CN103209991A - 用于产生自组装蛋白质的高浓缩溶液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及稳定水性蛋白质分散体,其在水相中包含至少一种分散形式的自组装蛋白质,以及至少一种用于该自组装蛋白质的特异性分散剂;用于产生这类稳定水性分散体的方法;用于用这类稳定水性分散体电纺丝自组装蛋白质的方法;用于从这类水性分散体产生纤维状表面结构或纤维的方法;这类水性分散体在涂布表面中的用途;通过电纺丝产生的材料在制备医疗器械、卫生用品和织物中的用途;以及通过本发明的电纺丝法产生的纤维状结构或纤维状表面结构。
Description
本发明涉及稳定水性蛋白质分散体,其在水相中包含至少一种分散形式的自组装蛋白质,以及至少一种用于该自组装蛋白质的特异性分散剂;用于产生这类稳定水性分散体的方法;用于使用这类稳定水性分散体电纺丝自组装蛋白质的方法;用于从这类水性分散体产生纤维片状体或纤维的方法;这类水性分散体在涂布表面中的用途;通过电纺丝产生的材料在制备医疗器械、卫生用品和织物中的用途;以及通过本发明的电纺丝法产生的纤维状或纤维片状体。
现有技术
电纺丝法是用于产生纳米纤维(nanofiber)和中间纤维(mesofiber)的优选方法。此方法例如由D.H.Reneker,H.D.Chun在Nanotechn.7(1996),第216页及之后页中描述,通常包括使聚合物熔化物或溶液在作为电极的边缘处暴露于高电场。这可以例如通过在低压力下在电场中使聚合物熔化物或溶液经与电源一极连接的套管挤出来达到。由于聚合物熔化物或溶液上产生的静电电荷,材料流将向反电极方向流动,仅在其至反电极的途中固化。取决于电极的几何形状,此方法提供纤维状无纺网(即无纺布)或有序纤维的组件。
天然起始材料(如生物聚合物或从其衍生的合成聚合物)也可通过电纺丝来加工。
一个实例是Zarkoob和Reneker(Polymer45:3973-3977,2004)所描述的通过电纺丝将蜘蛛(金纺蜘蛛(Nephila clavipes))的蜘蛛丝蛋白质从六氟-2-丙醇溶液加工为纳米纤维。Sukigara和Ko(Polymer44:5721-572,2003)描述了从甲酸溶液纺织家蚕(Bombyx mori)丝的尝试,他们改变电纺丝参数来影响纤维形态。Jin和Kaplan报道了丝或丝/聚环氧乙烷的基于水的电纺丝(Biomacromolecules3:1233-1239,2002)。
WO-A-03/060099描述了用于纺丝家蚕丝蛋白质和蜘蛛丝蛋白质的多种方法(包括电纺丝)和装置。通过转基因山羊重组产生所使用的蜘蛛丝蛋白质,从它们的乳汁回收,然后纺丝。
由昆虫蛋白质节肢弹性蛋白或分别称为R16和S16的蜘蛛丝蛋白质的重复单位构成的合成生物聚合物描述于共同受让的WO2008/155304中。微球形式的聚合物可以例如转化为凝胶状产品或加工为蛋白质膜。
可选地与药物活性物质或农业化学活性物质混合的聚合物(例如合成的生物聚合物或其他可纺丝的有机聚合物,或其相互协调的聚合混合物)的电纺丝描述于共同受让的WO2010/015709和WO2010/015419中。用有机溶剂或浓缩甲酸中的聚合物溶液作为纺丝溶液。
WO2010/015419中概括地提到R16或S16的水溶液一般可纺丝。但是,这类水溶液存在根本的问题,因为它们缺乏稳定性,尤其是在比较高的蛋白质浓度下缺乏稳定性,这导致溶液中不想要的胶凝作用或沉淀作用。
实际上,可以利用已知的离液试剂来大幅提高这类可纺丝的疏水蛋白质的溶解度。实验观察到的在10M硫氰酸胍(GdmSCN)溶液中的最高溶解度为约38%。但是,通过透析再次去除GdmSCN时,蛋白质沉淀。
发明概述
由于高度疏水的蛋白质(如R16蛋白质)例如在水中的低溶解度(最大约1%),本发明的目的是开发可纺丝系统,由此将蛋白质以比较高的浓度稳定在待纺丝的液相中。
本发明为避免蛋白质从水溶液沉淀(透析期间)的问题提供的第一解决方案包括用在其结构中同样包含疏水部分的亲水蛋白质稳定疏水蛋白质。更具体而言,实验显示,牛血清白蛋白(BSA,级分V)符合这些要求。牛血清白蛋白是在血液中执行脂肪酸和脂质的转运蛋白功能的可溶性蛋白质。BSA由607个氨基酸组成,具有约69.4kDa的分子量。无脂肪BSA(ffBSA)是BSA的具体实施方案,其中存在通过去除脂肪酸而产生的附加疏水部位。
本发明为上述问题提供的第二解决方案包括借助适宜的蛋白质片段(肽)来稳定疏水蛋白质。本发明的蛋白质片段包含亲水以及疏水的序列结构域。更具体而言,提供两个基于肽的系统:
a)借助R16蛋白质的蛋白质片段来稳定天然R16蛋白质;
b)借助BSA的蛋白质片段来稳定天然R16蛋白质。
以常规方式(例如利用80℃的NaOH溶液)实现蛋白质的各水解分裂来产生稳定蛋白质片段。
本发明为上述问题提供的第三解决方案包括借助适宜的合成有机寡聚体来稳定疏水蛋白质,该寡聚体本身是已知的化合物,且描述于例如WO2010/057654中,WO2010/057654的公开内容在此明确引用作为本文的参考。这些寡聚体同样包含亲水以及疏水的结构域,并将疏水蛋白质以提高的浓度稳定在水溶液中。
更具体而言,本发明人发现,令人惊奇地,上述全部多种解决方案都提供稳定水性蛋白质分散体,保持提高浓度的疏水蛋白质稳定足以通过电纺丝进一步加工这类分散体的时期。这首次消除了对在疏水聚合物的电纺丝中以高浓度使用有机溶剂或有机酸的需要——极大地简化了产生纳米纤维和纤维片状体的总体方法,并进一步降低了其成本。结果,按照本发明进行的方法更环保(因为它们从水溶液纺丝),纤维的产生更温和,并改善了蛋白质的稳定性。此外,该方法具有使用更小的体积的优势,因此也更易于处理。因为蛋白质溶液是浓缩的,所以可以以高流通量(即高生产力)从水溶液纺织纤维。
附图简述
图1显示本发明的R16蛋白质水解产物的质谱(Maldi-ToF)。
图2显示本发明的BSA蛋白质水解产物的质谱(Maldi-ToF)。
图3显示通过R16蛋白质溶液的电纺丝获得的纤维的电子显微照片,该溶液用BSA稳定,并为增强黏度而额外地与聚环氧乙烷聚合物(PEO)混合;图3a显示纺丝R16蛋白质、BSA和PEO的分散体的结果,对于这些成分,该分散体具有各为42.5%、42.5%和15%的固体含量;图3b显示这三种成分的混合物的结果,但固体含量分别为37%、37%和16%;图3c和d显示以0.4ml/小时(图3c)和0.5ml/小时(图3d)的纺丝速度纺丝这三种成分的混合物的结果,该混合物具有分别为34.5%、34.5%和31%的固体含量。
图4显示通过电纺丝借助R16蛋白质的肽片段稳定的R16蛋白质水性分散体获得的纤维的电子显微照片;图4a显示R16蛋白质、R16片段和PEO的混合物的纺丝,对于这些成分,该混合物具有分别为61%、0.003%和39%的固体含量;图4b显示按74%、0.004%和26%的各固体含量纺丝这三种成分的结果。
图5显示通过电纺丝用BSA肽片段稳定的R16蛋白质溶液获得的纤维的电子显微照片。图5a和b以不同的放大倍数显示相同的纤维。
图6显示通过电纺丝用本发明的式1的两亲性寡聚体稳定的R16蛋白质溶液获得的纤维的电子显微照片。
图7显示本发明的R16蛋白质对成纤维细胞的细胞增殖的体外活性。所显示的是与对照(无这类片段)相比,不同R16蛋白质片段浓度下相对细胞计数的时间依赖性变化。
发明详述
1.一般术语的定义
“两亲(性)的”描述物质既亲水又疏水的化学性质。hei//de.wikipedia.org/wikpolaren L″LERLINK″ht以及in apolarLkipedia.org/wiki/L%C3%B6sungses基于这样的事实,物质具有亲水结构域和疏水结构域二者。
“离液序列高的”用来指在水中溶解有序氢键的化学物质,例如钡盐、盐酸胍、硫氰酸盐(如硫氰酸胍)、高氯酸盐。通过断裂氢键,离液序列高的物质扰动水的结构,并导致熵的增加。在氨基酸的情况下,它们从而改善疏水效应,并对蛋白质具有变性作用,因为疏水性氨基酸的聚集正是蛋白质折叠中的驱动力。
“分散体”是几乎不溶解或化学上相互结合(如果真会发生)的两种或多种化学实体的异质混合物。相应地,水性蛋白质分散体是水性介质(分散介质)和固体蛋白质(分散相)的混合物,因此也可以称为“水性蛋白质悬液”。
“载体聚合物”将理解为意指生物聚合物和/或它们的混合物,或者一种或多种合成聚合物及一种或多种生物聚合物的混合物,其中该载体聚合物能够与待配制的一种或多种活性/有益物质进入非共价相互作用,或者能够包封或吸附(携带)颗粒活性物质(分散或结晶)。
活性或有益物质将理解为指具有亲水、亲脂或两亲特性的合成或天然的低分子量物质,其可以用于农业化学、药学、化妆品或食品和饲料工业;此外还指可以包封在本发明的纤维片状体中或可以吸附于本发明的纤维片状体的生物活性大分子,例如肽(如具有2至10个氨基酸残基的寡肽和具有超过10个(例如11至100个)氨基酸残基的多肽),以及酶和单链或双链的核酸分子(如具有2至50个核酸残基的寡核苷酸和具有超过50个核酸残基的多核苷酸)。
术语“纤维片状体”在本发明中不仅包括单个聚合纤维,还包括大量这类纤维的有序或随机的单层或多层聚集,例如纤维网或无纺布。
除非明确指出,聚合物的分子量叙述为Mn或Mw值。
2.具体实施方案
本发明更具体地提供以下实施方案:
1.稳定水性蛋白质分散体,其在水相中包含至少一种分散形式天然产生、合成产生或重组产生的自组装蛋白质,以及至少一种用于该自组装蛋白质的分散剂,其中该分散剂是选自两亲性蛋白质的聚合分散剂,或是选自两亲性肽片段和/或两亲性有机寡聚体的寡聚分散剂。
2.实施方案1的稳定水性分散体,其中该自组装蛋白质是形成微球或本身未折叠的蛋白质,更具体而言是丝蛋白质,如蜘蛛丝蛋白质,或昆虫蛋白质(如节肢弹性蛋白),或衍生自这些蛋白质中的至少一种,且具有至少约60%序列同一性(基于一种或多种起始蛋白质)的自组装类似物。
3.实施方案1或2的稳定水性分散体,其中该自组装蛋白质选自:
a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的R16蛋白质;
b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的S16蛋白质;
c)衍生自这些蛋白质且与SEQ ID NO:4或6具有至少约60%(例如约70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性的可纺丝的类似物蛋白质(例如,通过插入或附着寡聚氨基酸嵌段,如寡聚精氨酸嵌段(1-20Arg))。
4.前述实施方案中任意项的稳定水性分散体,其中该两亲性肽片段包含前体蛋白的片段。
5.前述实施方案中任意项的稳定水性分散体,其中该聚合分散剂是白蛋白,更具体而言是牛血清白蛋白(BSA)或无脂肪牛血清白蛋白(ffBSA)。
6.实施方案4的稳定水性分散体,其中该前体蛋白是白蛋白,更具体而言是牛血清白蛋白(BSA)或无脂肪牛血清白蛋白(ffBSA)。
7.实施方案4的稳定水性分散体,其中该两亲性肽片段是实施方案2或3的自组装蛋白质的肽片段。
8.实施方案1的稳定水性分散体,其中该两亲性有机寡聚体是包含醚结构单位且包含至少一个疏水性醚寡聚体嵌段(更具体而言,具有至少一个疏水侧基)和至少一个亲水性醚寡聚体嵌段(更具体而言,具有至少一个亲水侧基)的嵌段共寡聚体。更具体而言,每个嵌段同质,即由基本上相同的单体结构单位构成。
9.前述实施方案中任意项的稳定水性分散体,其包含比例在1wt%至40wt%,更具体而言,在2wt%至30wt%、3wt%至25wt%或5-20wt%(基于该稳定分散体的总重)的范围内的至少一种自组装蛋白质,可选地与0.01wt%至50wt%,更具体而言,0.05wt%至30wt%、0.08wt%至20wt%或0.1wt%至10wt%的至少一种其他配制或加工助剂一起。
10.前述实施方案中任意项的稳定水性分散体,其包含相对重量比在0.1∶1至1∶0.001、或0.2∶1至1∶0.05、或0.5∶1至1∶0.2或0.7∶1至1∶0.5的范围内的自组装蛋白质和分散剂。
11.用于产生前述实施方案中任意项的至少一种自组装蛋白质的稳定水性分散体的方法,该方法包括将自组装蛋白质溶解在含有增溶剂(离液剂)的水性介质中,并在分散剂的存在下透析或超滤得到的溶液来从自组装蛋白质去除增溶剂(离液剂)。
12.实施方案11的方法,其中将自组装蛋白质和聚合分散剂的混合物溶解在含有离液剂的水性介质中,并从自组装蛋白质去除离液剂(更具体而言,通过对不含离液剂的透析介质透析)来形成稳定分散体。
13.实施方案11的方法,其中将自组装蛋白质溶解在含有离液剂的水性介质中,并通过在去除离液剂前或去除离液剂期间加入两亲性肽片段或合成的两亲性寡聚体,从自组装蛋白质去除离液剂来形成稳定分散体。
14.实施方案11至13中任一项的方法,其中通过透析、超滤和/或沉淀来实现离液剂的去除。
15.实施方案13的方法,其中通过对含有至少一种两亲性肽片段或至少一种合成的两亲性寡聚体的透析介质(透析缓冲液)透析来实现离液剂的去除。
16.实施方案11至15中任一项的方法,其中将含有离液剂的水性介质换为缓冲水性介质。
17.实施方案16的方法,其中该缓冲介质具有约4至12,或10至12的范围内的pH,或约11.5的pH。
18.实施方案14至17中任一项的方法,其中透析体积比待透析的含有离液剂和自组装蛋白质的水性介质的体积高至少100倍,例如高200倍、300倍、500倍或1000倍。
19.用于电纺丝自组装蛋白质的方法,该方法包括电纺丝实施方案1至10中任一项的或按照实施方案11至18中任一项获得的稳定水性分散体。
20.用于产生包含至少一种自组装蛋白质的纤维片状体或纤维的方法,该方法包括电纺丝实施方案1至10中任一项的或按照实施方案11至18中任一项获得的水性分散体来形成纤维片状体。
21.实施方案19和20中任一项的方法,其中待纺丝的分散体以1wt%至40wt%,更具体而言,2wt%至30wt%、3wt%至25wt%或5-20wt%(基于稳定分散体的总重)的比例包含自组装蛋白质。
22.实施方案19至21中任一项的方法,其中该分散体在纺丝前与选自以下的至少一种其他添加剂混合:
a)黏度调节剂(means),如可溶或可分散在该分散体中的有机/合成或生物聚合物;
b)形成载体的聚合物;
c)药学添加剂、农业化学添加剂、皮肤或头发化妆品添加剂;
d)药物、创伤愈合促进剂;
e)抗微生物剂、抗菌剂或抗病毒剂。
23.实施方案1至10中任一项的稳定水性分散体的用途,用于涂布(更具体而言,喷涂或浸涂或片状涂布)表面(更具体而言,无纺布、纤维和泡沫)。
24.按照实施方案19至22中任一项获得的材料的用途,用于来自医疗领域的产品,更具体而言,用于创伤接触材料、缝线、医疗器械、植入物、组织工程。
25.按照实施方案19至22中任一项获得的材料的用途,用于制备卫生用品和织物。
26.通过实施方案20至22中任一项的方法获得的纤维或纤维片状体。
3.本发明的其他实施方案
i)自组装蛋白质
尤其有用的自组装蛋白质尤其是丝蛋白质。用于本发明的目的的丝蛋白质是下文的丝蛋白质,其包含高度重复的氨基酸序列,并以液体形式储存在动物体内,其分泌物(secretion)通过剪切或纺丝产生纤维(Craig,C.L.(1997)Evolution of arthropod silks.Annu.Rev.Entomol.42:231-67)。
尤其适宜的此类蛋白质是最初分离自蜘蛛,如分离自蜘蛛的主壶状腺的蜘蛛丝蛋白质,例如,来自十字园蛛(Araneus diadematus)主壶状腺的ADF3和ADF4(Guerette等,Science272,5258:112-5(1996))。
类似地适宜的蛋白质是衍生自天然丝蛋白质,并已用基因工程方法在原核或真核表达系统中异源产生的天然或合成的蛋白质。原核表达生物的非限制性实例是大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)等。真核表达生物的非限制性实例是酵母,如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等;丝状真菌,如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Acremonium chrysogenum等;哺乳动物细胞,如Hela细胞、COS细胞、CHO细胞等;昆虫细胞,如Sf9细胞、MEL细胞等。
基于天然丝蛋白质的重复单位的合成蛋白质也适宜。除合成的重复丝蛋白质序列外,这些蛋白质可以进一步包含一个或多个天然的非重复丝蛋白质序列(Winkler和Kaplan,J Biotechnol74:85-93(2000))。
在合成的蜘蛛丝蛋白质中,还可能将基于天然蜘蛛丝蛋白质的重复单位的合成蜘蛛丝蛋白质用于利用纺丝法配制活性剂。除合成的重复蜘蛛丝蛋白质序列外,这些蛋白质可以进一步包含一个或多个天然的非重复蜘蛛丝蛋白质序列。
在合成的蜘蛛丝蛋白质中,必须提到SEQ ID NO:2的所谓C16蛋白质(Hümmerich等,Biochemistry,43(42):13604-13612(2004)及此序列的功能等同物、功能衍生物和盐(也参见WO2007/082936)。
还优选与昆虫结构蛋白质(如节肢弹性蛋白)的序列组合的基于天然丝蛋白质的重复单位的合成蛋白质(Elvin等,2005,Nature437:999-1002)。在这些形成自丝蛋白质和节肢弹性蛋白的组合蛋白质中,尤其应提到R16和S16蛋白质。这些蛋白质具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6中所示的多肽序列(参见WO2008/155304)。
除SEQ ID NO:2、4和6中所示的多肽序列外,还尤其优选这些序列的功能等同物、功能衍生物和盐。
“功能等同物”在本文中还尤其意指突变体,其在上述氨基酸序列的至少一个序列位置中具有不同于明确提到的氨基酸的氨基酸,但其具有包装有效物质的特性。因此,“功能等同物”包含这样的突变体,其可通过一个或多个氨基酸添加、取代、缺失和/或倒位获得,且所述改变可以发生在任意序列位置,只要它们导致突变体具有本发明的特性谱。突变体和未改变的多肽之间在反应模式上定性一致时,尤其存在功能性等同性。
以上意义上的“功能等同物”还包含所述多肽的“前体”,以及该多肽的“功能衍生物”和“盐”。
“前体”是多肽的具有或不具有希望的生物学活性的天然或合成的前体。
适宜的氨基酸取代的实例从下表显而易见:
术语“盐”将理解为不仅意指本发明的蛋白质分子的羧基的盐,还意指本发明的蛋白质分子的氨基的酸加成盐。羧基的盐可以常规方式获得,且包含无机盐(例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐),以及与有机碱(例如胺,如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等)的盐。酸加成盐,例如与无机酸(如盐酸或硫酸)的盐及与有机酸(如乙酸和草酸)的盐同样形成本发明的部分主题。
同样可以利用已知的技术,在功能性氨基酸侧基上或在其N端或C端末端上制备发明的多肽的“功能衍生物”。这类衍生物包含,例如,羧酸基团的脂肪族酯、羧酸基团的酰胺,可通过与氨或与伯胺或仲胺反应获得;自由氨基的N-酰基衍生物,通过与酰基反应制备;或自由羟基的O-酰基衍生物,通过与酰基反应制备。
本发明还以“功能等同物”涵盖本文中明确公开的蛋白质/多肽的同源物。这些同源物与明确公开的氨基酸序列之一具有至少60%,例如70%、80%或85%,例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。
两个序列间的“同一性”尤其意指每种情况下整个序列长度内的残基的同一性,尤其是借助Vector NTI Suite7.1(Vector NTI Advance10.3.0,Invitrogen Corp.)(或来自Informax(美国)的软件,使用Clustal法(Higgins DG,Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequence alignmentson a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989年4月;5(2):151-1)),设置以下参数比较,计算的同一性:
多序列比对参数:
配对比对参数
ii)分散剂
尤其用聚合物或寡聚分散剂来产生稳定水性分散体。
(1)更具体而言,聚合分散剂选自球蛋白,尤其是白蛋白,更具体而言是牛血清白蛋白(BSA)及其无脂肪制剂(ffBSA),且可以就这样商购。
白蛋白具有约66000Da的摩尔质量,由584至590个氨基酸组成。由于其高比例的半胱氨酸,白蛋白具有相对高的硫含量。白蛋白是水溶性的,其对水的结合能力为约18ml/g。白蛋白的等电点为pH4.6。白蛋白是两性电解质,即,它们可以可逆地结合阴离子和阳离子二者。
(2)更具体而言,寡聚分散剂是上述天然和合成的丝蛋白质(更具体而言,R16和S16蛋白质)的两亲性肽片段;以及所述球蛋白(更具体而言,白蛋白,尤其是BSA或ffBSA)的两亲性肽片段。
此类片段可通过起始蛋白质的受控断裂获得。对于受控断裂,例如,可以称量适量蛋白质放入测试管中,并与0.2M NaOH溶液混合。牢固地密封测试管,并在水浴中加热混合物至约80℃的内部温度。剧烈搅拌这样获得的混合物。一段时间后,蛋白质开始溶解在NaOH溶液中。蛋白质一溶解,就将样品从水浴取出,并冷却和分析。可以以这种方式获得的蛋白质水解产物组成肽片段的混合物,如通过质谱分析法(例如Maldi-ToF)容易地验证,该肽片段具有从约500至5000,例如1000至3000或600至4000的范围内的分子量。
(3)更具体而言,寡聚分散剂是可按照WO2010/057654获得的包含醚结构单位且包含至少一个疏水性醚寡聚体嵌段(具体而言,具有至少一个疏水侧基)和至少一个亲水性醚寡聚体嵌段(具体而言,具有至少一个亲水侧基)的嵌段共寡聚体。更具体而言,每个嵌段具有同质结构,即,由基本上相同的单体结构单位构成。
可以用以下通式(A)来表示嵌段(block)共寡聚体的具体基团:
其中:
n和m相同或不同,且各表示从1至20,更具体而言,3至10的整数值,如4、5、6、7、8或9;
嵌段1和2不同,且嵌段1和2之一具有亲水侧基,而另一嵌段具有疏水侧基;
R1表示H或直链或支链C1-C6烷基、芳基或直链或支链C1-C6烷基芳基,其中芳基可选地取代,更具体而言,表示直链或支链C1-C4烷基或直链或支链C1-C4烷基苯基;
侧基R2和R3不同,且选自疏水基团,更具体而言,直链或支链C1-C6烷基、芳基或直链或支链C1-C6烷基芳基;或选自H和亲水基团,如-(CH2)p-COOH、-(CH2)p--COO-X+,其中X+表示H+或金属阳离子,如碱金属阳离子,更具体而言,Na+或K+,且p表示整数值,如1、2或3;
但在嵌段1和2内,侧基R2和R3分别相同,或在嵌段1和/或2内,侧基R2和/或R3可以分别不同,且分别在亲水或疏水嵌段内形成至少两个不同的亲水或疏水小嵌段,其中每个嵌段具有至少2至5个相同的侧基;且
R4表示H或C1-C6烷基,更具体而言,H。
C1-C6烷基表示例如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1,1-二甲基乙基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基。
更具体而言,芳基表示萘基或苯基。
更具体而言,C1-C6烷基芳基表示以上C1-C6烷基(更具体而言,未分支的C1-C6烷基)的芳基(更具体而言,苯基)取代的类似物。
更具体而言,芳基取代基是上文定义的C1-C4烷基。
作为这类寡聚体的优选实例,可以提到以下式(1)至(5)的化合物:
iii)增黏剂
为了更好地在电纺丝中加工本发明的稳定水性蛋白质分散体,将增黏剂与此分散体混合可以是有利的。
基本上,水性介质中的稳定蛋白质溶液/分散体可以与本领域技术人员已知用于以上目的的任意水溶性聚合物混合。更具体而言,适宜的聚合物是:聚乙烯醇、聚乙烯甲酰胺、聚乙烯胺、聚羧酸(聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸)、聚丙烯酰胺、聚衣康酸、聚(丙烯酸-2-羟乙基酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚甲基丙烯酰胺、聚环氧烷(例如聚环氧乙烷);聚-N-乙烯吡咯烷酮;羟甲基纤维素;羟乙基纤维素;羟丙基纤维素;羧甲基纤维素;藻酸盐;胶原;明胶、聚(吖丙啶)、聚苯乙烯磺酸;两种或多种前述聚合物的组合;包含一种或多种形成前述聚合物的单体单位的共聚物、包含一种或多种形成前述聚合物的单体单位的接枝共聚物。
在本发明的一个具体实施方案中,该水溶性聚合物选自聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚乙烯甲酰胺、聚乙烯胺和聚-N-乙烯吡咯烷酮。
此处所用聚合物的摩尔质量可以在大范围内变动,例如在500至2000000或1000至1000000或10000至500000的范围内。
前述水溶性聚合物可商购和/或可通过本领域技术人员已知的方法获得。
在本发明的另一实施方案中,待用于本发明的方法的蛋白质溶液或分散体包含基于该溶液/分散体的总固体的0.01wt%至40wt%,如0.5wt%至20wt%或2wt%至15wt%的至少一种上文定义的水溶性聚合物。
存在于溶液或分散体中的蛋白质与水溶性聚合物的重量比取决于所使用的聚合物。例如,可以以约300∶1至约1∶5,例如约100∶1至约1∶2或约20∶1至约1∶1的范围内的重量比使用蛋白质和水溶性聚合物。
iv)形成载体的聚合物
适宜的合成聚合物例如选自芳香族乙烯化合物的同聚物和共聚物、丙烯酸酐的同聚物和共聚物、甲基丙烯酸烷基酯的同聚物和共聚物、α-烯烃的同聚物和共聚物、脂肪族二烯的同聚物和共聚物、乙烯基卤化物的同聚物和共聚物、乙烯基乙酸酯的同聚物和共聚物、丙烯腈的同聚物和共聚物、氨基甲酸乙酯的同聚物和共聚物、乙烯基酰胺的同聚物和共聚物及由两种或多种形成前述聚合物的单体单位构成的共聚物。
更具体而言,有用的载体聚合物包括基于以下单体的聚合物:
丙烯酰胺、己二酸、甲基丙烯酸烯丙酯、α-甲基苯乙烯、丁二烯、丁二醇、丁二醇二甲基丙烯酸酯、丁二醇二乙烯基醚、丁二醇二甲基丙烯酸酯、丁二醇单丙烯酸酯、丁二醇单甲基丙烯酸酯、丁二醇单乙烯基醚、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸丁酯、环己基乙烯基醚、二甘醇二乙烯基醚、二甘醇单乙烯基醚、丙烯酸乙酯、乙基二甘醇丙烯酸酯(ethyldiglycol acrylate)、乙烯、乙二醇丁基乙烯基醚、乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙二醇二乙烯基醚、丙烯酸乙基己酯、甲基丙烯酸乙基己酯、甲基丙烯酸乙酯、乙基乙烯基醚、甲基丙烯酸缩水甘油酯、己二醇二乙烯基醚、己二醇单乙烯基醚、异丁烯、丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、异戊二烯、异丙基丙烯酰胺、丙烯酸甲酯、亚甲双丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯、甲基乙烯基醚、正丁基乙烯基醚、N-甲基-N-乙烯基乙酰胺、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基咪唑、N-乙烯基哌啶酮、N-乙烯基吡咯烷酮、十八烷基乙烯基醚、丙烯酸苯氧乙酯、聚四氢呋喃2二乙烯基醚、丙烯、苯乙烯、对苯二甲酸、叔丁基丙烯酰胺、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、四乙二醇二乙烯基醚、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二乙烯基醚、三乙二醇二乙烯基甲基醚、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三乙烯基醚、乙烯基2-乙基己基醚、乙烯基4-苯甲酸叔丁酯、乙酸乙烯酯、氯乙烯、乙烯基十二醚、偏二氯乙烯、乙烯基异丁醚、乙烯基异丙醚、乙烯基丙醚和乙烯基叔丁醚。
术语“合成聚合物”包括同聚物和共聚物二者。作为共聚物(不仅有随机系统,还有交替系统),可能是嵌段共聚物或接枝共聚物。术语共聚物包括从两种或多种不同单体构成的聚合物,或者可以以多种方式实现将至少一个单体掺入聚合物链的聚合物,如,例如立构嵌段共聚物的情况。
还可能使用同聚物和共聚物的混合物。同聚物和共聚物可以彼此溶混或不溶混。
优选提到以下聚合物:
聚乙烯醚,如,例如聚苄氧基乙烯、聚乙烯醇缩乙醛;聚乙烯酯,如,例如聚乙酸乙烯酯、聚氧四亚甲基二醇;聚酰胺;聚碳酸酯;聚酯;聚硅氧烷;聚氨基甲酸酯;聚丙烯酰胺,例如聚(N-异丙基丙烯酰胺);聚甲基丙烯酰胺;聚羟基丁酸酯;聚乙烯醇;乙酰化聚乙烯醇;聚乙烯甲酰胺;聚乙烯胺;聚羧酸(聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸);聚丙烯酰胺;聚衣康酸;聚(丙烯酸-2-羟乙酯);聚(N-异丙基丙烯酰胺);聚磺酸(聚(2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸)或PAMPS);聚甲基丙烯酰胺;聚环氧烷,例如聚环氧乙烷;聚-N-乙烯吡咯烷酮;马来酸;聚(吖丙啶);聚苯乙烯磺酸;聚丙烯酸酯,例如聚丙烯酸苯氧基乙酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯、聚丙烯酸十二酯、poly(ibornyl acrylate)、聚(丙烯酸正丁酯)、聚(丙烯酸叔丁酯)、聚丙烯酸环己酯、聚(丙烯酸-2-乙基己酯)、聚丙烯酸羟基丙酯;聚甲基丙烯酸酯,例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚(甲基丙烯酸正戊酯)、聚(甲基丙烯酸正丁酯)、聚甲基丙烯酸乙酯、聚(甲基丙烯酸羟基丙酯)、聚甲基丙烯酸环己酯、聚(甲基丙烯酸-2-乙基己酯)、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚(甲基丙烯酸叔丁酯)、聚甲基丙烯酸苄酯、poly(ibornyl methacrylate)、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚甲基丙烯酸十八酯;聚苯乙烯;以及基于苯乙烯的共聚物,例如与马来酸酐的共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物、N-乙烯吡咯烷酮共聚物、聚己酸内酯、聚己内酰胺、聚(N-乙烯己内酰胺)。
聚-N-乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸-苯乙烯共聚物、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚酰胺和聚酯尤其适宜。
还可能使用合成的生物可降解聚合物。
引述“生物可降解聚合物”将包括符合DIN V54900中给出的生物可降解性定义的所有聚合物,更具体而言,可堆肥的聚酯。
生物可降解性的一般含义是聚合物(如,例如聚酯)在适当和可验证的间隔内分解。可以通过水解和/或氧化且主要通过微生物(如细菌、酵母、真菌和藻类)的作用来实现降解。可以通过例如将聚酯与堆肥混合并保存一定的时间来定量生物可降解性。根据ASTM D5338、ASTM D6400和DIN V54900,无CO2的空气在堆肥期间流经成熟的堆肥,且成熟的堆肥经历确定的温度程序。在此通过样品释放的净CO2(减去无样品的堆肥所释放的CO2之后)与样品可释放的最大CO2量(从样品的碳含量计算)之比(作为百分比生物降解度)来定义生物可降解性。堆肥仅几天之后,生物可降解聚酯通常显示明显的降解迹象,如真菌生长、开裂和成孔。生物可降解聚合物的实例是生物可降解聚酯,如,例如聚交酯、聚己酸内酯、polyalkylene adipate terephthalates、聚羟基链烷酸酯(聚羟基丁酸酯)和聚交酯糖苷。尤其优选生物可降解的polyalkylene adipate terephthalates,优选polybutylene adipate terephthalates。适宜的polyalkylene adipateterephthalates描述于例如DE4440858中(且可商购,例如,来自BASF的)。
v)活性剂
按照本发明产生的稳定蛋白质分散体还可以用来产生包含活性剂或有益剂的纤维,或包含这类纤维的片状体,如薄膜或纤维状无纺布网。
这类包含活性剂或有益剂的制剂的产生更具体地描述于共同受让的WO2010/015419中,该专利在此明确引用作为本文的参考。
可能适宜的活性剂或有益剂种类的详细列表及其代表性实例的非限制性列表同样描述于WO2010/015419中。
基本上可以配制亲水剂及疏水剂。可配制的物质种类的实例是:蛋白质、肽、核酸、单糖、二糖、寡糖和多糖、蛋白聚糖、脂质、低分子量的合成或天然有机物或无机物或化学元素,例如银。
更具体而言,这类制剂用于化妆品、人用药和兽药,但还用于作物保护领域。
可配制的物质种类的具体的非限制性实例是:
用于化妆品或药物领域的染料、脂肪酸、类胡萝卜素、类视黄醇、维生素、维生素原、抗氧化剂、硫辛酸、UV遮光滤色片、过氧化物分解剂;及其衍生物和前体。
用于治疗或诊断目的的活性药物成分,例如抗刺激剂、抗炎剂、血管活性剂、感染抑制剂、麻醉剂、生长促进剂;及其衍生物和前体。
创伤愈合促进剂;及对创伤愈合具有积极作用的活性剂;
抗微生物、抗细菌或抗病毒活性剂;
抗体、酶、肽、核酸、生长因子。
作物保护活性剂,例如,具有除草、杀虫和/或杀真菌作用的那些。
现将参考以下非限制性说明性实施方案来更具体地描述本发明。
实验部分:
一般方法:
1.电纺丝
借助基于喷嘴的电纺丝系统(来自Gimpel Ingenieur-GesellschaftmbH www.gimpel.de)来纺丝蛋白质溶液。所用高压电源是来自Eltex的发电机,0-30kV、DC neg的KNH34/N2A型。在低压力下通过与电源一极连接的套管将蛋白质溶液挤入电场中。由于电场引起的蛋白质溶液上的静电电荷,材料流在反电极的方向流动,仅在其至反电极的途中固化,并以薄纤维的形式沉积。
使用以下参数设置:
相对空气湿度:27%,
纺丝温度:23℃,
电压:20kV,
电极距离:15-20cm,
套管直径:0.8或0.9mm,
泵速:0.2-0.5ml/小时。
所述说明性实施方案还可以应用于基于滚柱的电纺丝系统。
2.层析-质谱分析法
肽的MALDI-ToF测量
基质:α-氰基-4-羟基肉桂酸(CCA)
芥子酸(SA)
两种基质作为溶解在TA中的饱和溶液(20mg/ml)使用。
TA溶液的组成
物质 | 体积 |
乙腈 | 3.33ml |
H2O | 6.66ml |
三氟乙酸 | 10μl |
制备方法不仅有“覆盖法”,也有“混合法”。在“混合法”中,将溶解在缓冲液中的样品与基质1∶10混合,并将确定的体积应用于靶标。“混合法”中的稀释因子为10,而“覆盖法”中的稀释为1∶1。
借助固相萃取来降低样品的高盐含量。使用来自Applied Biosystems的具有C18涂层的Zip-Tip移液器吸头。用含0.1%三氟乙酸的纯乙腈和含0.1%TFA的1∶1乙腈/水洗涤Zip-Tip。然后用含0.1%TFA的水双平衡。将样品溶解在10μl0.1%TFA溶液中,并通过Zip-Tip反复吹吸来使肽结合树脂。然后,用含0.1%TFA和5%甲醇的水溶液洗涤吸头三次。用1.8μl基质溶液(基质溶解在0.1%TFA50%乙腈中)从Zip-Tip洗脱样品成分,并直接吸至MALDI-ToF-MS靶标上。
3.细胞增殖测试
用成纤维细胞(HDFn,Invitrogen,No.C0045C)进行体外测试。
按以下步骤进行测试:
-6孔板中15000细胞/孔接种于培养基(含10%FCS和1%青霉素/链霉素的低葡萄糖DMEM)中;
-4小时后(细胞已全部在此期间生长),将培养基换为加入了不同浓度的蛋白质片段(制备见下文)的培养基;1ml/孔;
-在培养箱中37℃和5%CO2孵育24小时后,加入Alamarblue(来自Invitrogen,订购号DAL1100;每毫升培养基100μl;对应于1∶10的稀释),并在培养箱中再孵育2小时;
-每孔转移2×100μl上清(=双测定)至具有F底的96孔板中,并在Optima荧光阅读器上在544nm测量;
-在多种测量时间重复测量,并利用Excel程序评价。
用于增殖测试的蛋白质片段的制备:
称量300mg R16蛋白质(或其他蛋白质)放入测试管中,并与9ml0.2M NaOH溶液混合。牢固地密封测试管。加热测试管中的混合物至约80℃的内部温度。此处的水浴温度应为至少85℃。剧烈搅拌混合物。一段时间后,蛋白质溶解形成透明溶液(颜色变化)。蛋白质一溶解,就将样品从水浴取出,并冷却。然后,不得将样品暴露于任意进一步的热处理,因为片段可以进一步分裂,且在某些情况下可以发生完全分裂。
冷却后,对蒸馏水(5L)透析样品。用具有1000Da分子量截留的再生纤维素透析膜(Carl-Roth,订购号1967.1)进行透析。透析过程中,换水三次。
然后,将样品转入塑料Petri皿(预先测定重量),并在37℃彻底干燥。测定重量后,可以用样品进行细胞测试。
参考实施例1:R16和S16蜘蛛丝蛋白质的产生
分别用R16和S16蛋白质微球产生可纺丝的R16和S16溶液。这些可以按WO2008/155304中所述制备。
参考实施例2:合成的两亲性寡聚分散剂的制备
(1)寡聚体P(苯基缩水甘油醚)-嵌段-P(羧甲基缩水甘油醚)-(3,3)的制备
式1的称为P(苯基缩水甘油醚)-嵌段-P(羧甲基缩水甘油醚)-(3,3)的两亲性寡聚体:
在其结构中具有三个非极性苯基醚基团和三个极性羧基,其可以通过溶液的pH变化变得带电。
使用常规Schlenk技术,且在缺乏氧/空气的情况下进行所有合成。
a)乙氧基乙基缩水甘油醚(EEGE)单体的合成
首先,将80g(1.08mol)缩水甘油和400mL乙基乙烯基醚与2g对-甲苯磺酸(p-TsOH)在冰浴中混合,使得温度不升至室温以上。随后搅拌该批次3小时。反应时间期满后,用碳酸氢钠洗涤溶液三次,并在硫酸钠上干燥。滤去干燥剂,并在真空中去除溶剂。真空蒸馏(油浴温度不高于70℃)残留物(约250mL EEGE),并保存在氢化钙上。随后缩合。
b)第一寡聚中间体的合成
将20.13ml(0.148mol)引发剂3-苯基丙-1-醇溶解在50ml含有14.8ml(0.148mol)10M叔丁醇钾的二甘醇二甲醚中。真空中40℃加热溶液半小时来去除叔丁醇。然后,向引发剂溶液中加入100ml(0.739mol)之前纯化的PGE(缩合并在CaH2上干燥),并在120℃过夜搅拌。次日,向溶液中加入98ml(0.739mol)EEGE,并在120℃搅拌加热混合物3小时。在真空中去除二甘醇二甲醚,留下金棕色蜂蜜样液体。
c)脱保护寡聚中间体
将金棕色蜂蜜样液体溶解在THF中,与93ml浓HCl(37%)混合,并搅拌1小时。然后,用NaHCO3中和溶液。形成微棕色沉淀,将其滤去。过夜,沉淀进一步沉下。离心,直至从溶液去除所有固体。然后,在真空中去除THF,留下116.28g(0.11mol)棕色透明的油。
d)寡聚中间体的乙酰化
将棕色油溶解在DMF中,并与16.2g(0.45mol)NaH(用戊烷洗涤)过夜搅拌。在该过程中,溶液变为深棕色。然后,加入78.8g(0.45mol)氯乙酸钠(NaTa),并在60℃过夜搅拌该批次。在真空中去除DMF,并将残留物溶解在蒸馏水中。用半浓缩的HCl沉下产物(浅棕色沉淀),分离,然后重新溶解在NaOH中,获得127g(0.127mol)式1的P(苯基缩水甘油醚)-嵌段-P(羧甲基缩水甘油醚)-(3,3),其对应于52%的理论产率。
溶解在NaOH溶液中得到钠盐,而不是酸功能。
产物作为钠盐在溶液中保持稳定几个月。也可以在使用前在37℃干燥溶液,并作为固体物质保存。
(2)其他寡聚体的制备
重复以上合成方法,但改变引发剂、单体成分的摩尔分数和/或脱保护和乙酰化的程度,可能制备例如式2至5的其他两亲性寡聚体
实施例1:用BSA稳定R16蜘蛛丝蛋白质溶液并纺丝经稳定的产物
1.1.制备稳定溶液
称量无脂肪BSA(ffBSA)(Carl Roth GmbH&Co.KG,Karlsruhe)和R16蛋白质,转入扣盖管(snap top vial),并借助硫氰酸胍溶液(6M)溶解。140mg R16蛋白质和140mg ffBSA的混合物可以溶解在2ml6M硫氰酸胍中。表1中显示用于多种批次的R16和ffBSA的量。
室温(约20-25℃)下过夜(至少12小时)搅拌溶液。然后,对10mMNaHCO3缓冲液(pH约10.5)透析得到的ffBSA/R16溶液。透析发生在具有约12400分子量截留的透析管(Sigma-Aldrich,目录号D9777-100FT,纤维素膜)中。NaHCO3缓冲液的体积至少是样品体积的100倍。透析过程中,更换缓冲液至少一次,以便可以尽可能多地去除GdmSCN。
测定各溶液在透析过程中的稳定时间,并同样在下文表2中报道。稳定性意指透析过程中未在具体溶液中观察到胶凝作用。
1.2.纺丝经稳定的溶液
为了测试经稳定的溶液的可纺丝性,将0.5ml样品与不同量的PEO聚合物(聚环氧乙烷,Mw=900000;Sigma-Aldrich,目录号189456-250g)纺丝。加入多种量的PEO(溶解在水中),混合,并在上文报道的条件下在实验室电纺丝系统中纺丝。
纺丝以下溶液,例如:
表1
a)R16和ffBSA各为7%(批号2,表2)
b)按0.4ml/小时纺丝
c)按0.5ml/小时纺丝
图3a至d中显示电子显微照片。
1.3.结果
表2
a)质量/体积(m/v)
据测定,用ffBSA/R16的1∶1混合物可以达到最佳结果。
实施例2:借助R16蛋白质的肽片段稳定R16蜘蛛丝蛋白质并纺丝经稳定的产物
2.1.制备R16蛋白质:
称量R16蛋白质,转入扣盖管,并借助硫氰酸胍溶液(6M)溶解。
2.2.制备R16肽片段:
称量45mg R16蛋白质放入测试管,加入2ml0.2M NaOH溶液。牢固地密封测试管,在水浴中加热混合物至约80℃的内部温度(水浴的温度应为至少85℃)。剧烈搅拌得到的混合物(约1000转/分钟)。一段时间(约10分钟)后,蛋白质开始溶解在NaOH溶液中。蛋白质一溶解,就将样品从水浴取出,并冷却。然后,样品可以不再暴露于增强的热处理,因为片段可以因此而进一步分裂,且可以发生完全分裂。未分裂的R16蛋白质在溶液中非常清晰可见。分裂过程中,它开始溶解,因为片段易溶于水。蛋白质一不再可见,就终止分裂,以便可以避免完全水解。
如附图1所说明,以这种方式制备的R16蛋白质水解产物组成具有约1000至3000范围内的分子量的肽片段的混合物。它显示典型产生的R16蛋白质水解产物的质谱(Maldi-ToF)。
2.3.制备透析浴
冷却后,用注射器将水解产物转入透析浴(NaHCO3缓冲液)(10mm,1.5l)。透析浴的pH必须设为约10-11(NaOH,固体物质)。多种批次中的每一个所用的R16肽的量在下文表3中列出。
2.4.进行透析
然后,将具有不同R16蛋白质含量(参见表3)的R16样品(按2.1制备)对包含R16水解产物的NaHCO3透析缓冲液(pH约10.5)透析。为此,将样品转入透析管(Sigma-Aldrich,目录号D9777-100FT,纤维素膜;分子量截留极限约12400)。NaHCO3缓冲液的体积(例如,1.5升)应为样品体积的至少100倍。
测定各溶液在透析过程中的稳定时间,并同样在下文表3中报道。稳定性意指透析过程中未在具体溶液中观察到胶凝作用。
表3
a)每种情况下样品体积为2ml
b)透析后样品中的终浓度
2.5.纺丝经稳定的溶液
为了测试R16片段稳定的溶液的可纺丝性,将0.5ml样品与不同量的PEO聚合物(聚环氧乙烷,Mw=900000;Sigma-Aldrich,目录号189456-250g)纺丝。加入多种量的PEO(溶解在水中),混合,并在上文报道的条件下在实验室电纺丝系统中纺丝。
纺丝以下溶液,例如:
表4
a)括号中为R16的%
b)按0.4ml/小时纺丝
c)按20cm、15kV、0.3ml/小时纺丝
实施例3:借助BSA的肽片段稳定R16蜘蛛丝蛋白质并纺丝经稳定的产物
3.1.制备R16蛋白质:
称量R16蛋白质,转入扣盖管,并借助硫氰酸胍溶液(6M)溶解。
3.2.制备BSA肽片段:
称量45mg BSA蛋白质放入测试管,加入2ml0.2M NaOH溶液。牢固地密封测试管。测试管中的混合物在室温下溶解,然后加热至约80℃的内部温度。水浴的温度应为至少85℃。必须剧烈搅拌混合物(约1000转/分钟)。一分钟后,蛋白质开始在NaOH溶液中分裂,形成黄色溶液。蛋白质一分裂,就将样品从水浴取出,并冷却。然后,样品可以不再暴露于增强的热处理,因为片段可以因此而进一步分裂,且可以发生完全分裂。
如附图2所说明,以这种方式制备的BSA蛋白质水解产物组成具有约600至4000范围内的分子量的肽片段的混合物。它显示典型产生的BSA蛋白质水解产物的质谱。
3.3.制备透析浴:
冷却后,用注射器将样品转入透析浴(NaHCO3缓冲液)(10mm,1.5l)。透析浴的pH必须设为(用NaOH)约10-11。BSA肽浓度为约0.003-0.004%。
3.4.进行透析:
然后,透析具有不同R16蛋白质含量、以不同量包含BSA水解产物的R16样品(按2.1制备)。透析发生在具有约12400的分子量截留极限的透析管(Sigma-Aldrich,见上文)中。NaHCO3缓冲液的体积应为样品体积的至少100倍(例如,2ml蛋白质溶液在1.5l透析浴中)。
测定各溶液在透析过程中的稳定时间,并在表5中报道。稳定性意指透析过程中未在所研究的溶液中观察到胶凝作用。
表5
a)每种情况下样品体积为2ml
b)透析后样品中的终浓度
3.5.纺丝经稳定的溶液
为了测试BSA片段稳定的溶液的可纺丝性,将2ml样品与不同量的PEO聚合物(聚环氧乙烷,Mw=900000;Sigma-Aldrich,目录号189456-250g)纺丝。加入多种量的PEO(PEO作为固体加入,见表6),混合,并在上文报道的条件下在实验室电纺丝系统中纺丝。
纺丝以下溶液,例如:
表6
a)按20kV、15cm、0.2ml/小时纺丝
实施例4:借助合成的两亲性寡聚体稳定R16蜘蛛丝蛋白质并纺丝经稳定的产物
所使用的稳定剂是按照参考实施例2(1)制备的P(苯基缩水甘油醚)-嵌段-P(羧甲基缩水甘油醚)-(3,3)。
之前溶解在NaOH溶液中的寡聚体(其以钠盐的形式在溶液中保持稳定几个月)可以作为溶液或作为固体(在37℃干燥)使用。
4.1.制备R16蛋白质:
为了稳定R16,尤其将该物质作为固体使用。将R16蛋白质溶解在6M硫氰酸胍溶液中。称量寡聚体固体,并直接溶解在R16溶液中。过夜缓慢搅拌溶液。在此时间内,寡聚体加至蛋白质上。多种批次的适当的定量数据总结在下文表7中。
4.2.进行透析:
次日,进行透析来去除硫氰酸胍。待透析的溶液的体积为3ml(包含磁力搅拌子,且在透析过程中搅拌)。透析溶液(10mM NaHCO3缓冲液,用NaOH调节pH=12)的体积为1.5l。透析过夜进行(12小时)。
测定各溶液在透析过程中的稳定时间,并在下文表7中报道。稳定性意指透析过程中未在所研究的溶液中观察到胶凝作用。
表7
a)括号中为每种情况下的样品体积
b)透析后样品中的终浓度
4.3.纺丝经稳定的溶液
为了测试寡聚体稳定的溶液的可纺丝性,将0.5ml样品与PEO聚合物(聚环氧乙烷,Mw=900000;Sigma-Aldrich,目录号189456-250g)纺丝。加入PEO(作为固体加入),混合,并在上文报道的条件下在实验室电纺丝系统中纺丝。
纺丝以下溶液,例如:
表8
a)按20kV、15cm、0.2ml/小时纺丝
实施例5:测定本发明的纤维片状体的创伤愈合促进剂特性
通过上述细胞增殖测试来测定按照本发明产生的纤维(按实施例2制备;用R16肽稳定R16)的创伤愈合促进剂作用。
实验结果总结在附图7中。在8天的时期内观察到细胞计数增加。加入R16蛋白质片段导致细胞计数的额外增加(最佳浓度为0.06mg/ml)。
本文提到的印刷出版物(更具体而言,WO2010/057654)的公开内容在此明确引用作为参考。
Claims (26)
1.稳定水性蛋白质分散体,其在水相中包含至少一种分散形式的自组装蛋白质和至少一种用于所述自组装蛋白质的分散剂,其中所述分散剂是选自两亲性蛋白质的聚合分散剂,或是选自两亲性肽片段和两亲性有机寡聚体的寡聚分散剂。
2.权利要求1的稳定水性分散体,其中所述自组装蛋白质是形成微球的蛋白质或本身未折叠的蛋白质,更具体而言是丝蛋白质,如蜘蛛丝蛋白质或昆虫蛋白质,或衍生自这些蛋白质中的至少一种,且具有至少约60%序列同一性的自组装类似物。
3.权利要求1或2的稳定水性分散体,其中所述自组装蛋白质选自:
a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的R16蛋白质;
b)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的S16蛋白质;
c)衍生自这些蛋白质,且与SEQ ID NO:4或6具有至少约60%序列同一性的可纺丝的类似物蛋白质。
4.前述权利要求中任一项的稳定水性分散体,其中所述两亲性肽片段包含前体蛋白的片段。
5.前述权利要求中任一项的稳定水性分散体,其中所述聚合分散剂是白蛋白,更具体而言是牛血清白蛋白(BSA)或无脂肪牛血清白蛋白(ffBSA)。
6.权利要求4的稳定水性分散体,其中所述前体蛋白是白蛋白,更具体而言是牛血清白蛋白(BSA)或无脂肪牛血清白蛋白(ffBSA)。
7.权利要求4的稳定水性分散体,其中所述两亲性肽片段是权利要求2或3的自组装蛋白质的肽片段。
8.权利要求1的稳定水性分散体,其中所述两亲性有机寡聚体是包含醚结构单位,且包含至少一个疏水性醚寡聚体嵌段(具有疏水侧基)和至少一个亲水性醚寡聚体嵌段(具有亲水侧基)的嵌段共寡聚体。
9.前述权利要求中任一项的稳定水性分散体,其包含基于所述稳定分散体的总重的比例在1wt%至40wt%,优选5-20wt%的范围内的至少一种自组装蛋白质,可选地包含0.01wt%至50wt%,优选0.1wt%至10wt%的至少一种其他配制助剂或加工助剂。
10.前述权利要求中任一项的稳定水性分散体,其包含相对重量比在0.1∶1至1∶0.001的范围内的自组装蛋白质和分散剂。
11.用于产生前述权利要求中任一项的至少一种自组装蛋白质的稳定水性分散体的方法,所述方法包括将自组装蛋白质溶解在含有增溶剂(离液剂)的水性介质中,并在分散剂的存在下透析或超滤得到的溶液来从所述自组装蛋白质去除所述增溶剂(离液剂)。
12.权利要求11的方法,其中将自组装蛋白质和聚合分散剂的混合物溶解在含有离液剂的水性介质中,并从所述自组装蛋白质去除所述离液剂来形成所述稳定分散体,更具体而言,通过对不含离液剂的透析介质透析来去除所述离液剂,形成所述稳定分散体。
13.权利要求11的方法,其中将自组装蛋白质溶解在含有离液剂的水性介质中,并通过在去除所述离液剂前或去除所述离液剂期间加入两亲性肽片段或合成的两亲性寡聚体,从所述自组装蛋白质去除所述离液剂来形成所述稳定分散体。
14.权利要求11至13中任一项的方法,其中通过透析、超滤或沉淀来实现所述离液剂的去除。
15.权利要求13的方法,其中通过对含有至少一种两亲性肽片段或至少一种合成的两亲性寡聚体的透析介质(透析缓冲液)透析来实现所述离液剂的去除。
16.权利要求11至15中任一项的方法,其中将所述含有离液剂的水性介质换为缓冲水性介质。
17.权利要求16的方法,其中所述缓冲介质具有约10至12的范围内的pH。
18.权利要求14至17中任一项的方法,其中透析体积比待透析的含有离液剂和自组装蛋白质的水性介质的体积高至少100倍。
19.用于电纺丝自组装蛋白质的方法,所述方法包括电纺丝权利要求1至10中任一项的稳定水性分散体或按照权利要求11至18中任一项获得的稳定水性分散体。
20.用于产生包含至少一种自组装蛋白质的纤维片状体或纤维的方法,所述方法包括电纺丝权利要求1至10中任一项的水性分散体或按照权利要求11至18中任一项获得的水性分散体来形成纤维片状体。
21.权利要求19或20的方法,其中待纺丝的分散体以基于所述稳定分散体的总重的1wt%至40wt%,优选5-20wt%的比例包含自组装蛋白质。
22.权利要求19至21中任一项的方法,其中所述分散体在纺丝前与选自以下的至少一种其他添加剂混合:
a)黏度调节剂,如可溶或可分散在所述分散体中的有机聚合物/合成聚合物或生物聚合物;
b)形成载体的聚合物;
c)药学添加剂、农业化学添加剂、皮肤或头发化妆品添加剂。
23.权利要求1至10中任一项的稳定水性分散体的用途,用于涂布表面,更具体而言,用于涂布无纺布、纤维和泡沫,所述涂布更具体而言是喷涂或浸涂。
24.按照权利要求19至22中任一项获得的材料的用途,用于来自医疗领域的产品,更具体而言,用于创伤接触材料、缝线、医疗器械、植入物、组织工程。
25.按照权利要求19至22中任一项获得的材料的用途,用于制备卫生用品和织物。
26.通过权利要求20至22中任一项的方法获得的纤维或纤维片状体。
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