CN105829890B - 用于蛋白稳定化和储存的电纺纤维 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于在纳米纤维介质中产生关注的试剂的可溶制剂的电纺方法。在一个实施方案中，纳米纤维可结合和稳定化关注的生物试剂，例如用于在室温下长时间储存。在一个实施方案中，纤维可以连续方式产生，并快速溶解。

Description

用于蛋白稳定化和储存的电纺纤维

背景

本文公开的主题一般涉及用于生物和化学过程的材料和试剂的储存。

生物活性材料可用于各种实验室和分析环境。然而，通常，如果不处理或制备以增强其储存特征的话，这些生物活性材料可能具有相对短的保存寿命。

例如，已知用于生物试剂稳定化和储存的各种方法。这样的一种方法包括在降低的温度(例如，-20℃至8℃)下以液体形式储存蛋白。例如，某些生物试剂可在4℃或低至-20℃下保持的50%甘油溶液中储存。或者，某些生物试剂可另外冷冻储存，例如在-20℃或低于-20℃。显然，这两种储存方法均需要冷冻才能长期保持试剂的生物活性。

另外，生物试剂可以冻干形式储存，其中所述试剂通过在高真空中冷冻干燥。这些经冻干试剂可在低温或在室温下储存。然而，用于产生经冻干产物的方法可能复杂而且耗时。具体地讲，用于产生生物酶的混合物的经冻干饼、膜、珠料或球的某些此类方法可能为间歇法，这种方法无法连续产生产物。在一些方法中，经冷冻溶液脱水，这需要复杂的冷冻干燥方法。另外，在此类技术中，所需的制造公差，例如关于珠料大小，可能难以得到或保持。

概述

在一个实施方案中，本发明公开了一种生化储存介质。所述生化储存介质包含一种或多种纤维。所述一种或多种纤维具有纳米至微米直径，并且包含一种或多种生物活性组分。

在另一个实施方案中，本发明公开了使生物活性组合物稳定化的方法。所述方法包括将包含一种或多种关注的生物分子的溶液进料到挤出部件的行为。所述溶液从所述挤出部件排出。静电荷施加到所述排出溶液，同时对收集器表面施加相反电荷。由所述排出和带电荷溶液形成的一种或多种纤维收集在所述收集器表面上。这种方法可以为非间歇法。所述纤维具有以纳米至微米测量的直径。

在又一个实施方案中，本发明公开了使用经稳定化的生物活性成分的方法。所述方法包括选择一定量的电纺纤维的行为。所述电纺纤维具有约10nm和约2000nm之间的直径。所述纤维包含经稳定化的生物活性成分。所述纤维具有极高表面-体积比。所述纤维加到含水环境。所述纤维在所述含水环境中溶解成水溶液。所述水溶液用于生物反应，其中所述经稳定化的生物活性成分参与所述生物反应。

附图简述

当参考附图阅读以下详述时，本发明的这些和其它特点、方面和优点将变得更好理解，其中在全部附图中相似的字母代表相似的部件，其中：

图1描述根据本公开的方面的适用于产生生物材料的经稳定化的纤维的电纺系统的实施例；

图2为使用用于图1系统的第一组参数使用70% Ficoll® PM400的水溶液产生的经稳定化的纤维的扫描电子显微照片；

图3为使用用于图1系统的第二组参数使用70% Ficoll® PM400的水溶液产生的纳米纤维的扫描电子显微照片；并且

图4为使用用于图1系统的第三组参数使用70% Ficoll® PM400的水溶液产生的纳米纤维的扫描电子显微照片。

详述

本发明的方法涉及使用适用于产生纳米纤维的电纺方法保存生物样品和试剂(例如酶、抗体、生长因子等)，所述纳米纤维包含关注的生物试剂和任何添加的组合物或保存剂。

本文所用的生化储存介质为用于储存活性态蛋白试剂的形式。储存条件随介质的形式而变。通常，生物试剂，例如蛋白，在低温下储存，以保持试剂的稳定性和功能。或者，使用产生冻干产物的某些现有方法室温储存蛋白或其它生物试剂是可能的。室温制剂可包含关注的蛋白和一种或多种稳定因子二者。可在此类制剂中包含的蛋白稳定因子的实例包括但不限于聚蔗糖(例如，Ficoll® PM70、Ficoll® PM400(可包含70至400个聚合蔗糖单元)和由任何数目的重复蔗糖单元构成的其它聚合物)、松三糖、海藻糖、蔗糖、山梨糖醇牛血清白蛋白、聚乙二醇和聚乙烯醇的制剂。

在这样的一种常规方法中，蛋白和稳定因子的这种组合可在液氮中经历冷冻步骤，随后干燥步骤，即，冷冻干燥过程，这使制剂能够在室温下以冻干形式储存。例如，在一种常规方法中，可在间歇型方法中使酶混合物的液滴(例如，20μl液滴)滴入液氮。作为间歇加工的部分，当一定数目的液滴或体积的混合物已滴入液氮时，可随后进行过滤和真空过程，以收集该间歇法产物，例如，所需酶混合物的冻干珠料。随后，可在使用之前或使用期间使经冻干的组合物再水合。例如，可用这种方法使核酸扩增中所用的酶以即用型室温储存，这使技术人员能够根据需要向反应或自动进行所需反应的系统加入所需的酶制剂。

然而，应理解，就正进行的步骤数和类型而言，这些方法不合乎需要地复杂。另外，就生产而言，这些间歇型方法也可由于过程的耗时性质和可归因于间歇加工的其它限制而不合乎需要。

与这些方法相反且如本文讨论，可用本发明的方法保存蛋白或其它生物试剂而不需要冻干步骤，也不限于间歇加工。相反，本发明的方法利用电纺方法以产生能够包封蛋白(或其它合适的生物试剂)且使蛋白在室温下稳定化以用于储存的纳米至微米纤维形式的关注的试剂的可溶制剂。这种方法的优点包括，但不限于在放入水（例如，根据实施方案，在小于10分钟、小于1分钟、小于10秒或小于2秒中溶解）时溶解的电纺产物的高度均匀纤维直径。具体地讲，与细纤维相关的大表面积使纤维能够在缓冲剂(例如，含水缓冲剂)中很快溶解，尽管仍可在某些实施方案中利用有机溶液。在纤维内为经稳定化的蛋白(或其它生物试剂)，经稳定化的蛋白在纤维溶解时以其完整的生物活性释放。所述电纺方法也可以连续方式进行，即，不以间歇法进行，并利用主要含水溶液，与有机溶剂相反。

如本文讨论，电纺为一种用电荷从液体组合物或溶液产生极细纤维(例如，微米至纳米)的方法。由于电纺方法不需要高温，这种方法可特别适用于产生结合复合物或大分子的纤维，例如蛋白或可在生物样品或试剂中发现的其它分子。

通常，电纺用电压使部分液体介质(例如，滴或液滴)带电荷，使得产生的静电力克服与液体介质相关的表面张力，使液体介质伸出形成细流。具体地讲，超过阈点时，带静电的液体介质流从液体表面拉出。流体流在飞行中干燥，使静电荷迁移到液体流的表面。为了响应这种电荷迁移，喷射的部分可相互静电排斥(例如，在流中的弯曲或缠绕)，由于这些部分在搅打或波动运动中相互排斥使流伸长(因此为电纺的“纺丝”方面)。流的这种自我排斥和伸长可继续直到所得经干燥的纤维作为层沉积于收集器上，收集器使任何残余静电荷接地。

所得纤维的尺寸和厚度基本上均匀，且在某些实施方案中，具有纳米大小直径(例如，在约10nm和约2000nm之间的直径)，即，纳米纤维。如本文所用，由这种方法产生的具有以纳米至微米大小测量的直径的纤维称为纳米纤维。此类纤维的尺寸(包括直径)可由各种因素决定，包括设备的针规和流速(以下讨论)、接收基材或收集器的性质、所用电荷密度和流至收集器的行进距离、电场强度以及液体混合物或溶液的组成和液体混合物或溶液的性质。例如，可决定纤维尺寸的液体混合物或溶液的组合物的性质包括所包含分子的分子量、溶剂或增溶剂的存在和/或相应成分的浓度。同样，液体溶液或混合物的性质，例如粘度、表面张力、电导率和挥发性，可决定纤维尺寸。

如本文中讨论，本发明的方法包括使用电纺使生物活性分子稳定化成纳米纤维。一旦稳定化为纳米纤维，生物活性分子就可在室温下储存，例如，在50℉至90℉之间，例如70℉。例如，在一项研究中，如本文中讨论，电纺成纳米纤维的抗体在室温下保持生物活性超过30天(例如，34天)。考虑到这一点，用于本发明的电纺方法的合适生物活性分子或此类分子的混合物的实例包括但不限于：酶混合物(包括聚合酶)和抗体、糖(例如，松三糖、聚蔗糖、蔗糖、聚乙二醇、山梨糖醇等)、核苷酸或此类核苷酸的链等。另外，在某些实施方案中，液体聚合物12的成分可包括但不限于：不稳定小分子、dNTP's、rNTP's、稳定因子(例如，白蛋白、聚乙二醇、聚乙烯醇、淀粉、糖)、清洁剂、盐、二价阳离子、缓冲剂分子、引物、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、染料缀合酯、标记分子等。

考虑前面并转向图1，图1公开了适用于本发明的方法的电纺系统10的实施例。在所描述的实施例中，在可存取容器或器皿中提供一种或多种关注的生物分子(例如一种蛋白或多种蛋白)的聚合物溶液12(例如，聚合物水溶液)。可用泵14将聚合物溶液12进料到注射器16或能够以合适速率挤出或排出聚合物溶液的其它合适设备。在所描述的注射器16实施例中，聚合物溶液12可以固定速率从针18或尖端排出。

在所描述的实施例中，还提供高压(例如，5kV至50kV) DC电源22。电源22用于使聚合物溶液12在从注射器尖端18排出时带静电，并使最终将在其上沉积纳米纤维50的收集器24的表面带相反电荷。在所描述的实施例中，收集器24接地，且进一步具有可连续平移或以其它方式移动的表面，例如通过一个或多个旋转圆筒26，以促进在表面上连续收集沉积的纳米纤维50。具体地讲，在一个实施方案中，收集器24可以为基材材料30的连续送料辊，基材30可作为在上面沉积纳米纤维50且收集用于随后使用的连续沉积表面。用于纤维收集的合适基材的实例包括但不限于：亲水表面、疏水表面、两亲表面、硝化纤维素膜、纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物膜、玻璃纤维基材和/或两种或更多种以上膜的任何组合。在一些实施方案中，纤维收集在供使用的容器中，而在其它实施方案中，将纤维进一步加工成供使用的较小片。

为了响应所施加的静电力，液体聚合物12最初从注射器16的尖端18作为带电荷流28喷出。随着流28在飞行中干燥，静电荷迁移到流28的表面。在此发生时，与流28相关的电流类型(最初为欧姆电流)转变到对流电流。在此转变发生时，如上讨论，流28可响应表面电荷产生的排斥力而伸长和波动，在此流28弯曲或缠绕，随着相关液体蒸发，在流28从液体转变成固体纤维50时最终产生所需的纤维50。如本文讨论，纤维50可具有纳米尺寸，并收集在收集器24上，在此为基材材料30的连续送料辊或片。应了解，纤维30可以均匀方式沉积在收集基材30上，或者可以不均匀方式(例如，在特定位置)沉积在收集基材上，或者以周期中断沉积在纤维50的沉积层中，以使基材能够以计划间隔分离作为制备过程的部分。

基材30可周期性收集有在基材30表面上沉积的电纺纤维50(由一种或多种关注的生物分子形成)。在所描述的实施例中，可将表面上具有纤维50的基材30例如在室温下加工(例如，割、切、压等)成适用于运输和/或储存的较小纤维涂布片58(例如，方块或圆)，由虚线60指示。例如，基于纤维50的沉积厚度，可使片58分成一定大小并切割，以对应于由一种或多种关注的生物活性分子形成的纤维50的剂量或用途。或者，可从基材30去除纤维50，用于包装或与基材30分开储存。例如，可在沉积后从全部或部分基材30去除纤维50。然后，可将去除的纤维50按质量或体积分配到大体积储存容器(例如，非反应性容器，例如玻璃瓶或罐)或单次或多次使用包装，例如泡罩或吸塑包装，在此，各泡罩对应于在给定类型的单一反应中使用的纤维50的量。

例如，由聚合酶混合物形成的足够纤维50可提供于包装或储存容器中，或可提供在基材的片58上，并且可加到或用于形成单PCR(或其它核酸扩增)操作的反应混合物。因此，在实际中，进行核酸扩增的使用者可单独将预测量量的纤维50或基材30的预切片58上的预测量量的纤维50加到水溶液或现有反应溶液。纤维50快速溶解(例如，在2秒或更少)，以结合或形成溶液，然后可与待扩增的样品结合用于所需的扩增操作。

可得益于用于生物材料的这种新储存形式(即，电纺纳米纤维)的应用包括但不限于可由此在操作过程中加入酶、抗体或其它蛋白混合物的核酸扩增操作(例如，常规、等温、基因组等)和免疫测定操作(例如，侧流测定、酶联免疫吸附测定、蛋白印迹测定等)。例如，为了室温储存，可用本文讨论的电纺方法和基于纤维储存来使适用于聚合酶链反应(PCR)系统的酶混合物稳定化。在此实施例中，电纺纤维样品可与水和DNA样品一起加到系统，以促进进行这种反应。同样，用于各种类型的测定或试验操作的合适酶或抗体混合物可电纺用于储存，并与试验试剂盒或系统结合使用，在此，电纺纤维可与水和样品组合以完成所需的测定或试验。

考虑前面，可在一系列研究中实施本发明的方法。在一项研究中，包含Ficoll®PM400(一种蛋白稳定因子)的水溶液电纺成具有均匀结构和尺寸的纳米纤维50。虽然在此实施例中描述了溶液中Ficoll® PM400的电纺，但也可在此纳米纤维50中结合其它蛋白稳定因子和/或蛋白(或本文所述其它关注分子)，从而提供适用于室温储存的新储存介质。

在本发明的实施例中，制备70% Ficoll® PM400的水溶液，并经过电纺过程，如图1中所公开。用不同电纺构造参数重复该方法，如表1中所示。

表1

其中接收距离对应于尖端18和收集器24之间的距离，电压对应于由DC电源22施加的电压，且流速对应于聚合物溶液12从注射器16通过尖端18排出的速率。

用以上设定并用70% Ficoll® PM400的水溶液作为聚合物溶液12，产生和收集纳米纤维50。转向图2-4，收集的纤维50用扫描电子显微镜以两种不同放大倍数成像。图2显示用表1的第1行中所示的设定产生的纤维50的图像。图3显示用表1的第2行中所示的设定产生的纤维50的图像。图4显示用表1的第3行中所示的设定产生的纤维50的图像。由图证明，Ficoll® PM400的所得纤维50具有小于5μm直径。

在其它研究中，用Ficoll® PM400、Ficoll® PM70、牛血清白蛋白(BSA)和Taq聚合酶的制剂形成纳米纤维。已发现，由这种制剂形成的纳米纤维在室温储存7天后保持其酶活性。

本发明的技术效果包括关注的生物组合物(包括酶混合物、抗体混合物、核酸混合物等)的电纺纤维和这种纤维的产生。在某些实施方案中，技术效果可包括为储存和/或用于标准化反应可分成一定大小的纤维涂布基材的产生。或者，在其它实施方案中，技术效果可包括未在收集基材上(例如从收集基材去除)并为储存和/或用于标准化反应提供的电纺纤维的产生。如本文中讨论的产生的电纺纤维具有基本上均匀的直径，并很快溶于水，例如，在2秒或更少。如本文中讨论的电纺纤维不以间歇法产生，而是以连续方式产生。另外，如本文中讨论的电纺纤维不用冻干法产生，例如冻干间歇法。

本书面说明用实施例公开本发明，包括最佳方式，且还使本领域的技术人员能够实施本发明，包括制造和使用任何设备或系统并进行任何结合方法。本发明的专利范围由权利要求限定，并且可包括本领域的技术人员可想到的其它实施例。这些其它实施例旨在权利要求的范围内，如果它们具有不有别于权利要求字面语言的结构元素，或者如果它们包括与权利要求字面语言无实质差异的等价结构元素。

Claims (24)

1.一种生化储存介质，所述生化储存介质包含一种或多种纤维，其中所述一种或多种纤维具有纳米至微米直径，并且包含生物活性组分，当所述一种或多种纤维溶于水溶液时，所述生物活性组分保持生物活性，其中所述纤维包含一种或多种聚蔗糖和任选包含一种或多种白蛋白，其中所述生物活性组分是Taq聚合酶。

2.权利要求1的生化储存介质，其中所述聚蔗糖是Ficoll® PM70或Ficoll® PM400。

3.权利要求1的生化储存介质，其中所述白蛋白是牛血清白蛋白。

4.权利要求1的生化储存介质，所述生化储存介质进一步包含在其上沉积一种或多种纤维的支持层。

5.权利要求4的生化储存介质，其中所述支持层包括疏水材料、亲水材料或其组合。

6.权利要求4的生化储存介质，其中所述支持层包括纤维素膜、聚烯烃膜、聚酯膜或其组合。

7.权利要求4的生化储存介质，其中所述支持层包括一种或多种硝化纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物膜、玻璃纤维基材或两种或更多种以上膜或基材的组合。

8.权利要求1的生化储存介质，其中所述一种或多种纤维具有10nm和2000nm之间的直径。

9.权利要求1的生化储存介质，其中所述一种或多种纤维在室温下稳定至少一星期。

10.权利要求1的生化储存介质，其中所述纤维对应于适用于预配置(preconfigured)反应的一定量的生物活性组分。

11.一种使生物活性组分稳定化的方法，所述方法包括：

将包含生物活性组分的溶液进料到挤出部件；

从所述挤出部件排出所述溶液；

将静电荷施加到所述排出溶液，同时对收集器表面施加相反电荷；并且

在非间歇过程中使由所述排出和带电荷溶液形成的一种或多种纤维收集在所述收集器表面上，其中所述纤维具有以纳米至微米测量的直径，

和其中当所述一种或多种纤维溶于水溶液时，所述生物活性组分保持生物活性，其中所述纤维包含一种或多种聚蔗糖和任选包含一种或多种白蛋白，其中所述生物活性组分是Taq聚合酶。

12.权利要求11的方法，其中所述聚蔗糖是Ficoll® PM70或Ficoll® PM400。

13.权利要求11的方法，其中所述白蛋白是牛血清白蛋白。

14.权利要求11的方法，其中所述收集器表面包括包含疏水材料、亲水材料或其组合的基材。

15.权利要求11的方法，其中所述收集器表面包括包含纤维素膜、聚烯烃膜、聚酯膜或其组合的基材。

16.权利要求11的方法，其中所述收集器表面包括包含一种或多种硝化纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物膜、玻璃纤维基材或两种或更多种以上膜或基材的组合的基材。

17.权利要求14-16中任一项的方法，所述方法包括：

将具有在其上沉积的收集纤维的基材加工成具有所述收集纤维的较小基材片。

18.权利要求17的方法，所述方法包括：

在室温下储存所述基材片，供以后使用。

19.权利要求11的方法，其中所述一种或多种纤维在连续过程中收集。

20.一种使用经稳定化的生物活性组分的方法，所述方法包括：

选择一定量的电纺纤维，其中所述电纺纤维具有10nm和2000nm之间的直径，且其中纤维包含经稳定化的生物活性组分；

将所述纤维加到含水环境，其中所述纤维在含水环境中溶解成水溶液；并且

将所述水溶液用于生化反应，其中所述经稳定化的生物活性组分参与所述生化反应，其中所述纤维包含一种或多种聚蔗糖和任选包含一种或多种白蛋白，其中所述生物活性组分是Taq聚合酶。

21.权利要求20的方法，其中所述生化反应为核酸扩增反应。

22.权利要求20的方法，其中所述聚蔗糖是Ficoll® PM70或Ficoll® PM400。

23.权利要求20的方法，其中所述白蛋白是牛血清白蛋白。

24.权利要求20的方法，所述方法包括：

在使用前在室温下储存所述纤维至少一星期。