CN101906459A - 一种静电纺丝纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种静电纺丝纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性的方法。本发明属于静电纺丝纤维膜固定化细胞进行酚类物质毒性检测技术领域，具体涉及一种固定化细胞方法及其检测酚类物质毒性方法。该固定化细胞为接种有绿色荧光蛋白的大肠杆菌，以环境友好型高分子聚合物聚乙烯醇为原料，采用原位静电纺丝技术进行细胞固定。固定化细胞中的绿色荧光蛋白对2，4-二氯酚和五氯酚的响应不同，根据其荧光强度的变化可以检测酚类物质对此细胞的毒性。
Description
技术领域
本发明属于静电纺丝纤维膜固定化细胞进行酚类物质毒性检测技术领域，具体涉及一种固定化细胞方法及其检测酚类物质毒性方法。
背景技术
酚类化合物是合成农药、染料、塑料抗氧剂等的重要精细化工中间体，被广泛用于农业、制药业和染料等工业中，在生活污水、天然水和饮用水中普遍存在，是水体中的重要污染物，对生态环境和人体健康有着严重的危害。美国在七十年代中期就将11种酚类化合物列入129种环境优先污染物之中，而我国也于八十年代末研究并提出了中国的环境优先污染物，其中包括了6种酚类化合物。因此，对水体中酚类化合物的检测具有非常重要的意义。
静电纺丝技术是一种应用高压电使带电荷的高分子溶液或熔体在静电场中流动或变形，然后由于溶剂蒸发或熔体冷却而固化，最终产生直径数十纳米到几十毫米的均匀纤维的过程。静电纺丝纳米纤维膜由于具有大的比表面积、高孔隙率和高吸附性能而被认为是一种较为理想的细胞固定化载体。直接将细胞与不同聚合物溶液进行混合，一同进行静电纺丝，即本发明中所涉及的原位电纺。这种方法在保持细胞生存性的同时又能保持其以完整的结构包埋于纤维中，以使保护细胞免受极端条件限制的纤维内部空间的优势得到充分发挥。DNA被包埋于静电纺丝纤维中而应用于基因治疗中。研究发现，直接从静电纺丝纤维中释放出的质粒DNA相当完整，可以使细胞转化，并且可以对β-牛乳糖酶的α部分进行编码。细丝状的细菌病毒悬浮于聚合物溶液进行静电纺丝后仍然能够保持其生存性。(Escherichia coli，Staphylococcus albus)和噬菌体(T7，T4，λ)在相当高的电压下进行静电纺丝，在纺丝过程中仍然存活，并且细菌和病毒在-20℃和-55℃放置三个月，其数量上没有下降。结果表明，静电纺丝过程运用于活的生物质的包埋以及固定化的潜在可能性。而将这一技术应用于固定化细胞从而用于检测酚类物质毒性具有很现实的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种静电纺丝纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性的方法，即利用静电纺丝技术将大肠杆菌细胞直接固定于聚乙烯醇纳米纤维中，该固定化大肠杆菌细胞在酚类存在的情况下其荧光强度的变化来检测酚类物质毒性的目的。此方法在于实现检测的高通量和灵敏度，分析的速度较快，试样用量少，且成本较低。
本发明是通过采用以下的技术方案来实现上述发明目的的：
本发明所提供的静电纺丝纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性的方法是以高分子量的聚乙烯醇为原料，通过静电纺丝技术制备得到电纺纤维膜固定化细胞，然后将此用于水中酚类物质的检测。该静电纺丝纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性的方法，其特征在于：包括下列三个步骤：细胞的培养、电纺纤维膜固定化细胞的制备及利用其检测水中酚类物质毒性。
1)细胞的培养：
①取一管100μL DH5a感受态细胞，加入绿色荧光蛋白质粒1μL，混合均匀，冰浴中放置30min；
②将管放到42℃水浴循环，热击90s；
③将所述管转移到冰浴中2～5min；
④向冰浴后的所述管中加入常温下700～800μL无抗性的SOB培养基，转入到摇床中，37℃下摇动1h；
⑤取已转化的感受态细胞450μL加入到50mg/L卡那霉素抗性的培养基上，等培养基全部吸收后，于37℃下培养12～16h；
⑥通过菌落PCR鉴定单菌落，确定含有能够表达绿色荧光的蛋白的质粒；
⑦PCR鉴定完毕无误之后，挑选该单菌落接种于含有卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃培养12～16h。
2)电纺纤维膜固定化细胞的制备：
将分子量为10万的聚乙烯醇颗粒和嵌段共聚物溶于超纯水中，均匀混合后加热搅拌至澄清，待此溶液冷却后，向其中加入一定量的步骤1)中培养的细胞，并将此混合溶液注入带有针头的5mL玻璃注射器，将注射器固定在注射泵上，纺丝电压调节至13.2kV，针头到接收板的距离设定为9cm，控制纺丝流速为0.2mL/h，纺丝时间3h，即得到所述电纺纤维膜固定化细胞。
3)利用电纺纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性：
将制备的固定有细胞的电纺纤维膜剪成1×1cm2大小相同的碎片放入96孔酶标板中，在对应的酶标板中以体积比为19∶1的比例加入一定浓度的酚类物质与M9培养基，在37℃下每5min对其荧光吸收进行测定，据荧光吸收的变化来确定酚类物质对细胞的毒性。
本发明的方法中，细胞的培养中所述的细胞为大肠杆菌，且其在利用电纺纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性中大肠杆菌在孔板中的密度为1×107个/cm2。
优选本发明中聚乙烯醇的醇解度为98～99％，平均聚合度为2400～2500，其在水溶液中的质量分数为6％。
本发明的方法中，电纺纤维膜固定化细胞的制备中所述的嵌段共聚物为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚醚F108，其分子式为PEO132-PPO50-PEO132，分子量为15500克/摩尔。
本发明的方法中，利用电纺纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性中培养基选用低荧光背景的M9培养基。
本发明的方法中，利用电纺纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性中所述酚类物质为2，4-二氯酚和五氯酚。
本发明的方法中，检测仪器为Tecan公司生产的Infinite M200型多功能酶标仪。
本发明的优点在于：本发明利用原位静电纺丝技术将细胞直接固定于电纺纤维膜中，从而解决了后固定化不能很好的保护包裹于纤维内部的细胞分子免受极端条件限制的纤维内部空间优势的发挥。而且，将此固定化细胞用于酚类物质毒性检测具有快速、价廉的优点。
附图说明
图1为聚乙烯醇/嵌段共聚物/细胞静电纺丝纤维激光共聚焦扫描电子显微镜图像；
图2为不同浓度2，4-二氯酚作用下的大肠杆菌荧光强度随时间的变化曲线，其中，2，4-二氯酚的浓度为0，0.625mg/L，2.5mg/L；
图3为不同浓度五氯酚作用下的大肠杆菌荧光强度随时间的变化曲线，其中，五氯酚浓度为0，1.0mg/L，20mg/L。
具体实施方式
以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实施不构成对本发明的限制。
实施例1
1)细胞的培养：
①取一管100μL DH5a感受态细胞，加入绿色荧光蛋白质粒1μL，混合均匀，冰浴中放置30min；
②将管放到42℃水浴循环，热击90s；
③将所述管转移到冰浴中2～5min；
④向冰浴后的所述管中加入常温下700～800μL无抗性的SOB培养基，转入到摇床中，37℃下摇动1h；
⑤取已转化的感受态细胞450μL加入到50mg/L卡那霉素抗性的培养基上，等培养基全部吸收后，于37℃下培养12～16h；
⑥通过菌落PCR鉴定单菌落，确定含有能够表达绿色荧光的蛋白的质粒；
⑦PCR鉴定完毕无误之后，挑选该单菌落接种于含有卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃培养12～16h。
2)电纺纤维膜固定化细胞的制备：
将分子量为10万的聚乙烯醇颗粒和嵌段共聚物F108溶于超纯水中，85℃下加热搅拌至澄清，其中聚乙烯醇的质量分数为6％，嵌段共聚物F108的质量分数为0.3％；待此溶液冷却后，向5mL聚乙烯醇/嵌段共聚物的水溶液中加400μL培养好的大肠杆菌，搅拌均匀后，将此混合溶液注入带有针头的5mL玻璃注射器，将注射器固定在注射泵上，纺丝电压调节至13.2kV，针头到接收板的距离设定为9cm，控制纺丝流速为0.2mL/h，纺丝时间3h，即得到所述静电纺丝固定化细胞。
3)利用电纺纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性：
将制备的固定有细胞的电纺纤维膜剪成1×1cm2大小相同的碎片放入96孔酶标板中，每个孔中放入一片此纤维膜，浓度分别为0.625mg/L，1.25mg/L，2.5mg/L，5mg/L，10mg/L的2，4-二氯酚溶液与M9培养基以19∶1的比例加入放有固定化细胞的纤维膜的酶标板中，在37℃下每隔5min对其荧光强度进行测定，共测定2h。实验表明，2，4-二氯酚对大肠杆菌的IC50在30min时的浓度为2.5mg/L，最低抑制浓度为0.625mg/L。
实施例2
以浓度为0.2mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，2.5mg/L，5mg/L，10mg/L，20mg/L的五氯酚溶液来代替实施例1中的2，4-二氯酚溶液，其他条件同实施例1。实验表明，五氯酚对大肠杆菌的IC50在40min时的浓度为20mg/L。
Claims (6)
1.一种静电纺丝纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性的方法，其特征在于：包括下列三个步骤：细胞的培养、电纺纤维膜固定化细胞的制备及利用其检测水中酚类物质毒性；
1)细胞的培养：
①取一管100μL DH5a感受态细胞，加入绿色荧光蛋白质粒1μL，混合均匀，冰浴中放置30min；
②将管放到42℃水浴循环，热击90s；
③将所述管转移到冰浴中2～5min；
④向冰浴后的所述管中加入常温下700～800μL无抗性的SOB培养基，转入到摇床中，37℃下摇动1h；
⑤取已转化的感受态细胞450μL加入到50mg/L卡那霉素抗性的培养基上，等培养基全部吸收后，于37℃下培养12～16h；
⑥通过菌落PCR鉴定单菌落，确定含有能够表达绿色荧光的蛋白的质粒；
⑦PCR鉴定完毕无误之后，挑选该单菌落接种于含有卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃培养12～16h。
2)电纺纤维膜固定化细胞的制备：
将分子量为10万的聚乙烯醇颗粒和嵌段共聚物溶于超纯水中，均匀混合后加热搅拌至澄清，待此溶液冷却后，向其中加入一定量的步骤1)中培养的细胞，并将此混合溶液注入带有针头的5mL玻璃注射器，将注射器固定在注射泵上，纺丝电压调节至13.2kV，针头到接收板的距离设定为9cm，控制纺丝流速为0.2mL/h，纺丝时间3h，即得到所述电纺纤维膜固定化细胞。
3)利用电纺纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性：
将制备的固定有细胞的电纺纤维膜剪成1×1cm2大小相同的碎片放入96孔酶标板中，在对应的酶标板中以体积比为19∶1的比例加入一定浓度的酚类物质与M9培养基，在37℃下每5min对其荧光吸收进行测定，据荧光吸收的变化来确定酚类物质对细胞的毒性。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：细胞的培养中所述的细胞为大肠杆菌，且其在利用电纺纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性中大肠杆菌在孔板中的密度为1×107个/cm2。
3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：电纺纤维膜固定化细胞的制备中所述的聚乙烯醇的醇解度为98～99％，平均聚合度为2400～2500，其在水溶液中的质量分数为6％～8％。
4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：电纺纤维膜固定化细胞的制备中所述的嵌段共聚物为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚醚F108，其分子式为PEO132-PPO50-PEO132，分子量为15500克/摩尔。
5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：利用电纺纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性中培养基选用低荧光背景的M9培养基。
6.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：利用电纺纤维膜固定化细胞检测水中酚类物质毒性中所述酚类物质为2，4-二氯酚和/或五氯酚。
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