CN104404021A - 一种固定化酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种固定化酶的制备方法，本发明采用角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜作为固定化酶载体，制备得到的纳米纤维膜有高比表面积、高孔隙率、良好生物相容性，为固定化酶提供生物友好的微环境，有效的提高固定化酶催化活性和稳定性。跟现有技术相比，本发明提供的方法工艺简单，而且制备得到的固定化酶有高的载酶量，催化稳定性好，重复使用性好。
Description
技术领域
本发明涉及纳米纤维膜的制备领域，具体涉及一种固定化酶的制备方法。
背景技术
酶是一种重要的生物催化剂，具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等特点。在食品、酿造、医药等领域具有广泛应用。由于酶的特殊性质，其高级结构对环境十分敏感，如对温度、pH、有机溶剂、重金属离子等因素，且反应后不能够回收，使酶在工业应用中受到限制。
而固定化酶技术可以有效提高酶在极端条件下的稳定性和催化活性，同时易于回收再利用。目前，制备固定化酶的材料和方法有很多种，其中纳米材料固定化酶因其高载酶量受到了研究者的亲睐，尤其是一些具有多孔结构、大比表面积的载体材料有利于提高固定化酶的载酶量，并有利于底物向酶活性中心和产物向反应区域以外扩散和回收的难题。近年来，利用静电纺丝制备纳米纤维膜固定化酶成为一个新兴研究热点。
载体的良好生物相容性是酶固定化载体的必备条件之一。由于良好的生物相容性可以减少酶蛋白与载体间的非特异性相互作用，为固定化酶提供生物友好的微环境，从而提高固定化酶的催化效率。天然高分子材料无毒害，亲水性好，具有适合酶催化反应的天然微环境，是目前固定化酶的首选材料。通常涂覆、吸附、自组装、表面修饰来改善载体的生物相容性。
角蛋白是一种不溶性的纤维状动物蛋白，广泛存在于动物皮肤及皮肤附属物中，如毛发、蹄、壳、爪、角、鳞片等。且角蛋白资源丰富、廉价易得。近几年大量研究表明，角蛋白是一种生物相容性好且不被机体免疫排斥的优质生物医用材料。
专利CN103993425一种聚己内酯-角蛋白复合纳米纤维膜的制备方法，公开日期2014年8月20日，公开了通过静电纺丝技术制备了聚己内酯-角蛋白复合纳米纤维膜，为医用敷料开发提供一种途径。Huang等人利用胶原蛋白等生物大分子对聚(丙烯腈-丙烯酸)纳米纤维膜进行表面改性，并固定化脂肪酶(Huang XJ,Yu AG,Jiang J,Pan C,Qian JW,Xu ZK,J.Mol.Catal.B:Enzym.2009,57:250-256)。
但是，上述技术在改善载体生物相容性和固定化酶存在工艺比较繁琐、很难大规模生产和应用等缺点。
因此，有必要研制一种工艺简单、生物相容性良好、有工业生产潜力的纳米纤维膜，同时提高固定化酶的载酶量、催化稳定性和重复使用性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种固定化酶的制备方法，以角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜为载体，制备得到的固定化酶有高的载酶量，催化稳定性好，重复使用性好。
本发明提供的一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)、将角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，完全溶解后，获得纺丝液，注入静电纺丝装置中进行静电纺丝，将获得的复合纳米纤维膜置于真空干燥箱中在25℃～40℃条件下干燥5～10h，即得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜；
(2)、将角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入质量分数为3％～6％的戊二醛溶液中，25℃水浴震荡1～4h，震荡速度40～100r/min，取出后用蒸馏水冲洗，再浸入1～15mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液中震荡活化1～4h，震荡速度40～100r/min；取出后在pH为7的磷酸盐缓冲液反复冲洗，得到活化后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜；
(3)、将活化后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入浓度为0.4～1.0mg/ml酶的磷酸盐缓冲液中，密闭后在4～25℃的恒温条件下震荡1～4h，震荡速度为40～100r/min，取出，用磷酸盐缓冲液反复冲洗5次，即可得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜固定化酶。
步骤(1)中所述角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的质量比为1:4-19；所述聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的丙烯酸甲酯与丙烯酸质量比为4-19:1。
步骤(1)中所述纺丝液中角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的总质量分数为26％～30％；静电纺丝的条件控制为：电压为14～20kV，纺丝流速为0.2～0.6ml/h、接受距离为10～25cm。
步骤(1)中所制备得到的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜的直径为300～600nm。
步骤(2)中所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液，其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐的摩尔比为1:1-4。
步骤(3)所述酶的磷酸盐缓冲液中所用的酶为：过氧化氢酶、过氧化物酶、脂肪酶或淀粉酶中的一种。
测试所制备的固定化酶的稳定性:
将制备得到的将固定化酶的复合纳米纤维膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，于4℃下储存测试固定化酶储存稳定性。具体方法为：将0.1mg/ml的游离酶溶液和一批固定化酶置于4℃下保存，间隔一段时间取出一份样品测试活性，通过测试酶的残留活性随时间的变化，研究酶的储存稳定性。
测试所制备的固定化酶的重复使用性:
将步骤(3)所得的固定化酶，经过重复5次使用，测试固定化酶活性，研究其重复使用性。
跟现有技术相比，本发明将角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)混合制备复合纳米纤维膜，改善载体的生物相容性，相对于传统的表面修饰改性，其工艺简单；角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜良好的生物相容性，可以减少酶蛋白与载体间的非特异性相互作用，为固定化酶提供生物友好的微环境，有效的提高固定化酶催化活性和稳定性；采用角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜作为固定化酶载体，一方面利用纳米纤维膜具有高比表面积和高孔隙率的特性，有利于底物向酶活性中心和产物向反应区域以外扩散，另一方面纳米纤维膜中氨基、羧基均能通过共价作用与酶分子结合，使酶分子固定，改善酶分子易脱落等缺点，极大地提高了固定化酶的载酶量、催化活性和稳定性；而且角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜固定化酶，可以从反应体系中回收，可重复使用，极大地提高酶的利用率和降低成本。
附图说明
图1为实施例1中复合纳米纤维的形貌结构；
图2为实施例2中固定化酶重复使用次数与酶活性的变化；
图3为实施例3中游离酶与固定化酶在30d中残留活性随时间的变化。
具体实施方式
以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实施例不构成对本发明的限制。
实施例1
一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)、将角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)质量比按1:19加入N,N-二甲基甲酰胺溶剂中配成总质量分数为30％的溶液，室温下磁力搅拌至完全溶解，得到均匀的纺丝液，注入到静电纺丝装置中，在电压为18kV，纺丝流速为0.2ml/h，接受距离为20cm的条件下静电纺丝，获得直径为600nm角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜，将复合纳米纤维膜在真空干燥箱中在25℃的条件下干燥5h，即得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜，观察复合纳米纤维的形貌结构，如图1所示。
其中，所述聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的丙烯酸甲酯与丙烯酸质量比为4:1。
(2)、称取5mg的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入3％的戊二醛溶液中，25℃水浴震荡1h，震荡的速度为60r/min；取出处理后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜并蒸馏水充分冲洗，以去除膜上残留的戊二醛；将戊二醛活化后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液中震荡活化1h，震荡速度60r/min；取出活化后的复合纳米纤维膜并用pH为7的磷酸盐缓冲液反复冲洗；
(3)、将活化后的复合纳米纤维膜浸入浓度为0.6mg/ml的辣根过氧化物酶磷酸盐缓冲液中，密封后于25℃水浴震荡2h，震荡速度为40r/min，反应后取出复合纳米纤维膜，用磷酸盐缓冲液冲洗5次，即可得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜固定化酶；将固定化酶的复合纳米纤维膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，于4℃下储存备用。其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐的摩尔比为1:1。
实施例2
一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)、将角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)质量比按1:4加入N,N-二甲基甲酰胺溶剂中配成总质量分数为26％的溶液，室温下磁力搅拌至完全溶解，得到均匀的纺丝液，注入到静电纺丝装置中，在电压为16kV，纺丝流速为0.6ml/h，接受距离为15cm的条件下静电纺丝，获得直径为300nm角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜，将复合纳米纤维膜在真空干燥箱中在40℃的条件下干燥10h，得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜。
所述聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的丙烯酸甲酯与丙烯酸质量比为9:1。
(2)、称取5mg的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入6％的戊二醛溶液中，25℃水浴震荡4h，震荡的速度为80r/min；取出处理后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜并蒸馏水充分冲洗，以去除膜上残留的戊二醛；将戊二醛活化后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入15mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液中震荡活化4h，震荡速度80r/min；取出活化后的复合纳米纤维膜并用pH为7的磷酸盐缓冲液反复冲洗；
(3)、将活化后的复合纳米纤维膜浸入浓度为1.0mg/ml的辣根过氧化物酶磷酸盐缓冲液中，密封后于25℃水浴震荡4h，震荡速度为100r/min，反应后取出复合纳米纤维膜，用磷酸盐缓冲液冲洗5次，即可得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜固定化酶；将固定化酶的复合纳米纤维膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，于4℃下储存。
其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐的摩尔比为1:2。
将固定化酶放入反应底物中反应3min后取出，测试固定化酶活性，酶活记为100％，然后用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗固定化酶膜5次，以去除膜表面残留的底物，再次加入到新鲜的底物中反应3min后取出，测试固定化酶活性，酶活性值为与第一次酶活性值比值，以百分数表示。重复使用5次，研究固定化酶的重复使用性，结果如图2所示。
实施例3
一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)、将角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)质量比按1:9加入N,N-二甲基甲酰胺溶剂中配成28％的的溶液，室温下磁力搅拌至完全溶解，得到均匀的纺丝液，注入到静电纺丝装置中，在电压为18kV，纺丝流速为0.6ml/h，接受距离为20cm的条件下静电纺丝，获得直径为400nm角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜，将复合纳米纤维膜在真空干燥箱中在25℃的条件下干燥5h，得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜。所述聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的丙烯酸甲酯与丙烯酸质量比为19:1。
(2)、称取5mg的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入4％的戊二醛溶液中，25℃水浴震荡2h，震荡的速度为40r/min；取出处理后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜并蒸馏水充分冲洗，以去除膜上残留的戊二醛；将戊二醛活化后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入15mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液中震荡活化2h，震荡速度40r/min；取出活化后的复合纳米纤维膜并用pH为7的磷酸盐缓冲液反复冲洗；
(3)、将活化后的复合纳米纤维膜浸入浓度为0.8mg/ml的过氧化氢酶磷酸盐缓冲液中，密封后于4℃水浴震荡1h，震荡速度为80r/min，反应后取出复合纳米纤维膜，用磷酸盐缓冲液冲洗5次，即可得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜固定化酶；将固定化酶的复合纳米纤维膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，于4℃下储存备用。其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐的摩尔比为1:4。
将0.1mg/ml的游离酶溶液和固定化酶置于4℃下保存，每间隔5天取出一份样品测定其活性。残留活性(Residual activity)的计算公式如下：Ra＝At/A0×100％；其中Ra：残留活性(％)，At：t时间后所测酶的活性(U)，A0：酶的初始活性(U)。通过考察酶残留活性随时间的变化，如图3所示，研究酶的存储稳定性。
实施例4
一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)、将角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)质量比按15:85加入N,N-二甲基甲酰胺溶剂中配成26％的的溶液，室温下磁力搅拌至完全溶解，得到均匀的纺丝液，注入到静电纺丝装置中，在电压为16kV，纺丝流速为0.4ml/h，接受距离为15cm的条件下静电纺丝，获得直径为350nm角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜，将复合纳米纤维膜在真空干燥箱中在40℃的条件下干燥10h，得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜。所述聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的丙烯酸甲酯与丙烯酸质量比为19:1。
(2)、称取5mg的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入5％的戊二醛溶液中，25℃水浴震荡3h，震荡的速度为100r/min；取出处理后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜并蒸馏水充分冲洗，以去除膜上残留的戊二醛；将戊二醛活化后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液中震荡活化2h，震荡速度100r/min；取出活化后的复合纳米纤维膜并用pH为7的磷酸盐缓冲液反复冲洗；
(3)、将活化后的复合纳米纤维膜浸入浓度为1.2mg/ml的脂肪酶磷酸盐缓冲液中，密封后于4℃水浴震荡3h，震荡速度为60r/min，反应后取出复合纳米纤维膜，用磷酸盐缓冲液冲洗5次，即可得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜固定化酶；将固定化酶的复合纳米纤维膜浸入pH为7.0的磷酸盐缓冲液中，于4℃下储存备用。其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐的摩尔比为1:3。
Claims (8)
1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)、将角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，完全溶解后，获得纺丝液，注入静电纺丝装置中进行静电纺丝，将获得的复合纳米纤维膜置于真空干燥箱中在25℃～40℃条件下干燥5～10h，即得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜；
(2)、将角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入质量分数为3％～6％的戊二醛溶液中，25℃水浴震荡1～4h，震荡速度40～100r/min，取出后用蒸馏水冲洗，再浸入1～15mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液中震荡活化1～4h，震荡速度40～100r/min；取出后在pH为7的磷酸盐缓冲液反复冲洗，得到活化后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜；
(3)、将活化后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入浓度为0.4～1.0mg/ml酶的磷酸盐缓冲液中，密闭后在4～25℃的恒温条件下震荡1～4h，震荡速度为40～100r/min，取出，用磷酸盐缓冲液反复冲洗5次，即可得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜固定化酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的质量比为1:4-19。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的丙烯酸甲酯与丙烯酸质量比为4-19:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述纺丝液中角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的总质量分数为26％～30％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述纺丝的条件控制为：电压为14～20kV，纺丝流速为0.2～0.6ml/h、接受距离为10～25cm。
6.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所制备得到的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜的直径为300～600nm。
7.据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2中所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液，其中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐的摩尔比为1:1-4。
8.根据权利要求7述的固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述酶的磷酸盐缓冲液中所用的酶为：过氧化氢酶、过氧化物酶、脂肪酶或淀粉酶中的一种。
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