CN114108319B - 一种内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于污染控制与修复领域，为解决现有方法中材料功能效应不足以及应用受限的问题，同时形成一种操作简单环境友好的抗生素污染高效修复剂，公开了一种内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法及应用。所述方法先将聚乙烯醇与海藻酸钠混合形成悬浊液，调pH后，加入FeCl3进行交联，然后进行静电纺丝得到海藻酸钠/聚乙烯醇复合纤维丝；再将其浸泡于希瓦氏菌菌悬液，烘干后浸泡于明胶水溶液，再次烘干即获得内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维。本发明原材料易获取且可生物降解，凝胶纤维制备方法简单、可塑性强，环境友好，利用该纤维修复抗生素污染操作简单，可直接应用于原位修复，可大量制备推广。

Description

一种内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法及应用
技术领域
本发明属于污染控制与修复领域，具体涉及一种内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法及应用。
背景技术
自1929年青霉素出现以来抗生素开始在全球范围内应用。环境中抗生素的大量残留会诱导细菌耐药性的增加和抗性基因(ARGs)的产生与传播，对生态环境和人体健康造成潜在不利影响。
生物降解可以通过微生物的新陈代谢对抗生素进行降解，降解过程相对安全且相较其他方法费用较低，其中保证微生物在抗生素污染环境中存活并保持活性是其核心环节，目前固定化微生物消减技术逐渐兴起，该方法有两个关键环节，一是找到良好的固定化材料，二是确保微生物高活性的固定化方法，已有研究中对微生物固定化技术研发存在不足。公布号为201910763497.5名为一种利用固定化密孔菌降解养殖废水中抗生素的方法，该方法将密孔菌(Pycnoporus sp.SYBC-L10)接种于菌包中培养一段时间后置于抗生素污染废水中，菌包由培养基组成(包括木屑、麸皮、石膏、果糖、水)，菌包释放出密孔菌从而实现养殖废水中抗生素的降解，该发明虽然为降解菌提供了菌包作为生长环境，但是将菌包置于抗生素污染废水中后便无法保障密孔菌在养殖废水中的存活及生物量。公布号201610912546.3名为甘蔗渣固定化细菌及其在农田土壤中磺胺甲恶唑污染修复中的应用、公布号20191137637.4名为一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂及其在土壤污染修复中的应用，以上专利选用甘蔗渣、花生壳、稻草杆等载体固定化微生物用于不同种类抗生素的降解，能够保证微生物密度及活性并延长菌体寿命。这些方法虽然解决了附着材料和菌剂存活问题，但材料对微生物生长环境的优化，降解过程的催化，降解材料的绿色化问题依然存在不足，应用受到限制。因此，开发一种去除高效、环境友好、操作简单、适用广泛的抗生素消减功能材料成为了本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
为解决上述材料功能效应不足以及应用受限的问题，同时形成一种操作简单环境友好的抗生素污染高效修复剂，本发明公开了一种用于催化降解抗生素的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法及应用。本发明的修复剂不仅优选了希瓦氏菌降解抗生素，还可以利用材料中的催化剂加速降解过程；本发明适用范围广泛，水环境及土壤环境中均可使用；本发明材料环境友好，制备过程简单，可大范围推广制备，可被生物降解，不会造成二次污染，操作简便，仅需将修复剂撒入环境即可起作用，且免于回收。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供一种内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇与海藻酸钠混合，水浴加热，搅拌使其完全混合，形成悬浊液；
(2)将(1)形成的悬浊液用NaOH或HCl将pH调节至碱性；
(3)交联：在(2)得到的悬浊液中加入FeCl3水溶液，搅拌；
(4)将(3)得到的悬浊液进行静电纺丝，得到海藻酸钠/聚乙烯醇复合纤维丝；
(5)希瓦氏菌菌悬液的制备：选取希瓦氏菌菌株置于液体培养基中进行培养，获得希瓦氏菌菌悬液；
(6)将(4)制得的海藻酸钠/聚乙烯醇复合纤维丝浸泡在(5)培养得到的菌悬液中振荡一定时间后，取出烘干；
(7)将(6)烘干后的纤维丝进行裁剪；
(8)将明胶溶解于去离子水中，水浴加热搅拌至完全溶解；
(9)将(7)裁剪后的纤维丝浸泡于(8)所得溶液中，然后迅速拉动纤维丝，使纤维丝外表浸满明胶溶液；
(10)对(9)处理后的纤维丝进行烘干处理，即获得所述内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维。
进一步，所述(1)中海藻酸钠的投加量为1～5％(w/w)，聚乙烯醇投加量为20～30％(w/w)；水浴加热温度为80℃；搅拌时间为1～2h。
进一步，所述(2)中NaOH和HCl的浓度均为1mol/L；将pH调节至碱性具体为将pH调节至8.0～8.5。
进一步，所述(3)中FeCl3水溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，FeCl3水溶液的添加量等于(1)中悬浊液的体积；搅拌温度为50℃，搅拌时间为2～3h。
进一步，所述(5)中希瓦氏菌菌株为Shewanella oneidensis MR-1，培养基选用LB培养基；培养条件为：在恒温摇床30℃，180r/min培养18h，培养到细胞密度为1×108个/mL。
进一步，所述(6)中振荡时间为6～8h，烘干温度为25～30℃，所述希瓦氏菌悬液的用量以可完全浸泡纤维丝为准；所述(7)中裁剪后的纤维丝长度为0.5cm-10cm；所述(8)中明胶的添加量为4％(w/w)，水浴加热温度为40℃；所述(10)中烘干温度为25～30℃。
本发明提供一种通过上述方法制备得到的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤。
本发明还提供一种所述的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维的应用，用于催化降解抗生素。
进一步，所述催化降解抗生素具体为：依据污染状况添加适量凝胶纤维，将其投加入污染水体或污染土壤中，通过搅拌使其均匀分布在污染介质中，即可起到降解作用。
进一步，依据污染状况凝胶纤维的添加量为：当环境中抗生素浓度≤200ppb时，每千克水溶液/土壤中凝胶纤维添加的质量百分比为0.01～0.10％，当抗生素浓度＞200ppb时，每千克水溶液/土壤中凝胶纤维添加的质量百分比为0.10～0.25％。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
1、本发明为一种用于催化降解抗生素的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维，原材料易获取且可生物降解，制备方法简单、环境友好，利用该纤维修复抗生素污染操作简单，可直接应用于原位修复。
2、本发明一种用于催化降解抗生素的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维，明胶与纤维素可以形成稳定的三维结构，遇水延展、干燥收缩，达到对环境中抗生素的吸附效果。
3、本发明一种用于催化降解抗生素的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维，海藻酸钠有良好的生物相容性、可降解吸收性，聚乙烯醇是电纺材料的优良基体，海藻酸钠与聚乙烯醇混纺后提高了可纺性和力学性能，且两者均属于水溶性材料，无毒无害，海藻酸钠/聚乙烯醇纤维吸附性能强，可吸附环境中的抗生素。且海藻酸钠和氯化铁交联无毒，本发明制得的纤维中的铁离子可以与环境中的钙离子发生离子交换，Fe3+可被希瓦氏菌还原为Fe2+、Fe0，在氧气、水和有机酸存在的情况下，Fe2+、Fe0可以产生羟基自由基，羟基自由基与有机污染物发生化学反应，最终将抗生素降解为无毒无害的小分子物质，进一步促进抗生素的降解。
4、本发明一种用于催化降解抗生素的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维可实现降解菌株高强度固定，为菌提供营养物质，保证了菌株的活性及降解的长效性，同时抗生素降解过程中产生的小分子物质及氧气有益于希瓦氏菌的生存及降解作用。
5、本发明一种用于催化降解抗生素的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备简单，可塑性强，操作方便，可大量制备推广。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1本发明用于催化降解抗生素的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维，制备方法如下：
(1)配制聚乙烯醇与海藻酸钠的混合溶液，其中以反应总体积为参照，海藻酸钠的投加量为4％(w/w)，聚乙烯醇投加量为25％(w/w)，80℃水浴加热下搅拌1h，使其完全混合；
(2)将(1)所述悬浊液用浓度为1mol/L的NaOH以及HCl将pH调节至8.0(±0.1)；
(3)交联：将(2)所述悬浊液中加入与(1)等体积的浓度为0.15mol/L的FeCl3水溶液，50℃搅拌3h；
(4)将(3)所述悬浊液进行静电纺丝得到海藻酸钠/聚乙烯醇复合纤维
(5)希瓦氏菌菌液的制备：选取Shewanella oneidensis MR-1置于LB液体培养基中进行在恒温摇床30℃，180r/min培养18h，培养到细胞密度为1×108个/mL；
(6)将(4)制得的纤维浸泡在(5)培养得的菌悬液中振荡7h后用镊子取出25℃烘干；
(7)将(6)所述纤维丝进行裁剪，使其长度为0.5cm-10cm；
(8)将明胶溶解于去离子水中(明胶添加量为4％(w/w))，40℃水浴加热搅拌至完全溶解；
(9)将(7)制得的纤维丝浸泡于(8)溶液中，然后迅速拉动纤维丝，使纤维丝外表浸满明胶溶液；
(10)对(9)所述纤维素30℃进行烘干处理，即可获得凝胶纤维丝。
实施例2
(1)配制聚乙烯醇与海藻酸钠的混合溶液，其中以反应总体积为参照，海藻酸钠的投加量为1％(w/w)，聚乙烯醇投加量为20％(w/w)，80℃水浴加热下搅拌1h，使其完全混合；
(2)将(1)所述悬浊液用浓度为1mol/L的NaOH以及HCl将pH调节至8.0(±0.1)；
(3)交联：将(2)所述悬浊液中加入与(1)等体积的浓度为0.1mol/L的FeCl3水溶液，50℃搅拌2h；
(4)将(3)所述悬浊液进行静电纺丝得到海藻酸钠/聚乙烯醇复合纤维
(5)希瓦氏菌菌液的制备：选取Shewanella oneidensis MR-1置于LB液体培养基中进行在恒温摇床30℃，180r/min培养18h，培养到细胞密度为1×108个/mL；
(6)将(4)制得的纤维浸泡在(5)培养得的菌悬液中振荡6h后用镊子取出25℃烘干；
(7)将(6)所述纤维丝进行裁剪，使其长度为0.5cm-10cm；
(8)将明胶溶解于去离子水中(添加量为4％(w/w))，40℃水浴加热搅拌至完全溶解；
(9)将(7)制得的纤维丝浸泡于(8)溶液中，然后迅速拉动纤维丝，使纤维丝外表浸满明胶溶液；
(10)对(9)所述纤维素25℃进行烘干处理，即可获得凝胶纤维丝。
实施例3
(1)配制聚乙烯醇与海藻酸钠的混合溶液，其中以反应总体积为参照，海藻酸钠的投加量为5％(w/w)，聚乙烯醇投加量为30％(w/w)，80℃水浴加热下搅拌2h，使其完全混合；
(2)将(1)所述悬浊液用浓度为1mol/L的NaOH以及HCl将pH调节至8.0(±0.1)；
(3)交联：将(2)所述悬浊液中加入与(1)等体积的浓度为0.5mol/L的FeCl3水溶液，50℃搅拌2h；
(4)将(3)所述悬浊液进行静电纺丝得到海藻酸钠/聚乙烯醇复合纤维
(5)希瓦氏菌菌液的制备：选取Shewanella oneidensis MR-1置于LB液体培养基中进行在恒温摇床30℃，180r/min培养18h，培养到细胞密度为1×108个/mL；
(6)将(4)制得的纤维浸泡在(5)培养得的菌悬液中振荡8h后用镊子取出30℃烘干；
(7)将(6)所述纤维丝进行裁剪，使其长度为0.5cm-10cm；
(8)将明胶溶解于去离子水中(添加量为4％(w/w))，40℃水浴加热搅拌至完全溶解；
(9)将(7)制得的纤维丝浸泡于(8)溶液中，然后迅速拉动纤维丝，使纤维丝外表浸满明胶溶液；
(10)对(9)所述纤维素30℃进行烘干处理，即可获得凝胶纤维丝。
实施例4用于催化降解抗生素的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维在水溶液中降解性能(本案例选用环境中常见的磺胺甲恶唑进行)：
配制浓度为200μg/L的磺胺甲恶唑，按照质量比为0.00、0.01、0.02、0.05、0.10％的投加量将实施例1制得的凝胶纤维添加到水溶液中，25℃，150r/min气浴恒温摇床培养7d，过滤后用LC-MS/MS测定其SMX含量，计算降解率。
LC-MS/MS仪器条件：流动相A是超纯水、流动相B是乙腈。梯度洗脱程序设置为：0～0.5min：(VA:VB＝75:25)；0.5～3min：(VA:VB＝20:80)；3.0～3.5min：(VA:VB＝5:95)；3.5～7.5min：(VA:VB＝5:95)；7.5～10min：(VA:VB＝95:5)；10～12min:(VA:VB＝95:5)。进样量10μL，柱温40℃，流速为0.8mL·min-1。ESI源采用正离子模式，使用多重反应监测模式(MRM)进行目标抗生素的定量分析。采用内标标准曲线法进行SMX浓度的定量分析。
表1不同添加量的凝胶纤维对水溶液中磺胺甲恶唑的降解率
通过以上实验可以看出，采用本发明所述的凝胶纤维对水溶液中磺胺甲恶唑的降解，培养7d后最终的污染物降解率最高可达86.72％。
实施例5用于催化降解抗生素的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维对土壤中磺胺甲恶唑的降解效果(本案例选用环境中常见的磺胺甲恶唑进行)：
用甲醇配制一定浓度的SMX溶液，避光置于通风橱内，将其与风干土壤混匀后待甲醇挥发完全，使土壤SMX含量为1mg/kg。称取100g污染土壤于花盆中，以土壤质量的0.00、0.01、0.02、0.05、0.10％的投加量分别向各花盆中加入实施例1中制得的凝胶纤维，调节土壤含水量为60％。培养15天后，通过振荡超声提取法提取土壤中磺胺甲恶唑后，利用LC-MS/MS(仪器条件如案例2)测定土壤中SMX含量，计算其降解率。
表2不同添加量的凝胶纤维对土壤中磺胺甲恶唑的降解率
添加量 0.00％ 0.01％ 0.02％ 0.05％ 0.10％
降解率 4.31％ 13.93％ 19.63％ 42.68％ 68.77％
通过以上实验可以看出，采用本发明所述的凝胶纤维对土壤中磺胺甲恶唑的降解，培养15d后磺胺甲恶唑的降解率最高可达68.77％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇与海藻酸钠混合，水浴加热，搅拌使其完全混合，形成悬浊液；
(2)将(1)形成的悬浊液用NaOH或HCl将pH调节至碱性；
(3)交联：在(2)得到的悬浊液中加入FeCl3水溶液，搅拌；
(4)将(3)得到的悬浊液进行静电纺丝，得到海藻酸钠/聚乙烯醇复合纤维丝；
(5)希瓦氏菌菌悬液的制备：选取希瓦氏菌菌株置于液体培养基中进行培养，获得希瓦氏菌菌悬液；
(6)将(4)制得的海藻酸钠/聚乙烯醇复合纤维丝浸泡在(5)培养得到的菌悬液中振荡一定时间后，取出烘干；
(7)将(6)烘干后的纤维丝进行裁剪；
(8)将明胶溶解于去离子水中，水浴加热搅拌至完全溶解；
(9)将(7)裁剪后的纤维丝浸泡于(8)所得溶液中，然后迅速拉动纤维丝，使纤维丝外表浸满明胶溶液；
(10)对(9)处理后的纤维丝进行烘干处理，即获得所述内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维。
2.根据权利要求1所述的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法，其特征在于：所述(1)中海藻酸钠的投加量为1～5％w/w，聚乙烯醇投加量为20～30％w/w；水浴加热温度为80℃；搅拌时间为1～2h。
3.根据权利要求1所述的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法，其特征在于：所述(2)中NaOH和HCl的浓度均为1mol/L；将pH调节至碱性具体为将pH调节至8.0～8.5。
4.根据权利要求1所述的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法，其特征在于：所述(3)中FeCl3水溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，FeCl3水溶液的添加量等于(1)中悬浊液的体积；搅拌温度为50℃，搅拌时间为2～3h。
5.根据权利要求1所述的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法，其特征在于：所述(5)中希瓦氏菌菌株为ShewanellaoneidensisMR-1，培养基选用LB培养基；培养条件为：在恒温摇床30℃，180r/min培养18h，培养到细胞密度为1×108个/mL。
6.根据权利要求1所述的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维制备方法，其特征在于：所述(6)中振荡时间为6～8h，烘干温度为25～30℃，所述希瓦氏菌悬液的用量以可完全浸泡纤维丝为准；所述(7)中裁剪后的纤维丝长度为0.5cm-10cm；所述(8)中明胶的添加量为4％w/w，水浴加热温度为40℃；所述(10)中烘干温度为25～30℃。
7.一种通过权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维。
8.一种权利要求7所述的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维的应用，其特征在于：用于催化降解抗生素。
9.根据权利要求8所述的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维的应用，其特征在于，所述催化降解抗生素具体为：依据污染状况添加适量凝胶纤维，将其投加入污染水体或污染土壤中，通过搅拌使其均匀分布在污染介质中，即可起到降解作用。
10.根据权利要求9所述的内嵌希瓦氏菌的凝胶纤维的应用，其特征在于，依据污染状况凝胶纤维的添加量为：当环境中抗生素浓度≤200ppb时，每千克水溶液/土壤中凝胶纤维添加的质量百分比为0.01～0.10％，当抗生素浓度＞200ppb时，每千克水溶液/土壤中凝胶纤维添加的质量百分比为0.10～0.25％。
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