筒型收集器上用无纺布收集电纺纤维膜，纺丝时间为180min，以便形成厚度为90μm的纤维膜，然后置于真空干燥箱中干燥240min，以便除去残留在纤维膜中的溶剂等杂质，即得到所述的串珠形状的静电纺纳米纤维固定化酵母，干燥保存备用。

Claims (10)

1.一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌由静电纺纺丝聚合物或大分子、溶剂和酵母菌组成，所配制混合液置于注射器后通过静电纺丝仪纺制而成，其中，静电纺纺丝液为合成/天然高分子的有机溶液、水溶液或混合溶液，酵母菌直径为1-5μm，酵母菌用量为静电纺纺丝液质量的1-30％。

2.根据权利要求1，所述的一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌，其特征在于：所述的静电纺纺丝聚合物或大分子可自行聚合或直接购买，具体为聚丙烯腈、聚四氟乙烯、聚烷基丙烯酰胺、聚丙烯酸及其衍生物、水溶性淀粉、环糊精、瓜儿胶、聚乳酸、聚苯并咪唑、聚已内酯、聚碳酸亚丙酯、聚氨酯、聚羟基丁酸戊酸酯、海藻酸钠、羧甲基壳聚糖、聚氧化乙烯、聚环氧乙烷、聚丙烯、聚酰胺、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯腈、聚对苯二甲酸对苯二胺、聚苯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇吡咯烷酮、乙基氰乙基纤维素、氨基甲酸酯、重组蛋白质、弹性多肽、缩氨酸中的任意一种，以及其混合物。

3.根据权利要求1，所述的一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌，其特征在于：所述的酵母菌为淡黄色颗粒状粉末，细胞形态为球形、香肠状或卵圆形，在有氧气或者没有氧气的情况下进行呼吸作用；在无氧的情况下，酵母菌则可对葡萄糖进行糖酵解，将葡萄糖分解成为CO₂和酒精；在有氧条件下，酵母菌可对葡萄糖进行发酵，将糖类转化为水和CO₂。

4.根据权利要求1，所述的一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌，其特征在于：所述的纳米纤维在自制或购买的静电纺丝仪器上通过改变工艺参数：5-30kV纺丝电压、10-30cm接收距离、0.3-2.0mL/h注射器推进速度，纺制而得。

5.一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌的制备方法，包括如下步骤：

1)静电纺纺丝聚合物或大分子混合溶液的配制：由天平称取静电纺纺丝聚合物和大分子，氮气保护下，缓慢加入溶剂，磁力搅拌5-300min，控制温度为25-100℃使其混合均匀，形成均一溶液，最终配置成质量浓度为8-15wt％静电纺纺丝聚合物或大分子混合溶液；

2)含酵母菌的静电纺纺丝液的配制：称取酵母菌固体颗粒，加入步骤1中的混合溶液中，磁力搅拌15-35min，以使酵母菌细胞充分分散在混合溶液中，最终获得含酵母菌的静电纺纺丝液；

3)静电纺纳米纤维固定化酵母菌的纺制：将步骤2中的静电纺纺丝液缓慢装入注射器中，利用自制或购买的静电纺丝装置，调节纺丝参数如纺丝电压、接收距离、进液速率等进行纺丝，避免针头处有大量纺丝液溢出；

4)样品收集和纯化：在收集板上收集电纺纤维膜，纺丝时间为30-200min，以便形成厚度为10-100μm的纤维膜，然后置于真空干燥箱中干燥30-300min，以便除去残留在纤维膜中的溶剂等杂质，即得到所述的串珠状结构的静电纺纳米纤维固定化酵母，干燥保存备用。

6.根据权利要求2，所述的一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为甲醇、乙二醇、石油醚、聚乙二醇辛基苯基醚、丙醇、丙二醇、丙三醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、吡咯烷酮、吡啶、哌啶、四氢呋喃、二氧六环、二甲基亚砜中的任意一种，若为与水、乙醇的相容性混合溶剂，则二者的体积比为3∶7-6∶1。

7.根据权利要求2，所述的一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌的制备方法，其特征在于：所述的注射器为塑料或金属材质，容量为5-20mL。

8.根据权利要求2，所述的一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌的制备方法，其特征在于：所述的收集板为圆筒型或平板型，接收介质为铝箔纸、无纺布布料、塑料薄膜或动植物表面中的任意一种。

9.根据权利要求2，所述的一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌的制备方法，其特征在于：所述的串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母，通过改变pH值、反应温度、静电纺纺丝参数、纺丝模具，可还形成竹节状、花瓣状、雪花状、花生状的纳米纤维。

10.根据权利要求2，所述的一种串珠状静电纺纳米纤维固定化酵母菌的制备方法，其特征在于：所述的静电纺纳米纤维固定化酵母应用于生物催化、过滤吸附、药物输送和组织工程领域。